KR102281173B1 - 사이펀식 배양법 - Google Patents

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KR102281173B1
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신사쿠 후세
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우베 고산 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치 및 그것을 이용한 세포 배양 방법을 제공한다. 사이펀 구조 또는 물받이 구조를 갖는 세포 배양 장치로서, 폴리머 다공질막과, 이 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와, 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 액 저장부의 하부에 배치된 배지 배출 수단과, 액 저장부에 저류되어 간헐적으로 토출되는 배지를 회수하는 배지 회수 수단을 구비한 세포 배양 장치를 제공한다.

Description

사이펀식 배양법
본 발명은 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치에 관한 것이다. 또한, 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치를 사용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
최근, 치료나 백신에 이용되는 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인, 바이러스(바이러스 단백질) 등의 단백질이 배양 세포를 이용하여 공업적으로 산생되고 있다. 그러나, 이러한 단백질의 생산 기술은 비용이 높아, 이것이 의료비를 끌어올리고 있었다. 그 때문에, 대폭적인 비용 삭감을 목표로 하여, 고밀도로 세포를 배양하는 기술이나, 단백질의 산생량을 증대시키는 것과 같은 혁신적인 기술이 요구되고 있었다.
단백질을 산생하는 세포로서, 배양 기재에 접착하는 부착 의존성의 접착 세포가 이용되는 경우가 있다. 이러한 세포는 부착 의존적으로 증식하기 때문에, 샤알레, 플레이트 또는 챔버의 표면에 접착시켜 배양할 필요가 있다. 종래, 이러한 접착 세포를 대량으로 배양하기 위해서는 접착하기 위한 표면적을 크게 할 필요가 있었다. 그런데, 배양 면적을 크게 하기 위해서는 공간을 필연적으로 증대시킬 필요가 있어, 그것이 비용을 증대시키는 요인이 되고 있었다.
배양 공간을 작게 하면서 접착 세포를 대량으로 배양하는 방법으로서, 미소 다공을 갖는 담체, 특히 마이크로캐리어를 이용한 배양법이 개발되어 있다(예컨대 특허문헌 1). 마이크로캐리어를 이용한 세포 배양계는, 마이크로캐리어가 상호 응집하지 않게 하기 위해서 충분히 교반·확산될 필요가 있다. 그 때문에, 마이크로캐리어를 분산시킨 배지를 충분히 교반·확산할 수 있을 만큼의 용적이 필요하게 되기 때문에, 배양할 수 있는 세포의 밀도에는 상한이 있다. 또한, 마이크로캐리어와 배지를 분리하기 위해서는 미세한 입자를 분별할 수 있는 필터로 분리시킬 필요가 있고, 그것이 비용을 증대시키는 원인으로도 되고 있었다. 이러한 상황 때문에 고밀도의 세포를 배양하는 혁신적인 세포 배양 방법론이 요구되고 있었다.
<폴리이미드 다공질막>
폴리이미드 다공질막은, 본 출원 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도를 위해서 이용되어 왔다. 특허문헌 2∼4는, 특히 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공공률(空孔率)이 높고, 양 표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높으며, 공공률이 높음에도 불구하고, 막 두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력이 우수한 마크로보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다. 이들은 모두 아믹산을 경유하여 작성된 폴리이미드 다공질막이다.
세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는 세포 배양 방법이 보고되어 있다(특허문헌 5).
특허문헌 1: 국제공개 제2003/054174호 특허문헌 2: 국제공개 제2010/038873호 특허문헌 3: 일본 특허공개 2011-219585호 공보 특허문헌 4: 일본 특허공개 2011-219586호 공보 특허문헌 5: 국제공개 제2015/012415호
본 발명은 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치를 사용한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 소정의 구조를 갖는 폴리머 다공질막이, 세포를 대량으로 배양할 수 있는 최적의 공간을 제공할 뿐만 아니라, 건조에 강한 습윤 환경을 제공하는 것을 알아내어, 세포를 기상 노출하여 배양하는 장치 및 그것을 사용하는 배양 방법을 완성시켰다. 즉, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.
[1] 폴리머 다공질막과,
상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와,
상기 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와,
상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과,
상기 액 저장부의 하부에 배치된 배지 배출 수단과,
상기 배지 배출 수단에 연통된 역 U자 관과,
상기 역 U자 관의 타단에 설치되어 배지를 회수하는 배지 회수 수단을 구비하고,
여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며,
여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지의 액면이 상기 역 U자 관의 정상부에 달했을 때, 사이펀의 원리에 의해 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
[2] 폴리머 다공질막과,
일단을 액 저장부, 타단을 바닥부로 하는 함상체(函狀體)로서, 상기 액 저장부에 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부를 구비한 함상체와,
상기 함상체의 바닥면 측의 일부에 설치된 회전축과,
상기 회전축을 지지하는 베어링과,
상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과,
상기 액 저장부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고,
여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며,
여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지가 상기 함상체 바닥부의 중량을 넘어 공급되었을 때에, 상기 액 저장부의 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
[3] 상기 배지 회수 수단과 일단부에서 연통된 배양액 배출 라인과,
상기 배지와 일단부에서 연통된 배양액 공급 라인
을 추가로 구비하고,
여기서, 상기 배출 라인의 타단부가 상기 배양액 공급 라인의 타단부와 펌프를 통해 연통되어 있어, 배양액이 순환 가능한 것인, [1] 또는 [2]에 기재한 세포 배양액장치.
[4] 상기 배양액 배분 수단이 미스트 공급 노즐인 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[5] 상기 폴리머 다공질막이,
i) 절첩되어,
ii) 롤형으로 감겨,
iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜,
iv) 새끼줄형으로 연결되어, 및/또는
v) 2 이상이 적층되어,
상기 평면 유로에 설치되어 있는 것인, [1]∼[4] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[6] 상기 폴리머 다공질막이, 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막이며,
여기서, 상기 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막은,
(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,
(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,
(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는
(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어
상기 케이싱 내에 수용된 것이고,
여기서, 상기 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막이 상기 평면 유로에 설치되어 있는 것인, [1]∼[5] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[7] 상기 폴리머 다공질막이, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 것인 [1]∼[6] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[8] 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 [1]∼[7] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[9] 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 [1]∼[8] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[10] 상기 폴리머 다공질막의 평균 막 두께가 5∼500 ㎛인 [1]∼[9] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[11] 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 [1]∼[10] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[12] 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 [11]에 기재한 세포 배양 장치.
[13] 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 [11] 또는 [12]에 기재한 세포 배양 장치.
[14] 상기 폴리머 다공질막이 폴리에테르술폰 다공질막인 [1]∼[10] 중 어느 것에 기재한 세포 배양 장치.
[15] [1]∼[14] 중 어느 것에 기재된 세포 배양 장치를 사용하는 세포 배양 방법.
