JP4834812B2 - 体外循環医療カラム用補助用具 - Google Patents

Description

近年、治療用の目的で血液、血漿、リンパ液などの体液を処理し、その組成物の比を変化させたり、組成物の機能を変化させたりする体外循環医療カラムが開発されている。各種疾患によって、正常範囲外にある体液成分を正常範囲に戻すための体外循環医療カラムや生体の免疫能を変化させるための体外循環医療カラムなど、種々の体外循環医療カラムが開発され、各種疾患で治療効果を上げつつある。例えば、腎不全患者の血液成分を正常に戻すための人工腎臓、血液中に酸素を送り込むための人工肺、血液もしくは血漿中の病因物質を選択的に吸着する吸着カラム、白血球やリンパ球を除去するための血球分離カラムなどの体外循環医療カラムが開発されている。

本発明は、これらのその本来の目的で使用されている体外循環医療カラムに対して補助的な役割を果たす体外循環医療カラム用補助用具に関する。

体外循環医療カラム用補助用具とは、体外循環医療カラムの治療効果を上げたり、薬剤の副作用などの懸念を低下させるためのものをいう。体外循環医療カラムの治療効果を上げる補助用具の例としては、“リクセル”（カネカ社）がすでに販売されている。腎不全患者の血液中はβ_２−ミクログロブリンの濃度が高くなっており、この物質の蓄積は透析アミロイド症を惹起する。そのため、現在ではβ_２−ミクログロブリンの除去能を有するハイパフォーマンスタイプの人工腎臓が主流となっている。“リクセル”はβ_２−ミクログロブリンを選択的に吸着除去する装置であり、透析アミロイド症を合併した腎不全患者に、人工腎臓と併用で使用されている。人工腎臓の目的は、β_２−ミクログロブリンなど、血液中の余分な老廃物を除去することである。“リクセル”は人工腎臓で除去できない物質を除去するというものではなく、人工腎臓でも除去できるが、それでは治療効果が不十分であるので、さらにβ_２−ミクログロブリンを除去することで、治療効果を上げるものである。しかしながら、リクセルはβ_２−ミクログロブリンを吸着するだけであり、体液の組成物質の機能を積極的に変化させることで、治療の一助になるようなものではない。

また、種々の体外循環医療カラムに対する共通の問題としては、血液凝固を進展させないように治療することが挙げられる。そのため、抗凝固剤を使用したり、体外循環医療カラムに抗血栓性を付与することが行われている。しかしながら、抗凝固剤の使用は、患者に負担を強いるものである。例えば、最もよく使用されている抗凝固剤の１つであるヘパリンに対して、ショック症状を呈する患者が存在することはよく知られている。また、体外循環医療カラムに抗血栓性を付与し、抗凝固剤を使用しない場合としては、例えば、血管内カテーテル・人工血管・人工心臓等の血液接触部分にアルブミンや無水こはく酸等をコーティングする方法（特許文献１参照）や、材料表面にアミノ硫酸基を導入することで、抗血栓性を付与する方法（特許文献２参照）、ヒト・トロンボモジュリンを固定化する方法（特許文献３）が開示されている。しかしながら、体外循環医療カラム本来の機能を維持しつつ、抗血栓性を付与することは非常に困難である。また体外循環医療カラムのなかで、抗血栓性を付与する材料は、その素材、形態など多種多様であるために、それぞれのカラムごとに抗血栓性を付与するための最適な設計が必要となる。これらの問題点のために、カラムに抗血栓性を付与する体外循環医療カラムは広く普及するには至ってない。

すなわち、これまでに体液の組成物質の機能を積極的に変化させることで、体外循環医療カラムの治療効果を上げたり、薬剤の副作用などの懸念を低下させるための体外循環医療カラム用補助用具は存在しておらず、特に血液凝固を進展させないように治療するという課題は十分に解決されているとは言い難かった。

特開昭５２−１３７１９７ 特開昭５４−７９９９７ 特許公報 第２９０５７９７号

本発明の目的は、かかる従来技術の欠点を改良し、その本来の目的で使用されている体外循環医療カラムに対して補助的な役割を果たす体外循環医療カラム用補助用具を提供することで、体外循環医療カラムの治療効果を上げたり、抗凝固剤の不使用もしくは、低減により薬剤の副作用の懸念を低下させることにある。

