KR20190023087A

KR20190023087A - 세포의 조제 방법, 세포 배양 장치 및 키트

Info

Publication number: KR20190023087A
Application number: KR1020197002113A
Authority: KR
Inventors: 마사히코 하기하라; 슈세이 오야
Original assignee: 우베 고산 가부시키가이샤
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-03-07
Also published as: JP6756368B2; US20190284525A1; WO2018021358A1; CN109496232A; KR102437810B1; EP3489349A4; JPWO2018021358A1; KR20210013306A; EP3489349A1

Abstract

본 발명은 세포를 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는 세포의 조제 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 조제 방법, 세포 배양 장치 및 키트

본 발명은 세포의 조제 방법, 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다.

세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는, 세포의 배양 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).

특허문헌 1: 국제 공개 제2015/012415호

본 발명은 폴리이미드 다공질막 이외의 폴리머 다공질막을 사용하여, 세포를 간편하게, 효율적으로, 또한 안정되게 배양을 행하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 감안하여, 예의 검토한 결과, 폴리에테르술폰 다공질막이 세포 배양에 사용할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 양태를 갖는다.

[1] 세포를 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는, 세포의 조제 방법.

[2] 상기 폴리에테르술폰 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막이고,

여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작으며,

상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 및 상기 표면층 A 및 B로 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖고,

상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되어 있는, [1]에 기재된 방법.

[3] 세포를 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4] 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올려 놓고,

상기 폴리에테르술폰 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,

세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는

공정을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[5] 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양 배지 또는 멸균된 액체로 습윤하고,

상기 습윤한 폴리에테르술폰 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,

공정을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[6] 생세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막 내에 머물고, 사세포는 수분과 함께 유출되는, [5]에 기재된 방법.

[7] 상기 멸균된 액체가 멸균수 혹은 멸균된 완충액인, [5] 또는 [6]에 기재된 방법.

[8] 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 넣는 것을 포함하고, 여기에 있어서, 폴리에테르술폰 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태인, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 2 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 소편을 이용하는 것을 특징으로 하는, [8]에 기재된 방법.

[10] 세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착하는, [8] 또는 [9]에 기재된 방법.

[11] 상기 폴리에테르술폰 다공질막을

ⅰ) 절첩하여,

ⅱ) 롤형으로 감아,

ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은

ⅳ) 새끼줄형으로 묶어

세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시키는, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착하는, [11]에 기재된 방법.

[13] 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는 것을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[14] [3]~[13] 중 어느 하나에 기재된 방법의 2종류 또는 그보다 많은 방법을 조합하여 이용하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[15] 세포가 폴리에테르술폰 다공질막의 표면 및 내부에 생육하여 증식하는, [1]~[14] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[16] 세포가, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[17] 동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인, [16]에 기재된 방법.

[18] 세균이, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아로 이루어지는 군에서 선택되는, [16]에 기재된 방법.

[19] 세포가, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택되는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[20] 세포가, 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택되는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[21] 폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, [1]~[20] 중 어느 하나에 기재된 세포의 조제 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.

[22] 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어 있는, [21]에 기재된 세포 배양 장치.

[23] 폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, [1]~[20] 중 어느 하나에 기재된 세포의 조제 방법에 사용하기 위한 키트.

본 발명에 의하면, 세포를 간편하게, 효율적으로, 또한 안정되게 배양할 수 있다. 특히, 폴리에테르술폰 다공질막은 착색도가 낮기 때문에 시인성이 우수하고, 세포의 파종이나 생착 거동 등을 육안으로 확인할 수 있다. 또한, 폴리에테르술폰 다공질막은 착색도가 낮기 때문에, 의장성이 우수하다.

도 1은 폴리에테르술폰 다공질막을 이용하여 배양된 인간 피부 섬유아세포의 세포수의 경시 변화를 도시한다.
도 2는 폴리에테르술폰 다공질막을 이용하여 배양된 인간 간엽계 줄기 세포의 세포수의 경시 변화를 도시한다.
도 3은 폴리에테르술폰 다공질막 상에서 배양된 인간 간엽계 줄기 세포를 지방 세포로 유도한 후의 현미경 관찰 결과를 도시한다.
도 4는 폴리에테르술폰 다공질막 상에서 배양된 인간 간엽계 줄기 세포를 골아세포로 유도하고, 또한 석회화 유도한 후의 광학 현미경 화상을 도시한다.
도 5는 인간 간엽계 줄기 세포를 폴리에테르술폰 다공질막으로 장기 배양한 후의 유전자 해석 결과를 도시한다.
도 6은 폴리에테르술폰 다공질막을 이용하여 배양된 인간 골아세포의 세포수의 경시 변화를 도시한다.
도 7은 폴리에테르술폰 다공질막 상에서 배양된 인간 골아세포를 석회화 유도한 후의 광학 현미경 화상을 도시한다.
도 8은 폴리에테르술폰 다공질막을 이용하여 배양된 CHO DP-12의 세포수의 경시 변화를 도시한다.
도 9는 폴리에테르술폰 다공질막 상에서 배양된 CHO DP-12 세포의 현미경 관찰 결과를 도시한다.