본 발명은, 세포 배양 담체로서 폴리머 다공질막을 이용함으로써, 배양 스페이스나 배지의 양이 적은 조건 하에서도 간편하면서 또한 효율적인 연속형 세포 배양을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 폴리머 다공질막은 미친수성(微親水性)의 다공질 특성을 갖기 때문에, 폴리머 다공질막 내에 안정된 액 유지가 이루어져, 건조에도 강한 습윤 환경이 유지된다. 그 때문에, 종래의 세포 배양 장치와 비교하여도 매우 소량의 배지로도 세포의 생존 및 증식을 달성할 수 있다. 또한, 폴리머 다공질막의 일부 또는 전부가 공기에 노출된 상태라도 배양이 가능하기 때문에, 세포에 대하여 효율적인 산소 공급을 할 수 있어, 대량의 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에 의하면, 사이펀(siphon) 기구 또는 물받이(shishi-odoshi) 기구에 의해 세포 배양부를 기상에 직접 노출시킴으로써 안정된 산소 공급을 정상적으로 달성할 수 있기 때문에, 산소 공급 시스템을 사용하지 않고서 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 또한, 자발적으로 액부의 이동을 반복하는 시스템이기 때문에, 액의 유통 이외에 특별한 장치나 에너지를 사용하는 일 없이 운전을 계속하는 것이 가능하게 된다. 또한, 세포와 하부의 배지 저류부(「세포 회수 수단」이라고도 한다)가 괴리되어 있기 때문에, 예컨대 pH 조정이나 글루코오스 주입 등의 조정에 있어서, 강교반이나 발포 등의 세포에 대한 금기도 사용 가능하게 되어, 작업장의 선택지를 크게 할 수 있는데다, 배양 스케일의 이론 상한 등으로부터도 자유롭게 되어 초대형 설비 등으로도 전개할 수 있게 된다.
도 1은 실시형태에 있어서의 사이펀식 세포 배양 장치를 도시한 도면이다.
도 2는 실시형태에 있어서의 물받이식 세포 배양 장치를 도시한 도면이다.
도 3의 (a)는 일 실시형태에 있어서의 건열 멸균형 사이펀식 세포 배양 장치(내열 사이펀형 리액터), (b)는 모듈을 도시한 도면이다.
도 4는 일 실시형태의 세포 배양 장치에 있어서의, 액적화 배지 공급 수단으로부터 적하되는 배지의 양식을 도시한 개념도이다. (a) 드롭형, (b) 메쉬형, (c) 샤워형을 도시한다. (d) 드롭형 및 메쉬형의 액적을 공급하기 위해서 사용되는, 일 실시형태의 세포 배양 장치에 적용되는 덮개를 도시한 도면이다. 덮개의 배지 공급구에는 스테인리스강제 메쉬를 감아 형성한 메쉬 다발이 삽입된다.
도 5는 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 세포 배양 장치를 사용한 경우의, 인간 피부 선유아세포로부터 산생되는 피브로넥틴의 양을 도시한 그래프이다. 컨트롤로서, 통상의 배양 접시로 인간 피부 선유아세포를 배양함으로써 산생된 피브로넥틴의 양을 나타내고 있다(배양 접시 제8일).
도 6은 폴리머 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도시한다.
이하, 본 발명의 실시형태에 관해서 필요에 따라 도면을 참조하면서 설명한다. 실시형태의 구성은 예시이며, 본 발명의 구성은 실시형태의 구체적 구성에 한정되지 않는다.
1. 폴리머 다공질막
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 A(이하에서 「A면」 또는 「메쉬면」이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만, 0.01∼150 ㎛, 0.01∼100 ㎛, 0.01∼50 ㎛, 0.01 ㎛∼40 ㎛, 0.01 ㎛∼30 ㎛, 0.01 ㎛∼20 ㎛ 또는 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 바람직하게는 0.01 ㎛∼15 ㎛이다.
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 B(이하에서 「B면」 또는 「대혈면」(大穴面)이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 큰 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하, 20 ㎛∼100 ㎛, 30 ㎛∼100 ㎛, 40 ㎛∼100 ㎛, 50 ㎛∼100 ㎛ 또는 60 ㎛∼100 ㎛이며, 바람직하게는 20 ㎛∼100 ㎛이다.
폴리머 다공질막 표면의 평균 구멍 직경은, 다공질막 표면의 주사형 전자현미경 사진으로부터 200점 이상의 개공부에 관해서 구멍 면적을 측정하고, 이 구멍 면적의 평균치로부터 하기 식 (1)에 따라서 구멍의 형상이 진원(眞圓)이라고 했을 때의 평균 직경을 계산에 의해 구할 수 있다.
Figure 112019007858507-pct00001
(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균치를 의미한다.)
표면층 A 및 B의 두께는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이며, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다.
폴리머 다공질막에 있어서의 마크로보이드층 중의 마크로보이드의 막 평면 방향의 평균 구멍 직경은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 10∼500 ㎛이며, 바람직하게는 10∼100 ㎛이고, 보다 바람직하게는 10∼80 ㎛이다. 또한, 상기 마크로보이드층 중의 격벽의 두께는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이며, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 마크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서 상기 마크로보이드층 중의 격벽은 구멍을 갖지 않는다.
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 표면의 총 막 두께는 특별히 한정되지 않지만, 5 ㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상 또는 25 ㎛ 이상이라도 좋고, 500 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이하 또는 50 ㎛ 이하라도 좋다. 바람직하게는 5∼500 ㎛이며, 보다 바람직하게는 25∼75 ㎛이다.
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 막 두께는 접촉식의 두께 측정기로 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 공공률은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 40% 이상 95% 미만이다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막의 공공률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하여, 평량 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라서 구할 수 있다.
Figure 112019007858507-pct00002
(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리머의 밀도를 각각 의미한다. 폴리머가 폴리이미드인 경우는, 밀도는 1.34 g/㎤으로 한다.)
본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은, 바람직하게는 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이며, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 마크로보이드층의 격벽, 그리고 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 마크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리머 다공질막이다. 일 실시형태에 있어서, 마크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서 격벽은 그와 같은 구멍을 갖지 않는다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리로서는 특별히 한정되지 않지만, 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막은, 상기한 구조적 특징을 갖추는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 폴리이미드 다공질막 또는 폴리에테르술폰(PES) 다공질막이다.
1-1. 폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이며, 통상은 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하며 강고한 분자 구조를 가지면서 또한 이미드 결합이 강한 분자간력을 가지므로, 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이며, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은, 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋지만 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 주지 않는 부가적인 성분임을 의미한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막도 포함된다.
폴리아믹산은 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은, 열이미드화 또는 화학이미드화함으로써 폐환하여 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.
폴리아믹산은 아믹산의 일부가 이미드화되어 있더라도 본 발명에 영향을 주지 않는 범위라면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은 부분적으로 열이미드화 또는 화학이미드화되어 있어도 좋다.
폴리아믹산을 열이미드화하는 경우는, 필요에 따라서 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학이미드화하는 경우는, 필요에 따라서 화학이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합하더라도 착색 전구체가 석출되지 않는 조건으로 행하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 「착색 전구체」란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화하여 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.
상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 착색 전구체로서는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산되고, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재 하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해되고, 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하며, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하고, 탄소계 착색 전구체가보다 바람직하다.
착색 전구체는, 가열해 나가면 일견 탄소화물로 보이는 것으로 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 다른 원소를 포함하며, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조인 것을 포함한다.
탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 석유타르, 석유피치, 석탄타르, 석탄피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로서는 폴리아크릴니트릴이 바람직하다.
또한, 다른 실시형태에 있어서 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 상기한 착색 전구체를 사용하지 않고서, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액을 성형한 후, 열처리함으로써 얻어지는 폴리이미드 다공질막도 포함된다.
착색 전구체를 사용하지 않고서 제조되는 폴리이미드 다공질막은, 예컨대 극한점도수가 1.0∼3.0인 폴리아믹산 3∼60 질량%와 유기 극성 용매 40∼97 질량%로 이루어지는 폴리아믹산 용액을 필름형으로 유연(流延)하고, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜 폴리아믹산의 다공질막을 제작하고, 그 후 상기 폴리아믹산의 다공질막을 열처리하여 이미드화함으로써 제조되어도 좋다. 이 방법에 있어서, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매가, 물이거나, 또는 5 질량% 이상 100 질량% 미만의 물과 0 질량% 초과 95 질량% 이하인 유기 극성 용매와의 혼합액이라도 좋다. 또한, 상기 이미드화 후, 얻어진 다공질 폴리이미드막의 적어도 한 면에 플라즈마 처리를 실시하여도 좋다.
