WO2018021358A1 - 細胞の調製方法、細胞培養装置及びキット - Google Patents
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Definitions
- a cell culturing method has been reported which includes culturing cells by applying them to a polyimide porous membrane (Patent Document 1).
- Polyethersulfone as a raw material for the polyethersulfone porous membrane may be synthesized by a method known to those skilled in the art. Method of polycondensation reaction of divalent phenol, alkali metal compound and dihalogenodiphenyl compound in organic polar solvent, Method of previously synthesizing alkali metal disalt of dihydric phenol and polycondensation reaction in dihalogenodiphenyl compound and organic polar solvent Can be manufactured by etc.
- the organic polar solvent can be selected from solvents capable of dissolving polyethersulfone, and examples thereof include N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like. It is done. N-methyl-2-pyrrolidone is preferred from the viewpoint of good formation of macrovoids.
- the solidified membrane having pores obtained above is heat-treated to coarsen the pores, particularly the pores of the surface layer (that is, increase the pore size), and thus the polyethersulfone porous membrane is obtained.
- the heat treatment is performed on the solidified film having pores in a temperature range of 80 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 30 ° C./min or higher, further preferably 40 ° C./min or higher, more preferably 50 ° C./min.
- the temperature is increased at a temperature increase rate of 100 ° C. or higher.
- the temperature increase rate is advantageous in that the pores are well coarsened.
- the temperature increase rate is preferably 300 ° C./min or less, more preferably 270 ° C./min or less, from the viewpoint of stably forming a macrovoid having a desired shape.
- the preparation method of the cell of this invention includes applying a cell to a polyether sulfone porous membrane, and culture
- the method of the present invention comprises applying cells to a polyethersulfone porous membrane and culturing the cells on or inside the polyethersulfone porous membrane.
- the cells in the cell suspension are retained in the membrane and the water is allowed to flow out.
- processing such as concentrating the concentration of cells in the cell suspension or allowing unnecessary components other than cells to flow out together with moisture.
- the sterilized liquid used in the embodiment (C) is not particularly limited, but is a sterilized buffer or sterilized water.
- the buffer solution include (+) and (-) Dulbecco's PBS, (+) and (-) Hank's Balanced Salt Solution, and the like. Examples of buffer solutions are shown in Table 1 below.
- cultured cells can be classified into adhesion culture cells and suspension culture cells depending on the form of cell culture.
- Adherent culture cells are cultured cells that adhere to a culture vessel and proliferate, and the medium is changed during passage.
- Floating culture cells are cultured cells that proliferate in a floating state in a medium. In general, dilution culture is performed without replacing the medium during passage.
- Suspension culture can be cultured in a floating state, that is, in a liquid state, so that it can be cultured in large quantities. Compared with adherent cells that grow only on the surface of the culture vessel, it is a three-dimensional culture. There is an advantage that the number of cells that can be cultured is large.
- the bottom area of the container is the upper limit of the cell culture area, but in the cell culture using the polyethersulfone porous membrane of the present invention, the large surface area of the previously introduced polyethersulfone porous membrane All of these are areas where cells can be cultured. Since the polyethersulfone porous membrane allows the cell culture solution to pass therethrough, for example, nutrients, oxygen and the like can be supplied into the folded membrane.
- the cells are selected from the group consisting of animal cells, insect cells, plant cells, yeasts and bacteria.
- Animal cells are roughly classified into cells derived from animals belonging to the vertebrate phylum and cells derived from invertebrates (animals other than animals belonging to the vertebrate phylum).
- the origin of the animal cell is not particularly limited.
- Vertebrates include the maxilla and maxilla, and the maxilla includes mammals, birds, amphibians, reptiles, and the like.
- it is a cell derived from an animal belonging to the mammal class generally called a mammal. Mammals are not particularly limited, but preferably include mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, goats and the like.
- somatic cells refers to cells other than germ cells among the cells constituting multicellular organisms. In sexual reproduction, it is not passed on to the next generation.
