ES2663430T3 - Membrana irradiada para la expansión de células - Google Patents

Abstract

Un proceso de preparación de una membrana que comprende una polisulfona, una poliétersulfona o una poliarilétersulfona y una polivinilpirrolidona para el cultivo de células, que comprende la irradiación de la membrana con rayos gamma o beta o un haz de electrones en una dosis de 70 a 175 kGy en presencia de oxígeno en una concentración de 4 % a 100 % en contenido/volumen molar.

Description

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DESCRIPCION

Membrana irradiada para la expansión de células Campo técnico

La invención se refiere a un proceso de preparación de una membrana que puede utilizarse para el cultivo de células adherentes o de suspensión, en particular células adherentes, en el que dicha membrana permite la adhesión y proliferación de las células debido a la irradiación de la membrana húmeda o seca con rayos gamma o beta o un haz de electrones en una dosis de 70 a 175 kGy en presencia de oxígeno en una concentración de 4 % a 100 % en contenido/volumen molar. La membrana resultante se puede utilizar sin ningún tratamiento previo con sustancias modificadoras de la superficie.

Antecedentes de la invención

El objetivo de la presente invención fue la identificación de las membranas que exhiben características de crecimiento sustancialmente similares a las placas de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) que representan el criterio de referencia actual para la expansión de células utilizando frascos de cultivo o pilas de células. Las principales características a medir fueron velocidad de expansión de células, eficiencia de re-unión de las células sobre membranas, y características de expansión posterior de células incluyendo control de la morfología, fenotipo y potencial de diferenciación. Dicha membrana debe ser una adecuada para ser fabricada con diversas geometrías, tales como una membrana de lámina plana o de fibras huecas.

La invención se refiere particularmente a un proceso de preparación de membranas que pueden, por ejemplo, ser utilizadas para cultivo, crecimiento, almacenamiento y/o expansión de células adherentes de diferentes tipos. En el contexto de la presente invención, la expresión "cultivo celular" o "cultivo (de) células" comprenderá todos estos usos, es decir, la adherencia, el mantenimiento, el crecimiento, la expansión, la diferenciación, la modificación biológica molecular (p. ej., transfección), y/o el almacenamiento de células de diferentes tipos.

Al igual que la mayoría de las células in vivo, muchas células son células adherentes, o células dependientes de anclaje, es decir, que pueden metabolizarse y dividirse sólo si están unidas a una superficie o sustrato. Sólo las células del sistema circulatorio (p. ej., linfocitos y glóbulos rojos) y otros tipos de células tales como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, células CHO, etc., crecen desvinculadas y se suspenden en una solución in vitro. Si bien muchas células dependientes de anclaje pueden crecer en superficies de vidrio o sintéticas, estas células a menudo pierden su capacidad de diferenciarse y responder a las hormonas. La pérdida de morfología celular no sólo supone una pérdida de función, sino que también impide el poder regenerativo en un sistema de cultivo a largo plazo. Sin embargo, el cultivo a largo plazo sería de gran importancia, por ejemplo, con el uso de células humanas para el cultivo de tejidos, y muchas células no están disponibles en cualquier cantidad. Por esta razón, este tipo de placas de cultivo tisular se recubren a menudo con componentes de la matriz extracelular, tales como colágeno o fibronectina. Sin embargo, el uso de factores xenogénicos es una clara desventaja, especialmente si las células tales como o en una matriz se utilizan para el tratamiento médico de seres humanos, ya que acarreará riesgos de contaminación y puede resultar en reacciones adversas en el paciente tratado.

El fracaso de las células para crecer en tales superficies o mantener sus capacidades es, por ejemplo, una limitación importante de las técnicas de cultivo tisular actuales. Los cultivos tisulares son una fuente potencial de tejidos y órganos que se podría utilizar para el trasplante en seres humanos. Por ejemplo, las células de la piel en cultivo tisular podrían utilizarse potencialmente en injertos de piel. El objetivo es desarrollar sustitutos biológicos que pueden restaurar y mantener la función normal, por ejemplo, mediante el uso de matrices acelulares, que dependerá de la capacidad del cuerpo para regenerar la orientación y la dirección adecuadas de crecimiento de nuevo tejido, o por el uso de matrices o membranas con células adheridas a las mismas (Atala (2006): Recent developments in tissue engineering and regenerative medicine. Curr. Opin. Pediatr. 16, 167-171). Las células también se pueden utilizar para la terapia mediante inyección, ya sea con vehículos o solos. En tales casos, las células necesitan expandirse en cultivo, unirse a una matriz de soporte, y acto seguido reimplantarse en el huésped después de la expansión. Las aplicaciones terapéuticas veterinarias están disponibles en la actualidad y pueden representar una aplicación adicional de las membranas para el cultivo celular.

La capacidad para cultivar células, especialmente células adherentes, también es importante debido a que representan "fábricas" biológicas capaces de producir grandes cantidades de bioproductos tales como factores de crecimiento, anticuerpos y virus. Estos productos se pueden aislar a partir de los cultivos celulares y utilizarse, por ejemplo, para tratar enfermedades humanas.

Adicionalmente, los cultivos celulares son herramientas emergentes para estudios de biocompatibilidad y toxicología en el campo de la industria de la farmacéutica y la ciencia biológica.

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Por último, los cultivos tisulares comprenden generalmente células de sólo uno o unos pocos tejidos u órganos. Por consiguiente, los cultivos celulares proporcionan a los científicos un sistema para estudiar las propiedades de los tipos de células individuales sin las complicaciones de trabajar con todo el organismo.

Un método conocido para el cultivo de células adherentes implica un biorreactor de membrana de fibras huecas. En este sistema, las células se unen generalmente al lumen de una membrana cilíndrica de fibras huecas. Medios de cultivo y oxígeno fluyen a través del centro de la membrana cilíndrica de fibras huecas. El peso molecular de corte de la membrana permite que los nutrientes y el oxígeno lleguen a las células sin permitir que las células se escapen.

Una variedad de polímeros ha sido sugerida para producir membranas semipermeables para el cultivo celular y tisular (documento US 2007/269489). Incluyen polialginato, cloruro de polivinilo, fluoruro de polivinilideno, isocianato de poliuretano, acetato de celulosa, diacetato de celulosa, triacetato de celulosa, nitrato de celulosa, polisulfona, poliétersulfona, poliestireno, poliuretano, alcohol polivinílico, poliacrilonitrilo, poliamida, polimetilmetacrilato, politetrafluoroetileno, óxido de polietileno y combinaciones de tales polímeros. El soporte polimérico también puede consistir en polietileno tereftalato (PET) o policarbonato. Otros materiales que fueron sugeridos, por ejemplo, como armazones para material de tejido trasplantable, son vehículos macroporosos de celulosa o colágeno o matrices biodegradables.

El documento WO 93/00439 A1 describe el mantenimiento de un cultivo celular en una membrana biocompatible, semipermeable en la que se estimulan las células y secretan un factor activo. La membrana semipermeable utilizada permite la difusión del factor activo a través de la misma mientras que excluye que los agentes perjudiciales presentes en el entorno externo tengan acceso al cultivo. La membrana descrita tiene una forma tubular y se dice que permite la difusión de moléculas que tienen un peso molecular de hasta 150 kDa. Los materiales que se sugieren para dicha membrana son copolímeros acrílicos, cloruro de polivinilo, poliestireno, poliuretano, poliamida, polimetacrilato, polisulfona, poliacrilato, fluoruro de polivinilideno, isocianato de poliuretano, polialginato, acetato de celulosa, polisulfona, alcoholes polivinílicos, poliacrilonitrilo, óxido de polietileno y derivados y mezclas de los mismos. El uso de cualquier irradiación para preparar tal membrana no se describe. La membrana no tiene, como tal, que servir como una matriz para la adhesión celular en la presente divulgación.

El documento WO 90/11820 A2 desvela membranas planas con superficies utilizables para el crecimiento celular in vitro o como un implante artificial in vivo. La membrana se describe por tener ser porosa con un tamaño de poros en el intervalo de 0,1 a 100 micrómetros y por tener una configuración similar a un dedo en una capa intermedia. La membrana comprende un polímero hidrófobo y un polímero hidrófilo. Los ejemplos dados para el polímero hidrófobo comprenden polisulfona, poliamidas, poliétersulfona, poliésteres, policarbonatos, preferentemente uretano de poliéter y copolímeros de los mismos. La referencia no notifica si la membrana se puede utilizar o no para adherir y cultivar células. El uso de cualquier técnica de irradiación no se describe.

Aparte del problema de la identificación de las composiciones de membrana que podrían utilizarse como una matriz para el cultivo de células adherentes, las membranas actualmente conocidas en la técnica se ven afectadas por su incapacidad para promover y mantener suficientemente la adhesión, la expansión, la diferenciación y la vida útil extendida sin el pre-tratamiento de dichas membranas o matrices, o la adición de factores exógenos, tales como, por ejemplo, fibronectina, laminina o colágeno.

Por ejemplo, Fissell (2006) en Expert Rev. Med. Devices 3(2), 155, analiza los esfuerzos con respecto al desarrollo de un riñón artificial basado en la adhesión de células de los túbulos renales a una membrana de fibras huecas a base de polisulfona sintética. En este caso, la membrana tiene que ser recubierta con ProNectin-L™ con el fin de promover la unión de las células.

El documento US-A 6.150.164 y el documento US-A 6.942.879 ambos presentes elaboran formas hacia un riñón bioartificial basado en células renales tales como, por ejemplo, células endoteliales o las llamadas células madre renales, que se siembran en fibras huecas. Las membranas de fibras huecas que se mencionan por ser útiles se basan en celulosa, poliacrilonitrilo, polisulfona y otros componentes o copolímeros de los mismos. La superficie interna y externa de la fibra hueca está pre-cubierta con componentes adecuados de la matriz extracelular (MEC), incluyendo colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, laminina, matrigel, proteoglicanos, fibronectina y combinaciones de los mismos. Sólo después de tal tratamiento las células se pueden sembrar.

Es un procedimiento conocido para presentar membranas sintéticas, tales como membranas a base de polisulfona, para irradiación gamma con el fin de reticular ciertos componentes de la membrana, tales como, por ejemplo, PVP, o con el fin de esterilizar las membranas. La dosis de radiación estará generalmente comprendida en el intervalo de 10 a 50 kGy, preferentemente en el intervalo de 20 a 35 kGy (véase, por ejemplo, el documento US 6.960.297 B2 o el documento US-A 6.103.117). El documento EP 0 550 798 A1 describe la reticulación de PVP en una membrana tipo polisulfona por irradiación de la membrana con una dosis máxima de 50 kGay en presencia de aire.

Dosis mayores se evitan en general con el fin de minimizar la degradación de la membrana. Además, dichos procesos conocidos se diseñan generalmente de una manera para omitir la presencia de oxígeno por las mismas razones, es decir, la formación de y degradación de la membrana por los derivados de oxígeno agresivos, tales

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como los radicales de oxígeno o H2O2. La esterilización por irradiación gamma se realiza generalmente en condiciones acuosas, es decir, con membranas húmedas, en la que la solución se desgasifica para eliminar el oxígeno. En caso de que se utilicen condiciones secas, el oxígeno también se elimina del sistema, mediante el uso de una atmósfera de gas inerte, depuradores de oxígeno etc.

Es más, el objetivo claro de dichas membranas y procesos de la técnica anterior es evitar o minimizar la adhesión de células a la membrana que se utilizará generalmente en tratamientos de diálisis. Esto es contrario al objetivo de la presente invención que se centra en proporcionar una superficie que es favorable a la adhesión y crecimiento de las células. En consecuencia, los métodos descritos en la técnica anterior están diseñados para proporcionar membranas que no serán útiles para el fin de la presente invención, es decir, el cultivo de células.

El documento EP 1 795 254 A1 describe la formación de una membrana basada en polisulfona, en la que la membrana se expone a un rayo radiactivo, tal como rayo gamma, en condiciones en que la concentración de oxígeno en la atmósfera ambiente alrededor de la membrana es de 0,001 a 0,1 % o inferior y el contenido de humedad de la membrana es de 0,2 a 7 % en peso, relacionado con el peso de la misma. Se afirma en esta referencia que las concentraciones de oxígeno más altas, especialmente el uso de aire atmosférico, darán lugar a radicales de oxígeno excitados que romperán las cadenas principales de los polímeros y las descompondrán y que por lo tanto es deseable tener una atmósfera de gas inerte, preferentemente también en presencia de un depurador de oxígeno. Puesto que es difícil excluir de manera absoluta oxígeno, el límite antes mencionado se sugiere como el nivel más alto de oxígeno. El documento EP 1 795 254 A1 observa además que la dosis de radiación debe ser de 1 a 50 kGy, o mejor de 10 a 30 kGy, en caso de uso de rayos gamma. Las dosis más bajas darán como resultado una esterilización insuficiente mientras que dosis más altas desintegrarán los componentes de la membrana. La referencia no contempla el uso de las membranas para el cultivo celular.

El documento JP 2003/245526 también describe un método de irradiación de una membrana de fibras huecas sin utilizar fibras húmedas (llenas de agua). En este método, el contenido de humedad se ajusta a al menos 4 % con respecto al peso de las membranas de fibras huecas. La concentración de oxígeno en el módulo de membrana de fibras huecas se ajusta a 0,1 a 3,6 %.

El documento US 2006/191844 describe el tratamiento de un módulo de membrana cargándola con una solución acuosa desgasificada RO seguido de sellado, en el que el módulo se expone entonces a 10 a 60 kGy de rayos gamma. Cuando la dosificación de rayos gamma es demasiado alta, el polímero hidrófobo, el polímero hidrófilo y/o la carcasa pueden desintegrarse y deteriorarse. De este modo, la dosificación de rayos gamma se desvela para que sea preferentemente 50 kGy o menos, particularmente 30 kGy o menos. Cuando se utiliza agua no desgasificada, el oxígeno disuelto en el agua oxida y deteriora los componentes de la membrana.