本発明者らは上記課題を達成するため、鋭気検討を重ねた結果、本発明を完結した。すなわち、本発明は、下記の（１）〜（３）の構成によって達成される。
(1) 体外循環用医療カラムの前処理に用いる、カラム又は回路である体外循環医療カラム用補助用具であって、該補助用具にプロテインＣを１００％以上活性化させるヒト・トロンボモジュリンが、基材に接触した状態で１５ｋＧｙ以上、８０ｋＧｙ未満の放射線を照射することにより基材に固定化されていることを特徴とする体外循環医療カラム用補助用具。
(2) 該体外循環医療カラムが、人工腎臓、人工肺および血球分離カラムから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする(1)に記載の体外循環医療カラム用補助用具。
(3) 血液凝固防止用のカラムであることを特徴とする(1)又は(2)のいずれかに記載の体外循環医療カラム用補助用具。

本発明によって、体外循環医療カラムがその本来の目的で使用されていることに対して補助的な役割を果たす体外循環医療カラム用補助用具を提供することで、体外循環医療カラムの治療効果を上げたり、薬剤、例えば、抗凝固剤を使用しなかったり、低減させることで、その副作用の懸念を低下させることができる。

本発明は、各種疾患によって正常範囲外にある体液成分を正常範囲に戻すための体外循環医療カラム、例えば、人工腎臓や人工肺、病因物質吸着カラム、白血球などの血球分離カラムなどがその本来の目的で使用されていることに対して、補助的な役割を果たす体外循環医療カラム用補助用具に関する。

ここでいう補助的な役割とは、体外循環医療カラムによる治療において、その一助となること、すなわち、体外循環医療カラムの治療効果を上げたり、抗凝固剤などの薬剤の不使用もしくは、低減により薬剤の副作用の懸念を低下させることをいう。

また、本発明の体外循環医療カラム用補助用具はプロテインＣを１００％以上活性化させるヒト・トロンボモジュリンが固定化されていることを特徴とする。プロテインＣとは生体内において、凝固制御系を担うタンパク質である。生体は様々な系で恒常性を保つように作用しており、血液凝固系もその１つである。すなわち、凝固が開始されるとそれにブレーキをかける凝固制御系が存在している。凝固系が作動すると、プロテインＣが活性化され、凝固系の重要な因子である第V因子や第 VIII因子を切断し凝固系にブレーキをかける役割を担っている。血液が体外循環医療カラムなど生体外の異物と接触すると血液凝固が進展するため、通常はこれらのカラムを用いた治療時には、抗凝固剤を投与する。プロテインＣを１００％以上活性化させるヒト・トロンボモジュリンが固定化された体外循環医療カラム用補助用具を体外循環医療カラムの前に接続して使用することで、抗凝固剤を使用しなかったり、低減させることが可能である。これは、補助用具で活性化されたプロテインＣが血流にのって循環するために、体外循環医療カラムなど抗血栓性を有さない部分に血液が接触しても、プロテインＣが血液凝固の進展を抑制できるためである。

体外循環医療カラム本来の機能を維持しつつ、抗血栓性を付与することは非常に困難であり、カラムの素材、形態など多種多様であるために、それぞれのカラムごとに抗血栓性を付与するために最適な設計が必要となるが、プロテインＣを１００％以上活性化させるヒト・トロンボモジュリンを固定化した体外循環医療カラム用補助用具を用いれば、従来から存在する抗血栓性を有しない種々の体外循環医療カラムに対して、抗凝固剤なし、もしくは低減しての使用が可能となり、利用価値は大きい。したがって、本発明の好ましい態様の１つとして血液凝固防止用のカラムである体外循環医療カラム用補助用具を挙げることができる。