- the somatic cells are hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, adipocytes, skin cells, fibroblasts, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, or , Lymphocytes, erythrocytes, leukocytes, monocytes, macrophages or megakaryocyte blood cells.
- the shape and scale of the system used for culturing are not particularly limited, and it can be appropriately used from petri dishes for cell culture, flasks, plastic bags, test tubes to large tanks.
- a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
- the polyethersulfone porous membrane in the present invention it has become possible to perform culture in a state similar to suspension culture using a suspension culture apparatus even for cells that were not inherently capable of suspension culture.
- a spinner flask manufactured by Corning, rotary culture, or the like can be used.
- hollow fiber culture such as FiberCell (registered trademark) System manufactured by VERITAS can be used as an environment in which similar functions can be realized.
- the culture unit may be a culture unit that does not include an air supply port, an air discharge port, and an oxygen exchange membrane, and further includes an air supply port and an air discharge port, or an oxygen exchange membrane. It may be a culture unit. Even if the culture unit does not include an air supply port, an air discharge port, and an oxygen exchange membrane, oxygen and the like necessary for cell culture are sufficiently supplied to the cells through the medium. Furthermore, in the cell culture apparatus, the culture unit further includes a medium discharge line, wherein the first end of the medium discharge line is connected to the medium storage container, and the second end of the medium discharge line is the culture unit. The culture medium may be circulated between the culture medium supply unit and the culture unit by communicating with the culture unit via the culture medium outlet.
- the polyethersulfone solution prepared above is uniformly cast to a thickness of about 100 to 300 ⁇ m on a stainless steel 20 cm square substrate whose surface is mirror-polished. Applied. Thereafter, the substrate was left in the atmosphere at a temperature of 23 ° C. and a humidity of 40% for 90 seconds, and then the entire substrate was put into a mixed coagulation bath which was an aqueous solution having an NMP ratio of 40% by mass. After the addition, the mixture was allowed to stand for 10 minutes to deposit a polyethersulfone film on the substrate.
- the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A of the PES porous membrane 1 was 14 ⁇ m, the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B was 27 ⁇ m, and the porosity was 58%.
- Example 4 Induction and calcification induction of human mesenchymal stem cells cultured on a PES porous membrane
- the PES porous membrane on which the cells were engrafted was differentiated into osteoblasts. It was transferred to an induction medium (PromoCell, C-28013) and cultured for 21 days. Thereafter, calcification was further induced in an osteoblast calcification medium (PromoCell, C-27020) for 21 days.
- the cells were fixed with methanol at a low temperature and stained with a calcification staining kit (Cosmo Bio). Observation with an optical microscope was performed to observe the calcification site.
