JPWO2018021362A1 - 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
再生医療の重要度が加速的に増す中、特異な機能を有する末梢細胞を用いた移植療法は、広く実施されるようになり、高い治療効果が注目を集めている。軟骨細胞はこの移植療法で注目される細胞の例である。患者から摘出可能で健常な軟骨細胞を生体外で培養し、関節軟骨の損傷部に移植・包埋・置換する軟骨再生術が,すでに臨床応用として進められている。自家移植のメリットを活用した方法論である一方で、患部が大きな場合等は大量の細胞が必要とする場合には、プラスチックシャーレ等での継代増殖を行なう事が不可欠となる。
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献5〜7は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
[1]
脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
[2]
前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、又は筋芽細胞である、[1]に記載の方法。
[3]
前記工程(2)が少なくとも30日間実施される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
前記工程(2)において、細胞を、ポリマー多孔質膜1平方センチメートル当たりに1.0x105個以上となるまで増殖させる、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]
2以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]
前記ポリマー多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法。
[7]
工程(2)において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、[1]〜[6]のいずれか1つに記載の方法。
[8]
工程(2)において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9]
前記表面層Aの平均孔径が、0.01〜50μmである、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10]
前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の方法。
[11]
前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、5〜500μmである、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法。
[12]
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、[1]〜[11]のいずれか1つに記載の方法。
[13]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、[12]に記載の方法。
[14]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、[12]又は[13]に記載の方法。
[15]
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、[1]〜[11]のいずれか1つに記載の方法。
[16]
脱分化しやすい細胞を調製する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
[17]
脱分化しやすい細胞を用いて物質を産生する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
(3)前記細胞が産生する物質を回収する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
[18]
前記細胞が軟骨細胞であって、前記物質がプロテオグリカン、コラーゲン及びヒアルロン酸から選択される少なくとも1つである、[17]に記載の方法。
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の脱分化抑制方法」とも呼ぶ。
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の細胞調製方法」とも呼ぶ。
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
(3)前記細胞が産生する物質を回収する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の物質産生方法」とも呼ぶ。
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(B)前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層A(以下で、「A面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ)に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、0.01μm以上200μm未満、0.01〜150μm、0.01〜100μm、0.01〜50μm、0.01μm〜40μm、0.01μm〜30μm、0.01μm〜20μm、又は0.01μm〜15μmであり、好ましくは、0.01μm〜15μmである。
1)1,4−ジアミノベンゼン(パラフェニレンジアミン)、1,3−ジアミノベンゼン、2,4−ジアミノトルエン、2,6−ジアミノトルエンなどのベンゼン核1つのべンゼンジアミン;
2)4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ビス(トリフルオロメチル)−4,4’−ジアミノビフェニル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジカルボキシ−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’,5,5’−テトラメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、ビス(4−アミノフェニル)スルフィド、4,4’−ジアミノベンズアニリド、3,3’−ジクロロベンジジン、3,3’−ジメチルベンジジン、2,2’−ジメチルベンジジン、3,3’−ジメトキシベンジジン、2,2’−ジメトキシベンジジン、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,3’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、4,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,3’−ジアミノジフェニルスルホン、3,4’−ジアミノジフェニルスルホン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン、3,3’−ジアミノベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジクロロベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノジフェニルメタン、3,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、3,3’−ジアミノジフェニルスルホキシド、3,4’−ジアミノジフェニルスルホキシド、4,4’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核2つのジアミン;
3)1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェノキシ)−4−トリフルオロメチルベンゼン、3,3’−ジアミノ−4−(4−フェニル)フェノキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジ(4−フェニルフェノキシ)ベンゾフェノン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(3−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核3つのジアミン;
4)3,3’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、3,3’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核4つのジアミン。
(i)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
(ii)テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び/又は、
(iii)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
対数粘度0.5〜1.0のポリエーテルスルホンの0.3質量%〜60質量%と有機極性溶媒40質量%〜99.7質量%とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、PES多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは240℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が10μm〜500μmである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBはそれぞれ、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBのうち、一方が平均孔径5μm超200μm以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径0.01μm以上200μm未満の複数の細孔を有し、
表面層A及び表面層Bの、一方の表面開口率が15%以上であり、他方の表面層の表面開口率が10%以上であり、