상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 테트라카르복실산 이무수물은, 임의의 테트라카르복실산 이무수물을 이용할 수 있으며, 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 테트라카르복실산 이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산 이무수물, 옥시디프탈산이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐이무수물, 2,2-비스〔(3,4-디카르복시페녹시)페닐〕프로판이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 이용할 수 있다.
이들 중에서도 특히 비페닐테트라카르복실산 이무수물 및 피로멜리트산이무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 테트라카르복실산 이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산 이무수물로서는 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.
상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 디아민은 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서 이하의 것을 들 수 있다.
1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠핵 하나의 벤젠디아민;
2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐설폭시드, 3,4'-디아미노디페닐설폭시드, 4,4'-디아미노디페닐설폭시드 등의 벤젠핵 2개의 디아민;
3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(3-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠 등의 벤젠핵 3개의 디아민;
4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠핵 4개의 디아민.
이들은 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 이용하는 디아민은 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
이들 중에서도 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디아민이 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 글라스 전이 온도가 240℃ 이상이거나, 또는 300℃ 이상에서 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.
(i) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
(ii) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
및/또는
(iii) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이며, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 마크로보이드층의 격벽, 그리고 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 마크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리이미드 다공질막이다. 여기서, 마크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다.
예컨대 국제공개 제2010/038873호, 일본 특허공개 2011-219585호 공보 또는 일본 특허공개 2011-219586호 공보에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도 본 발명에 사용 가능하다.
1-2.폴리에테르술폰(PES) 다공질막
본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은 폴리에테르술폰을 포함하며, 전형적으로는 실질적으로 폴리에테르술폰으로 이루어진다. 폴리에테르술폰은 당업자에게 공지된 방법으로 합성된 것이면 되며, 예컨대 2가 페놀, 알칼리 금속 화합물 및 디할로게노디페닐 화합물을 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법, 2가 페놀의 알칼리 금속 2염을 미리 합성하여 디할로게노디페닐 화합물과 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법 등에 의해서 제조할 수 있다.
알칼리 금속 화합물로서는, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 수소화물, 알칼리 금속 알콕시드 등을 들 수 있다. 특히 탄산나트륨 및 탄산칼륨이 바람직하다.
2가 페놀 화합물로서는, 히드로퀴논, 카테콜, 레조르신, 4,4'-비페놀, 비스(히드록시페닐)알칸류(예컨대 2,2-비스(히드록시페닐)프로판 및 2,2-비스(히드록시페닐)메탄), 디히드록시디페닐술폰류, 디히드록시디페닐에테르류, 또는 이들의 벤젠환의 수소의 적어도 하나가, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 저급 알킬기, 또는 메톡시기, 에톡시기 등의 저급 알콕시기로 치환된 것을 들 수 있다. 2가 페놀 화합물로서는, 상기한 화합물을 2 종류 이상 혼합하여 이용할 수 있다.
폴리에테르술폰은 시판 제품이라도 좋다. 시판 제품의 예로서는 스미카엑셀 7600P, 스미카엑셀 5900P(이상, 스미토모카가쿠(주) 제조) 등을 들 수 있다.
폴리에테르술폰의 대수점도는, 다공질 폴리에테르술폰막의 마크로보이드를 양호하게 형성한다는 관점에서, 바람직하게는 0.5 이상, 보다 바람직하게는 0.55 이상이고, 다공질 폴리에테르술폰막의 제조 용이성의 관점에서, 바람직하게는 1.0 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 더욱 바람직하게는 0.8 이하, 특히 바람직하게는 0.75 이하이다.
또한, PES 다공질막 또는 그 원료로서의 폴리에테르술폰은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 글라스 전이 온도가 200℃ 이상이거나 또는 명확한 글라스 전이 온도가 관찰되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대
대수점도 0.5∼1.0의 폴리에테르술폰의 0.3 질량%∼60 질량%와 유기 극성 용매 40 질량%∼99.7 질량%를 포함하는 폴리에테르술폰 용액을 필름형으로 유연하고, 폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매를 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜 빈 구멍을 갖는 응고막을 제작하는 공정 및
상기 공정에서 얻어진 빈 구멍을 갖는 응고막을 열처리하여 상기 빈 구멍을 조대화시켜 PES 다공질막을 얻는 공정을 포함하고,
상기 열처리는, 상기 빈 구멍을 갖는 응고막을 상기 폴리에테르술폰의 글라스 전이 온도 이상 혹은 240℃ 이상까지 승온시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되어도 좋다.
본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은, 바람직하게는 표면층 A, 표면층 B 및 상기 표면층 A와 상기 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 PES 다공질막으로서,
상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 구멍 직경이 10 ㎛∼500 ㎛인 복수의 마크로보이드를 가지며,
상기 마크로보이드층의 격벽은 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,
상기 표면층 A 및 B는 각각 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,
상기 표면층 A 및 B 중, 한쪽이 평균 구멍 직경 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하인 복수의 세공을 가지며, 또한 다른 쪽이 평균 구멍 직경 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만인 복수의 세공을 가지고,
표면층 A 및 표면층 B의, 한쪽의 표면 개구율이 15% 이상이며, 다른 쪽의 표면층의 표면 개구율이 10% 이상이고,
상기 표면층 A 및 상기 표면층 B의 상기 세공이 상기 마크로보이드에 연통되어 있고,
상기 PES 다공질막은 총 막 두께가 5 ㎛∼500 ㎛이면서 또한 공공률이 50%∼95%인 PES 다공질막이다.
본 발명의 세포 배양 장치에 이용되는, 세포 배양 담체로서의 상술한 폴리머 다공질막은, 미친수성의 다공질 특성을 갖기 때문에, 폴리머 다공질막 내에 안정된 액 유지가 이루어져, 건조에도 강한 습윤 환경이 유지된다. 그 때문에, 종래의 세포 배양 담체를 이용하는 세포 배양 장치와 비교하여, 매우 소량의 배지라도 세포의 생존 및 증식을 달성할 수 있다. 또한, 폴리머 다공질막의 일부 또는 전부가 공기에 노출된 상태라도 배양이 가능하기 때문에, 세포에 대하여 효율적인 산소 공급을 할 수 있어, 대량의 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에 의하면, 이용하는 배지의 양이 매우 적고, 또한 배양 담체인 폴리머 다공질막을 기상에 노출할 수 있으므로, 세포에의 산소 공급은 확산에 의해서 충분히 행해진다. 따라서, 본 발명에서는 특별히 산소 공급 장치를 필요로 하지 않는다.
2. 세포 배양 장치
본 발명은, 사이펀 구조 또는 물받이 구조를 갖는 세포 배양 장치이며, 폴리머 다공질막과, 이 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와, 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 액 저장부의 하부에 배치된 배지 배출 수단을 구비한 배지 저류부를 구비하고, 여기서, 액 저장부에 일시적으로 저류된 배지는 배지 저류부에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 장치는, 전형적으로는 사이펀식 세포 배양 장치 및 물받이식 세포 배양 장치를 이용하여 예증(例證)되지만, 상술한 것과 같이, 액 저장부에 일시적으로 저류된 배지가 배지 저류부에 간헐적으로 토출되는 것을 특징하는 배양 장치라면, 상기 명칭 중 어느 것으로 분류할 필요는 없다. 본 명세서에 있어서, 일반적으로 이들 세포 배양 장치를 「본 발명의 세포 배양 장치」라고도 부른다. 이하에 본 발명의 세포 배양 장치의 실시양태에 관해서 도면에 기초하여 설명한다.