1. 본 발명에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막에 대해

본 명세서에 있어서, 「폴리에테르술폰 다공질막」 (이하에서 「PES 다공질막」이라고도 부른다.)이란, 그 표면에 복수의 구멍을 갖는 막을 말하며, 폴리에테르술폰을 포함하고, 전형적으로는 실질적으로 폴리에테르술폰으로 이루어진다.

본 발명의 세포의 조제 방법에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막으로서는, 바람직하게는, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작으며, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 및 상기 표면층 A 및 B로 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖고, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되어 있다. 이러한 구조를 갖는 폴리에테르술폰막을, 이하에서 「발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막」이라고도 부른다.

본 발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막 중의 표면층 A(이하에서, 「A면」 또는 「메시면」이라고도 부른다.)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만, 0.01~150 ㎛, 0.01~100 ㎛, 0.01~50 ㎛, 0.01 ㎛~40 ㎛, 0.01 ㎛~30 ㎛, 0.01 ㎛~20 ㎛, 또는 0.01 ㎛~15 ㎛이고, 바람직하게는, 0.01 ㎛~15 ㎛이다.

본 발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막 중의 표면층 B(이하에서, 「B면」 또는 「큰 구멍면」이라고도 부른다.)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 큰 한 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하, 20 ㎛~100 ㎛, 30 ㎛~100 ㎛, 40 ㎛~100 ㎛, 50 ㎛~100 ㎛, 또는 60 ㎛~100 ㎛이고, 바람직하게는, 20 ㎛~100 ㎛이다.

발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막 표면의 평균 구멍 직경은, 다공질막 표면의 주사형 전자 현미경 사진으로부터, 200점 이상의 개공부에 대해 구멍 면적을 측정하고, 상기 구멍 면적의 평균값으로부터 하기 식 (1)에 따라 구멍의 형상이 진원이라고 했을 때의 평균 직경을 계산으로부터 구할 수 있다.

(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균값을 의미한다.)

표면층 A 및 B의 두께는, 특별히 한정되지 않으나, 예컨대 0.01~50 ㎛이고, 바람직하게는 0.01~20 ㎛이다.

발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막에 있어서의 매크로보이드층 중의 매크로보이드의 막 평면 방향의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않으나, 예컨대 10~500 ㎛이고, 바람직하게는 10~100 ㎛이며, 보다 바람직하게는 10~80 ㎛이다. 또한, 상기 매크로보이드층 중의 격벽의 두께는, 특별히 한정되지 않으나, 예컨대 0.01~50 ㎛이고, 바람직하게는, 0.01~20 ㎛이다.

발명에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막의 총 막 두께는, 특별히 한정되지 않으나, 5 ㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상 또는 25 ㎛ 이상이어도 좋고, 500 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이하 또는 50 ㎛ 이하여도 좋다. 바람직하게는, 5~500 ㎛이고, 보다 바람직하게는 25~75 ㎛이다.

발명에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막의 막 두께의 측정은, 접촉식의 두께계로 행할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막의 공공률(空孔率)은 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 40% 이상 95% 미만이다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리에테르술폰 다공질막의 공공률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하고, 단위 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라 구할 수 있다.

(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리에테르술폰의 밀도를 각각 의미한다. 폴리에테르술폰의 밀도는 1.37 g/㎤로 한다.)

본 발명에 있어서 이용되는 폴리에테르술폰 다공질막은, 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리로서는, 특별히 한정되지 않으나, 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리에테르술폰 다공질막은, 바람직하게는, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막으로서, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만이고, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하이며, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 및 상기 표면층 A 및 B로 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖고, 상기 매크로보이드층의 격벽, 및 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01~50 ㎛이며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 매크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5~500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인, 폴리에테르술폰 다공질막이다.