前記表面層A及び前記表面層Bの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記PES多孔質膜は、総膜厚が5μm〜500μmであり、かつ空孔率が50%〜95%である、
PES多孔質膜である。
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図1に示す。図1は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。たとえば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。脱分化しやすい細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリマー多孔質膜に適用した細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリマー多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
本発明の物質産生方法において、上述したように細胞を培養することにより、細胞から所望の物質を産生させる。産生された物質が、細胞内に留まる物質であっても、細胞から分泌される物質であってもよい。産生された物質は、物質の種類、性質に応じて公知の方法により回収することが可能である。細胞から分泌される物質の場合、細胞培養培地から物質を回収することができる。産生された物質が細胞内に留まる物質の場合、細胞溶解剤等を用いた化学的処理、超音波処理、ホモジナイザー、破砕用ディスポチューブ等を用いた物理的処理などの公知の方法により細胞を破壊することにより、物質を細胞外に出して回収することが可能である。細胞を破壊する方法は、細胞の種類、物質の種類等に応じて適宜当業者が適用可能である。
ポリイミド多孔質膜上でのヒト軟骨細胞の培養
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社 cat.103)に軟骨細胞増殖培地(PromoCell社製)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のA面を上にして培地に浸漬させた。1枚のシートあたり4×104個のヒト軟骨細胞を播種し、週2回培地(1ml)を交換しながらCO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを以下で「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。培養開始後、Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所製、以下で「CCK8」と呼ぶ)を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図3に示す。長期間に亘る、安定したヒト軟骨細胞の増殖及び生育が観察された。
ポリイミド多孔質膜から空のポリイミド多孔質膜へのヒト軟骨細胞の移動(気相継代法)
実施例1に記載の方法に従って、ヒト軟骨細胞を59日間CO2インキュベータ内で培養した。培養中の細胞の生育したポリイミド多孔質膜シートに対し、新規な同サイズのポリイミド多孔質膜各1枚で上下を挟み、3段重ねのポリイミド多孔質膜積層体を1セット用意した。この3段重ねの積層体を、培地中に置いたメッシュの上に気相に接する様に置き、CO2インキュベータ内で培養を継続した。7日間後、それぞれの積層体を1枚毎に独立させ、各ポリイミド多孔質膜の細胞数についてCCK8を用いて測定した。結果を図4に示す。
ヒト軟骨細胞の長期培養
実施例1のヒト軟骨細胞の培養を、実施例1と同一の条件下でさらに継続した。CCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図5に示す。
ヒト軟骨細胞からの物質産生
実施例3における、培養開始後120日目及び365日目の部材培養細胞サンプル、及び当該細胞サンプルを培養した後の培地を回収し、ELISA法によってタイプIIコラーゲン及びプロテオグリカンの産生量を測定した。なお、部材培養細胞サンプルについては、外部からの超音波破砕によって細胞壁を破壊し、細胞内のタイプIIコラーゲン及びプロテオグリカンを回収した。
ヒト軟骨細胞の長期培養及び物質産生(細胞の初期播種数の違いが及ぼす影響)
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に軟骨細胞増殖培地(PromoCell社製)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のA面を上にして培地に浸漬させた。1枚のシートあたり4×104又は2×104個の軟骨細胞をそれぞれ播種し、週2回培地(1ml)を交換しながらCO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。CCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図7に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、ヒト軟骨細胞を安定して長期に培養することができた。
ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に骨芽細胞増殖培地 (PromoCell社製、C-27001)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のA面を上にして培地に浸漬させた。1枚のシートあたり4×104個のヒト骨芽細胞(PromoCell社製)を播種し、CO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。週2回培地(1ml)を交換した。培養開始後、CCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図8に示す。長期間に亘る、安定した細胞の増殖及び生育が観察された。
ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養と石灰化誘導
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に骨芽細胞増殖培地 (PromoCell社製、C-27001)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のA面を上にして培地に浸漬させた。1枚のシートあたり4×104又は2×104個のヒト骨芽細胞(PromoCell社製)を播種し、週2回培地(1ml)を交換しながらCO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、CCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図9に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、長期間に亘る、安定したヒト骨芽細胞の増殖及び生育が観察された。
ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養と顕微鏡観察
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に骨芽細胞増殖培地 (Promo Cell社製、C-27001)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のA面を上にして容器の培地に浸漬させた。1枚のポリイミド多孔質膜あたり4×104又は2×104個のヒト骨芽細胞(PromoCell社製)をそれぞれ播種し、週2回培地(1ml)を交換しながらCO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、CCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図11に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、長期間に亘る、安定したヒト骨芽細胞の増殖及び生育が観察された。
Claims (18)
- 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。 - 前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、又は筋芽細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)が少なくとも30日間実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記工程(2)において、細胞を、ポリマー多孔質膜1平方センチメートル当たりに1.0x105個以上となるまで増殖させる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 2以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 工程(2)において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(2)において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面層Aの平均孔径が、0.01〜50μmである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、5〜500μmである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項12に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 脱分化しやすい細胞を調製する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。 - 脱分化しやすい細胞を用いて物質を産生する方法であって、
(1)前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
(3)前記細胞が産生する物質を回収する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。 - 前記細胞が軟骨細胞であって、前記物質がプロテオグリカン、コラーゲン及びヒアルロン酸から選択される少なくとも1つである、請求項17に記載の方法。
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