(1) 사이펀식 세포 배양 장치
본 발명의 일 양태는, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와, 상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 액 저장부의 바닥부에서 연통된 역 U자 관과, 상기 역 U자 관의 타단의 하부에 설치된 배지 회수 수단과, 상기 배지 회수 수단에 배치된 배지 배출 수단을 구비하고, 여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지의 액면(16)(도 1)이 상기 역 U자 관의 정상부에 달했을 때, 사이펀의 원리에 의해 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치에 관한 것이다. 이 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈(예컨대 도 3(b))로 치환하여 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 사이펀식 세포 배양 장치의 전형적인 예를 도시하는 도면이다. 하나 이상의 세포 배양부(21a∼21f)를 상하 방향으로 지주(23)로 유지하게 한 세포 배양부 지지체(2)는, 액 저장부(11)에 수납 가능하고, 또한 배양 종료 후에 빼낼 수 있게 손잡이(22)를 구비한다. 세포 배양 지지체(2)의 단면 형상은 액 저장부(11)에 대응시키기 위해서 적절하게 조정할 수 있다. 액 저장부(11)의 단면 형상은 특별히 한정되지 않지만, 정방형, 장방형, 원형, 삼각형이 예시되고, 바람직하게는 원형이다. 액 저장부(11) 및 세포 배양 지지체(2)의 형상은 목적에 따라서 적절하게 설계를 변경하여도 좋다.
세포 배양부(21a∼21f)는, 배지를 유통할 수 있게 구멍 구조를 가지며, 폴리머 다공질막(도시하지 않음)을 설치 또는 수용할 수 있다. 이 세포 배양부의 단수는 특별히 한정되지 않지만, 배지가 액 저장부(11)에 저류 시작된 후, 최하단의 세포 배양부(21f)에 배지가 잠기기 시작하고 나서 최상단의 세포 배양부(21a)에 배지가 잠길 때까지 시간차가 있으므로, 바람직하게는 100단 이하, 보다 바람직하게는 50단 이하, 더욱 보다 바람직하게는 30단 이하이며, 또 보다 바람직하게는 10단 이하이고, 예컨대 9단, 8단, 7단, 6단, 5단, 4단, 3단, 2단, 1단이라도 좋다. 또한, 세포 배양에 있어서 각 세포 배양부에서 배양된 세포에의 기상 노출 시간을 일정하게 하기 위해서, 액 저장부(11)에 배지 공급 수단(14)으로부터의 배지의 단위 시간당 공급량과, 이 액 저장부에 구비한 역 U자 관(12)의 타단으로부터의 배지의 단위 시간당 토출량은 같은 것이 바람직하다.
액 저장부(11)는 그 상부에 배지 공급 수단(14)과 바닥부에 역 U자 관(12)을 구비한다. 배지 공급 수단(14)은, 배지를 배지 저장조(도시하지 않음) 또는 배지 회수 수단(13)에 저장된 배지를, 액 저장부(11)에 공급하기 위한 수단이며, 배지의 유량을 조절할 수 있는 조절부를 구비하여도 좋다. 또한, 액 저장부(11)에의 배지 공급 수단은, 도시되지 않지만, 배양액을 미소 액적 상태로 공급할 수 있는 미스트 공급 노즐이라도 좋다. 본 발명에 있어서, 미스트 공급 노즐은 배지가 액적의 상태로 공급되는 수단이면 되며, 노즐의 수 및 배치, 그리고 공급되는 액적의 사이즈는 한정되지 않는다.
일 양태에서는, 세포 배양 장치는, 배지 배출 수단(15)과 일단부에서 연통된 배지 배출 라인과, 배지 공급 수단(14)과 일단부에서 연통된 배지 공급 라인을 추가로 구비하여도 좋고, 배지 배출 라인의 타단부는 배지 공급 라인의 타단부와 펌프를 통해 연통되어 있어, 배지 순환이 가능하다. 배양액을 퍼 올리기 위한 펌프의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 유량을 조절할 수 있는 연동 펌프(Peristaltic pump) 등을 사용할 수 있다. 상기 조절부는 이러한 펌프에 대용 가능하다.
배지 회수 수단(13)은, 액 저장부(11)에 저장되고 토출된 배지를 일시적으로 저류하는 역할을 가지므로, 그 용량은 액 저장부(11)의 용량 이상인 것이 바람직하다.
(2) 물받이식 세포 배양 장치
본 발명의 일 양태는, 폴리머 다공질막과, 일단을 액 저장부, 타단을 바닥부로 하는 함상체로서, 상기 액 저장부에 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부를 구비한 함상체와, 상기 함상체의 바닥면 측의 일부에 설치된 회전축과, 상기 회전축을 지지하는 베어링과, 상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 액 저장부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고, 여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지가, 상기 함상체의 바닥부의 중량 밸런스를 넘어 공급되었을 때에, 상기 액 저장부의 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 물받이식 세포 배양 장치의 전형적인 예를 도시하는 도면이다. 본 발명의 물받이식 세포 배양 장치는, 한 번 액 저장부에 배지를 저장하고, 일정 기간 후에 배지가 토출된다는 점에서, 사이펀식 세포 배양 장치와 기능이 공통된다. 함상체(3)는 액 저장부(31a)와 바닥부(31b)를 구비하고, 바닥부(31b)는, 액 저장부(31a)에 공급된 배지의 중량이 임계치를 넘어, 함상체(3)가 기울어지기 시작하고, 배지의 토출이 완료된 후에 원래의 수평 위치로 복원될 수 있는 정도의 무게를 갖는다. 액 저장부(31a)는, 폴리머 다공질막을 수용하는 역할을 갖지만, 함상체(3)의 경사에 의해 폴리머 다공질막이 탈락되지 않도록 액 저장부(31a) 내에, 액 유통 가능한 구멍, 펜스 또는 메쉬 등을 갖는 격판(31c)을 구비하여도 좋다. 또한, 배지 공급 수단으로부터 공급되는 배지가 폴리머 다공질막에 직접 맞닿지 않게 격판(31c)으로 구획되고, 폴리머 다공질막이 없는 타측에 배지를 공급할 수 있도록 배지 공급 수단의 배치를 적절하게 변경할 수 있다.
또한, 함상체(3)의 바닥 측에는, 바닥면 측의 일부에 회전축(33)과, 필요에 따라서 액 저장부(31a)가 빈 상태에서부터 배지량이 임계치에 달할 때까지, 바람직하게는 함상체(3)의 수평성을 유지하기 위한, 바닥부(31b)의 바닥면 측의 일부에 지지 수단(도시하지 않음)을 구비하여도 좋다. 회전축(33)은, 그 양끝이 베어링(34)에 지지되어, 함상체(3)의 전도(轉倒) 동작을 용이하게 한다. 함상체(3)의 전도 동작을 가능하게 하는 수단으로서는, 상기한 것에 한정되지 않고, 바닥면 측의 일부에 부착된 평판형의 전도축을 전도 지점으로 하여 전도 동작 가능하게 구성된 것이라도 좋다. 당업자라면, 사이펀식 세포 배양 장치를 구성하는 배지 공급 수단, 배지 회수 수단, 배지 배출 수단, 각종 라인, 펌프를 사이펀식 세포 배양 장치에 적절하게 사용할 수 있음을 승인할 수 있다.