El documento WO 2006/135966 A1 desvela un método de reticulación de los componentes hidrófilos de una membrana, por ejemplo PVP, utilizando radiación gamma, opcionalmente combinado con un proceso de tratamiento con solución química. La dosificación utilizada es de 1 a 100 kGy, preferentemente de 10 a 50 kGy. Se dice que la irradiación es aplicable a las membranas secas y húmedas. Sin embargo, los ejemplos dados utilizan membranas húmedas y una dosificación no superior a 35 kGy. El uso de membranas preparadas según su referencia para el cultivo de células no se menciona.

El documento EP 1 439 212 A1 también describe la irradiación de una polisulfona y una membrana a base de PVP con rayos gamma. Una vez más, la membrana se irradia en estado húmedo, en la que la membrana debe contener al menos 1 % en peso o más de agua o sumergirse en agua, y las dosis no deben exceder 50 kGy a fin de evitar cualquier degradación de la membrana. Se enseña que la irradiación reducirá la adhesión de las plaquetas a la superficie de la membrana, lo que contrasta con el objetivo de la presente invención, es decir, la adhesión de las células a la superficie de la membrana.

El documento JP 2004/305840 describe una membrana de fibras huecas compuesta de un polímero hidrófobo y un polímero hidrófilo que se esteriliza por irradiación con rayos gamma después del hilado. La irradiación se realiza en un estado herméticamente cerrado desoxigenado seco a baja temperatura. Es importante tener en cuenta que una vez más la exclusión de oxígeno es crucial.

Sumario de la invención

En la presente invención, se desvela un proceso de preparación de membranas que se tratan, después de la preparación, con rayos beta o gamma o un haz de electrones a una dosis de 70 a 175 kGy en presencia de oxígeno como se describe en la reivindicación 1.

Durante la irradiación, la membrana puede estar en estado seco o húmedo, y puede estar cubierta por aire, agua o soluciones acuosas, respectivamente. No de acuerdo con la invención, se describen métodos de uso de la membrana para promover la unión celular y para el cultivo de células, en particular células adherentes, sin la necesidad de pre-tratar o pre-cubrir las membranas con cualquiera de los componentes de la matriz extracelular. Las membranas preferentes en el contexto de la presente invención son membranas sintéticas basadas en polisulfona,

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basadas en poliétersulfona o basadas en poli(aril)etérsulfona, que comprenden, además, PVP y opcionalmente pequeñas cantidades de polímeros adicionales, tales como, por ejemplo, poliamida o poliuretano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el número de MSC cultivadas de la médula ósea sin procesar en varios tipos de membrana en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (14 días) y segunda (7 días) fases de crecimiento en [%] (Experimento 1). La línea horizontal indica el nivel de TCPS. Para las abreviaturas utilizadas véase la Tabla I.

La Figura 2 muestra el número de MSC cultivadas de la médula ósea sin procesar en varios tipos de membrana en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (14 días) y segunda (7 días) fases de crecimiento en [%] (Experimento 2). La línea horizontal indica el nivel de TCPS. Para las abreviaturas utilizadas véase la Tabla I.

La Figura 3 muestra la morfología de MSC sembradas en placas en placas de TCPS convencional en el día 5 de la segunda fase de crecimiento. Las MSC se derivan del Experimento 2 como se describe en el Ejemplo 10. Las abreviaturas son como se describe en la Tabla I. (A) Membrana VTK, cubierta con agua, 0 % de ácido acrílico, 75 kGy. (B) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,0001 % de ácido acrílico, 75 kGy. (C) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,001 % de ácido acrílico, 75 kGy. (D) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico, 75 kGy. (E) TCPS. (F) Membrana VTK, cubierta con aire, 25 kGy. (G) Membrana VTK, cubierta con aire, 75 kGy. (H) Membrana VTK, sin tratar. (J) Membrana VTK + recubrimiento FN.

La Figura 4 muestra el número de MSC cultivadas de MSC pre-seleccionadas en varios tipos de membrana en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (9 días) y segunda (7 días) fases de crecimiento en [%] (Experimento 1). La línea horizontal indica el nivel de TCPS. Para las abreviaturas utilizadas véase la Tabla II y el Ejemplo 11.

La Figura 5 muestra el número de MSC cultivadas de MSC pre-seleccionadas en varios tipos de membrana en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (10 días) y segunda (11 días) fases de crecimiento en [%] (Experimento 2). La línea horizontal indica el nivel de TCPS. Para las abreviaturas utilizadas véase la Tabla II y el Ejemplo 11.

La Figura 6 muestra una comparación de las membranas que han sido directamente irradiadas con rayos gamma y las membranas que se esterilizaron con vapor antes de la irradiación con rayos gamma. El experimento como se describe en el Ejemplo 12 se dirige al número de MSC que se adhieren a la superficie de una membrana determinada en relación con el número de MSC que se adhieren a una superficie de TCPS convencional en [%]. La línea horizontal representa el nivel de TCPS.

La Figura 7 muestra el número de MSC cultivadas de la médula ósea sin procesar en membranas irradiadas con 75 kGy con y sin esterilización con vapor y ETO, en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (11 días) y segunda (7 días) fases de crecimiento en [%]. La línea horizontal indica el nivel de TCPS.

La Figura 8 muestra la adipogénesis exitosa de MSC que se cultivaron en las membranas de la invención. (A) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico, 75 kGy. (B) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de alilamina, 75 kGy. (C) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico y 0,01 % de alilamina, 25 kGy.

La Figura 9 muestra la osteogénesis exitosa de MSC que se cultivaron en las membranas de la invención. (A) Membrana en TCPS (comparación). (B) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico, 75 kGy. (C) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de alilamina, 75 kGy. (D) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico + 0,01 % de alilamina, 75 kGy. (E) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,01 % de ácido acrílico, 25 kGy. (F) Membrana VTK, cubierta con agua, 0,5 % de ácido acrílico, 25 kGy.

La Figura 10 muestra los resultados de un cultivo de células a corto plazo de fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) en membranas VTK irradiadas con 25 kGy (cubierta con aire) o 75 kGy (cubierta con agua) en comparación con TCPS. Las columnas de la izquierda muestran el número de células NHDF después de 1 día con respecto al número de células sobre TCPS, es decir, representan la eficiencia de la adhesión celular. Las columnas de la derecha muestran el número de células NHDF después de 5 días en relación con el número de células en TCPS, es decir, representan la eficiencia de la proliferación celular.

La Figura 11 muestra los resultados de un cultivo de células a corto plazo de células de hepatocarcinoma humano (HepG2) en las membranas VTK irradiadas con 25 kGy (cubiertas con aire) o 75 kGy (cubiertas con agua) en comparación con TCPS. Las columnas de la izquierda muestran el número de células HepG2 después de 1 día con respecto al número de células sobre TCPS, es decir, representan la eficiencia de la adhesión celular. Las columnas de la derecha muestran el número de células HepG2 después de 5 días en relación con el número de células en

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TCPS, es decir, representan la eficiencia de la proliferación celular. Las membranas según la invención muestran una adhesión y proliferación celular que es superior a una superficie de TCPS.

La Figura 12 muestra los resultados de un cultivo de células a corto plazo de células epiteliales renales humanas (HK-2) en membranas VTK irradiadas con 25 kGy (cubiertas con aire) o 75 kGy (cubiertas con agua) en comparación con TCPS. Las columnas de la izquierda muestran el número de células HK-2 después de 1 día con respecto al número de células sobre TCPS, es decir, representan la eficiencia de la adhesión celular. Las columnas de la derecha muestran el número de células HK-2 después de 5 días en relación con el número de células en TCPS, es decir, representan la eficiencia de la proliferación celular.

La Figura 13 muestra los resultados de un cultivo de células a corto plazo de células epiteliales renales caninas (MDCK) en membranas VTK irradiadas con 25 kGy (cubiertas con aire) o 75 kGy (cubiertas con agua) en comparación con TCPS. Las columnas de la izquierda muestran el número de células MDCK después de 1 día con respecto al número de células sobre TCPS, es decir, representan la eficiencia de la adhesión celular. Las columnas de la derecha muestran el número de células MDCK después de 5 días en relación con el número de células en TCPS, es decir, representan la eficiencia de la proliferación celular.

La Figura 14 muestra la relación entre la relación de tiempo de duplicación de las células en biorreactores basado en membranas según la invención en comparación con el cultivo en matraz convencional (véase el Ejemplo 15). El tiempo de duplicación hace referencia al tiempo de duplicación de las células en un biorreactor dado/tiempo de duplicación de las células en matraces de control.

La Figura 15 muestra la viabilidad de MSC que se cultivaron a partir de una médula ósea sin procesar. La viabilidad de las células cosechadas estaba por encima del 90 % para todos los biorreactores ensayados.

La Figura 16 muestra el fenotipo de células cosechadas de biorreactores según la invención. Las MSC se cultivaron a partir de la médula ósea sin procesar. Como puede observarse, las células expandidas en el biorreactor lleno de agua VTK (75 kGy) mostraron valores comparativamente altos para CD45 y HLA-DR. Las células cosechadas de los demás biorreactores mostraron el fenotipo esperado de MSC con respecto a CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 y HLA-DR.

La Figura 17 muestra el número de MSC cultivadas a partir de MSC pre-seleccionadas en varios tipos de membrana en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (10 días) y segunda (11 días) fases de crecimiento en [%]. Los resultados indican los efectos de la dosis de rayos gamma sobre las propiedades de proliferación celular de las membranas. La línea horizontal indica el nivel de TCPS.

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención es un proceso de preparación de una membrana polimérica que ha sido sometida, ya sea en un estado seco o húmedo, a irradiación con rayos beta o gamma o haz de electrones a una dosis de 70 a 175 kGy en presencia de oxígeno. La membrana, durante la irradiación, puede estar rodeada de aire, en la que el oxígeno está presente durante la irradiación en una concentración de 4 a 100 % en vol., p. ej., 5 a 30 % en vol., o 15 a 25 % en vol.

La membrana polimérica comprende polímeros hidrófobos o hidrófilos, o ambos. En una realización, la membrana comprende una combinación de al menos un polímero hidrófilo y al menos un polímero hidrófobo. En otra realización, la membrana comprende copolímeros hidrófilos. En otra realización, la membrana comprende copolímeros hidrófilos y polímeros hidrófobos. En otra realización, la membrana comprende homopolímeros hidrófilos. En una realización adicional, la membrana comprende homopolímeros hidrófilos y polímeros hidrófobos.

En una realización de la invención, la solución polimérica utilizada para preparar la membrana comprende polímeros hidrófobos e hidrófilos en cantidades tales que la fracción de polímero hidrófobo en la solución polimérica se comprende entre 5 y 20 % en peso y la fracción del polímero hidrófilo se comprende entre 2 y 13 % en peso.

En una realización particular, la membrana comprende un primer componente polimérico hidrófobo, un segundo componente polimérico hidrófilo, y, opcionalmente, un tercer componente polimérico hidrófobo.

Dicho primer polímero hidrófobo se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en poliamida (PA), poliaramida (PaA), poli(aril)étersulfona (PAES), poliétersulfona (PES), polisulfona (PSU), poliarilsulfona (PASU), policarbonato (PC), poliéter, poliuretano (PUR), poliéterimida y copolímeros de dichos polímeros. Dicho segundo polímero hidrófilo se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), monoéster poliglicólico, derivados celulósicos solubles en agua, copolímeros de polisorbato y óxido de polietileno-óxido de polipropileno. Dicho tercer polímero hidrófobo se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en poliamida (PA), poliaramida (PAA), poli(aril)étersulfona (PAES), poliétersulfona (PES), polisulfona (PSU), poliarilsulfona (PASU), policarbonato (PC), poliéter, poliuretano (PUR), poliéterimida y

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copolímeros de dichos polímeros. Las membranas se pueden preparar en forma de membranas de lámina plana o de fibras huecas.

En un aspecto, la membrana se puede utilizar para la unión o adhesión celular, crecimiento celular y expansión o almacenamiento de células sin la necesidad de pre-tratar o pre-cubrir la membrana con MEC. Las ventajas de utilizar una membrana sin ninguna MEC para el cultivo celular son, por ejemplo, un menor coste en términos de ahorro de tiempo y menos etapas de proceso, una reducción significativa del riesgo de contaminación acarreado por MEC (cumplimiento de BPF) o el mayor número de etapas de proceso necesarias para el recubrimiento de una membrana, materiales definidos significativamente mejor y protocolos para la producción de células.

Naturalmente es posible pre-tratar o pre-cubrir adicionalmente la membrana de la presente invención con una o más MEC que se conocen generalmente en la técnica. Especialmente para aplicaciones que no tienen por objeto expandir o cultivar células o tejidos para la re-implantación en el huésped, tal pre-tratamiento puede mejorar aún más el rendimiento de la membrana en términos de adhesión o proliferación. Sin embargo, siempre es preferible utilizar la membrana de la invención sin ningún recubrimiento con MEC.

En un aspecto adicional de la presente invención, el rendimiento en el cultivo de células se puede mejorar significativamente mediante la preparación de una membrana de fibras huecas como se describe en la presente memoria, y mediante el uso de dicha membrana de fibras huecas o un fascículo de las mismas en un proceso de cultivo continuo como alternativa a las técnicas de cultivo en placas. Además de un proceso continuo, la membrana de fibras huecas se puede utilizar en un proceso estático o semi-continuo.

La membrana se puede preparar en formas que confieren las propiedades adhesivas específicas para el conjunto de la membrana, es decir, en caso de una membrana de fibras huecas para aplicaciones continuas, hacia el exterior y el interior de la membrana de fibras huecas.

En un aspecto adicional, la membrana también proporciona un sistema de co-cultivo celular de dos o más tipos de células diferentes.