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Abstract
Description
[1]
細胞をポリエーテルスルホン多孔質膜に適用し、培養することを含む、細胞の調製方法。
[2]
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリエーテルスルホン多孔質膜であり、
ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、[1]に記載の方法。
[3]
細胞を前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の表面に播種する工程を含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せ、
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[5]
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリエーテルスルホン多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[6]
生細胞が前記ポリエーテルスルホン多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、[5]に記載の方法。
[7]
前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]
細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び1又はそれ以上の前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリエーテルスルホン多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、[1]~[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9]
2以上の前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、[8]に記載の方法。
[10]
細胞が、前記ポリエーテルスルホン多孔質膜に自発的に接着する、[8]又は[9]に記載の方法。
[11]
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、[1]~[7]のいずれか1つに記載の方法。
[12]
細胞が、前記ポリエーテルスルホン多孔質膜に自発的に接着する、[11]に記載の方法。
[13]
2以上のポリエーテルスルホン多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[14]
[3]~[13]のいずれか1つに記載の方法の2種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、[1]又は[2]に記載の方法。
[15]
細胞がポリエーテルスルホン多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[16]
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、[1]~[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17]
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、[16]に記載の方法。
[18]
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、[16]に記載の方法。
[19]
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、[1]~[15]のいずれか1つに記載の方法。
[20]
細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、[1]~[15]のいずれか1つに記載の方法。
[21]
ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、[1]~[20]のいずれか1つに記載の細胞の調製方法に使用するための細胞培養装置。
[22]
2以上のポリエーテルスルホン多孔質膜が、上下又は左右に積層している、[21]に記載の細胞培養装置。
[23]
ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、[1]~[20]のいずれか1つに記載の細胞の調製方法に使用するためのキット。
本明細書において、「ポリエーテルスルホン多孔質膜」(以下で「PES多孔質膜」とも呼ぶ)とは、その表面に複数の孔を有する膜のことであり、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。
ポリエーテルスルホン多孔質膜の原料となるポリエーテルスルホンは、当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
本発明で使用される三層構造のポリエーテルスルホン多孔質膜は、例えば以下の工程:
(1)対数粘度0.5~1.0のポリエーテルスルホンの0.3質量%~60質量%と有機極性溶媒40質量%~99.7質量%とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
(2)前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ポリエーテルスルホン多孔質膜を得る工程
を含む、方法で製造され得る。
まず、ポリエーテルスルホン溶液をフィルム状に流延する。ポリエーテルスルホン溶液は、好ましくは、ポリエーテルスルホン0.3~60質量%及び有機極性溶媒40~99.7質量%、より好ましくは、ポリエーテルスルホン1.0~30質量%及び有機極性溶媒70~99質量%、更に好ましくは、ポリエーテルスルホン5~15質量%及び有機極性溶媒85~95質量%とを含む。
次に、流延物を、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリエーテルスルホンを析出させて多孔質化を行うことで、空孔を有する凝固膜を作製する。得られた空孔を有する凝固膜は、必要に応じて洗浄及び/又は乾燥を行う。
本発明の細胞の調製方法は、細胞をポリエーテルスルホン多孔質膜に適用し、培養することを含む。本発明の方法は、ポリエーテルスルホン多孔質膜に細胞を適用し、ポリエーテルスルホン多孔質膜の表面又は内部で細胞を培養することを含むことを特徴とするものである。
細胞のポリエーテルスルホン多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリエーテルスルホン多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(A)細胞を前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様;