본 발명의 실시형태에서 사용되는 폴리머 다공질막은, 예컨대, i) 절첩하여, ii) 롤형으로 감아, iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 및/또는 iv) 새끼줄형으로 연결하여, 평면 유로 상에 적용되어도 좋다. 또한, 본 발명의 실시형태에서 사용되는 폴리머 다공질막은, v) 2 이상이 적층되어, 평면 유로 상에 적용되어도 좋다. i)∼v)와 같이 형상을 가공함으로써, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 폴리머 다공질막을 넣을 수 있다.
본 발명의 실시양태에서 사용되는 폴리머 다공질막은, 모듈화된 폴리머 다공질막(이하, 「모듈화 폴리머 다공질막」이라고 한다.)이 사용되어도 좋다. 본 명세서에 있어서 「모듈화 폴리머 다공질막」이란, 케이싱에 수용된 폴리머 다공질막을 말한다. 본 명세서에 있어서 「모듈화 폴리머 다공질막」이라는 기재는, 단순히 「모듈」이라고 기재할 수 있으며, 서로 변경하더라도 같음을 의미한다.
본 발명의 실시양태에서 사용되는 모듈화 폴리머 다공질막이 구비하는 케이싱은, 2 이상의 세포 배지 유출입구를 가지고, 이 세포 배지 유출입구에 의해서 배지가 케이싱의 내외로 유출입한다. 이 케이싱의 세포 배지 유출입구의 직경은, 케이싱의 내부로 세포가 유입할 수 있게 상기 세포의 직경보다도 큰 것이 바람직하다. 또한, 세포 배지 유출입구의 직경이, 이 세포 배지 유출입구로부터 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 것이 바람직하다. 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 직경은, 케이싱에 수용된 폴리머 다공질막의 형상, 크기에 따라서 적절하게 선택 가능하다. 예컨대, 폴리머 다공질막이 끈 형상인 경우, 상기 폴리머 다공질막의 짧은 변의 폭보다 작고, 상기 폴리머 다공질막이 유출되지 않는 적절한 직경이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 세포 배지 유출입구의 수는, 세포 배지가 케이싱 내외로 공급 및/또는 배출되기 쉽게 가능한 한 많이 마련되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 5 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 바람직하게는 100 이상이다. 세포 배지 유출입구는, 케이싱의 일부 또는 전부가 메쉬형의 구조를 갖고 있어도 좋다. 또한, 상기 케이싱 자체가 메쉬형이라도 좋다. 본 발명에 있어서 메쉬 형상의 구조란, 예컨대 세로, 가로 및/또는 기울어진 격자형의 구조를 갖는 것이며, 각 개공도가 유체가 통과할 수 있을 정도로 세포 배지 유출입구를 형성하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시양태에서 사용되는 모듈화 폴리머 다공질막의 케이싱은, 예컨대 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 스테인리스강(「스테인리스」라고도 한다) 등의 금속 등을 들 수 있지만, 세포의 배양에 영향을 주지 않는 소재라면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 실시양태에서 사용되는 모듈화 폴리머 다공질막은,
(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,
(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,
(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는
(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,
상기 케이싱 내에 수용된 것이며, 상기 모듈화 폴리머 다공질막을 평면 유로에 적용하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 「케이싱 내에 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어 수용되어 있다」란, 상호 독립된 2 이상의 폴리머 다공성막이 케이싱으로 둘러싸인 일정 공간 내에 집약되어 수용되어 있는 상태를 가리킨다. 본 발명에 있어서, 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막은, 상기 폴리머 다공질막의 적어도 한 곳과 상기 케이싱 내의 적어도 한 곳을 임의의 방법에 의해서 고정하여, 상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태로 고정된 것이라도 좋다. 또한, 2 이상의 독립된 폴리머 다공질막은 소편이라도 좋다. 소편의 형상은, 예컨대 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈 형상 등, 임의의 형태를 취할 수 있지만, 바람직하게는 대략 정방형이 바람직하다. 본 발명에 있어서 소편의 크기는 임의의 크기를 취할 수 있는데, 대략 정방형인 경우, 길이는 임의의 길이라도 좋지만, 폭은 80 mm 이하가 좋고, 바람직하게는 50 mm 이하가 좋고, 보다 바람직하게는 30 mm 이하가 좋으며, 더욱 보다 바람직하게는 20 mm 이하가 좋고, 10 mm 이하라도 좋다. 또한, 폴리머 다공성막의 소편이 대략 정방형인 경우, 그 한 변의 길이는, 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 되도록, 케이싱의 내벽을 따라서, 또는 내벽의 한 변의 길이보다 짧게(예컨대 0.1 mm∼1 mm 정도 짧게) 형성된 것이라도 좋다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 또한, 끈 형상의 폴리머 다공질막의 경우, 후술하는 것과 같이, (ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어, (iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는 (iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어, 상기 케이싱에 수용되어도 좋다.
본 명세서에 있어서 「절첩된 폴리머 다공질막」이란, 상기 케이싱 내에서 절첩되어 있음으로써, 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공질막이다. 본 명세서에 있어서 「절첩된」이란, 폴리머 다공막에 접음선이 생긴 상태라도 좋고, 접음선이 생기지 않은 상태라도 좋다.
본 명세서에 있어서 「롤형으로 감긴 폴리머 다공질막」이란, 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공성막을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 새끼줄형으로 엮은 폴리머 다공질막이란, 예컨대 단책형의 복수의 폴리머 다공질막을 임의의 방법에 의해서 새끼줄형으로 엮어 넣어, 폴리머 다공질막끼리의 마찰력에 의해서 상호 움직이지 않는 상태의 폴리머 다공질막을 말한다. (i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약된 폴리머 다공질막, (ii) 절첩된 폴리머 다공질막, (iii) 롤형으로 감긴 폴리머 다공질막 및 (iv) 새끼줄형으로 연결된 폴리머 다공질막이 조합되어 케이싱 내에 수용되어 있어도 좋다.
본 명세서에 있어서 「상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태」란, 상기 모듈화 폴리머 다공질막을 세포 배양 배지 중에서 배양하는 경우에, 상기 폴리머 다공질막이 계속적으로 형태 변화하지 않는 상태가 되도록 케이싱 내에 수용되어 있는 상태를 말한다. 바꿔 말하면, 상기 폴리머 다공질막 자체가 유체에 의해서 계속적으로 물결치는 움직임을 하지 않도록 억제된 상태이다. 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태를 유지하기 때문에, 폴리머 다공질막 내에서 생육되고 있는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되어, 세포가 사멸되는 일 없이 안정적으로 세포 배양이 가능하게 된다.
(3) 건열 멸균형 사이펀식 세포 배양 장치
본 발명의 일 양태로서, 상기 (1)에 있어서 정의한 사이펀식 세포 배양 장치를 완전히 전체적으로 건열 멸균 가능한 세포 배양 장치를 제공할 수 있다. 본 발명에 의하면, 유리제 내열 사이펀 리액터를 채용하고, 그 리액터 내에 수용되는 모듈(도 3(b))이며, 스테인리스강 메쉬에 의해서 제작된, 그 내부에 폴리이미드 다공질막을 갖는 메탈 모듈을 집어 넣은 건열 멸균형 사이펀식 세포 배양 장치가 제공된다(도 3(a)). 유리제 내열 사이펀 리액터로서는, 사이펀의 원리에 의해 배지가 간헐적으로 토출되는 기능을 갖는 것이라면 한정되지 않지만, 예컨대 속슬렛 추출기를 베이스로 한 것이라도 좋다.
3. 세포 배양 장치를 사용한 세포 배양 방법
<세포를 폴리머 다공질막에 적용하는 공정>
본 발명에서 사용되는 세포를 폴리머 다공질막에 적용하는 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재한 공정, 혹은 세포를 막 형상의 담체에 적용하기에 알맞은 임의의 수법을 채용할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 있어서 세포의 폴리머 다공질막에의 적용은 예컨대 다음과 같은 양태를 포함한다.