Un aspecto adicional es que la membrana promueve muy bien la formación de una monocapa de células óptima en términos de diferenciación e integridad sin la necesidad de pre-cubrir la superficie de la membrana con cualquier MEC. La membrana proporciona la retención de la morfología celular típica, una monocapa se forma fácilmente, y uniones estrechas pueden ser creadas. En el contexto de la presente invención, una monocapa se refiere a una capa de células en las que ninguna célula está creciendo en la parte superior de otra, pero todas están creciendo una al lado de la otra y están en muchos casos en contacto entre sí en la misma superficie de crecimiento, a pesar de esto, no es necesario para todas las aplicaciones potenciales de la membrana.

La membrana se puede utilizar por lo tanto ventajosamente, por ejemplo,

(a) en la tecnología de cultivo de tejidos, es decir, para el establecimiento de implantes bioartificiales, tales como riñones o hígados bioartificiales (véase también Atala (2006);

(b) para el cultivo de células adherentes, tales como, por ejemplo, MSC, células musculares lisas, células de la piel, células nerviosas, neuroglias o células endoteliales en general, o células en suspensión, tales como células madre hematopoyéticas, células de sangre de cordón, células madre neurales, etc., para su uso en terapias médicas a través de la inyección de células, que necesitan ser expandidas in vitro antes de ser reimplantadas en el huésped;

(c) para la expansión y proporción de células que sirven como productores de bioproductos tales como factores de crecimiento, proteínas recombinantes, citoquinas o anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales;

(d) para la preparación de cultivos de células adherentes, preferentemente cultivos en monocapa de células, para el estudio de determinados tipos de células o para el estudio de la influencia de algún fármaco en las células (procedimientos de identificación sistemática), tales como, por ejemplo, agentes contra el cáncer, antifúngicos, antibióticos, antivirales (incluyendo anti-VIH) y fármacos anti-parasitarios,

(e) o cualquier otra aplicación que se base en o requiera el cultivo de expansión o almacenamiento de células adherentes o en suspensión en un sistema in vitro.

La membrana de la invención puede tener cualquier geometría adecuada según las necesidades del uso previsto, es decir, puede ser una lámina plana, una fibra hueca o un fascículo de fibras huecas, o puede ser conformada para formar cámaras u otras geometrías deseadas. La unidad de núcleo para la expansión de células es preferentemente un sistema de membrana a base de fibras huecas que permite el intercambio suficiente de O2 y CO2, suministro de nutrientes y eliminación de residuos. La superficie de la membrana está diseñada para permitir la adhesión y la proliferación de células que tienen las propiedades deseadas a través de las características superficiales específicas. Las ventajas del cultivo de las células en el interior de fibras huecas se basan en la relación de superficie con respecto al volumen ventajosa que resulta en la minimización del consumo medio en el proceso de cultivo, la minimización de las necesidades de espacio y la minimización de la mano de obra en comparación con un frasco convencional o métodos de cultivo de apilamiento de células. Otra ventaja de la estructura de fibras huecas es trayectorias uniformes de flujo controlado.

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La membrana se puede utilizar en diversas clases de expansión celular o dispositivos o sistemas de cultivo celular, como se describe, por ejemplo, en los documentos US 2003/0203478 A1, US 6.150.164 o US 6.942.879.

La membrana se puede utilizar ventajosamente para el cultivo de células adherentes en general. Las células adherentes se definen, en el contexto de la presente invención, como células de unión a un sustrato que se van a mantener, expandir, diferenciar, almacenar, etc. La membrana se utilizará para el cultivo, por ejemplo, de células madre, incluyendo células embrionarias y madre adultas, especialmente células madre mesenquimales (MSC), fibroblastos, células epiteliales, hepatocitos, células endoteliales, células musculares, condrocitos, etc.

En un primer aspecto de la invención, las membranas se preparan a partir de una mezcla de polímeros que comprende polímeros hidrófobos e hidrófilos en cantidades tales que la fracción de polímero hidrófobo en la solución polimérica utilizada para preparar la membrana es de 5 a 20 % en peso y la fracción del polímero hidrófilo es de 2 a 13 % en peso. Al menos dicho polímero hidrófobo se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en poliamida (PA), poliaramida (PAA), poliarilétersulfona (PAES), poliétersulfona (PES), polisulfona (PSU), poliarilsulfona (PASU), policarbonato (PC), poliéter, poliuretano (PUR), poliéterimida y copolímeros de dichos polímeros, preferentemente poliétersulfona o una mezcla de poliarilétersulfona y poliamida. Al menos dicho polímero hidrófilo se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), monoéster poliglicólico, derivados celulósicos solubles en agua, copolímeros de polisorbato y óxido de polietileno-polipropileno, preferentemente polivinilpirrolidona.

Una membrana que se puede utilizar preferentemente en el contexto de la presente invención comprende, en la solución polimérica para la preparación de la membrana, de 11 al 19 % en peso de un primer polímero seleccionado entre el grupo que consiste en polisulfona (PS), poliétersulfona (PES) y poliarilétersulfona (PAES), de 0,5 a 13 % en peso de un segundo polímero tal como polivinilpirrolidona (PVP), de 0 % en peso a 5 % en peso, preferentemente de 0,001 a 5 % en peso de una poliamida (PA), de 0 a 7 % en peso de agua y, el resto hasta 100 % en peso, de un disolvente seleccionado entre el grupo que consiste en N-metil-2-pirrolidona (NMP), que es preferente, N-etil-2- pirrolidona (NEP), N-octil-2-pirrolildona (NOP), dimetilacetamida, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y gamma-butirolactona (GBL).

Preferentemente, la polivinilpirrolidona (PVP) en la solución polimérica consiste en una combinación de al menos dos homopolímeros de polivinilpirrolidona, en la que uno de los homopolímeros de polivinilpirrolidona (= PVP de bajo peso molecular) tiene un peso molecular relativo medio de aproximadamente 10.000 g/mol a 100.000 g/mol, preferentemente de aproximadamente 30.000 g/mol a 70.000 g/mol, y otro de los homopolímeros de

polivinilpirrolidona (=PVP de alto peso molecular) tiene un peso molecular relativo medio de aproximadamente 500.000 g/mol a 2.000.000 g/mol, preferentemente de aproximadamente 800.000 g/mol a 2.000.000 g/mol. Los ejemplos de tales homopolímeros de PVP son PVP K85, una PVP de alto peso molecular que tiene un peso

molecular de aproximadamente 825.000 Da, y PVP K30, una PVP de bajo peso molecular que tiene un peso

molecular de aproximadamente 66.800 Da. En una realización preferente de la presente invención, la solución polimérica para la preparación de la membrana comprende de 0,5 a 5 % en peso de una PVP de alto peso molecular y de 1 a 8 % en peso de una PVP de bajo peso molecular.

Los métodos de preparación de tales membranas se describen en detalle, por ejemplo, en los documentos US-A 4.935.141, US-A 5.891.338 y EP 1 578 521 A1, todos los cuales se incorporan en la presente memoria por referencia. Los ejemplos para este tipo de membrana, que puede tratarse eficazmente según la presente invención, son membranas Gambro Polyflux™ (poliarilétersulfona/PVP/poliamida), que se utilizan actualmente en productos comerciales, tales como, por ejemplo, las series L y H de Polyflux™; membranas de Arylane™

(poli(aril)étersulfona/PVP); o membranas de DIAPES™ o PUrEmA™ (poli(aril)étersulfona/PVP) u otras membranas de diálisis comerciales basadas en combinaciones de polímeros hidrófilos e hidrófobos, p. ej., combinaciones que comprenden PVP y PES o polisulfona.

En un segundo aspecto de la presente invención, la solución polimérica utilizada para preparar la membrana de la invención comprende de 12 al 15 % en peso de poliétersulfona o polisulfona como polímero hidrófobo y de 5 al 10 % en peso de pVp, en la que dicha PVP consiste en un componente de PVP de bajo y alto peso molecular. La PVP total contenida en la solución de hilado consiste en 22 a 34 % en peso, preferentemente de 25 a 30 % en peso, de un componente de alto peso molecular (> 100 kDa) y 66 a 78 % en peso, preferentemente de 70 a 75 % en peso de un componente de bajo peso molecular (<= 100 kDa). Los ejemplos de PVP de alto y bajo peso molecular son, por ejemplo, PVP K85/K90 y PVP K30, respectivamente. La solución polimérica utilizada en el proceso de la presente invención comprende además preferentemente 66 a 86 % en peso de disolvente y de 1 a 5 % en peso de aditivos adecuados. Los aditivos adecuados son, por ejemplo, agua, glicerol y/u otros alcoholes. El agua es especialmente preferente y, cuando se utiliza, está presente en la solución de hilado en una cantidad de 1 a 8 % en peso, preferentemente de 2 a 5 % en peso. El disolvente utilizado en el proceso de la presente invención se selecciona preferentemente entre N-metilpirrolidona (NMP), dimetilacetamida (DMAC), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), butirolactona y mezclas de dichos disolventes. NMP resulta especialmente preferente. El fluido central o líquido del cilindro que se utiliza para la preparación de la membrana comprende al menos uno de los disolventes mencionados anteriormente y un medio de precipitación seleccionado entre agua, glicerol y otros alcoholes. Lo más preferentemente, el fluido central consiste en 45 a 70 % de medio de precipitación y 30 a 55 % en

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peso de disolvente. Preferentemente, el fluido central consiste en 51 a 57 % en peso de agua y 43 a 49 % en peso de NMP.

Los métodos de preparación de tales membranas se desvelan en detalle en la solicitud de patente europea n.° 08008229. Los ejemplos para este tipo de membrana, que puede tratarse eficazmente según la presente invención, son, por ejemplo, la membrana Gambro Revaclear™ y derivados de la misma. También es posible utilizar, en el contexto de la presente invención, las membranas que se utilizan actualmente en productos comerciales, tales como, por ejemplo, las membranas de la clase Fresenius FX™ (membranas Helixone™) o membranas de tipo Optiflux™) u otras membranas de diálisis comerciales basadas en combinaciones de polímeros hidrófilos e hidrófobos, p. ej., combinaciones que comprenden PVP y PES o polisulfona.

En un tercer aspecto de la presente invención, la solución polimérica utilizada para preparar la membrana comprende de 11 al 19 % en peso de un primer polímero seleccionado entre el grupo que consiste en polisulfona (PS), poliétersulfona (PES) y poliarilétersulfona (PAES) de 0,5 a 13 % en peso de un segundo polímero tal como polivinilpirrolidona (PVP), de 0,001 a 20 % en peso de un poliuretano (PU), de 0 a 7 % en peso de agua y un disolvente seleccionado entre el grupo que consiste en N-metil-2-pirrolidona (NMP), N-etil-2-pirrolidona (NEP), N- octil-2-pirrolildona (NOP), dimetilacetamida, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y gamma- butirolactona (GBL), una adición de hasta 100 % en peso. Dicho primer polímero está presente preferentemente en la solución polimérica en una cantidad de 13 y 14 % en peso, en especial preferentemente en una cantidad de 13,6 a 14 % en peso. La poliétersulfona (PES) y poliarilétersulfona (PAES) se utilizan preferentemente para la preparación de la membrana. Preferentemente, la polivinilpirrolidona (PVP) en la solución polimérica consiste en una combinación de al menos dos homopolímeros de polivinilpirrolidona, en la que uno de los homopolímeros de polivinilpirrolidona (= PVP de bajo peso molecular) tiene un peso molecular relativo medio de aproximadamente 10.000 g/mol a 100.000 g/mol, preferentemente de aproximadamente 30.000 g/mol a 70.000 g/mol, y otro de los homopolímeros de polivinilpirrolidona (= PVP de alto peso molecular) tiene un peso molecular relativo medio de aproximadamente 500.000 g/mol a 2.000.000 g/mol, preferentemente de aproximadamente 800.000 g/mol a 2.000.000 g/mol. Los ejemplos de tales homopolímeros de PVP son PVP K85, una PVP de alto peso molecular que tiene un peso molecular de aproximadamente 825.000 Da, y PVP K30, una PVP de bajo peso molecular que tiene un peso molecular de aproximadamente 66.800 Da. En una realización preferente de la presente invención, la solución polimérica para la preparación de la membrana comprende de 0,5 a 5 % en peso de una PVP de alto peso molecular y de 1 a 8 % en peso de una PVP de bajo peso molecular. El contenido de agua de la solución de hilado es preferentemente de 1 a 5 % en peso, más preferentemente de aproximadamente 3 % en peso. Diversos disolventes pueden utilizarse para la preparación de una membrana de la invención, tal como N-metil-2-pirrolidona (NMP), N-etil-2-pirrolidona (NEP), N-octil-2-pirrolidona (NOP), dimetilacetamida, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) o gamma-butirolactona (GBL) y mezclas de los mismos. El disolvente estará presente en una cantidad para añadir hasta 100 % en peso de la solución polimérica. El contenido del disolvente en la solución polimérica es preferentemente de 60 a 80 % en peso, más preferentemente de 67 a 76,4 % en peso.

Las membranas se pueden preparar, por ejemplo, en una geometría de lámina plana o de fibra hueca.

En una realización, las membranas tienen una estructura asimétrica. En el caso de fibras huecas, existe una fina capa de separación en el lado interior de las fibras. La estructura o morfología de la membrana puede variar de otra manera sin impacto significativo en su rendimiento con respecto a la adhesión y proliferación celular. Las membranas pueden tener, por ejemplo, una estructura de 3 capas o una estructura similar a una esponja o una estructura similar a una espuma. En una realización, la membrana se caracteriza además por la suavidad o baja rugosidad del lado de la adhesión celular.

En una realización, la permeabilidad hidráulica de una membrana puede variar de aproximadamente 0,110'4 cm3 a 200-10' 4 cm3/(cm2 bar s), p. ej., 0,110'4 cm3 a 1010'4 cm3/(cm2 bar s), o incluso 0,1-10-4 cm3 a 510'4 cm3/(cm2 bar s). A fin de lograr tal permeabilidad hidráulica sin obtener defectos en la estructura de la membrana, la viscosidad de la solución polimérica estará generalmente en el intervalo de 2.500 centipoises (cP) a 200.000 cP, o incluso de 10.900 cP a 25.600 cP para la producción de fibras huecas. Para la producción de una membrana de lámina plana, la viscosidad estará generalmente en el intervalo de 2.500 cP a 500.000 cP, o incluso de 4.500 cP a 415.000 cP.