(B)前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリエーテルスルホン多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。
本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリエーテルスルホン多孔質膜に細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリエーテルスルホン多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
本発明はまた、ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、本発明の調製方法に使用するための細胞培養装置に関する。本発明の細胞培養装置において、ポリエーテルスルホン多孔質膜は固定されて用いられても良く、あるいは細胞培養培地中に浮遊して用いられても良い。細胞培養装置において、2以上のポリエーテルスルホン多孔質膜が、上下又は左右に積層してもよい。
本発明はさらに、ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、細胞の調製方法に使用するためのキットに関する。
ポリエーテルスルホン多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞数の経時変化
(1)ポリエーテルスルホン多孔質膜1及び2の調製
500mlのセパラブルフラスコに、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)を溶媒として用いて、ポリエーテルスルホン(スミカエクセル7600P:住友化学(株)製、対数粘度:0.701)をポリマー濃度が10質量%になる量を測り取って投入した。その後、撹拌羽、窒素導入管、排気管を取り付けたセパラブルカバーで蓋をし、オイルバスを用いて50℃に保ちながら24時間撹拌を行い、粘稠で透明な液体であるポリエーテルスルホン溶液を得た。
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に細胞培養培地0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のPES多孔質膜1及び2を、メッシュ構造のA面を上にして容器に据え、1枚のPES多孔質膜あたり4×104個のヒト皮膚線維芽細胞を播種した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回定期的に培地を交換した。培養開始後、3日、7日、15日、22日後にCell Counting Kit-8(同仁化学研究所製、以下で「CCK8」と呼ぶ)を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図1に示す。PES多孔質膜上で安定した細胞の生育が観測された。
PES多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の長期培養
ヒト間葉系幹細胞をタイプIコラーゲンコートディッシュ(IWAKI製、口内径6cm)に播種して培養後、トリプシン処理により剥離し、細胞懸濁液を調製した。2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に細胞培養培地(GIBCO製、DMEM+FBS10%)0.5mlを加えた。実施例1で調製された、滅菌した1.4cm角の正方形のPES多孔質膜1を、メッシュ構造のA面を上にして容器に据え、1枚のPES多孔質膜あたり4×104個のヒト間葉系幹細胞を膜上部に添加した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回定期的に培地を交換した。培養開始後、定期的にCCK8を用いて細胞数を計測しつつ143日間培養した。結果を図2に示す。PES多孔質膜1上で、安定した間葉系幹細胞の生育が観測された。PES多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。
PES多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の脂肪細胞への誘導
実施例2の培養開始99日目において、細胞が生着したPES多孔質膜を脂肪細胞誘導培地(PromoCell社製、C-28016)に移し、21日間培養した。21日間の脂肪細胞への誘導後、細胞が生着したPES多孔質膜をホルマリン固定し、BODIPYで脂肪滴を蛍光染色した。光学観察、並びに共焦点レーザー顕微鏡による同視野の光学及び蛍光観察の結果を図3に示す。視認性の高いPES多孔質膜の特性により、脂肪滴の存在が光学的にも容易に視認することができた。PES多孔質膜上で長期培養した後においても、間葉系幹細胞の持つ誘導特性が維持されていることが分かった。
PES多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の骨芽細胞への誘導及び石灰化誘導
実施例2の培養開始99日目において、細胞が生着したPES多孔質膜を骨芽細胞分化誘導培地(PromoCell社製、C-28013)に移し、21日間培養した。その後、更に21日間、骨芽細胞石灰化培地(PromoCell社製、C-27020)にて石灰化誘導を行った。石灰化誘導終了後、細胞を低温でメタノール固定し、石灰化染色キット(コスモ・バイオ)にて染色した。光学顕微鏡観察を行い、石灰化部位の観察を行なった。赤変部位が観察され、石灰化の進行が確認された(図4)。脂肪細胞と同様に、骨芽細胞にも誘導可能な、間葉系幹細胞の特性が確認された。PES多孔質膜の高視認性も、観察性向上に寄与している。
PES多孔質膜上で長期間培養されたヒト間葉系幹細胞の遺伝子解析
1.サンプルの調製
実施例2の培養開始139日目における部材培養細胞サンプルを遺伝子解析用サンプルとして使用した。また、PES多孔質膜を使用しないこと以外は実施例2と同様の条件で、タイプIコラーゲンコートディッシュ(IWAKI製)中でヒト間葉系幹細胞を7日間培養した。培養された細胞を遺伝子解析用サンプルとして使用した。PES多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。
得られたサンプルに関し、以下の手順で遺伝子解析を行なった。
(1) RNA抽出
RNeasy Plus micro Kit(Qiagen)を用いて付属のプロトコール通りにRNAの抽出を行った。RNAは30μLのNuclease Free Waterで抽出し、その後、TURBO DNA free Kit(Life Technologies)を用いてDNaseによるゲノムDNAの分解処理を行った。分解処理後、RNA 溶液の濃度をNano Drop 2000(Thermo Fishier Scientific)で測定した。
(2) cDNA合成
濃度測定後のRNA 溶液を12.5ng/μLに調製し、100ngをテンプレートとしてcDNA合成を行った。合成にはSuperScript(商標) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)を使用した。cDNA 溶液の濃度をNano Drop 2000で測定した。
(3)q-PCR 反応