(A) 세포를 상기 폴리머 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리머 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 싣고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리머 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여 세포 현탁액을 상기 막에 빨아들이게 하고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는 공정을 포함하는 양태; 및
(C) 상기 폴리머 다공질막의 한 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리머 다공질막에 세포 현탁액을 장전하고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는 공정을 포함하는 양태.
(A)의 양태는, 폴리머 다공질막의 표면에 세포, 세포 덩어리를 직접 파종하는 것을 포함한다. 혹은, 폴리머 다공질막을 세포 현탁액 중에 넣어, 막의 표면으로부터 세포 배양액을 침윤시키는 양태도 포함한다.
폴리머 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리머 다공질막에 접착하여, 다공의 내부로 들어간다. 바람직하게는, 특히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않더라도 세포는 폴리머 다공질막에 접착한다. 폴리머 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라서 다양한 다른 형태를 취할 수 있다.
(B)의 양태에 있어서, 폴리머 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 싣는다. 폴리머 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리머 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여 세포 현탁액을 상기 막에 빨아들이게 함으로써, 세포 현탁액이 막 중에 침투한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것은 폴리머 다공질막의 각 표면 형상 등에 유래하는 성질에 의한 것이라고 생각된다. 본 양태에 의해, 막의 세포 현탁액이 장전된 부위에 세포가 빨아들여져 파종된다.
혹은 (C)의 양태와 같이, 상기 폴리머 다공질막의 한 면 또는 양면의 부분 또는 전체를, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고 나서, 습윤한 폴리머 다공질막에 세포 현탁액을 장전하여도 좋다. 이 경우, 세포 현탁액의 통과 속도는 크게 향상된다.
예컨대, 막의 비산 방지를 주된 목적으로 하여 막 극히 일부를 습윤시키는 방법(이후, 이것을 「1점웨트법」이라고 기재한다)을 이용할 수 있다. 1점웨트법은 실질상은 막을 습윤시키지 않는 드라이법((B)의 양태)에 거의 가까운 것이다. 단, 습윤시킨 작은 부분에 관해서는, 세포액의 막 투과가 신속하게 된다고 생각된다. 또한, 폴리머 다공질막의 한 면 또는 양면 전체를 충분히 습윤시킨 것(이후, 이것을 「웨트막」이라고 기재한다)에 세포 현탁액을 장전하는 방법도 이용할 수 있는 (이후, 이것을 「웨트막법」이라고 기재한다). 이 경우, 폴리머 다공질막 전체에 있어서 세포 현탁액의 통과 속도가 크게 향상된다.
(B) 및 (C)의 양태에 있어서, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 멈추게 하고, 수분은 유출시킨다. 이에 따라 세포 현탁액 중의 세포의 농도를 농축한다, 세포 이외의 불필요한 성분을 수분과 함께 유출시킨다, 등의 처리도 가능하게 된다.
(A)의 양태를 「자연 파종」, (B) 및 (C)의 양태를 「흡입 파종」이라고 부르는 경우가 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리머 다공질막에는 생세포가 선택적으로 머물게 된다. 따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 생세포가 상기 폴리머 다공질막 내에 머물고, 사세포는 우선적으로 수분과 함께 유출된다.
양태(C)에 있어서 이용하는 멸균된 액체는 특별히 한정되지 않지만, 멸균된 완충액 혹은 멸균수이다. 완충액은 예컨대 (+) 및 (-) Dulbecco's PBS , (+) 및 (-) Hank's Balanced Salt Solution 등이다. 완충액의 예를 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure 112019007858507-pct00003
더욱이, 본 발명의 방법에 있어서 세포의 폴리머 다공질막에의 적용은, 부유 상태에 있는 접착성 세포를 폴리머 다공질막과 현탁적으로 공존시킴으로써 세포를 막에 부착시키는 양태(휘감기)도 포함한다. 예컨대, 본 발명의 방법에 있어서 세포를 폴리머 다공질막에 적용하기 위해서, 세포 배양 용기 중에 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리머 다공질막을 넣더라도 좋다. 세포 배양 배지가 액체인 경우, 폴리머 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유된 상태이다. 폴리머 다공질막의 성질 때문에 세포는 폴리머 다공질막에 접착할 수 있다. 따라서, 태생적으로 부유 배양에 알맞지 않는 세포라도, 폴리머 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유된 상태로 배양하는 것이 가능하다. 바람직하게는 세포는 폴리머 다공질막에 접착한다. 「자발적으로 접착한다」란, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않더라도 세포가 폴리머 다공질막의 표면 또는 내부에 머무는 것을 의미한다.
상술한 세포의 폴리머 다공질막에의 적용은, 2 종류 또는 그보다 많은 방법을 조합하여 이용하어도 좋다. 예컨대 양태 (A)∼(C) 중 2개 이상의 방법을 조합하여 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여도 좋다. 세포를 담지시킨 폴리머 다공질막을 상술한 세포 배양 장치에 있어서의 평면 유로에 적용하여 배양할 수 있다.
그 밖에, 미리 폴리머 다공질막이 설치된 평면 유로에, 현탁된 세포가 포함되는 배지를, 세포 공급 수단으로부터 적하하여 파종하여도 좋다.
본 명세서에 있어서 「현탁된 세포」란, 예컨대 트립신 등의 단백질 분해 효소에 의해서 접착 세포를 강제적으로 부유시켜 배지 중에 현탁하여 얻어진 세포나, 공지된 순화 공정에 의해서 배지 중에 부유 배양 가능하게 된 접착 세포 등을 포함하고 있다.
본 발명에 이용할 수 있는 세포의 종류는, 예컨대 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택된다. 동물 세포는, 척추동물 문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추동물(척추동물 문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 대별된다. 본 명세서에 있어서의 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 척추동물 문에 속하는 동물유래의 세포를 의미한다. 척추동물 문은 무악상강과 악구상강을 포함하고, 악구상강은 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로 포유동물이라고 일컬어지는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유동물은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.
본 발명에 이용할 수 있는 동물 세포의 종류는 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 다능성 줄기세포, 조직 줄기세포, 체세포 및 생식세포로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 명세서에 있어서 「다능성 줄기세포」란, 온갖 조직의 세포로 분화할 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기세포는, 배성 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포), 배성 생식 줄기세포(EG 세포), 생식 줄기세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는 ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없다는 등의 이유에 의해 특히 바람직하다. 다능성 줄기세포로서는 공지된 임의의 것을 사용할 수 있는데, 예컨대 국제공개 제2009/123349호(PCT/JP2009/057041)에 기재한 다능성 줄기세포를 사용할 수 있다.
「조직 줄기세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정 조직에 한정되어 있지만, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기세포는 혈구의 근간이 되고, 신경 줄기세포는 신경 세포로 분화된다. 이 밖에도 간장을 만드는 간 줄기세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기세포 등 여러 가지 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기세포는 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 또는 조혈 줄기세포에서 선택된다.
「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대로는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는 간세포, 췌세포, 근세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 연골세포, 지방세포, 피부세포, 선유아세포, 췌세포, 신세포, 폐세포 또는 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구, 매크로파지 혹은 거핵구의 혈구세포로부터 선택된다.
「생식세포」는 생식에 있어서 유전 정보를 차세대로 전하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.