プロテインＣを活性化させるヒト・トロンボモジュリンとは、後述するプロテインＣの活性化測定の方法において、ヒト・トロンボモジュリン1ngを用いた場合の４０５ｎｍの吸光度の値が、ブランクに対して２０％以上増加させる物質のことをいう。プロテインＣの活性化が２０％より少ない場合、抗血栓性の効果が充分でない場合がある。ヒト・トロンボモジュリンは、血管内皮細胞膜上の糖タンパク質であり、血液凝固を制御している。その仕組みとしては、ＴＭがトロンビンと結合することにより、トロンビンの凝固作用であるフィブリン形成作用および血小板凝集作用等を消失させると共に、プロテインＣの活性化作用を数千倍に促進することで凝固系にブレーキをかける。したがって、プロテインＣを活性化させる生理活性物質が、トロンビンの凝固作用を消失できる機能も有していれば、抗血栓性にさらに有利であるため、ヒト・トロンボモジュリンもしくはその構造の一部分を有するペプチドが好ましい。

本発明でいうところのトロンボモジュリン（ＴＭと略記する）とは、プロテインＣの活性化作用を有する作用をもつものであれば、ＴＭ分子そのものでなくても、ＴＭの構造の一部分や、プロテインＣの活性化作用を有するペプチドなども含めたものをいう。ＴＭの取得方法の例としては、ヒト組織からＴＭを精製したり、遺伝子工学的手法によって得ることができる。また、本発明の体外循環医療カラム用補助用具は、プロテインＣを１００％以上、好ましくは２００％以上活性化させることが好ましい。プロテインＣの活性化測定についての詳細は後述するが、405nmの吸光度で比較する。プロテインＣが５０％活性化しているとは、ブランクの吸光度の値よりも1.5倍の値を示していることをいう。ここで、ブランクとは、後述する測定方法のなかで、前記補助用具を用いずに、同様の測定を行った場合のことをいう。プロテインＣの活性化が５０％未満の場合は、十分な抗血栓性の効果が得られない場合が多い。

また、本発明でいうところの体外循環医療カラム用補助用具は、カラム又は回路である。すなわち、体外循環医療カラム用補助カラムとは、生理活性物質を固定化した基材が充填されたものであり、体外循環医療カラム用補助回路とは、体内と医療用カラムをつなぐ回路の体液通過部分に生理活性物質を固定化したものをいう。なお、基材とは生理活性物質を固定化する担体をさす。また、回路における生理活性物質の固定化は、回路全体になされていても、一部であっても良い。

生理活性物質の固定化とは、基材や回路に生理活性物質が存在しており、生理活性物質の溶出が極微量である状態をいう。溶出の具体的測定方法は後述するが、溶出が極微量であるとは、体液との接触部分の面積１ｍ^２あたり４Ｌ以上の水で洗浄した後、室温で５００ｍｌ以上の水を用いて２時間抽出した水中の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを言う。ここで、水の代わりに生理食塩水もしくは緩衝液を用いても良い。なお、体液との接触部分に血小板よりも小さい孔を有する多孔質基材の場合は、多孔質内部の面積は考慮しない。

ヒト・ＴＭの固定化の方法としてはヒトＴＭを基材と接触させた状態で、１５ｋＧｙ以上、８０ｋＧｙ以下、好ましくは２０ｋＧｙ以上、５０ｋＧｙ以下の放射線を照射して滅菌する。本願発明者らは、ヒトＴＭを基材と接触させた状態で、この程度の量の放射線を照射してもヒトＴＭの生理活性は維持され、一方、滅菌が達成されることを見出した。また、ヒトＴＭの水溶液を基材と接触させた状態で、上記のように放射線を照射すると、滅菌と同時に固定化も達成される。

体外循環医療カラム用補助カラムや、補助回路の素材は特に限定されるものではないが、成形などの容易さから高分子が好ましい。高分子の例としては、ポリスルホン系ポリマー、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、セルローストリアセテートなどの改質セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルニトリル、塩化ビニルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

補助カラムに内蔵された素材の形状としては、編み地、不織布などの繊維、ビーズ、平膜や中空糸膜などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。回路の形状としては、その本来の機能、すなわち、チューブ状であることが必要であり、適宜、チャンバーなどを備えたものである。