Para la preparación de las membranas, los polímeros se disuelven en el disolvente a temperatura y presión constantes. La desgasificación de la solución polimérica se realiza en un horno de secado que crea un vacío (aproximadamente 100 mbar). La temperatura de la solución polimérica puede variar en un intervalo relativamente amplio. Es ventajoso elegir una temperatura en el intervalo de temperatura ambiente a 60 °C.

Para preparar una membrana de lámina plana, la solución polimérica final se cuela como una película uniforme sobre una superficie lisa tal como un portaobjetos de vidrio que actúa como una zona de soporte, mediante la utilización de una cuchilla de revestimiento especial. La velocidad de colada de la película polimérica puede variar en un intervalo relativamente amplio. Una velocidad comprendida entre 10 y 20 mm/s puede resultar apropiada. En un proceso a escala de laboratorio a modo de ejemplo, la solución polimérica se aplica primero constante sobre el portaobjetos de vidrio utilizando una jeringa. Es importante trabajar libre de burbujas. La cuchilla de revestimiento con una altura de espacio definida es accionada con velocidad constante, creando una película polimérica uniforme.

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Para una buena distribución del espesor, una cuchilla de revestimiento que tiene un espacio uniforme es aconsejable.

En una realización de la invención, el baño de precipitación comprende H2O en una cantidad de 30 a 100 % en peso, preferentemente en una cantidad de 56 a 66 % en peso, y un disolvente, tal como NMP, en una cantidad de 0 a 70 % en peso, preferentemente 34 a 44 % en peso. La temperatura del baño de precipitación se puede variar en un intervalo relativamente amplio. Puede ser ventajoso aplicar una temperatura comprendida entre 0 °C y 80 °C, o entre 30 °C y 50 °C. El tiempo de precipitación también se puede variar. Como ejemplo, el tiempo de precipitación puede ser de aproximadamente cinco minutos. El baño de precipitación consiste preferentemente en H2O y un disolvente. El baño comprende preferentemente H2O en una cantidad de 30 % en peso a 100 % en peso, y un disolvente seleccionado entre N-metil-2-pirrolidona (NMP), N-etil-2-pirrolidona (NEP), N-octil-2-pirrolildona (NOP), dimetilacetamida, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) o gamma-butirolactona (gBl) y mezclas de los mismos en una cantidad de 70 % en peso a 0 % en peso. En una realización de la invención, el baño de precipitación comprende H2O en una cantidad de 56 a 66 % en peso, y un disolvente en una cantidad de 34 a 44 % en peso. NMP es un disolvente especialmente adecuado en el contexto de la presente invención.

La membrana precipitada se almacena entonces en un no disolvente hasta que se corta la membrana. Después del corte, la membrana se lava, se seca y se esteriliza.

El espesor de una membrana de lámina plana de la invención puede variar entre 15 pm y 200 pm. Un espesor de 35 |jm a 50 pm puede ser especialmente ventajoso para la mayoría de aplicaciones.

Las membranas también se pueden preparar en geometría de fibras huecas. Para la preparación de tales membranas de fibras huecas, la solución se bombea a través de un troquel de hilado y se forma la fibra hueca líquida. La concentración de disolvente en el centro origina una estructura abierta en el lado interior de la membrana. Los poros más pequeños se encuentran directamente en el lado interior de la membrana. Cuando está en uso, la capa selectiva en el interior está en contacto directo con el medio celular.

En una realización, el baño de precipitación consiste en agua. La temperatura del baño de precipitación se puede variar en un amplio intervalo, pero la temperatura ambiente de hasta aproximadamente 40 °C se utiliza ventajosamente en el proceso. La distancia entre el troquel y el baño de precipitación se encuentra en el intervalo de 0 a 100 cm, p. ej., de 50 a 100 cm. La temperatura del troquel (hilera) también se puede variar. Las temperaturas comprendidas entre 20 y 80 °C pueden ser utilizadas. Puede resultar ventajoso aplicar temperaturas comprendidas entre 40 y 55 °C. La velocidad de hilado se puede elegir para que se encuentre en el intervalo de 5 a 80 m/min, p. ej., de 11 a 40 m/min.

Las dimensiones de una membrana de fibras huecas se pueden variar dependiendo del uso pretendido de la membrana. El diámetro interior se comprende generalmente en el intervalo de 50 a 2.000 pm. Para muchas aplicaciones, un diámetro interior de 100 a 950 pm puede ser ventajoso. El espesor de pared se comprende generalmente en el intervalo de 25 a 55 pm.

La Lp resultante para una membrana se encuentra en el intervalo de 0,1-10"4 a 200-10"4 cm3/(cm2 bar s), p. ej., 0,1-10"4 a 1010-4 cm3/(cm2bars), o incluso de 0,1-10"4 a 5-10"4 cm3/(cm2bars). En otra realización, la Lp de las membranas se encuentra en el intervalo de 2-10"4 a 18-10"4 cm3/(cm2bars). En otra realización, la Lp de las membranas se encuentra en el intervalo de 510-4 a 1510-4 cm3/(cm2bars). Es decir, membranas que se van a utilizar para el cultivo celular pueden ser llamadas membranas de bajo flujo.

Existen dos maneras para la producción de membranas que pueden ser referidas como "húmeda" y "seca". En caso de que se preparen membranas "húmedas", las membranas tienen que ser secadas por separado en un tubo o en un horno después de que hayan sido preparadas. Con este fin, haces de fibras (por ejemplo, de 30 a 15.000 fibras) se colocan en un recipiente de plástico o metal. El aire caliente se hace pasar a través de este recipiente para secar las membranas. La segunda forma es la denominada "secado en línea", que es una manera eficaz de preparar directamente fibras huecas secas en una máquina de hilado. Ambos procedimientos son aplicables para llegar a las membranas que se pueden tratar y utilizar según la invención.

Según la invención, las membranas que se han descrito antes son tratadas cubriéndolas con aire o agua o soluciones acuosas que contienen aditivos adecuados, tales como, por ejemplo, ácido acrílico, alilamina o acrilamida en concentraciones de 0,00001 % en peso a 5 % en peso, p. ej., de 0,0001 a 0,01 % en peso, y sometidas a irradiación con rayos gamma, beta o haces de electrones en presencia de oxígeno.

Para llegar a las membranas que pueden servir para los fines de cultivo celular, las membranas pueden ser colocadas en una cámara de irradiación y sometidas a irradiación gamma, beta, o haces de electrones, en particular irradiación con rayos gamma, utilizando las dosis de radiación de 70 a 175 kGy. En otro aspecto de la presente invención, se utilizan dosis de 70 a 100 kGy.

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La irradiación con rayos gamma se puede realizar, por ejemplo, mediante el uso de una fuente de Co-60. La irradiación con haces de electrones puede llevarse a cabo mediante el uso de un acelerador de haces de electrones. La irradiación con rayos beta puede realizarse utilizando una fuente de radiación beta, p. ej., Sr-90 o Ru-106.

En una realización de la presente invención, la membrana se somete a irradiación en condiciones secas, es decir, la membrana está cubierta con o rodeada por aire. La expresión "seco", en el contexto de la presente invención, no excluye que el agua esté presente dentro de la estructura porosa de la membrana, es decir, se tiene por objeto que abarque el intervalo de la ausencia completa de agua a una condición en la que la estructura porosa completa de la pared de la membrana se llena con agua.

En contraste con la irradiación con rayos gamma conocida de las membranas que se efectúa, por ejemplo, con el fin de esterilizar la membrana o reticular ciertos componentes de la membrana, tales como, por ejemplo, PVP, la presencia de oxígeno durante la irradiación es crucial para la obtención de membranas adecuadas para los fines de cultivo celular. El aire circundante durante la irradiación, en un aspecto de la presente invención, puede ser aire sin modificar, que contiene aproximadamente (por contenido/volumen molar) 78,08 % de nitrógeno, 20,95 % de oxígeno, 0,93 % de argón, 0,038 % de dióxido de carbono, pequeñas cantidades de otros gases, y una cantidad variable de vapor de agua. En otro aspecto de la presente invención, el contenido de oxígeno del aire circundante se puede aumentar, p. ej., mediante la introducción adicional de gas de oxígeno en el sistema. La concentración de oxígeno se puede aumentar hasta un límite de aproximadamente 100 %, p. ej., hasta 30 %. En otro aspecto de la presente invención, la concentración de oxígeno puede reducirse hasta un límite de aproximadamente 4 %. Las concentraciones de oxígeno de 4 % a 100 %, p. ej., de 4 a 30 % (por contenido/volumen molar) se utilizan para lograr los resultados deseados. Puede ser ventajoso utilizar una concentración de oxígeno de 5 % a 25 %, o incluso de 15 % a 22 %.

En otra realización de la presente invención, las membranas se someten a irradiación en estado húmedo, o, en otras palabras, en condiciones acuosas. Las expresiones "húmedo" y "condiciones acuosas", en el contexto de la presente invención, se refieren a la presencia de agua durante el proceso de irradiación, es decir, las membranas pueden estar cubiertas por o sumergidas en agua. En una realización de la presente invención, se utiliza agua RO.

En otra realización de la presente invención, los aditivos pueden mezclarse con agua en bajas cantidades. Tales aditivos pueden mejorar el rendimiento de las membranas irradiadas para los fines de cultivo celular en general o para determinados tipos de células mediante la introducción de grupos funcionales a la superficie de la membrana. Los ejemplos de tales aditivos son el grupo de vinilo que contiene monómeros que tienen funcionalidades amino, carboxilo o carboxamida, p. ej., ácido acrílico, alilamina o acrilamida. En una realización particular, se utiliza ácido acrílico. En otra realización particular, se utiliza alilamina. Los aditivos pueden estar presentes en la solución acuosa en concentraciones de 0,00001 % en peso a 5 % en peso. Puede resultar ventajoso el uso de concentraciones de 0,0001 % en peso a 1 % en peso, o de 0,0001 % en peso a 0,1 % en peso. Las bajas concentraciones de un aditivo, tales como 0,0001 % en peso a 0,01 % en peso pueden demostrar ser eficaces.

Puede resultar ventajoso el uso de mayores dosis de radiación para la irradiación de membranas en estado húmedo, tales como dosis de 70 a 175 kGy.

El tiempo necesario para llegar a la dosis elegida puede variar en un intervalo relativamente amplio. Como ejemplo, con una fuente de Co-60, se pueden necesitar aproximadamente 6 a 7 horas para una dosis de 25 kGy, y aproximadamente 17 a 20 horas para una dosis de 75 kGy, es decir, el tiempo de irradiación se triplica. El tiempo necesario dependerá de la fuente como tal y su fuerza en el momento de la irradiación y necesita ser ajustado.

La temperatura también se puede variar en un amplio intervalo y dependerá también del material de la carcasa de la membrana, es decir, si la carcasa está fabricada de metal o de un material sintético. En general, la temperatura estará en el intervalo de 0 °C a 41 °C. En la mayoría de los casos, será conveniente utilizar temperatura ambiente.

En otra realización de la presente invención, las membranas se someterán a secado, preferentemente secado en línea, seguido de esterilización por vapor, antes de que se irradien, con el fin de conservar las características deseadas de bajo flujo. Una esterilización adicional con EtO (óxido de etileno), si así se desea o necesita en el proceso de preparación, se puede añadir sin influencia negativa sobre la eficacia de las membranas de la invención con respecto a su uso para fines de cultivo celular. Los métodos de esterilización por vapor o de esterilización por EtO de membranas son bien conocidos en la técnica.

Las membranas irradiadas pueden entonces ser utilizadas directamente para el cultivo de células de diferentes tipos, preferentemente células adherentes.

Las membranas exhiben características de crecimiento sustancialmente similares o superiores a las placas de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) que representan el criterio de referencia actual para la expansión de células utilizando frascos de cultivo o pilas de células.

Las membranas muestran tasas de expansión celular, eficiencia de re-unión de las células sobre membranas, y las características de la expansión posterior de las células que incluyen el control de morfología similar o superior a

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cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS), como se muestra en los ensayos realizados con células madre mesenquimales (MSC), fibroblastos, células epiteliales y hepatocitos.

No de acuerdo con la invención es un dispositivo de cultivo celular que comprende una membrana de la invención. Los ejemplos de la expansión de células o dispositivos o sistemas de cultivo de células que pueden ser modificados para comprender la membrana de la invención se desvelan en los documentos US 2003/0203478 A1, US-A 6.150.164, o US-A 6.942.879. El dispositivo puede comprender una pila de membranas de lámina plana o un haz de membranas de fibras huecas.

En una realización del dispositivo, la membrana forma una interfaz entre dos compartimentos de fluido del dispositivo. El dispositivo puede ser de construcción similar a los dispositivos de filtración disponibles comercialmente utilizados, por ejemplo, en hemodiálisis o hemofiltración.

Un dispositivo a modo de ejemplo comprende dos compartimentos separados por una membrana semipermeable montada en una carcasa, un primer compartimento interno equipado con dos accesos y un segundo compartimento externo que comprende uno o dos accesos, ambos compartimientos también están separados por un compuesto de encapsulamiento, basado en un compuesto adhesivo apropiado, destinado para formar, según corresponda, (i) una partición cilíndrica que separa ambos compartimentos de dicho dispositivo que contiene una membrana semipermeable del tipo de haz de fibras huecas como se ha definido anteriormente o (ii) un cierre hermético en dicho dispositivo que incluye una membrana semipermeable del tipo de membrana de lámina como se ha definido anteriormente.

