JP2012503688A - 細胞の増大のための照射膜 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、接着または懸濁細胞(特に、接着細胞)を培養するために使用できる膜に関し、該膜は酸素の存在下で12.5 〜175 kGyの量でガンマ-またはベータ-線または電子ビームでの湿性または乾燥膜の照射により細胞の付着 および 増殖を許容する。結果的に生じる膜は、表面修飾物質(surface-modifying substances)での何らかの前処理なしで使用しえる。さらに、本発明は、細胞(特に,接着細胞)の培養に使用できる前記照射膜を調製するための方法、また細胞(特に,接着細胞)の培養のため係る膜を使用する方法に関する。
本発明の目的は、培養 フラスコまたはセルスタックを用いる細胞を増大させるため現在での最も基準的なものを代表する組織培養 ポリスチレン (TCPS) プレートと実質的に 類似する成長特性を示す膜(membranes)の同定であった。測定される主要な特性は、細胞増大速度(cell expansion rate), 細胞の膜への再付着効率, および形態のコントロール(morphology control), 表現型, および分化ポテンシャルを含む細胞増大後の特性であった。係る膜は、様々な形状(例えば、平らなシートまたは中空繊維膜)に製造されるために適切であるべきである。
本発明において、調製後にベータ線またはガンマ線または電子ビームで12.5 〜175 kGyの量で酸素の存在下で処理された膜が開示される。照射の間、膜は、乾燥または湿性状態で存在でき、それぞれ空気, 水,または水性の溶液でカバーされてもよい。また、本発明は、係る膜を調製する方法に関する。また、本発明は、細胞外基質成分で膜を前処理するまたは事前に被覆する必要がない細胞付着を促進するための及び細胞(特に、接着細胞)の培養のための膜を用いる方法に関する。本発明において好適な膜は、ポリスルホンベースの, ポリエーテルスルホンベースの又はポリ(アリール)エーテルスルホンベースの合成膜であって、加えてPVPおよび任意で低い量のさらなるポリマー(例えば、ポリアミドまたはポリウレタン)を含んでいる膜である。
本発明の対象は、乾燥した又は湿った状態の何れかで、酸素の存在下でベータ線またはガンマ線または電子ビームの照射に12.5 〜175 kGyの用量で供されるポリマー膜である。照射の間、膜は、酸素が照射の間に4 〜100 vol.-%(例えば、5 〜30 vol.-%または15 〜25 vol.-%)の濃度で存在する空気で囲まれてもよい又は水または低量の添加物を含んでいる水溶液で囲まれてもよい。
(a) 組織培養の技術に使用できる〔即ち、バイオ人工腎臓または肝臓などのバイオ人工インプラントを樹立するため(Atala (2006)をも参照されたい)〕;
(b) 接着細胞(例えば、一般的に、MSC, 平滑筋細胞, 皮膚細胞, 神経細胞, 神経膠細胞または内皮細胞,または懸濁細胞、例えば、造血性幹細胞, 臍帯血細胞, 神経幹細胞, など)を、ホストに再移植する前にインビトロで増大させることが必要である細胞の注射を介した医学的な治療法に使用するための培養に使用できる;
(c) 例えば、成長因子, 組換えタンパク質, サイトカインまたは抗体, 例えば、モノクローナル抗体などのバイオプロダクトの生産者として貢献する細胞を増大させる及び提供するため使用できる;
(d) 接着細胞の培養物(好ましくは、細胞単層培養物)を調製するため、特定の細胞タイプを研究するため又は抗癌薬, 抗真菌薬, 抗生物質, 抗-ウイルス薬(抗-HIV薬を含む)および抗-寄生虫薬などの任意の薬物の細胞における影響を研究(スクリーニング手順)するため使用できる;
(e) または、インビトロ系における接着細胞または懸濁細胞の培養増大または貯蔵に基づく又はこれらを必要とする任意の他の適用のため使用できる。
本発明の膜の適合性 および 効率の評価は、一般的には細胞増大速度, 細胞の膜への再付着効率などの主要な特性, および形態の制御を含む細胞増大後の特性に基づく。本発明の膜が様々な粘着細胞タイプを培養するため適切であることを証明するため、間充織幹細胞(MSC: mesenchymal stem cells), 線維芽細胞, 上皮細胞 および肝細胞で試験を行った。MSCが細胞培養のための本発明の膜の性能の綿密な分析のため選択された。
手束(hand bundles), ミニモジュール(mini-modules), フィルターおよび平らなシート挿入物(flat sheet inserts)の調製
(A) 手束