세포는 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택하여도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암이며, 연부육종, 악성골종양 등을 포함한다. 육종 세포는 육종에 유래하는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되어, 일정한 안정된 성질을 갖기에 이르러, 반영구적인 계대 배양이 가능하게 된 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니즈햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁경부암 유래), Vero 세포(녹색원숭이 신장 상피세포 유래), MDCK 세포(개 신장 뇨세관 상피세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래 세포주), BHK 세포(신생아 햄스터 신장 세포), NIH3T3 세포(마우스 태아 선유아세포 유래) 등 인간을 포함하는 다양한 생물종의 다양한 조직에 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질 전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다.
본 명세서에 있어서 「접착 세포」란, 일반적으로 증식을 위해서 적절한 표면에 자신을 접착시킬 필요가 있는 세포이며, 부착 세포 또는 부착 의존성 세포라고도 일컬어진다. 본 발명의 몇 개의 실시형태에서는 사용하는 세포는 접착 세포이다. 본 발명에 이용되는 세포는 접착 세포이며, 보다 바람직하게는 배양액 중에 현탁한 상태에서도 배양 가능한 세포이다. 현탁 배양 가능한 접착 세포란, 공지된 방법에 의해서, 접착 세포를 현탁 배양에 알맞은 상태로 순화시킴으로써 얻을 수 있으며, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, Vero 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있다. 여기에 예로 들지 않는 것이라도, 본 발명에 이용되는 세포는, 접착 세포이며 순화에 의해서 현탁 배양 가능한 세포라면 특별히 한정되지 않는다.
폴리머 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도 1, 도 2 및 도 3(a)에 도시한다. 이들 도면은 이해를 돕기 위한 도면이며, 각 요소는 실제 치수가 아니다. 본 발명의 세포 배양 방법에서는, 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여 배양함으로써, 폴리머 다공질막이 갖는 내부의 다면적인 연결 다공 부분이나 표면에 대량의 세포가 생육하기 때문에, 대량의 세포를 간편하게 배양할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 세포 배양 방법에서는, 세포 배양에 이용하는 배지의 양을 종래 의 방법보다도 대폭 줄이면서 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 예컨대, 폴리머 다공질막의 일부분 또는 전체가 세포 배양 배지의 액상과 접촉하지 않은 상태라도 대량의 세포를 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화에 대하여 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적을 현저히 줄이는 것도 가능하게 된다.
본 명세서에 있어서, 세포를 포함하지 않는 폴리머 다공질막이 그 내부 간극의 체적도 포함하여 공간 중에 차지하는 체적을 「외관상 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 6 참조). 그리고, 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리머 다공질막의 표면 및 내부에 세포가 담지된 상태에 있어서, 폴리머 다공질막, 세포 및 폴리머 다공질막 내부에 침윤한 배지가 전체적으로 공간 중에 차지하는 체적을 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 6 참조). 막 두께 25 ㎛의 폴리머 다공질막의 경우, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적은, 외관상 폴리머 다공질막 체적보다 최대로 50% 정도 큰 값이 된다. 본 발명의 방법에서는, 하나의 세포 배양 용기 중에 복수의 폴리머 다공질막을 수용하여 배양할 수 있는데, 그 경우, 세포를 담지한 복수의 폴리머 다공질막 각각에 관한 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화를, 단순히 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화」라고 기재하는 경우가 있다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 10000배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있게 된다. 또한, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 1000배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 더욱이, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 100배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 그리고, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 10배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다.
즉, 본 발명에 의하면, 세포 배양하는 공간(용기)을 종래의 이차원 배양을 행하는 세포 배양 장치에 비해서 극한까지 소형화할 수 있게 된다. 또한, 배양하는 세포의 수를 늘리고 싶은 경우는, 적층하는 폴리머 다공질막의 매수를 늘리는 등의 간편한 조작에 의해 유연하게 세포 배양하는 체적을 늘리는 것이 가능하게 된다. 본 발명에 이용되는 폴리머 다공질막을 구비한 세포 배양 장치라면, 세포를 배양하는 공간(용기)와 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)을 분리하는 것이 가능하게 되어, 배양하는 세포수에 따라서 필요하게 되는 양의 세포 배양 배지를 준비하는 것이 가능하게 된다. 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)은, 목적에 따라서 대형화 또는 소형화하여도 좋으며, 혹은 대체 가능한 용기라도 좋고, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 세포 배양 방법에 있어서, 예컨대 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수가, 세포가 전부 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산되어 있는 것으로 하여, 배지 1 밀리리터당 1.0×105개 이상, 1.0×106개 이상, 2.0×106개 이상, 5.0×106개 이상, 1.0×107개 이상, 2.0×107개 이상, 5.0×107개 이상, 1.0×108개 이상, 2.0×108개 이상, 5.0×108개 이상, 1.0×109개 이상, 2.0×109개 이상 또는 5.0×109개 이상이 될 때까지 배양하는 것을 말한다.
또한, 배양 중 또는 배양 후의 세포수를 계측하는 방법으로서는 다양한 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수를, 세포가 전부 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산되어 있는 것으로 하여 계측하는 방법으로서는, 공지된 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 예컨대 CCK8을 이용한 세포수 계측법을 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는 Cell Countinig Kit8; 도진카가쿠겐큐쇼 제조 용액 시약(이하 「CCK8」이라고 기재한다.)을 이용하여, 폴리머 다공질막을 이용하지 않는 통상의 배양에 있어서의 세포수를 계측하여, 흡광도와 실제의 세포수의 상관 계수를 구한다. 그 후, 세포를 적용하여 배양한 폴리머 다공질막을, CCK8을 포함하는 배지로 옮겨, 1∼3시간 인큐베이터 내에서 보존하고, 상청을 뽑아내어 480 nm의 파장으로 흡광도를 측정하여, 앞서 구한 상관 계수로부터 세포수를 계산한다.
또한 다른 관점에서는, 세포의 대량 배양이란, 예컨대 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 폴리머 다공질막 1 평방센티미터당 포함되는 세포수가 1.0×105개 이상, 2.0×105개 이상, 1.0×106개 이상, 2.0×106개 이상, 5.0×106개 이상, 1.0×107개 이상, 2.0×107개 이상, 5.0×107개 이상, 1.0×108개 이상, 2.0×108개 이상 또는 5.0×108개 이상이 될 때까지 배양하는 것을 말한다. 폴리머 다공질막 1 평방센티미터당 포함되는 세포수는, 셀 카운터 등의 공지된 방법을 이용하여 적절하게 계측할 수 있다.
[ 실시예 ]
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 또한 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
이하의 실시예에서 사용된 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분인 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA)과 디아민 성분인 4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA)로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과, 착색 전구체인 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 조제되었다. 얻어진 폴리이미드 다공질막은, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 이 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이며, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 6 ㎛이고, 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 46 ㎛이고, 막 두께가 25 ㎛이며, 공공률이 73%였다.
(실시예 1)
사이펀식 리액터에 의한 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양법(그의 1)
항인간 IL-8 항체 산생 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 3.9×106이 될 때까지 배양을 계속했다. 10 cm 직경 샤알레 1장에 상기 부유배양액을 각각 12 ml 주입한 후, 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투(케이싱)를 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 12개를 동 샤알레에 가한다. 모듈을 세포 현탁액으로 습윤한 후, CO2 인큐베이터 내에서 밤새 방치했다.
다음날 모듈을 빼내어, 도 1에 도시하는 사이펀식 리액터의 스테이지 부분에 모듈 10개를 설치하고, 액 저장부에는 350 ml의 배지를(FBS 2%를 포함하는 IMDM) 저류하여 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다. 2일 후에 배양을 종료했다. 세포 밀도 5.5×104 세포/㎠에서 총 세포수 1.2×107개의 세포가 관찰되었다.