Otro dispositivo a modo de ejemplo comprende una pluralidad de membranas de fibras huecas, que se contiene dentro de una cubierta exterior, y se configura para que el fluido dentro de un espacio exterior a las fibras huecas (es decir, un compartimento extracapilar) sea segregado a partir de fluido que pasa a través de las fibras huecas y sus orificios correspondientes. Adicionalmente, el dispositivo incluye dos cámaras terminales del colector dentro de la cubierta exterior en los extremos opuestos del dispositivo. Cada una de las dos bocas de una fibra hueca se conecta a una cámara terminal diferente. Las cámaras terminales y el compartimiento extracapilar están separadas por las membranas semipermeables de las fibras huecas. La composición dentro del compartimiento extracapilar puede controlarse, hasta cierto punto, por el corte de peso molecular, o el tamaño de poros, de las membranas de las fibras huecas.

En un modo operativo del dispositivo, las células se cultivan en el compartimiento extracapilar mientras que un medio de nutrientes se pasa a través de las fibras huecas. El medio se puede hacer pasar a través del compartimiento extracapilar o intracapilar. En otro modo operativo del dispositivo, las células se cultivan en el espacio intracapilar (es decir, lumen) de las fibras huecas, mientras que un medio de nutrientes se pasa a través del compartimento extracapilar y/o intracapilar. La naturaleza semipermeable de las fibras huecas permite que los nutrientes, gases y desechos de células pasen a través de las paredes de las fibras huecas mientras bloquea a las células de hacer lo mismo.

Los biorreactores de tipo de cubierta y tubo proporcionan varias ventajas. Para las células adherentes, el uso de varias fibras huecas proporciona, dentro de un volumen relativamente pequeño, una gran cantidad de superficie sobre la que las células pueden crecer. Esta gran cantidad de superficie también facilita la distribución localizada de medios de nutrientes a las células en crecimiento y recogida inmediata de los productos de desecho celular. Los biorreactores de tipo cubierta y tubo permiten el crecimiento de células en tasas de densidad mucho mayores de lo que es posible con otros dispositivos de cultivo celular. Pueden soportar densidades celulares superiores a 108 células por mililitro, mientras que otros dispositivos de cultivo celular están normalmente limitados a densidades de aproximadamente 106 células por mililitro.

Un aspecto adicional proporciona un dispositivo para el tratamiento extracorporal de fluidos corporales, que comprende células y una membrana como se describe en la presente memoria. En una realización, las células son células adherentes que forman una capa confluente sobre una superficie de la membrana, por ejemplo la superficie del lumen de una membrana de fibras huecas, o la superficie externa de una membrana de fibras huecas. Para el resto, el diseño del dispositivo puede ser similar al diseño descrito anteriormente para el dispositivo de cultivo celular. El fluido corporal a tratar se lleva a través de un espacio de fluido del dispositivo en el que se pasa por encima de la capa de células, permitiendo que las células extraigan componentes del fluido corporal, para metabolizar los componentes del fluido corporal, o para segregar los componentes en el fluido corporal.

Ejemplos

La evaluación de la idoneidad y la eficiencia de las membranas como se describe en la presente memoria se basa, en general, en las siguientes características principales: tasa de expansión celular, eficiencia de re-unión de las células sobre membranas, y las características de la expansión posterior de las células que incluyen el control de la morfología. Los ensayos se realizaron con células madre mesenquimales (MSC), fibroblastos, células epiteliales y hepatocitos con el fin de demostrar que las membranas según la presente invención son adecuadas para el cultivo

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de diversos tipos de células adhesivas. MSC fueron elegidas para el análisis minucioso del rendimiento de las membranas para el cultivo celular.

Métodos

Preparación de haces de mano, mini-módulos, filtros y e insertos de lámina plana

(A) Haces de mano

La preparación del haz de membranas después del proceso de hilado es necesaria para preparar el haz de fibras de una manera adecuada para que los ensayos de rendimiento tengan éxito. La primera etapa del proceso es cortar los haces de fibras a una longitud definida de 23 cm. La siguiente etapa del proceso consiste en la fusión de los extremos de las fibras. Un control óptico asegura que todas las fibras estén bien fundidas. Acto seguido, los extremos del haz de fibras se transfieren a una tapa de encapsulamiento. La tapa del encapsulamiento se fija mecánicamente y un tubo de encapsulamiento se pone sobre las tapas de encapsulamiento. Posteriormente, el encapsulamiento se efectúa con poliuretano. Después de la encapsulación se tiene que asegurar que el poliuretano pueda endurecerse durante al menos un día. En la siguiente etapa del proceso, el haz de membranas encapsulado se corta a una longitud definida y se abren los extremos de las fibras. La última etapa del proceso consiste en un control óptico del haz de fibras. Durante esta etapa del proceso, los siguientes puntos son controlados: (i) la calidad del corte (el corte es liso o existen daños en la cuchilla), (ii) calidad del encapsulamiento (es el número de fibras abiertas del proceso de hilado reducido por fibras que están encapsuladas o existen vacíos visibles en los que no hay poliuretano). Después del control óptico, los haces de membranas se almacenan en seco antes de que se utilicen para los diferentes ensayos de rendimiento.

(B) Preparación de mini-módulos

Se preparan mini-módulos [= haces de fibras en una carcasa] con etapas de proceso relacionadas. Se necesitan mini-módulos para asegurar una protección de las fibras y una fabricación muy limpia. La fabricación de los minimódulos difiere en los siguientes puntos: (i) el haz de fibras se corta a una longitud definida de 20 cm; (Ii) el haz de fibras se transfiere a la carcasa antes del proceso de fusión; (iii) el mini-módulo se pone en un horno de secado al vacío durante la noche antes del proceso de encapsulamiento.

(C) Preparación de filtros

El filtro comprende aproximadamente 8.000 a 15.000 fibras con una superficie efectiva de 0,9 a 1,7 m2. Un filtro se caracteriza por una carcasa cilíndrica con dos conectores para el suministro del fluido del medio de cultivo y aplica tapas en ambos lados, cada una con un conector centrado. El proceso de fabricación (tras enrollado) se puede dividir en las siguientes etapas principales: (i) los haces cortados (longitud de aprox. 30 cm) se transfieren a la carcasa con una garra especial de haz; (ii) los dos extremos de los haces están cerrados por un proceso de cierre; (iii) las fibras se encapsulan en la carcasa con poliuretano (PUR); (iv) los extremos se cortan para abrir las fibras, en las que se requiere una superficie lisa; (v) los extremos se inspeccionan visualmente para fibras cerradas o imperfecciones en el bloque de PUR; (vi) las tapas están pegadas a los conectores; (vii) tratamiento final: enjuague, ensayos de integridad, secado final; (viii) embalaje en bolsas especiales para etapas adicionales (p. ej., irradiación).

(D) Preparación de insertos de lámina plana

Las membranas planas están inmovilizadas sobre placas de vidrio. El funcionamiento de poliuretano como pegamento para los insertos se distribuye uniformemente en una placa. Los insertos se sumergieron con cuidado en poliuretano y de inmediato se pegaron a la membrana respectiva. Los insertos se sobrecargaron con una placa de vidrio e hierro y se secaron durante 16 a 18 horas. Los insertos de membrana plana se cortan y sueldan en bolsas de esterilización. Finalmente, los insertos se pueden esterilizar en un autoclave a 121 °C.

Permeabilidad hidráulica (Lp) de haces de mano y mini-módulos

La permeabilidad hidráulica de un haz de membranas se determina presionando un volumen exacto definido de agua bajo presión a través del haz de membranas, que se ha sellado en un lado, y midiendo el tiempo requerido. La permeabilidad hidráulica puede calcularse a partir del tiempo determinado, la superficie de la membrana efectiva, la presión aplicada y el volumen de agua presionado por la membrana. A partir del número de fibras, la longitud de la fibra, así como el diámetro interior de la fibra, se calcula la superficie efectiva de la membrana. El haz de membranas tiene que ser humedecido treinta minutos antes de que se realice el ensayo de Lp. Para este fin, el haz de membranas se coloca en una caja que contiene 500 ml de agua ultapura. Transcurridos 30 minutos, el haz de membranas se transfiere al sistema de ensayo. El sistema de ensayo consiste en un baño de agua que se templa a 37 °C y un dispositivo en el que el haz de membranas puede implementarse mecánicamente. La altura de llenado del baño de agua tiene que garantizar que el haz de membranas se encuentre bajo la superficie del agua en el dispositivo designado. Para evitar que una fuga de la membrana pueda ocasionar un resultado de ensayo incorrecto, un ensayo de integridad del haz de membranas y el sistema de ensayo tienen que ser llevados a cabo con

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antelación. El ensayo de integridad se realiza presionando aire a través del haz de membranas que está cerrado en un lado del haz. Las burbujas de aire indican una fuga del haz de membranas o el dispositivo de ensayo. Se ha de comprobar si la fuga puede estar asociada con la implementación incorrecta del haz de membranas en el dispositivo de ensayo o si una fuga de membrana verdadera está presente. El haz de membranas tiene que ser desechado si se detecta una fuga en la membrana. La presión aplicada del ensayo de integridad tiene que tener al menos el mismo valor que la presión aplicada durante la determinación de la permeabilidad hidráulica con el fin de asegurar, que no pueda producirse fuga alguna durante la medición de la permeabilidad hidráulica debido a una presión aplicada demasiado alta.

Permeabilidad difusiva de haces de mano

Los experimentos de difusión con solución isotónica de cloruro, así como fosfato diluido en fluido de diálisis (100 mg/l) se llevan a cabo para determinar las propiedades de difusión de una membrana. Un haz de mano se pone en una célula de medición. La célula de medición permite pasar la solución particular en el interior de la fibra hueca. Adicionalmente, la célula de medición se llena completamente con agua y un alto flujo transversal de agua destilada se establece para llevar lejos los iones particulares que pasan a la sección transversal de la membrana desde el interior de la fibra hueca hacia el exterior. Mediante el ajuste correcto de las relaciones de presión, se dirige una filtración cero, de manera que sólo las propiedades de difusión de la membrana se determinan (mediante el logro del gradiente de concentración máxima del ion particular entre el interior de la fibra hueca y los alrededores de la fibra hueca) y no una combinación de propiedades difusiva y convectiva. Una muestra del grupo se toma al principio y una muestra de la fracción retenida se toma después de 10 y 20 minutos. Las muestras de cloruro se valoran a continuación con una solución de nitrato de plata para determinar la concentración de cloruro. Las muestras de fosfato se analizan fotométricamente. De las concentraciones determinadas, la superficie efectiva de membrana A y las condiciones de flujo, la permeabilidad P, de cloruro o fosfato, respectivamente, se pueden calcular según la siguiente ecuación (2):

Px [10-4 cm/s] = [Qb/60/A] * ln [(ca-cd)/cr] * 104 (2)

con

P = permeabilidad difusiva [cm/s] c = concentración [mmol]

A = superficie efectiva de membrana [cm2]

índices:

x = sustancia (en este caso: cloruro o fosfato, respectivamente)

A = concentración de partida (suministro)

D = dializado R = fracción retenida Q b = flujo sanguíneo [ml/min]

Coeficiente de tamizado para mioglobina en solución acuosa (haz de mano)

Los experimentos del coeficiente de tamizado en solución acuosa de mioglobina y albúmina se realizan utilizando dos configuraciones experimentales diferentes con soluciones distintas. Como un primer ensayo se determina el coeficiente de tamizado de la mioglobina.

La concentración de mioglobina disuelta en tampón TFS es 100 mg/l. La fecha de caducidad de la solución acuosa es de entre 4 y 8 semanas. La solución tiene que ser almacenada en el refrigerador. Antes del experimento de coeficiente de tamizado, el ensayo de Lp se hace utilizando el método descrito anteriormente. El experimento de coeficiente de tamizado de mioglobina se ejecuta en un único paso mientras que las condiciones de ensayo se definen según se indica: el caudal intrínseco (Jv en cm/s) y la velocidad de cizallamiento de pared (Y^in s-1) son fijos mientras que se calcula el flujo sanguíneo (Qb) y la tasa de filtración (UF) (véase la ecuación (4) + (5)):

Qb [ml/min] = y * n * n * di3 * 60/32

(4)

UF [ml/min] = Jv * A * 60

(5)

con

n = cantidad de fibras

di = diámetro interno de la fibra [cm]

Y = velocidad de cizallamiento [s-1]

A = superficie efectiva de membrana [cm2]

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mientras que A se calcula según la ecuación (1):

Al ensayar un haz de mano o un mini-módulo, la velocidad de cizaNamiento se establece en 500 s-1 y el caudal intrínseco se define para ser 0,38-10" 04 cm/s.

Las primeras muestras se toman después de 15 minutos (grupo, fracción retenida y filtrado) y una segunda vez después de 60 min. Al final, el ensayo de haz se enjuaga durante algunos minutos con tampón TFS, acto seguido el ensayo se detiene.

Ejemplo 1

Preparación de una membrana de lámina plana

Una solución polimérica se preparó disolviendo poliétersulfona (Ultrason® 6020, BASF), polivinilpirrolidona (K30 y K85, BASF), poliuretano (Desmopan® 9665 DU, Bayer MaterialScience AG), así como agua destilada en N- metilpirrolidona (NMP) hasta obtener a 60 °C una solución transparente, altamente viscosa.

La fracción en peso de los diferentes componentes en la solución de hilado de polímero, PES/PVP (K85)/PVP (K30)/9665DU/H2O/NMP fue 14/3/5/2/3/73. La viscosidad de la solución polimérica resultante fue de 21.000 mPas.

La solución se filtró y se desgasificó. La desgasificación de la solución polimérica se realizó en un horno de secado a temperatura elevada (<100 °C) y presión reducida (aproximadamente 100 mbar). A continuación, se coló la solución polimérica final (automáticamente) como una película uniforme sobre una superficie lisa (portaobjetos de vidrio), que actuó como zona de soporte mediante la utilización de una cuchilla de revestimiento especial. En primer lugar, la solución polimérica se calentó a 60 °C en un horno y luego se aplicó directamente de forma estacionaria sobre el portaobjetos de vidrio utilizando una jeringa. La cuchilla de revestimiento con una altura definida del espacio (100 |jm) se accionó con una velocidad constante de 12,5 mm/s, creando así una película polimérica uniforme. Este portaobjetos de vidrio con la película delgada de polímero se sumergió rápidamente en el baño de coagulación. Como baño de coagulación, una mezcla de agua/NMP que contiene 56 % en peso de agua y 44 % en peso de NMP se utilizó a 50 °C. La precipitación de la membrana duró unos 5 minutos. Posteriormente, la membrana precipitada se recogió, se almacenó en no disolvente hasta que se prepararon todas las membranas de una serie y luego se cortó a un tamaño definido. Después del corte, las membranas se lavaron con agua destilada durante 30 minutos a 70 °C. Las etapas siguientes fueron secado en un horno a 60 °C durante la noche y, finalmente, envasado de las membranas en bolsas especiales utilizadas para esterilización. El espesor de la membrana era de 35 pm.