スピニングプロセス後の膜束(membrane bundle)の調製は、続いての性能試験に対し適切な様式で線維束を調製するため必要である。第一の処理工程は、線維束を23 cmの規定長に切断することである。次の処理工程は、線維の端の融解からなる。光学的な制御によって、全ての線維が良好に融解されることが保証される。それから、線維束の端は、ポッティングキャップ(potting cap)に移された。ポッティングキャップは、機械的に固定された。そして、ポッティングチュウブは、ポッティングキャップにおかれた。その後、ポッティングがポリウレタンでなされた。ポッティング後、少なくとも一日ポリウレタンが硬化(harden)できることが保証されなければならない。次の処理工程において、ポッティングされた膜束は、規定の長さに切断され、線維の端が開かれた。最後の処理工程は、線維束の光学的な制御からなる。この処理工程の間、次の点が制御された。 (i) 切断の質(滑らかな切断であるか又はナイフの何らかのダメージが存在するか), (ii) ポッティングの質(ポッティングされた線維により減少したスピニング処理の開いた線維の数又はポリウレタンが存在しない目に見える欠陥品が存在するか)。
ミニモジュール[= ハウジングにおける線維束]は、関連する処理工程で調製された。ミニモジュールは、線維の保護、また非常に清潔な製造を保証するため必要とされる。ミニモジュールの製造は、次の点において異なる: つまり、 (i) 線維束は、20 cmの規定長に切断される; (ii) 線維束は、融解処理前にハウジングに移される; (iii) ミニモジュールは、ポッティング処理前に一晩減圧乾燥器におかれる。
フィルターは、約 8.000 〜15.000の線維を0.9 〜1.7 m2の有効表面(effective surface area)で含む。フィルターは、培養培地の流体を供給するための二つの連結部を有する円柱状のハウジングおよび各々が一中心連結部(one centered connector)をともなう両側の適合キャップ(applied caps)により特徴づけられる。製造方法 (巻き取り後)は、次の主な工程に分けることができる: (i) 切断した束(約 30 cmの長さ)は、特殊な束鉤爪(bundle claw)を有するハウジングに移される; (ii) 束の両端は、閉鎖処理で閉鎖される; (iii) 線維は、ハウジングにポリウレタン (PUR)でポッティングされる; (iv) 端が切断されて線維が開かれる(ここで、滑らかな表面が必要とされる); (v) 端は、視覚的に閉鎖線維またはPURブロックの欠陥に関して点検される;
(vi) キャップが連結部に接着される; (vii) 最終的な処理(洗浄, 完全性試験, 最終乾燥); (viii) さらなる工程(例えば、照射)のための特殊なバックへのパッケージング。
平らな膜がガラスプレートに固定化された。挿入物の接着剤として機能するポリウレタンをプレートに均等に分布させた。挿入物は、穏やかにポリウレタンに浸漬され、それぞれの膜に直ちに接着された。挿入物は、ガラスおよび鉄のプレートで圧迫され、16 〜18 時間乾燥された。平らな膜の挿入物が、切り抜かれ、滅菌バックへ密着された。最終的に、挿入物は、オートクレーブで121゜Cで滅菌されてもよい。
膜束の透水率は、正確な規定量の水を圧力下で膜束(片側で封鎖されている)を通して圧縮すること, 必要とされる時間で測定することで決定される。透水率は、既定時間, 有効膜表面領域, 適用圧および膜を通して圧縮された水の容量から計算することができる。線維の数、線維の長さ、同様に、線維の内径から有効膜表面領域(effective membrane surface area)が計算された。膜束は、三十分間Lp-検査が行われる前に湿らせなければならない。この目的のために、膜束は、500 mlの超純水を含んでいる箱におかれた。30 分後、膜束は、試験系に移された。試験系は、37 ゜Cに調節されたウォーターバスおよび膜束を機械的に処理する装置からなる。ウォーターバスの水位によって、膜束が指定の装置中で水面下に配置されることが保証されなければならない。膜の漏出によって誤った検査結果が導かれることを回避するため、膜束および検査系の完全性試験を事前に行わなければならない。完全性試験(integrity test)は、束の片側で閉鎖された膜束を通して空気を圧縮することで行われた。気泡は、膜束または検査装置の漏出を示す。漏出を検査装置中で膜束が誤って処理されたことと関連させることができるかどうか又は実際に膜の漏出が存在するかどうかがチェックされなければならない。膜の漏出が検出された場合、膜束は廃棄されなければならない。完全性試験の適用圧は、高すぎる圧力の適用が理由で漏出が透水率の測定の間に生じえないことを保証するため少なくとも透水率の決定の間の適用圧と同じ値でなければならない。
透析流体(100 mg/l)に希釈された等張性の塩化物溶液、同様に、リン酸塩での拡散実験が行われ膜の拡散特性が決定された。手束は、測定セル(measuring cell)におかれた。測定セルは、中空繊維の内側で特定の溶液が通過することを許容する。その上、測定セルは、完全に水で満たされ、蒸留水の高いクロスフロー(high cross flow)を設定して中空繊維の内側から外側に膜の横断面を通過する特定のイオンが輸送された。圧力比を正確に調整することにより、ゼロ濾過(zero filtration)が目標とされ、膜の拡散特性のみが(中空繊維の内側および中空繊維の周囲の間の特定のイオンの最大濃度勾配を達成することにより)決定され、拡散性(diffusive)および対流性(convective)の特性の組み合わせは決定されない。プールからのサンプルは最初に取得され、未透過物(retentate)のサンプルは10 および 20 分間後に取得された。塩化物サンプルは、次に硝酸銀溶液でタイトレーションされて塩化物濃度が決定された。リン酸塩サンプルは、光学的に分析された。決定された濃度から、それぞれ塩化物またはリン酸塩の有効膜表面領域 A およびフロー条件(透過性 P)を次の 式 (2)にしたがって計算することができる:
Px [10-4cm/s] = [QB/60/A]*ln[(cA-cD)/cR]*104 (2)
式中で
P = 拡散透過性(diffusive permeability) [cm/s]
c = 濃度[mmol]
A = 有効膜表面領域[cm2]
指標(indices):
x = 物質 (ここでは: それぞれ塩化物またはリン酸塩)
A = 開始濃度(フィード)
D = 透析液
R = 未透過物
QB = 血流(blood flow) [ml/min]
水溶液におけるミオグロビンのふるい係数(手束)
ミオグロビン および アルブミンの水溶液における篩係数の実験は、別々の溶液での二つの異なる実験設定を用いて行われた。最初の検査として、ミオグロビンの篩係数が決定された。
固有の流速 (Jv、cm/s) および 壁ずり速度(γ.、s-1)は固定され、血流 (QB) および 濾過比 (UF)が計算された〔式 (4) + (5)を参照されたい〕:
QB [ml/min] = γ * n * π * di3 * 60/32 (4)
UF [ml/min] = JV * A * 60 (5)
式中で
n = 線維の量
di = 線維の内径 [cm]
γ = ずり速度 [s-1]
A = 有効膜表面領域[cm2]
Aは式 (1)にしたがって計算された:
手束またはミニ-モジュールの試験で、ずり速度は500 s-1に設定され、固有の流速(intrinsic flow rate)は0.38・10-04 cm/sと規定された。
平らなシート膜の調製
ポリマー溶液はポリエーテルスルホン (Ultrason (登録商標) 6020, BASF), ポリビニルピロリドン (K30 および K85, BASF), ポリウレタン (Desmopan (登録商標) 9665 DU, Bayer MaterialScience AG)、同様に、蒸留水をN-メチルピロリドン (NMP)中で 60゜Cで透明で高度に粘稠性の溶液が得られまで溶解することで調製された。
平らなシート膜の調製
ポリマー溶液は、ポリエーテルスルホン (Ultrason (登録商標) 6020, BASF), ポリビニルピロリドン (K30 および K90, BASF)、同様に、蒸留水をN-メチルピロリドン (NMP)中で 60゜Cで透明で高度に粘稠性の溶液が得られまで溶解することで調製された。
中空繊維膜の調製
ポリマー 溶液を、13.5%のポリエーテルスルホン, 0.5%のポリアミド, 7.5%のPVP K30 および 78.5%のNMPを混合することにより調製した。59 wt.-%の水および41 wt.-%のNMPの混合物が中心流体として機能した。ポリマー溶液の粘性(22゜Cの温度で測定された)は、4,230 mPa・sであった。
中空繊維膜の調製
ポリマー溶液を、14.0 wt.-% のポリエーテルスルホン, 5.0 wt.-% のPVP K30, 2.0 wt.-% のPVP K85/K90, 3 wt.-% の水 および 76.0 % のNMPを混合することにより調製した。55 wt.-% 水および45 wt.-% NMPの混合物は、中心流体として作用した。ポリマー溶液の粘性(22゜Cの温度で測定された)は、5,400 mPa・sであった。
中空繊維膜の調製
ポリマー溶液はポリエーテルスルホン (Ultrason (登録商標) 6020, BASF), ポリビニルピロリドン (K30 および K85, BASF), ポリウレタン (Desmopan (登録商標) PU 9665 DU, Bayer MaterialScience AG)、同様に、蒸留水をN-メチルピロリドン (NMP)中で 50゜Cで透明で高度に粘稠性の溶液が得られまで溶解することで調製された。
挿入物の照射および細胞培養のための調製
空気カバー膜(酸素濃度が増加しない又は低下した)は、それぞれ6.3 および 18.9 hでガンマ線照射 (それぞれ25 および 75 kGy)に従来の滅菌バック中で室温で供された。水またはアクリル酸溶液でカバーした膜挿入物は、約 70 mlの溶液を含んでいるプラスチック容器中でガンマ線照射に供された。流体でカバーした膜挿入物の洗浄に関して、約 300 mlの従来のPBS 培地(8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4を800 mlの蒸留したH2Oに含み、HClでpH7.4に調整され、H2Oが 1 リットルまで添加され、オートクレーブ滅菌された)を含んでいる各膜タイプのためのディッシュを調製した。挿入物を、容器から無菌的に除去し、PBSディッシュで洗浄し、更なるリンスのため6-ウェルプレートに移した。全ての挿入物のタイプを、6-ウェルプレートに移し、それぞれ3 ml および 5 mlのPBSで上部および底部側で五回リンスした。各リンス工程に関して、挿入物を、残留する試薬およびガンマ線照射の間に生成された副産物を除去するため少なくとも 10 minインキュベーションした。リンス処置を終えた後、挿入物を細胞培養のため新しいウェルプレートに移した。それぞれウェル中の挿入物の上部側に3 mlのMSC 培地が添加され、底部側に5 mlが添加された。挿入物を、インキュベーターにおいてMSC 培地中で一晩インキュベーションした。