cDNA 溶液を200ng/μLに調製し、200ngをテンプレートとしてとしてリアルタイムPCRによる測定を行った。PCRはCFX connect(Bio-Rad)で行い、試薬はSsoAdvanced(商標) Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を使用した。間葉系幹細胞陽性マーカー(CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71)、間葉系幹細胞陰性マーカー(CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86)について、発現量を測定し、内部標準遺伝子としてはbeta-Actinを使用した。
(4)測定データ解析
測定で求められた各遺伝子のCt値を、内部標準遺伝子として測定したbeta-ActinのCt値で引いた値から、相対発現量を算出して比較した。また、通常培養細胞サンプルと部材培養細胞サンプルで遺伝子発現の経時変化を比較するために、7日間通常培養した細胞サンプルの発現量を1とした場合の変化をそれぞれ算出して比較した。陽性マーカーの発現量に関する結果を図5に示す。なお、陰性マーカーの発現量は全て低値であることを確認した。遺伝子発現量の結果から、PES多孔質膜を用いて長期培養した後であっても、幹細胞特性が維持されることが確認された。
PES多孔質膜を用いた、ヒト骨芽細胞の培養
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に骨芽細胞増殖培地(PromoCell社製、C-27001)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のPES多孔質膜1(実施例1で調製されたもの)を培地に浸漬させた。1枚のPES多孔質膜あたり4×104個のヒト骨芽細胞(PromoCell社製)を播種し、CO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。週2回培地交換(1ml)を継続し、定期的にCCK8を用いて細胞数を計測した。結果を図6に示す。長期間培養した場合であっても、安定的にかつ高密度でヒト骨芽細胞の増殖及び生育が観察された。
PES多孔質膜上で培養されたヒト骨芽細胞の石灰化誘導
実施例6の培養開始224日目において、培地を骨芽細胞石灰化培地(PromoCell社製、C-27020)に代えて石灰化誘導を行った。28日後に、石灰化染色キット(コスモ・バイオ社製)を用いて細胞を染色した。光学顕微鏡観察を行い、石灰化部位の観察を行なった。赤変部位が観察され、石灰化の進行を確認した(図7)。PES多孔質膜上でヒト骨芽細胞を長期間培養した後であっても、骨芽細胞特性が維持されることが確認された。PES多孔質膜の高視認性が、赤変の観察性の向上に寄与している。
PES多孔質膜を用いた、CHO DP-12細胞の培養
抗ヒトIL-8抗体産生CHO DP-12細胞(ATCC CRL-12445)をディッシュ(口内径10cm)に播種して培養後、トリプシン処理により剥離し、細胞懸濁液を調製した。2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に細胞培養培地(IMDM,2%FBS)0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のPES多孔質膜1及び2(実施例1で調製されたもの)を、メッシュ構造のA面を上にして容器に据え、1枚のPES多孔質膜あたり4×104個のCHO DP-12細胞を播種した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回定期的に培地を交換した。培養開始後、定期的にCCK8を用いて細胞数を計測しつつ、143日間培養した。結果を図8に示す。安定したCHO DP-12の増殖及び生育が観察された。
Claims (23)
- 細胞をポリエーテルスルホン多孔質膜に適用し、培養することを含む、細胞の調製方法。
- 前記ポリエーテルスルホン多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリエーテルスルホン多孔質膜であり、
ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、請求項1に記載の方法。 - 細胞を前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の表面に播種する工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せ、
前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリエーテルスルホン多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 生細胞が前記ポリエーテルスルホン多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、請求項5に記載の方法。
- 前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、請求項5又は6に記載の方法。
- 細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び1又はそれ以上の前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリエーテルスルホン多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 2以上の前記ポリエーテルスルホン多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 細胞が、前記ポリエーテルスルホン多孔質膜に自発的に接着する、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記ポリエーテルスルホン多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。 - 細胞が、前記ポリエーテルスルホン多孔質膜に自発的に接着する、請求項11に記載の方法。
- 2以上のポリエーテルスルホン多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項3~13のいずれか1項に記載の方法の2種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、請求項1又は2に記載の方法。
- 細胞がポリエーテルスルホン多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項16に記載の方法。
- 細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の細胞の調製方法に使用するための細胞培養装置。
- 2以上のポリエーテルスルホン多孔質膜が、上下又は左右に積層している、請求項21に記載の細胞培養装置。
- ポリエーテルスルホン多孔質膜を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の細胞の調製方法に使用するためのキット。
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