Ejemplo 2

Preparación de una membrana de lámina plana

Una solución polimérica se preparó disolviendo poliétersulfona (Ultrason® 6020, BASF), polivinilpirrolidona (K30 y K90, BASF), así como agua destilada en N-metilpirrolidona (NMP) a 60 °C hasta obtener una solución transparente altamente viscosa.

La fracción en peso de los diferentes componentes en la solución de hilado polimérica, PES/PVP (K90)/PVP (K30)/H2O/NMP fue 13,6/2/5/3/76,4. La viscosidad de la solución polimérica resultante fue de 5.900 mPas.

Se preparó una membrana como se describe en el Ejemplo 1. El espesor de la membrana era de 50 pm.

Ejemplo 3

Preparación de una membrana de fibras huecas

Una solución polimérica se preparó mezclando 13,5 % de poliétersulfona, 0,5 % de poliamida, 7,5 % de PVP K30 y 78,5 % de NMP. Una mezcla de 59 % en peso de agua y 41 % en peso de NMP sirvieron como fluido central. La viscosidad de la solución polimérica, medida a una temperatura de 22 °C era de 4.230 mPas.

El fluido central se calentó a 55 °C y se bombeó a través de una hilera de fibras huecas de dos componentes. La solución polimérica salía de la hilera a través de una ranura anular con un diámetro exterior de 0,5 mm y un diámetro interior de 0,35 mm. El fluido central salía de la hilera en el centro del tubo anular de solución polimérica con el fin de iniciar la precipitación de la solución polimérica desde el interior y para determinar el diámetro interior de la fibra hueca.

Al mismo tiempo, los dos componentes (solución polimérica y fluido central) entraban en un espacio separado de la atmósfera ambiente. El espacio se denomina eje de hilado. Una mezcla de vapor (100 °C) y aire (22 °C) se inyectó en el eje de hilado. La temperatura en el eje de hilado se ajustó a 49 °C y una humedad relativa de 99,5 % en la relación de vapor y aire y el contenido de disolvente en el mismo se ajustó a 3,9 % en peso, relacionado con el

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contenido de agua. El disolvente era NMP. La longitud del eje de hilado fue de 890 mm. Con la ayuda de la gravedad y un rodillo accionado por motor, la fibra hueca se extrajo de arriba a abajo, desde la hilera a través del eje de hilado en un baño de agua en dirección vertical. La velocidad de hilado fue de 50 m/min. La fibra hueca se llevó posteriormente a través de una cascada de baños de agua y temperaturas crecientes de 20 a 90 °C. La membrana de fibras huecas húmeda que sale del baño de enjuague con agua se seca en una etapa de secado en línea consecutiva. Después de una etapa de texturización opcional, se recogió la fibra hueca en un torno de hilar en forma de un haz. La superficie exterior de la fibra hueca según este ejemplo tenía 62.500 poros por mm2 que tiene un diámetro de poros en el intervalo de 0,5 a 3 pm.

Ejemplo 4

Preparación de una membrana de fibras huecas

Una solución polimérica se preparó mezclando 14,0 % en peso de poliétersulfona, 5,0 % en peso de PVP K30, 2,0 % en peso de PVP K85/K90, 3 % en peso de agua y 76,0 % de NMP. Una mezcla de 55 % en peso de agua y 45 % en peso de NMP sirvió como fluido central. La viscosidad de la solución polimérica, medida a una temperatura de 22 °C, fue de 5.400 mPas.

El fluido central se calentó a 55 °C y se bombeó a través de una hilera de fibras huecas de dos componentes. La solución polimérica salía de la hilera a través de una ranura anular con un diámetro exterior de 0,5 mm y un diámetro interior de 0,35 mm. El fluido central salía de la hilera en el centro del tubo anular de solución polimérica con el fin de iniciar la precipitación de la solución polimérica desde el interior y para determinar el diámetro interior de la fibra hueca. Al mismo tiempo, los dos componentes (solución polimérica y fluido central) entraban en un espacio separado de la atmósfera ambiente. El espacio se denomina eje de hilado. Se inyectó una mezcla de vapor (100 °C) y aire (22 °C) en el eje de hilado. La temperatura en el eje de hilado se ajustó a aproximadamente 45 °C y una humedad relativa del 99,5 % en la relación de vapor y aire. La longitud del eje de hilado fue de 890 mm. Con la ayuda de la gravedad y un rodillo accionado por motor, la fibra hueca se extrajo de arriba a abajo, desde la hilera a través del eje de hilado en un baño de agua en dirección vertical. La velocidad de hilado fue de 50 m/min. La fibra hueca se llevó posteriormente a través de una cascada de baños y temperaturas crecientes de 15 a 40 °C. La membrana de fibras huecas húmeda que deja el baño de enjuague con agua se secó en una etapa de secado en línea consecutiva. Después de una etapa de texturización, se recogió la fibra hueca en un torno de hilar en forma de un haz. Alternativamente, se pueden formar haces de mano.

Ejemplo 5

Preparación de una membrana de fibras huecas

Una solución polimérica se preparó disolviendo poliétersulfona (Ultrason® 6020, BASF), polivinilpirrolidona (K30 y K85, BASF), poliuretano (Desmopan® PU 9665 DU, Bayer MaterialScience AG), así como agua destilada en N- metilpirrolidona (NMP) a 50 °C hasta obtener una solución transparente altamente viscosa.

La fracción en peso de los diferentes componentes en la solución de hilado polimérica, PES/PVP (K85)/PVP (K30)/9665 DU/H2O/NMP fue 14/3/5/2/3/73. La viscosidad de la solución polimérica era de 22.900 mPas.

La solución caliente se enfrió a 20 °C y se desgasificó. Una membrana se formó por calentamiento de la solución polimérica a 50 °C y pasando la solución a través de una tobera de hilado. Como líquido de perforación, se utilizó una mezcla agua/NMP que contiene 56 % en peso de agua y 44 % en peso de NMP. La temperatura del troquel era de 50 °C. La membrana de fibras huecas fue formada a una velocidad de hilado de 40 m/min. El capilar líquido que sale del troquel se hizo pasar a un baño de agua que tiene temperatura ambiente. La longitud de la distancia entre el troquel y el baño de precipitación era de 100 cm. La membrana de fibras huecas formada fue guiada a través de una serie de baños de agua. A continuación, la membrana de fibras huecas húmeda se secó y tenía un diámetro interior de 216 pm y un diámetro exterior de 318 pm. La membrana tenía una estructura de membrana totalmente asimétrica. La capa de separación activa de la membrana estaba en el lado interior. La capa de separación activa se definió como la capa con los poros más pequeños. La estructura muestra una estructura similar a una esponja general. La superficie interior muestra poros muy lisos. Las membranas fueron enrolladas sobre una rueda de devanado y haces de mano con 200 fibras se prepararon según el método descrito a continuación. La permeabilidad hidráulica (valor de Lp) de la membrana se midió en mano. La membrana mostró una permeabilidad hidráulica de 3,7 x 10"4 cm3/(cm2 bar s). Adicionalmente, se midió el coeficiente de tamizado de la mioglobina (en solución acuosa). Se obtuvo un coeficiente de tamizado de 1,5 % después de 15 minutos y se obtuvo un coeficiente de tamizado de 1,1 % después de 60 minutos. Posteriormente, la permeabilidad hidráulica (valor de Lp) de la membrana se midió de nuevo y era 2,7 x 10"4 cm3/(cm2 bar s) a 37 °C. Es más, los experimentos con respecto a la permeabilidad difusiva de la membrana se llevaron a cabo con cloruro, inulina y vitamina B12. La permeabilidad para el cloruro, la inulina y la vitamina B12 fue de 10,5 x 10"4 cm/s, 3,7 x 10"4 cm/s y 4,0 x 10"4 cm/s, respectivamente, a 37 °C.

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Irradiación de insertos y preparación para el cultivo celular

Las membranas cubiertas con aire (la concentración de oxígeno no se aumentó o redujo) se sometieron a irradiación gamma (25 y 75 kGy, respectivamente) en bolsas de esterilización convencionales durante 6,3 y 18,9 h, respectivamente, a temperatura ambiente. Los insertos de membrana cubierta con una solución acuosa o ácido acrílico fueron sometidos a irradiación gamma en recipientes de plástico que contenían aproximadamente 70 ml de solución. Para el lavado de los insertos de membrana cubierta con líquido, se prepararon las placas para cada tipo de membrana que contenía aproximadamente 300 ml de medio TFS convencional (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 en 800 ml de H2O destilada, se ajustó a un pH de 7,4 con HCl, se añadió H2O a 1 litro y se esterilizó por autoclave). Los insertos se eliminaron de forma estéril desde el recipiente, se lavaron en la placa de TFS, y se transfirieron a placas de 6 pocillos para un enjuague adicional. Todos los tipos de inserto se transfirieron a placas de 6 pocillos y se lavaron cinco veces en el lado superior e inferior con 3 ml y 5 ml de TFS, respectivamente. Para cada etapa de enjuague, los insertos se incubaron al menos 10 min con el fin de eliminar los reactivos residuales y productos secundarios generados durante la irradiación gamma. Después de haber terminado el procedimiento de enjuague, los insertos se transfirieron a nuevas placas de pocillos para el cultivo celular. 3 ml de medio de MSC se añadieron al lado superior y 5 ml al lado inferior del inserto en el pocillo, respectivamente. Los insertos se incubaron en medio de MSC en una incubadora durante la noche.

Las membranas recubiertas con fibronectina (basadas en membranas según el Ejemplo 2), a utilizar para motivos de comparación, representaron una excepción. El lavado y enjuague de los insertos se realizó como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 1 ml de tampón TFS que contenía 21 |jg de fibronectina a la parte superior del inserto y se incubó en una incubadora durante la noche. Al día siguiente, la solución de fibronectina se eliminó y los insertos se lavaron una vez con TFS, y se incubó con medio celular durante la noche antes de la siembra de células. Los insertos de membrana sin tratar (Ejemplo 2) y las placas de cultivo de TCPS se utilizaron como control negativo y positivo, respectivamente.

Ejemplo 7

Irradiación de membranas de fibras huecas

Los biorreactores (fibras huecas en una carcasa) que se sometieron a irradiación con rayos gamma consistieron en membranas de la invención con geometría de fibra hueca (véanse los Ejemplos 4 a 6). Los materiales para la carcasa, cabezales y encapsulamiento eran estables en gamma y consistieron en Makrolon® DP1-1262 (Bayer MaterialScience AG) con azul Fibasol (carcasa/cabezales) y poliuretano estable en gamma (encapsulamiento). Los biorreactores que contenían membranas basadas en PES/PVP/PA (véase el Ejemplo 4) se llenaron con aire ambiente, agua (agua RO), una solución acuosa de 0,001 % de ácido acrílico (0,01 g de AA en 1 l de agua RO) o una solución acuosa de 0,01 % de ácido acrílico (0,1 g de AA en 1 l de agua RO), y se sometieron a irradiación gamma al aplicar 25 o 75 kGy. El llenado de los reactores con soluciones acuosas y agua se llevó a cabo mediante el limpiado con un chorro de agua desde el lado intracapilar (IC) con 100 ml/min, y se eliminó el aire. La línea fuera de IC se sujetó y el lado extracapilar (EC) se llenó por ultrafiltración. Las etapas se repitieron hasta que no quedara aire residual en el biorreactor. La irradiación gamma se efectuó con una fuente de Co-60 al aplicar 25 o 75 kGy durante 6,3 y 18,9 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 8

Cultivo de médula ósea sin procesar en membranas de lámina plana

El medio de MSC (900 ml de medio alfa-MEM (Lonza, Cat. n.° BE12-169F), 100 ml de SFB, 10 ml de penicilina/estreptomicina, y 10 ml de ultraglutamina I; antes de su uso en el cultivo celular, el medio de MSC se calentó hasta 37 °C) fue reemplazado después de la incubación durante la noche sobre las membranas de inserto por medio de MSC reciente en el lado superior (2 ml) y el lado inferior (4 ml) del inserto. Esos volúmenes del medio se aplicaron en todas las etapas posteriores. Los volúmenes respectivos de la médula ósea sin procesar se añadieron a cada inserto como se indica en la Tabla I. La médula ósea se distribuyó homogéneamente en la membrana por agitación de la placa. Los insertos se colocaron en una incubadora durante 3 días para permitir la adhesión de MSC. En el día 3, se retiró el medio de un lado superior e inferior del cultivo de inserto. Las membranas se enjuagaron dos veces con 2 ml de TFS para cada etapa de enjuague en el lado superior. Se añadió medio reciente de MSC en el lado superior e inferior. En una primera fase de crecimiento (es decir, fase de cultivo de la médula ósea para la siembra con el primer desprendimiento de MSC), el medio se cambió en el lado superior e inferior de los insertos cada 2 a 3 días hasta el día 12 o 14. En el día 12 o 14, las MSC se separaron utilizando 500 jl de tripsina (10 min, 37 °C) por inserto de 3 de los 4 insertos. La tripsina se inactivó utilizando 1,5 ml de medio de MSC por inserto, la suspensión de MSC se recogió en un tubo estéril y se tomaron muestras para el recuento de MSC utilizando un contador CASY. Uno de los 4 insertos se fijó y se preparó para MEB. Por lo tanto, el inserto se lavó en el lado superior una vez con TFS, se añadió 1 ml de una solución de glutaraldehído al 2 % y se almacenó durante la noche a 4 °C. Posteriormente, los insertos se lavaron tres veces con agua destilada, se secaron al aire y

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se sometieron a MEB. En el segundo de los experimentos, no se realizó una MEB. Se añadió medio reciente en el lado superior e inferior de los mismos insertos después de un pre-calentamiento y acondicionamiento del medio de MSC con gas en una incubadora hasta que se vuelven a sembrar MSCs. 10.500 MSCs/cm2 se les permitió volver a unirse durante la noche en los mismos insertos. En la segunda fase de crecimiento, las MSCs unidas de nuevo se expandieron en las membranas durante 7 días adicionales. El medio de MSC se cambió cada 2 a 3 días. Las MSC se recogieron de 3 insertos procedentes de 4 insertos en el día 19 o 21 utilizando tripsina durante 10 min a 37 °C. Las MSC fueron re-sembradas en TCPS para el control de la morfología y potencial de proliferación de MSC. Por lo tanto, las MSC recogidas se volvieron a sembrar sobre TCPS a 5.000 MSCs/cm2 para el control de la morfología y a 500 MSCs/cm2 para el control del control de la proliferación durante 4 o 5 días. La morfología y el potencial de proliferación se registraron tomando imágenes microscópicas en el día 1 o 2 para la evaluación de la morfología y en el día 4 o 5 para la evaluación del potencial de proliferación.