(실시예 2)
사이펀식 리액터에 의한 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양법(그의 2)
항인간 IL-8 항체 산생 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 9.9×106이 될 때까지 배양을 계속했다. 진탕 배양용 산소 투과 가방에 모듈10개를 넣어, CO2 인큐베이터 내에서 밤새 진탕 배양을 행했다. 다음날 진탕 가방으로부터 모듈을 빼내어, 실시예 1과 같은 조건으로 사이펀식 리액터에 의한 세포 배양을 행했다. 액 저장부에는, 350 ml의 배지(코진바이오 제조 KBM270)를 저류하여 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다. 4일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 1.0×105 세포/㎠에서 총 세포수 2.1×107개의 세포가 관찰되었다.
(실시예 3)
메탈 모듈 및 유리제 내열 사이펀 리액터
폴리이미드 다공질막이 갖는 내열성을 최대한으로 활용하여, 간단한 전체 건열 멸균으로 멸균 작업을 완료하기 위해 스테인리스강 메쉬 제조의 케이싱, 속깔개 및 폴리이미드 다공질막으로 구성되는 메탈 모듈을 제작했다(도 3(b)의 일 양태). 구체적으로는 1 cm×1 cm의 폴리이미드 다공질막 및 폴리이미드 다공질막과 동면적의 스테인리스강 메쉬(「속깔개」라고 한다. 도시하지 않는다)를 적층한 것(폴리이미드 다공질 3장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 4장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 3장의 순서로 적층)을, 스테인리스 메쉬 제조의 케이싱으로 밀봉하여, 메탈 모듈을 제작했다. 작업은 개방 공간 하에서 비멸균적으로 실시했다.
이 메탈 모듈을 운용하기 위한 유리제 내열 사이펀 리액터는, 속슬렛 추출기를 베이스로 디자인하고, 내열성을 갖게 하기 위해서 유리와 금속만으로 제작했다(도 3(a)). 메탈 모듈을 넣은 유리제 내열 사이펀 리액터를 도시한다. 이 리액터 내부에 스테인리스 모듈 30개를 비멸균적으로 적층시켜 장치를 조립했다. 그 후, 리액터 부분을 은박지로 싸서 섭씨 190도에서 80분간 건열 멸균하고, 방냉했다.
이어서, 내열형 사이펀 리액터에 의한 인간 피부 선유아세포의 간만(干滿) 배양을 실시했다. 도 3(a)에 도시한 것과 같이, 리액터 전체를 멸균적으로 조립하여 CO2 인큐베이터 내에 장치 전체를 설치했다. 샤알레로 배양하고 있었던 인간 피부 선유아세포를 트립신 처리로 박리시켜, 세포 현탁액 70 ml를 준비했다. 셀 카운트했더니, 1 ml당 생세포수는 1.4×105였다. 현탁액 70 ml를 메탈 모듈을 설치한 속슬렛관 내부에 주입하여 30분간 정치시켰다. 정치 후, 내부액을 멸균적으로 배출하고, 배출된 액을 재차 사이펀 리액터 내부에 주입한다. 이 작업을 3회 반복하고, 그 후, 액부를 샘플링하여 세포수를 측정한 바, 세포수는 8.0×103이었다. 94%의 세포가 이 정치 조건에서의 자연 접촉으로 흡착되었다고 말할 수 있다. 이어서, 펌프를 이용하여 연속적으로 배지(코진바이오가부시가이샤 제조_KBM Fibro Assist를 사용)를 공급함으로써 사이펀 기능이 발현되어, 메탈 모듈 내부에 안정적이면서 또한 순환적으로 배지와 공기(산소)가 공급된다. 3일에 1회 배지 교환을 실시하면서 배양을 계속했다. 안정적이면서 또한 대량의 피브로넥틴이 산생되었음을 다카라바이오 제조 인간 피브로넥틴 측정용 Elisa-kit로 측정하여, 고효율의 물질 산생이 간편하면서 또한 계속적으로 달성되고 있음을 확인했다(도 5).
도면으로부터 드러나는 것과 같이, 단위 체적당 1일의 물질 산생량이 우수한데다, 통상의 샤알레 배양과는 달리 스케일업이 매우 용이하기 때문에, 컴팩트한 장치로 생산성을 향상시킬 수 있다. 인간 초대 세포를 물질 산생의 기반으로 하여 연속 산생계를 제작하고, 산소 공급 등의 수단을 갖는 복잡한 장치를 사용하지 않고서 희소 물질이나 유용 물질을 제조하는 방법을 보였다.
1: 사이펀식 세포 배양 장치
11: 액 저장부
12: 역 U자 관
13: 배지 회수 수단
14: 배지 공급 수단
15: 배지 배출 수단
16: 액면
2: 세포 배양부 지지체
21a, 21b, 21c, 21d, 21e, 21f: 세포 배양부
22: 손잡이
23: 지주
3: 물받이식 세포 배양 장치
31: 함상체
31a: 액 저장부
31b: 바닥부
31c: 격판
32: 폴리머 다공질막
33: 회전축
34: 베어링
35: 배지 회수 수단
36: 배지 공급 수단

Claims (15)

  1. 폴리머 다공질막과,
    상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와,
    상기 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와,
    상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과,
    상기 액 저장부의 바닥부에서 연통된 역 U자 관과,
    상기 역 U자 관의 타단의 하부에 설치된 배지 회수 수단과,
    상기 배지 회수 수단에 배치된 배지 배출 수단을 구비하고,
    여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며,
    여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지의 액면이 상기 역 U자 관의 정상부에 달했을 때, 사이펀의 원리에 의해 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  2. 폴리머 다공질막과,
    일단을 액 저장부, 타단을 바닥부로 하는 함상체(函狀體)로서, 상기 액 저장부에 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부를 구비한 함상체와,
    상기 함상체의 바닥면 측의 일부에 설치된 회전축과,
    상기 회전축을 지지하는 베어링과,
    상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과,
    상기 액 저장부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고,
    여기서 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A와 표면층 B 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽, 그리고 이 격벽과 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며,
    여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지가, 상기 함상체의 바닥부의 중량을 넘어 공급되었을 때에, 상기 액 저장부의 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 회수 수단과 일단부에서 연통된 배지 배출 라인과,
    상기 배지와 일단부에서 연통된 배지 공급 라인
    을 추가로 구비하고,
    여기서, 상기 배지 배출 라인의 타단부가 상기 배지 공급 라인의 타단부와 펌프를 통해 연통되어 있어, 배지가 순환할 수 있는 것인 세포 배양 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 공급 수단이 배지 배분 수단이고, 여기서, 상기 배지 배분 수단이 미스트 공급 노즐인 세포 배양 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이,
    i) 절첩되어,
    ii) 롤형으로 감겨,
    iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜,
    iv) 새끼줄형으로 연결되어, 및/또는
    v) 2 이상이 적층되어,
    평면 유로에 설치되어 있는 것인 세포 배양 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이, 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막이며,
    여기서, 상기 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막은,
    (i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,
    (ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,
    (iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는
    (iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어
    상기 케이싱 내에 수용된 것이고,
    여기서, 상기 케이싱을 구비한 모듈화 폴리머 다공질막이 평면 유로에 설치되어 있는 것인 세포 배양 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 것인 세포 배양 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 세포 배양 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 세포 배양 장치.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막의 평균 막 두께가 5∼500 ㎛인 세포 배양 장치.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 세포 배양 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 세포 배양 장치.
  13. 제11항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 세포 배양 장치.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 폴리에테르술폰 다공질막인 세포 배양 장치.
  15. 제1항 또는 제2항에 기재된 세포 배양 장치를 사용하는 세포 배양 방법.
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