中空繊維膜の照射
ガンマ線照射に供されたバイオリアクター(ハウジング中の中空繊維)は、中空繊維の形状で本発明の膜からなる(例4 〜6を参照されたい)。ハウジング, ヘッダー(headers), およびポッティングのための材料は、ガンマ線安定性(gamma-stable)であり、Fibasol blue (ハウジング/ヘッダー) およびガンマ線安定性のポリウレタン(ポッティング)を有するMakrolon (登録商標) DP1-1262 (Bayer MaterialScience AG)からなる。PES/PVP/PA-ベースの膜を含んでいるバイオリアクター(例 4を参照されたい)は、周囲(ambient)の空気, 水(RO-水), 0.001% アクリル酸の水溶液(1 lのRO-水に0.01 gのAA)または0.01% アクリル酸の水溶液 (1 lのRO-水に0.1 gのAA)で満たされ、25または75 kGyを適用するガンマ線照射に供された。反応器を水性の溶液で充填し、水で毛管内(IC: intra-capillary)側から100 ml/minでフラッシング(flushing)を行い、空気を除去した。IC-アウトラインをクランプし、毛管外(EC: extra-capillary)側を限外濾過により充填した。バイオリアクターに残存した残気がなくなるまで工程を繰り返した。ガンマ線照射をCo-60 源で行い、25または75 kGy を6.3 および 18.9 時間で室温で適用した。
平らなシート膜における未処理の骨髄の培養
MSC 培地〔900 ml アルファ-MEM 培地(Lonza, Cat.-No. BE12-169F), 100 ml FBS, 10 ml ペニシリン/ストレプトマイシン, および 10 ml ウルトラグルタミン I; 細胞培養の使用の前, MSC 培地を37゜Cに温めた〕を、挿入膜上での一晩のインキュベーション後に挿入物の上部(2ml) および 底部の側(4ml)において新鮮な MSC 培地で置換した。それらの培地の容量を、全てのさらなる工程に適用した。それぞれの容積の未処理の骨髄を、表 Iに示した各挿入物に添加した。骨髄をディッシュを振盪することにより膜に均質に分布させた。挿入物をインキュベーターに3 日配置し、MSCを付着させた。3日目、培地を挿入物の培養の上部および底部側から除去した。膜を各リンス工程で2 mlのPBSで上部側で二回リンスした。新鮮な MSC培地を上部および底部側に添加した。第一の成長期(即ち、骨髄の播種から最初のMSCの剥離までの培養期)において、培地を、2から3 日ごとに12日または14日まで挿入物の上部および底部側で交換した。12または14日に、MSCsを4つの挿入物のうち3つから挿入物ごとに500 μlのトリプシン (10 min, 37゜C)を用いて分離した。トリプシンを挿入物ごとに1.5 mlのMSC培地を用いて不活化した。MSC 懸濁液を無菌チュウブに集めた。CASY カウンターを用いたMSCの計数のためサンプルを取った。4つの挿入物の一つを固定し、SEMのため調製した。その調製のため挿入物をPBSで上部側で一度洗浄し、1 ml の2% グルタルアルデヒド溶液を添加し、一晩4゜Cで貯蔵した。引き続いて、挿入物を蒸留水で三回洗浄し、空気乾燥し、SEMに供した。第二の実験ではSEMは行わなかった。MSC培地をMSCsの再播種までインキュベーター中で予熱し、ガスで馴化した後に、新鮮な培地を同じ挿入物の上部および底部側に添加した。10,500 MSCs/cm2 を同じ挿入物に一晩再付着させた。第二の成長期において、再付着させたMSCsを付加的な 7 日間で膜で増殖させた。MSC培地を2 〜3 日毎に交換した。MSCsを4つの挿入物のうち3つの挿入物から19または21日に10 min、37゜Cでトリプシンを用いて収穫した。MSCsをMSCの形態および増殖の潜在能力の対照とするためTCPSに再度蒔いた。そのため収穫したMSCsを、形態の対照に関して5,000 MSCs/cm2で、また増殖コントロールの対照に関して500 MSCs/cm2でTCPSに4または5 日間再播種した。形態および増殖の潜在能力を、形態評価のため1または2日、また増殖の潜在能力の評価のため4または5日顕微鏡写真をとることで記録した。
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膜 骨髄容積(μl) n 総骨髄容積(μl)
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TCPS 300 3 900