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

１．中空糸膜ミニカラムの作成
中空糸型人工腎臓である東レ株式会社製“トレスルホンＴＳ−１．６ＵＬ”を解体し、中空糸膜を取り出した。中空糸膜を１００本束ね、直径約７ｍｍ、長さは１２ｃｍのプラスチック管ミニカラムケースに挿入した。中空糸膜の両末端を、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で固定し、ミニカラムを作成した。該カラムの中空糸内表面積は７５ｃｍ^２である。ミニカラムの中空糸膜内側および外側を３７℃の超純水を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で３０分間洗浄した。
２．ヒト・トロンボモジュリン（ＴＭ）

プロテインＣを活性化させる生理活性物質としてＴＭを使用した。特開平１−６２１９号公報の記載に従い、遺伝子工学的手法によって得たＴＭを用いた。

このＴＭ１ｎｇを５ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２）１ｍｌ中３７℃で１時間インキュベートした。１００ｎＭのプロテインＣ溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２）０．５ｍｌを加え、さらに３７℃で１時間インキュベートした。この上清５０μｌに１ｍＭのＳ−２２３８（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡの混合溶液）１００μｌを加えて４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、吸光度は０．１２であった。一方で、ＴＭを添加しなかったブランク溶液の吸光度は０．０７であった。ブランクに対して吸光度は７１％増加していることから、このＴＭがプロテインＣ活性化能を有していることが確認できた。

３．ＴＭ固定化ミニカラムの作成
上記１．で得られたミニカラムの中空糸内側に２．で得られたＴＭのリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略記）溶液（ＴＭ濃度は２５μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎの流速で１時間、室温で灌流させた後、ＰＢＳ１０ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎの流速で３０分間、室温で循環させて洗浄した。その後、該ミニカラムに１５ｋＧｙのγ線を照射した。

４．ＴＭの溶出試験
上記３．で得られたＴＭ固定化ミニカラムについて、ＴＭ溶出試験を始める直前に、ＰＢＳ３０ｍｌ（中空糸内表面１ｍ^２換算でＰＢＳ４Ｌに相当する）を室温にて１ｍｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ循環し、洗浄した。ＰＢＳ５ｍｌ（中空糸内表面１ｍ^２換算で６６７ｍｌに相当する）を０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、室温で２時間循環させた。なお、後述する血液循環試験と対応させるために、循環開始後の最初の１ｍｌは廃棄した後、循環した。 循環後のＰＢＳ中のＴＭ濃度は、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。

５．プロテインＣ活性化度の測定
ＴＭ固定化ミニカラムに、内径1mm、外径2mm、長さ50cmのシリコーンチューブ（製品名ARAM（登録商標））２本をミニカラム前後に接続した。PBS 30mlを室温にて1ml/minで３０min循環し、洗浄した。その後、ＴＭ固定化ミニカラムの中空糸膜内側を、混合緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｍｉｎ（フラクションＶ、和光純薬工業(株)、以下、ＢＳＡと略記）、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）１０ｍｌを用いて洗浄した。中空糸膜内側を５unit/mlのトロンビン溶液5mlで３７℃、１時間、0.5ml/minで循環させた。その後、中空糸内側を混合緩衝液Ｄ(50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0)、0.1% NaCl、0.1% BSA、2mM CaCl₂)10mlを用いて洗浄した。中空糸膜内側を100nMのプロテインＣ溶液2.5mlで３７℃、１時間0.5ml/minで循環させた。この循環後の液、５０μｌに1mMのS-2238 100μlを加えて405nmの吸光度を測定した。吸光度の値が大きいほど、プロテインＣが活性化されていることを示す。

６．血液循環試験
上記３．で得られたＴＭ固定化ミニカラムについて、血液循環試験を始める直前に、ＰＢＳ３０ｍｌ（中空糸内表面１ｍ^２換算でＰＢＳ４Ｌに相当する）を室温にて１ｍｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ循環し、洗浄した。

健常者ボランティアから静脈血を採血後、十数秒内にヘパリンを０．５Ｕ／ｍｌになるように添加した。その後、数分以内に、該血液をカラムで循環させた。循環は５ｍｌの血液を、垂直に立てた中空糸膜ミニカラムの上から下に、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、室温で行った。なお、ミニカラム内および回路内には、はじめはＰＢＳが充填されてあるので、循環開始後の最初の１ｍｌは廃棄した後、循環した。該条件での、循環可能時間を測定した。なお、ここでいう循環可能時間とは、回路中もしくはミニカラム中に血栓などが生じて血液が流れなくなるまでの時間、もしくは血液が流れにくくなったため、回路接続部などから血液が漏れだしてくるまでの時間をいう。