La médula ósea sin procesar se sembró en placas sobre diversos sustratos (Tabla I). TCPS o VTK-FN (recubierta con fibronectina) y VTK (estéril por vapor, no recubierta) se utilizaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la primera fase de crecimiento de 12-14 días, las células se tripsinizaron y se contaron. Los respectivos números de MSC en relación con TCPS están representados por barras claras en las Figuras 1 y 2. Para la segunda fase de crecimiento, las MSC fueron re-sembradas a una densidad de 500 MSC/cm2 en los mismos insertos y expandidas en una segunda fase de crecimiento durante 10 días adicionales. Después de la segunda fase de crecimiento de 7 días, se realizó la determinación de las cantidades de MSC (representadas por barras negras en las Figuras 1 y 2), la siembra en placas de nuevo para la morfología (Figura 3) y la fijación para MEB. El número de MSC (n=3) con relación a TCPS como patrón se muestra en las Figuras 1 y 2, la línea indica el nivel de TCPS convencional. Los experimentos con médula ósea sin procesar se realizaron dos veces.

Membrana

Volumen de médula ósea (Ml) n Volumen de médula ósea total (Ml)

TCPS

300 3 900

VTK (sin tratar)

150 4 600

VTK + recubrimiento FN

150 4 600

VTK cubierta con aire 25 kGy

150 4 600

VTK cubierta con aire 75 kGy

150 4 600

AN96ST (sin tratar)

150 4 600

VTK cubierta con agua 75 kGy

150 4 600

VTK cubierta con agua con 0,0001 % de AA, 75 kGy

150 4 600

VTK cubierta con agua con 0,001 % de AA, 75 kGy

150 4 600

VTK cubierta con agua con 0,01 % de AA, 75 kGy

150 4 600

Tabla I: Resumen de los tipos de membrana y condiciones de irradiación utilizados para el cultivo de MSC de la médula ósea sin procesar. "n" indica el número de ensayos realizados para cada configuración. "AA" representa "ácido acrílico". La expresión "VTK" representa una membrana basada en la solución polimérica utilizada en el Ejemplo 2. "FN" representa "fibronectina". La membrana AN69ST™ es una membrana comercial basada en poliacrilonitrilo.

Como puede observarse a partir de las Figuras 1 a 3, MSC mostró un crecimiento en las membranas VTK recubiertas con fibronectina en la primera fase de crecimiento comparable a las membranas VTK recubiertas con fibronectina, es decir, no son adecuadas para un cultivo de re-siembra. Se supone que la razón de la falta de rendimiento de las membranas recubiertas con fibronectina después de tripsinización es la degradación de la fibronectina por la tripsina. En el Experimento 2 (Figura 2), las membranas VTK recubiertas con fibronectina no trabajaron ni en el primer ni en el segundo cultivo. Las membranas VTK no recubiertas mostraron un crecimiento muy débil de MSC en ambos experimentos. Los insertos VTK cubiertos con aire irradiados con 25 kGy mostraron resultados controvertidos que comparan los Experimentos 1 y 2; en la Figura 1, este tipo de membrana realizó una comparación con TCPS en la primera fase de crecimiento, pero mostró una fuerte disminución de MSC en la segunda fase de crecimiento, mientras que el tipo de membrana se comportó viceversa en el Experimento 2. Los insertos VTK cubiertos con aire irradiados con 75 kGy mostraron un crecimiento de MSC en ambas fases de crecimiento comparables o mejores a TCPS. El cubrimiento de las membranas VTK con agua o solución acuosa de ácido acrílico con diferentes concentraciones durante el procedimiento de irradiación gamma dio como resultado resultados similares como insertos VTK recubiertos con aire irradiados con 75 kGy. Los insertos AN69ST se incluyeron en el experimento 1 y resultaron ser inadecuados para el cultivo de MSC. Las MSC re-sembradas en placas después de la segunda fase de crecimiento mostraron una morfología en su mayoría husiforme y proliferación normal (véase la Figura 3).

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Cultivo de MSC pre-procesadas en membranas de lámina plana

El medio de MSC fue reemplazado a partir de insertos después de la incubación durante la noche por un medio reciente en los lados superior e inferior de los insertos. Las MSC se tripsinizaron a partir de los matraces al aplicar condiciones de matraz condicionales para MSC (0,25 % de tripsina, 5 min, y 37 °C, golpeando hasta que todas las células se separan e inactivación de la tripsina mediante la adición del medio). Las MSC se contaron utilizando un contador CASy. Se preparó una suspensión de MSC lo que permitió la siembra de 500 MSC/cm2 en pocillos de TCPS o insertos. Las placas de pocillos y los insertos se colocaron en una incubadora para permitir la adhesión de MSC. El medio de MSC se cambió en el lado superior e inferior cada 2 a 3 días hasta el día 7 o 9 (con el objetivo de hasta una confluencia en TCPS del 80 %). En el día 7 y/o 9, las MSC se separaron mediante el uso de 500 pl de tripsina (10 minutos, 37 °C). Acto seguido, la tripsina se inactivó mediante el uso de 1,5 ml de medio de MSC y las MSC se recogieron como suspensión de células en un tubo estéril. Se tomaron muestras para el recuento de células utilizando un contador CASY. Un inserto se fijó y se preparó para MEB. Por lo tanto, los insertos se lavaron en el lado superior una vez con TFS, a continuación, se añadió 1 ml de una solución de glutaraldehído al 2 % y todo se almacenó durante la noche a 4 °C. Posteriormente, los insertos se lavaron con agua destilada, se secaron al aire y se sometieron a MEB. El medio de MSC reciente se añadió al lado superior (2 ml) y al lado inferior (4 ml) de los insertos. El medio fue pre-calentado y acondicionado con gas en una incubadora hasta que las células se resembraron. 500 MSC/cm2 se volvieron a unir durante la noche en una incubadora sobre los mismos insertos. Las MSC unidas de nuevo se expandieron en las membranas durante un periodo adicional de 10 o 11 días. El medio de MSC se cambió cada 2 a 3 días. Las MSC fueron recogidas a partir de tres insertos en el día 16 o 21. Las MSC fueron sembradas de nuevo en placas en TCPS para el control de la morfología y potencial de proliferación de MSC. Por lo tanto, las MSC recogidas se volvieron a sembrar sobre TCPS en 5.000 MSC/cm2 para el control de la morfología y en 500 MSC/cm2 para el control del potencial de proliferación durante 4 o 5 días. La morfología y el potencial de proliferación se registraron tomando imágenes microscópicas en el día 1 o 2 para la evaluación de la morfología y en el día 4 o 5 para la evaluación del potencial de proliferación. La Tabla II da una visión general sobre todos los tipos de membranas y modificaciones, así como sobre condiciones de irradiación utilizadas en estos experimentos.

Membrana

Número de células (500 células/cm2) n Número de células totales

TCPS

4.800 3 14.400

VTK (sin tratar)

2.250 4 9.000

VTK + recubrimiento FN

2.250 4 9.000

VTK cubierta con aire 25 kGy

2.250 4 9.000

VTK cubierta con aire 75 kGy

2.250 4 9.000

VTK cubierta con agua 75 kGy

2.250 4 9.000

VTK cubierta con agua con 0,0001 % de AA, 75 kGy

2.250 4 9.000

VTK cubierta con agua con 0,001 % de AA, 75 kGy

2.250 4 9.000

VTK cubierta con agua con 0,01 % de AA, 75 kGy

2.250 4 9.000

Tabla II: Resumen de los tipos de membrana y condiciones de irradiación utilizados para el cultivo de MSC preseleccionadas. "n" indica el número de ensayos realizados para cada configuración. "AA" representa "ácido acrílico". La expresión "VTK" representa una membrana basada en la solución polimérica utilizada en el Ejemplo 2. "FN" representa "fibronectina".

Los experimentos que utilizan MSC pre-seleccionadas se efectuaron dos veces y los resultados se muestran en la Figura 4 (Experimento 1) y en la Figura 5 (Experimento 2). Las MSC mostraron un crecimiento en las membranas VTK cubiertas con fibronectina en la primera fase de crecimiento de los Experimentos 1 y 2 comparable a TCPS pero mostraron una disminución fuerte en el crecimiento en la segunda fase de crecimiento, es decir, las membranas cubiertas con fibronectina no eran adecuadas para un re-siembra en el Experimento 1. Se supone que la razón de la falta de rendimiento de las membranas cubiertas con fibronectina después de tripsinización es la degradación de la fibronectina por la tripsina. Las membranas VTK no cubiertas mostraron un crecimiento muy débil de MSC en ambos experimentos. Los insertos VTK recubiertos con aire irradiados con 25 kGy se ensayaron solamente en el Experimento 2 y mostraron un rendimiento comparable a TCPS y comparable a todos los tipos de membrana VTK después de una irradiación gamma de 75 kGy. Los insertos VTK recubiertos con aire irradiados con 75 kGy mostraron un crecimiento de MSC en ambas fases de crecimiento comparable o en la mayoría de los casos mejor en TCPS. El cubrimiento de las membranas VTK con agua o solución acuosa de ácido acrílico con diferentes concentraciones durante el procedimiento de irradiación gamma dio como resultado resultados similares al igual que los insertos VTK recubiertos con aire irradiados con 75 kGy. Los insertos AN69ST se incluyeron en el Experimento 2 y resultaron ser inadecuados para el cultivo de MSC. Las MSC sembradas de nuevo en placas sobre placas convencionales de TCPS después de la segunda fase de crecimiento mostraron principalmente una morfología husiforme y proliferación normal.

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Influencia de la esterilización por vapor antes de irradiación gamma

Se realizaron experimentos según el Ejemplo 10, en el que se determinó el número de MSC que se adhirió a la superficie de la membrana en relación con TCPS (%). Las cantidades de células se determinaron para TCPS y las membranas VTK con recubrimiento de fibronectina, así como para las membranas VTK que habían sido irradiadas con 25 o 75 kGy, ya sea cubiertas con aire o llenas de agua. Se realizaron tres series de experimentos. En una primera configuración, la membrana fue irradiada directamente con rayos gamma después de la producción. En una segunda configuración, las membranas fueron esterilizadas por vapor antes de que fueran sometidas al respectivo tratamiento con rayos gamma. Como puede observarse en la Figura 6, las membranas que habían sido esterilizadas por vapor antes de la irradiación con rayos gamma se llevaron a cabo mejor con respecto a la unión de MSC en comparación con las membranas sin esterilización por vapor.

En una tercera configuración, se investigó la influencia de una etapa adicional de esterilización por EtO. Se determinó el número de MSC cultivadas desde la médula ósea sin procesar en las membranas irradiadas con 75 kGy con y sin esterilización por vapor y ETO, en relación con el número de MSC cultivadas en TCPS convencional después de la primera (11 días) y segunda (7 días) fases de crecimiento. Como puede observarse en la Figura 7, la esterilización por EtO no tiene un efecto adverso pronunciado sobre el rendimiento de las membranas.

Ejemplo 12

Diferenciación de las células

A fin de evaluar la capacidad de diferenciación de las células que han sido cultivadas en membranas según los ensayos de la invención, se realizaron ensayos de diferenciación de adipogénesis y osteogénesis para determinar la capacidad de MSC para diferenciarse.

(A) Adipogénesis

Las MSC se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de aprox. 10.000 MSC/cm2. Se utilizaron tres pocillos, uno para diferenciar MSC en adipocitos como se describe a continuación, uno para cultivar MSC en medio de expansión de MSC convencional (sin inducir adipogénesis) y otro como control para la tinción. MSC se cultivaron hasta la confluencia o hasta diez días más de confluencia utilizando un medio de expansión de MSC convencional (900 ml de medio alfa-MEM, 100 ml de SFB, 10 ml de penicilina/estreptomicina, y 10 ml de ultraglutamina I; antes de la utilización del cultivo de células, el medio de MSC se calentó hasta 37 °C). La adipogénesis se indujo mediante el uso de un medio de inducción adipogénico (20 pl de solución madre IBMX (55,55 mg de IBMX disuelto en 10 ml de agua destilada, a continuación, 20 a 40 mg de carbonato de sodio se añaden a la solución), 1 pl de solución madre de dexametasona (19,62 mg de dexametasona en 50 ml de etanol puro), 1 pl de solución madre de insulina (10 mg/ml), y 2 pl de indometacina (178,9 de indometacina en 10 ml de etanol puro) en 1 ml de medio convencional de MSC) durante 11 días (día 0 a día 11). El medio se cambió cada 2-3 días. Se utilizó medio de mantenimiento adipogénico (1 pl de solución madre de insulina en 1 ml de medio convencional de MSC) durante 3 o 5 días (día 1214 o día 12-16) y se cambió durante cada 2-3 días. Las células fueron enjuagadas con un tampón TFS convencional. Las células se fijaron mediante el uso de una solución de formaldehído (~10 %) durante al menos 4 horas a temperatura ambiente. Acto seguido, aproximadamente 0,5 ml de solución de Oil Red O (filtrado estéril reciente) se añadieron a cada pocillo, seguido de incubación durante 30 min a 2 horas a temperatura ambiente, enjuague de las células con TFS dos veces, seguido de enjuague con etanol al 50 %. Las células se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Mayer durante 5 min a temperatura ambiente, se enjuagaron durante 1 min con agua del grifo, tres veces, y se fijaron con solución de formaldehído. La Figura 8 representa la adipogénesis exitosa de MSC en células que habían sido cultivadas en membranas VTK irradiadas con rayos gamma (75 o 25 kGy, en presencia de ácido acrílico o de alilamina).