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VTK(未処置) 150 4 600
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VTK + FN コーティング 150 4 600
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VTK 25 kGy, 空気カバー 150 4 600
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VTK 75 kGy, 空気カバー 150 4 600
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AN96ST (未処置) 150 4 600
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VTK75kGy,水カバー 150 4 600
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VTK75kGy,0.0001% AAの水カバー 150 4 600
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VTK75kGy,0.001% AAの水カバー 150 4 600
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VTK75kGy,0.01% AAの水カバー 150 4 600
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表I: 非処理の骨髄からのMSCの培養に使用した膜のタイプおよび照射条件の概要「n」は、各設定で行われた試験の数を示す。「AA」は、「アクリル酸」を示す。「VTK」の表現は、例 2に使用したポリマー溶液に基づく膜を表す。「FN」は、フィブロネクチンを示す。AN69ST TM膜は、ポリアクリロニトリルに基づく市販の膜である。
平らなシート膜における処理前のMSCの培養
挿入物の上部および底部側で新鮮な培地で一晩インキュベーション後に挿入物からMSC培地を置換した。MSCの標準のフラスコ条件を適用したフラスコからMSCをトリプシン処理した(0.25% トリプシン, 5 min, および 37゜Cで、全ての細胞が剥がれるまで叩き、培地の付加でトリプシンを不活性化した)。MSCをCASY カウンターを用いて計数した。MSC 懸濁液を調製した(これによりTCPS-ウェルまたは挿入物において500 MSC/cm2の播種が許容される)。ウェルプレート および 挿入物をインキュベーターに配置してMSCを付着させた。MSC培地を上部および底部側で 2 〜3 日毎に7または9 日まで交換した(TCPSにおいて〜80% 集密までを目標としている)。7日および/または9日に、MSCを500 μlのトリプシン (10 分間, 37゜C)を用いて分離した。次に、トリプシンを1.5 ml MSC培地を用いて不活化し、MSCを無菌のチュウブ中に細胞懸濁液として集めた。サンプルをCASY カウンターを用いる細胞計数のため取得した。一つの挿入物を固定し、SEMのため調製した。そのため挿入物をPBSで上部側で一度洗浄し、次に1 ml の2% グルタルアルデヒド溶液を添加し、全てを一晩4゜Cで貯蔵した。引き続いて、挿入物を蒸留水で洗浄し、空気乾燥し、SEMに供した。新鮮なMSC培地を、挿入物の上部(2 ml)および底部(4 ml)側に添加した。培地を細胞の再播種までインキュベーターにおいて予熱し、ガスで馴化させた。500 MSC/cm2 を同じ挿入物に一晩インキュベーター中で再付着させた。再付着したMSCを付加的な 10または11 日間で膜に増殖させた。MSC培地を2 〜3 日毎に交換した。MSCを16または21日に三つの挿入物から収穫した。MSC をMSCの形態および増殖の潜在能力の対照のためTCPSに再度蒔いた。そのため収穫したMSCsを、形態の対照のため5,000 MSCs/cm2で、また増殖の潜在能力の対照のため500 MSCs/cm2でTCPSに4または5 日間再播種した。形態および増殖の潜在能力を、形態評価のため1または2日、また増殖の潜在能力の評価のため4または5日顕微鏡写真をとることで記録した。表 IIは、これらの実験に使用された全ての膜タイプおよび修飾、同様に、照射条件の概要を提供する。
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膜 細胞数 (500 細胞/ cm2) n トータルの細胞数
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TCPS 4,800 3 14,400
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VTK(未処置) 2,250 4 9,000