７．ＴＭ濃度測定
ＴＭの濃度は、ヒトＣＤ１４１ ＥＬＩＳＡキット（ＤＩＡＣＬＯＮＥ社製造）を使用した。実験手順は、以下の通りである。ＥＬＩＳＡプレートのウェルにサンプルを１００μｌずつ加えた。ｂｉｏｔｉｎａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ１４１を調整し、５０μｌずつウェルに加えた。プレートカバーでカバーし、１時間室温下で定温放置した。カバーを外し、プレートをマイクロプレートウオッシャー（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＩｍｍｕｎｏＷａｓｈ Ｍｏｄｅｌ １５７５）にて、以下のように洗浄した。
１） 全てのウェルから溶液を吸い出した。
２） 全てのウェルに洗浄液を３００μｌずつ満たした。
３） 再度全てのウェルから溶液を吸い出した。
４） 手順２）と３）を二度繰り返した。

洗浄操作後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を調整し、ウェルに１００μｌ加えた。プレートカバーでカバーし、３０分間室温下で定温放置した。カバーを外してウェルを、上記洗浄操作１）〜４）と同様に洗浄を行った。ｒｅａｄｙ−ｕｓｅ ＴＭＢ基質溶液をウェルに１００μｌ加えた。プレートをアルミホイルで包んで光を遮断し１５分間室温で定温放置した。ウェルに１００μｌの停止試薬Ｈ_２ＳＯ_４を加えて、酵素基質反応を停止した。停止試薬Ｈ_２ＳＯ_４を加えた後に、速やかにマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ マイクロプレートリーダー モデル６８０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。既知濃度の吸光度の値から検量線を引き、サンプルのＴＭ濃度を算出した。

実施例１
上記３．で得たＴＭ固定化ミニカラムのプロテインＣ活性化度を測定した結果、405nmの吸光度は0.36であり、ブランクは0.10であった。すなわち、プロテインＣを２６０％活性化するものであった。ＴＭ固定化ミニカラムを体外循環医療カラム用補助カラムに、上記１．で得た中空糸膜ミニカラムを体外循環医療カラムの１つである人工腎臓のモデルとした。ＴＭ固定化ミニカラムの片側に、内径１ｍｍ、外径２ｍｍ、長さ１ｃｍのシリコーンチューブ（製品名ＡＲＡＭ（登録商標））を介して、中空糸膜ミニカラムを直列に接続した。ＴＭ固定化ミニカラムおよび中空糸膜ミニカラムのもう一端には、それぞれ内径１ｍｍ、外径２ｍｍ、長さ５０ｃｍのシリコーンチューブを接続した。血液の流れは、ＴＭ固定化ミニカラムが上流に、中空糸膜ミニカラムが下流になるように、ポンプを接続し、血液循環試験を行った。血液の循環可能時間は、４時間であった。また、ＴＭの溶出は２ｎｇ／ｍｌ未満であり、ＴＭは膜から溶出してこないことが確認できた。

比較例１
実施例１と同様に、ＴＭを固定化していない中空糸膜ミニカラムを２本直列で接続し、血液循環試験を行った。血液は実施例１と同じものを用いた。血液の循環可能時間は、２時間であり、実施例１と比較して、有意に循環可能時間が短かった。

Claims (3)

1. 体外循環用医療カラムの前処理に用いる、カラム又は回路である体外循環医療カラム用補助用具であって、該補助用具にプロテインＣを１００％以上活性化させるヒト・トロンボモジュリンが、基材に接触した状態で１５ｋＧｙ以上、８０ｋＧｙ以下の放射線を照射することにより基材に固定化されていることを特徴とする体外循環医療カラム用補助用具。
2. 該体外循環医療カラムが、人工腎臓、人工肺および血球分離カラムから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の体外循環医療カラム用補助用具。
3. 血液凝固防止用のカラムであることを特徴とする請求項１又は２に記載の体外循環医療カラム用補助用具。