(B) Osteogénesis

Las MSC se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de aprox. 10.000 MSC/cm2. Se utilizaron tres pocillos, uno para diferenciar MSC en osteoblastos como se describe a continuación, un pocillo para cultivar MSC en medio convencional de expansión de MSC (sin inducir osteogénesis) y uno como control para tinciones. Las MSC se cultivaron hasta la confluencia o hasta diez días más de confluencia utilizando medio convencional de MSC. El medio de MSC se reemplazó con los medios de diferenciación osteogénica (100 pl de solución madre de fosfato de glicerol (2,16 g de fosfato de glicerol en 100 ml de medio convencional de MSC), 1 pl de solución madre de dexametasona, y 1 pl de solución madre de ácido ascórbico (0,145 g de ácido ascórbico en 10 ml de medio basal, alfa-MEM), en 1 m de medio convencional de MSC) y se cambió cada 3-4 días. Después de 2-3 semanas, había depósitos calcificados en y alrededor de las células. Las células se lavaron en TFS. TFS se eliminó y las células se fijaron con 10 % de formaldehído durante 10 min, seguido de lavado una vez con TFS y dos veces con agua desionizada. Las células se secaron al aire y se tiñeron con nitrato de plata bajo luz UV durante 10 min. Después de lavar 2-3 veces con agua desionizada, las células se contratiñeron con hematoxilina de Mayer, seguido de lavado en

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agua del grifo durante un minuto, a continuación, se lavaron dos veces con agua desionizada. Las células se incrustan en 10 % de formaldehído. La Figura 9 representa la osteogénesis con éxito de células que se cultivaron en las membranas según la invención.

Ejemplo 13

Idoneidad para la expansión de diversos tipos de células

Con el fin de evaluar la aplicabilidad de las membranas irradiadas con rayos gamma según la invención para el cultivo de diversos tipos de células, las membranas planas se ensayaron a modo de ejemplo. Las membranas utilizadas fueron como se describe en los Ejemplos 10 y 11 y se refieren como membranas "VTK". Las membranas se irradiaron con 25 (cubiertas con aire) y 75 kGy (cubiertas con agua), respectivamente. Las membranas se ensayaron en cultivo a corto plazo, evaluando de este modo la adhesión celular (1 día después de la siembra) y la proliferación celular (5 días después de la re-siembra) en comparación con el TCPS convencional. Las células utilizadas fueron (a) NHDF, fibroblastos dérmicos humanos normales, (b) HepG2, una estirpe celular de hepatocarcinoma humano, (c) HK-2, una estirpe celular humana renal proximal epitelial, y (d) MDCK, una estirpe de células epiteliales de riñón canino Madin-Darby. Las células (a) a (d) se ensayaron en las membranas según la invención y en TCPS. Se sembraron las células según se indica: (a) NHDF: 5103 células/cm2 en medio (DMEM + 10 % de SFB + 10 % de penicilina/estreptomicina); (b) HepG2: 5,6 x 104 células/cm2 en medio (RPMI + 10 % de SFB + 0,5 % de gentamicina); (c) HK-2: 104 células/cm2 en medio (queratinocitos SFM (Gibco, Cat n.° 17005) + suplementos para queratinocitos SFM (Gibco, Cat n.° 37000-015) + 10 pg/ml de Meronem + 1 % de SFB + 1 % de CaCh); (d) MDCK: 104 células/cm2 en medio (M199 + 10 pg/ml de Meronem + 10 % de SFB (inactivado por calor)). Las cantidades de células se determinaron 1 día (adhesión) y 5 días (proliferación) después de la siembra de células por recuento CASY. Las Figuras 10 a 13 muestran que todos los tipos de células podrían expandirse de manera eficiente en membranas irradiadas a 75 kGy. Los resultados demuestran que las membranas son al menos tan eficientes como TCPS convencional, especialmente con respecto a la expansión de células. Los resultados muestran que las membranas que han sido tratadas con dosis más altas son un poco más adecuadas para el cultivo de células que las membranas que han sido tratadas con una dosis menor. La membrana VTK 25 kGy, no funcionó de manera eficiente con células HK-2 (Figura 12), probablemente debido a problemas en la primera eliminación de las células después del primer día.

Ejemplo 14

Expansión de MSC en membranas de fibras huecas irradiadas con rayos gamma (biorreactores) a parir de médula ósea sin procesar

La expansión de MSC de la médula ósea sin procesar y la expansión de MSC pre-seleccionadas se efectuaron en varios biorreactores de fibras huecas en un sistema de expansión de células (SEC). Los biorreactores que resultaron ser adecuados para MSC pre-seleccionadas se ensayaron adicionalmente con médula ósea sin procesar. Los tiempos de duplicación en biorreactores según la invención se compararon con los tiempos de duplicación en matraces de control (TCPS) a partir de la misma densidad celular en la siembra. El tiempo de duplicación sirvió como un método para evaluar el rendimiento de las diversas membranas/TCPS.

MSC pre-seleccionadas: MSC utilizadas fueron pre-seleccionadas, MSC se crio-conservaron a partir de la médula ósea en el cuarto pase máximo. MSC se pre-seleccionaron por expansión de MSC derivadas de médula ósea en matraces TCPS convencionales para al menos dos pases. Aproximadamente 2,8 millones de MSC se cargaron en un biorreactor de 1,7 m2 que corresponde a 164 MSC/cm2. En caso de que la superficie fuera más pequeña que 1,7 m2 se redujo el número de MSC cargadas. El periodo de cultivo fue de 7 días.

Médula ósea sin procesar: Aproximadamente se cargaron 10-12 ml de médula ósea en un biorreactor de 1,7 m2, en caso de que la superficie fuera inferior a 1,7 m2, se redujo el volumen de la médula ósea cargada. El periodo de cultivo fue de 13 días.

Los matraces TCPS T75 sirvieron como matraces de control. Las MSC pre-seleccionadas se sembraron en matraces en la misma densidad que en biorreactores (164 MSC/cm2). Cuando a partir de la médula ósea sin procesar, 234 pl de la médula ósea se sembraron en matraces (3,12 pl/cm2) y 12 ml de médula ósea se cargaron en biorreactores de 1,7 m2 (0,71 pl/cm2).

Los tipos de membrana utilizados en este experimento se resumen en la Tabla III. Las membranas basadas en PES/PVP/PA se prepararon como se describe en el Ejemplo 3. Las membranas basadas en PES/PVP/PU se prepararon como se describe en el Ejemplo 5. La expresión PAN se refiere a poliacrilonitrilo.

N.°

Tipo Tratamiento Material de membrana

1

VTK recubierta con fibronectina vapor PES/PVP/PA

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AN69ST (superficie tratada) irradiación con gamma PAN/PEI

3

AN69XS (sin superficie tratada) irradiación con gamma PAN

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0,5 % PU (sin secado en línea) irradiación con gamma PES/PVP/PU

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VTK llenada con aire 25 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA

6

VTK llenada con aire 75 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA

7

VTK llenada con agua 25 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA

8

VTK llenada con agua 75 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA

9

VTK 0,001 % de AA 25 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA/(AA)

10

VTK 0,001 % de AA 75 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA/(AA)

11

VTK 0,01 % de AA 25 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA/(AA)

12

VTK 0,01 % de AA 75 kGy irradiación con gamma PES/PVP/PA/(AA)

Tabla III: Resumen de los tipos de membrana que se ensayaron con respecto a la expansión de MSC preseleccionadas y médula ósea sin procesar. Los resultados para las membranas se compararon con matraces convencionales TCPS. Una membrana que no se irradió con rayos gamma pero en su lugar se cubrió con fibronectina (1) se incluyó en este experimento por razones de comparación.

La médula ósea se sembró en el día 0 en los biorreactores y en los matraces. En el día 2 se cambió el medio por primera vez y de nuevo en el día 4 o 5, 6 o 7, 8 a 10 y 10 a 12. En el día 13 se recogieron las células (tripsina) y se contaron las células. La viabilidad de las células se ensayó, así como su fenotipo y la morfología y/o su comportamiento de proliferación.

Recuento de colonias celulares para el cálculo del número inicial de células cuando se usa médula ósea sin procesar (CFU-F)

78 |jl de médula ósea sin procesar se sembraron en matraces T25 (TCPS) que contenían 5 ml de medio de MSC. Las células no adherentes se retiraron después de 2 a 3 días por lavado dos veces con TFS, seguido de la adición de medio de MSC reciente. El medio de MSC se cambió cada 2 a 3 días. En el día 7 se contaron las colonias (aumento de 10 veces/microscopio).

Cálculo del tiempo de duplicación y relación del tiempo de duplicación

El tiempo de duplicación (TD) es el periodo de tiempo necesario para que una célula se duplique en número. TD de la relación de MSC y TD se calcula según se indica.

Número de duplicación de MSC :

imagen1

N es la cantidad de MSC obtenida después del periodo de cultivo indicado, N0 es el número de MSC sembradas.

TD (horas) = periodo de cultivo (horas)/número de duplicaciones.

La relación TD = TD de células en biorreactor/TD de células en matraces de control.

Todos los biorreactores irradiados con rayos gamma seleccionados con médula ósea sin procesar mostraron un rendimiento comparable a biorreactores TCPS y VTK-FN. Los tiempos de duplicación variaron de 28 a 34 horas, que eran sólo ligeramente más altos que en los matraces de control (23 a 25 horas). Por lo tanto, la relación de tiempo de duplicación osciló de 1,1 a 1,5 (Figura 14). El biorreactor de PU al 0,5 % mostró un crecimiento de células ligeramente más lento en comparación con biorreactores irradiados con rayos gamma y el biorreactor VTK-FN.

La viabilidad de las células recogidas (Figura 15) se ensayó mediante análisis de CCAF con 50.000 células por tubo de CCAF en medio de MSC. Una muestra se tiñó con solución de yoduro de propidio (conc. final 1 jg/ml) durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Otra muestra sin teñir se utilizó como referencia. La viabilidad de las células recogidas varió de 88 a 99,5 %.

El fenotipo de las células recogidas (véase la Figura 16) se ensayó después de la tripsinización de las células. 1 millón de células se resuspendieron en 5.000 jl de tampón de bloqueo (lavado de células + suero humano al 10 %) y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. 50 jl se distribuyeron en 10 tubos, y se añadieron anticuerpos (uno sin teñir (sin anticuerpo): CD34-PE - 2 jl, CD45-Pe - 2 jl, CD73-PE - 2 jl, mlgG1-PE - 1 jl (isotipo de control para CD34, CD45, CD73), HLA-DR, DP, DQ-FITC - 2 jl, mIgG2a-FITC - 1 jl (control de isotipo para HLA-DR), CD90- FITC - 1 jl, CD105-FlTC - 1 jl, mlgGl-FITC - 2 jl (control de isotipo para CD90, CD105). Las mezclas se mezclaron bien y se almacenaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego se añadieron 1 ml de tampón CCAF (lavado de células + 2 % de SFB (inactivado por calor)) y se agitó en un vórtex, seguido por centrifugación durante 3 minutos a 400 g. El tampón se retiró y el sedimento se agitó en un vórtex. A continuación se añadieron 400 jl de tampón de fijación (diluido 1:10 con agua) y se agitó en vórtex. Las células se almacenaron a 4 °C y se analizaron en un periodo de 4 días.

Las células expandidas en el biorreactor lleno de agua modificado e irradiado con rayos gamma a 75 kGy mostraron valores comparativamente altos para CD45 y HLA-DR (18 y 16,7 % de las células fueron positivas, respectivamente). Las células recogidas de los otros biorreactores mostraron el fenotipo esperado de MSC.

5 El examen de re-unión sobre la expansión posterior a TCPS mostró en su mayoría células husiformes que exhibieron un comportamiento de crecimiento post-siembra en placas (datos no mostrados).

Ejemplo 15

10 Influencia de la dosis de radiación

Para investigar la influencia de la dosis de radiación en las propiedades de la membrana, el Ejemplo 14 se repitió con MSC pre-seleccionadas utilizando membranas VTK llenas con aire irradiadas con dosis de radiación de rayos gamma entre 12,5 kGy y 125 kGy, y se determinó el número de MSC cultivadas en relación con el número de MSC 15 cultivadas en TCPS convencional después de la primera (10 días) y segunda (11 días) fases de crecimiento. Los resultados se muestran en la Figura 17.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un proceso de preparación de una membrana que comprende una polisulfona, una poliétersulfona o una poliarilétersulfona y una polivinilpirrolidona para el cultivo de células, que comprende la irradiación de la membrana

   5 con rayos gamma o beta o un haz de electrones en una dosis de 70 a 175 kGy en presencia de oxígeno en una concentración de 4 % a 100 % en contenido/volumen molar.
2. 2. Un proceso según la reivindicación 1, en el que la membrana se irradia a una temperatura de 0 °C a 41 °C.

   10 3. Un proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la membrana comprende además un

   poliuretano.
3. 4. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la membrana comprende además una poliamida.

   15
4. 5. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la membrana es una membrana de fibras huecas.
5. 6. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha membrana es una membrana de 20 lámina plana.