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VTK + FN コーティング 2,250 4 9,000
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VTK 25 kGy, 空気カバー 2,250 4 9,000
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VTK 75 kGy 空気カバー 2,250 4 9,000
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VTK 75 kGy 水カバー 2,250 4 9,000
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VTK 75 kGy, 0.0001% AAでの水カバー 2,250 4 9,000
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VTK 75 kGy, 0.001% AAでの水カバー 2,250 4 9,000
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VTK 75 kGy, 0.01% AAでの水カバー 2,250 4 9,000
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表II: 事前に選択したMSCの培養に使用した膜のタイプおよび照射条件の概要「n」は、各設定で行われた試験の数を示す。「AA」は、「アクリル酸」を示す。「VTK」の表現は、例 2に使用したポリマー溶液に基づく膜を表す。「FN」は、フィブロネクチンを示す。
ガンマ線照射前の蒸気滅菌の影響
例 10にしたがって実験を行い、膜表面に接着したMSCの数をTCPSと比べて(%)で決定した。細胞数をTCPSおよびフィブロネクチンコーティングを有するVTK膜に関して、同様に、25または75 kGyで放射線で照射された空気で満たされた又は水でカバーした何れかのVTK 膜に関して決定した。3つのセットの実験を行った。第一の設定において、直接的に生産後にガンマ線照射した。第二の設定において、それぞれガンマ線処理に供される前に膜を蒸気滅菌した。図 6に認められるとおり、ガンマ線照射前に蒸気滅菌した膜は、蒸気滅菌なしの膜と比較してMSCの付着に関してより良く機能した。
細胞の分化
本発明の膜で培養した細胞の分化能力を評価するため、脂肪生成 および 骨形成の分化の試験を行なってMSCが分化する能力を決定した。
MSCを24-ウェルプレートに約 10,000 MSC/cm2の密度で播種した。三つのウェルを使用した。一つは以下の記載のとおりMSCの脂肪細胞への分化、一つは標準のMSC増殖培地(脂肪生成を誘導することのない)におけるMSCの成長、もう一つは染色の対照として使用した。MSCをコンフルエントまで又はコンフルエントを超え十日まで、標準のMSC増殖培地 (900 mlのアルファ-MEM 培地, 100 mlのFBS, 10 mlのペニシリン/ストレプトマイシン, および10 mlのウルトラグルタミンI; 細胞培養の使用の前, MSC 培地を37゜Cに温めた)を用いて成長させた。脂肪生成を、脂肪生成の誘導培地〔20 μlのIBMX 貯蔵溶液(55.55 mgのIBMXを10 ml蒸留水に溶解し, それから 20 〜40 mgの炭酸ナトリウムを前記溶液に添加した), 1 μlのデキサメサゾン貯蔵溶液(19.62 mg デキサメサゾンを50 mlの純粋なエタノールに含む), 1 μlのインシュリン 貯蔵溶液(10 mg/ml), および 2 μlのインドメタシン (178.9 インドメタシンを10 mlの純粋なエタノールに含む)を 1 mlの標準MSC培地に含む〕を11 日間(0日〜11日)用いて誘導した。前記培地を2 〜3 日毎に交換した。脂肪生成の維持培地 (1 μlのインシュリンストック溶液を1 mlの標準MSC培地に含む)を、3または5 日(12-14日または12-16日)使用し、2-3 日毎に交換した。細胞を標準のPBS緩衝剤でリンスした。細胞をホルムアルデヒド溶液(〜10%)を用いて少なくとも 4 時間、室温で固定した。次に、約 0.5 mlのOil Red O溶液(新たに濾過滅菌した)を、各ウェルに添加し、30 min 〜2 時間、室温でインキュベーションし、細胞をPBSで二回リンスし、50% エタノールでリンスした。細胞を、Mayer's ヘマトキシリン溶液で5 min、室温で対比染色し、1 min、水道水で三回リンスし、ホルムアルデヒド 溶液で固定した。図 8は、ガンマ線照射(75または25 kGy, アクリル酸またはアリルアミンの存在下)したVTK膜で培養した細胞におけるMSCの脂肪生成が成功したことを示す。
MSCを24-ウェルプレートに約 10,000 MSC/cm2の密度で播種した。三つのウェルを使用した。一つは以下の記載のとおりMSCの骨芽細胞への分化、一つのウェルは標準のMSC増殖培地(骨形成を誘導することのない)におけるMSCの成長、一つは染色の対照として使用した。MSCをコンフルエントまで又はコンフルエントを超え十日まで標準 MSC培地を用いて成長させた。MSC培地を、骨形成分化培地〔100 μlのグリセロールリン酸ストック溶液(2.16 gのグリセロールリン酸を100 mlの標準MSC培地に含む), 1 μlのデキサメサゾンストック溶液, および 1 μlのアスコルビン酸ストック溶液 (0.145g アスコルビン酸を10 ml の基礎培地, アルファ-MEMに含む), を1 mの標準MSC培地に含む〕で置換し、3-4 日毎に交換した。2-3 週後、細胞中及び細胞の周囲に石灰化した沈殿物が存在した。細胞をPBS中で洗浄した。PBS を除去し、細胞を10% ホルムアルデヒドで10 min固定し、PBSで一回洗浄し、脱イオン水で二回洗浄した。細胞を、空気乾燥し、硝酸銀で紫外光下で10 min染色した。脱イオン水で2-3 回洗浄した後、細胞をMayer's ヘマトキシリンで対比染色し、一分間水道水中で洗浄し、次に脱イオン水で二回洗浄した。細胞を10% ホルムアルデヒドに入れた。図 9は、本発明の膜で成長させた細胞の骨形成の成功を示す。
様々な細胞タイプの増殖に関する適合性
様々な細胞タイプの培養に関して本発明のガンマ線照射した膜の適合性を評価するため、平らな膜を例示的に試験した。使用した膜は、例10 および 11に記載され、「VTK」膜と称される。膜を、それぞれ25 kGy(空気でカバー) および 75 kGy (水でカバー)で照射した。膜を短期培養で試験して、標準のTCPSと比較して細胞接着(播種の1日後) および 細胞増殖 (再播種の5 日後)を評価した。使用した細胞は、(a) NHDF(正常なヒトの皮膚の線維芽細胞), (b) HepG2(ヒト肝臓癌細胞株), (c) HK-2(ヒト腎臓近位上皮細胞株), および (d) MDCK(Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞株)であった。
(a) NHDF: 5・103 細胞/cm2を培地(DMEM + 10% FBS + 1 % ペニシリン/ストレプトマイシン)に含む;
(b) HepG2: 5.6 x 104 細胞/cm2を培地(RPMI + 10% FBS + 0.5% ゲンタマイシン)に含む;
(c) HK-2: 104 細胞/cm2を培地(ケラチノサイト SFM (Gibco, Cat# 17005) + ケラチノサイトSFMのサプリメント(Gibco, Cat# 37000-015) + 10 μg/ml Meronem + 1% FBS +1% CaCl2)に含む;
(d) MDCK: 104 細胞/cm2を培地〔M199 + 10 μg/ml Meronem + 10% FBS (熱不活化された)〕に含む。
ガンマ線で照射された中空繊維膜(バイオリアクター)における非処理の骨髄からのMSCの増大
非処理の骨髄からのMSCの増大および事前に選択したMSCの増大を、Cell Expansion System (CES)における様々な中空繊維バイオリアクターにおいて行った。事前に選択した MSCに適切であることが証明されたバイオリアクターを、さらに非処理の骨髄で試験した。本発明のバイオリアクターにおける倍加時間(doubling times)を、播種時に同じ細胞密度で開始した対照のフラスコ(TCPS)における倍加時間と比較した。倍加時間を様々な膜/TCPSの性能を評価する方法として使う。
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No. タイプ 処理 膜の材料
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1 フィブロネクチンで被覆したVTK 蒸気 PES/PVP/PA
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2 AN69ST (表面処理) ガンマ線照射 PAN/PEI
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3 AN69XS (表面処理なし) ガンマ線照射 PAN
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4 0.5% PU(オンライン乾燥なし) ガンマ線照射 PES/PVP/PU
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5 VTK 空気を充填 25 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA
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6 VTK 空気を充填 75 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA
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7 VTK 水を充填 25 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA
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8 VTK 水を充填 75 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA
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9 VTK AA 0.001% 25kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA/(AA)
-----------------------------------------------------------------------
10 VTK AA 0.001% 75kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA/(AA)
-----------------------------------------------------------------------
11 VTK AA 0.01% 25 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA/(AA)
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12 VTK AA 0.01% 75 kGy ガンマ線照射 PES/PVP/PA/(AA)
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表III: 事前に選択した MSC および 非処理の骨髄の増大に関して試験した膜のタイプの概要。膜に関する結果を、標準のTCPSフラスコと比較した。ガンマ線照射されないが、代わりにフィブロネクチンで被覆された膜(1)が、比較のため本実験に含まれた。
78 μlの非処理の骨髄を、5 mlのMSC培地を含んでいるT25 (TCPS) フラスコに播種した。非-接着細胞を2 〜3 日後にPBSで二回洗浄することにより除去し、新鮮なMSC培地を添加した。MSC培地を2 〜3 日毎に交換した。7 日目、コロニーを計数した(10倍拡大率 / 顕微鏡)。
倍加時間 (DT)は、細胞の数が二倍になるため必要とされる時間の期間である。MSCのDT および DT 比を以下の通り計算した。
Nは示した培養期間後に得られたMSCの数であり、N0は播種したMSCの数である。
照射量の影響
膜の特性における照射量の影響を研究するため、例 14を事前に選択した MSCで12.5 kGy および 125 kGyの間のガンマ線照射量で照射され空気で満たされたVTK膜を用いて繰り返し、第一(10 日) および 第二(11 日)の成長期の後に標準のTCPSで成長させたMSCの数と比べた成長したMSCの数を決定した。結果を図17に示す。
Claims (14)
- ポリスルホン, ポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホン, およびポリビニルピロリドンを含み、4 〜100 vol%の濃度の酸素の存在下でガンマ線またはベータ線または電子ビームで12.5 〜175 kGyの量で照射された膜。
- 請求項1に記載の膜であって、さらにポリウレタンを含む膜。
- 請求項1または2に記載の膜であって、さらにポリアミドを含む膜。
- 中空繊維膜である、請求項1〜3の何れか一項に記載の膜。
- 平らなシート膜である、請求項1〜3の何れか一項に記載の膜。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の膜を調製するための方法であって、ポリスルホン, ポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホン, およびポリビニルピロリドンを含む前形成された膜を4 〜100 vol%の濃度の酸素の存在下でガンマ線またはベータ線または電子ビームで12.5 〜175 kGyの量で照射することを含む方法。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の膜または請求項6により調製された膜を含む細胞培養装置。
- 細胞および請求項1〜5の何れか一項に記載の膜または請求項6により調製された膜を含む体液の体外処理のための装置。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の膜または請求項6により調製された膜の細胞の培養のための使用。
- 請求項9に記載の使用であって、前記細胞が接着細胞である使用。
- 請求項10に記載の使用であって、前記細胞が間充織幹細胞である使用。
- 請求項10に記載の使用であって、前記細胞が肝臓細胞である使用。
- 請求項10に記載の使用であって、前記細胞が腎臓細胞である使用。
- 請求項10に記載の使用であって、前記細胞が上皮細胞である使用。
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