2. 본 발명에서 사용되는 폴리에테르술폰 다공질막의 제조 방법에 대해

폴리에테르술폰 다공질막의 원료가 되는 폴리에테르술폰은, 당업자에게 공지된 방법으로 합성된 것이어도 좋고, 예컨대, 2가 페놀, 알칼리 금속 화합물 및 디할로게노디페닐 화합물을 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법, 2가 페놀의 알칼리 금속 이염을 미리 합성하여 디할로게노디페닐 화합물과 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법 등에 의해 제조할 수 있다.

알칼리 금속 화합물로서는, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 수소화물, 알칼리 금속 알콕시드 등을 들 수 있다. 특히, 탄산나트륨 및 탄산칼륨이 바람직하다.

2가 페놀 화합물로서는, 하이드로퀴논, 카테콜, 레조르신, 4,4'-비페놀, 비스(히드록시페닐)알칸류(예컨대 2,2-비스(히드록시페닐)프로판, 및 2,2-비스(히드록시페닐)메탄), 디히드록시디페닐술폰류, 디히드록시디페닐에테르류, 또는 이들의 벤젠환의 수소 중 적어도 하나가, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 저급 알킬기, 또는 메톡시기, 에톡시기 등의 저급 알콕시기로 치환된 것을 들 수 있다. 2가 페놀 화합물로서는, 상기한 화합물을 2종류 이상 혼합하여 이용할 수 있다.

폴리에테르술폰은 시판품이어도 좋다. 시판품의 예로서는, 스미카엑셀 7600P, 스미카엑셀 5900P(이상, 스미토모 가가쿠(주) 제조) 등을 들 수 있다.

폴리에테르술폰의 대수 점도는, 폴리에테르술폰 다공질막의 매크로보이드를 양호하게 형성하는 관점에서, 바람직하게는 0.5 이상, 보다 바람직하게는 0.55 이상이고, 폴리에테르술폰 다공질막의 제조 용이성의 관점에서, 바람직하게는 1.0 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 더욱 바람직하게는 0.8 이하, 특히 바람직하게는 0.75 이하이다.

또한, 폴리에테르술폰 다공질막, 또는 그 원료로서의 폴리에테르술폰은, 내열성, 고온하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가, 200℃ 이상이거나, 또는 명확한 유리 전이 온도가 관찰되지 않는 것이 바람직하다.

<본 발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막의 제조>

본 발명에서 사용되는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막은, 예컨대 이하의 공정:

(1) 대수 점도 0.5~1.0의 폴리에테르술폰의 0.3 질량%~60 질량%와 유기 극성 용매 40 질량%~99.7 질량%를 포함하는 폴리에테르술폰 용액을, 필름형으로 유연(流延)하고, 폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매를 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜, 공공을 갖는 응고막을 제작하는 공정, 및

(2) 상기 공정에서 얻어진 공공을 갖는 응고막을 열처리하여 상기 공공을 조대화(粗大化)시켜, 폴리에테르술폰 다공질막을 얻는 공정

을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

(유연)

먼저, 폴리에테르술폰 용액을 필름형으로 유연한다. 폴리에테르술폰 용액은, 바람직하게는, 폴리에테르술폰 0.3~60 질량% 및 유기 극성 용매 40~99.7 질량%, 보다 바람직하게는, 폴리에테르술폰 1.0~30 질량% 및 유기 극성 용매 70~99 질량%, 더욱 바람직하게는, 폴리에테르술폰 5~15 질량% 및 유기 극성 용매 85~95 질량%를 포함한다.

유기 극성 용매는, 폴리에테르술폰을 용해시킬 수 있는 용매에서 선택할 수 있고, 예컨대 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등을 들 수 있다. 매크로보이드의 양호한 형성의 관점에서, N-메틸-2-피롤리돈은 바람직하다.

유연 방법은 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 폴리에테르술폰 용액을 도프액으로서 사용하고, 블레이드나 T 다이 등을 이용하여 유리판이나 스테인리스판 등 위에, 폴리에테르술폰 용액을 필름형으로 유연할 수 있다. 또한, 연속의 가동식의 벨트 상에, 폴리에테르술폰 용액을 필름형으로 단속적 또는 연속적으로 유연하여, 연속적으로 개편(個片) 또는 장척형의 유연물을 제조할 수 있다. 벨트는, 폴리에테르술폰 용액 및 응고 용매에 영향을 받지 않는 것이면 되고, 스테인리스 등의 금속제, 폴리테트라플루오로에틸렌 등의 수지제를 이용할 수 있다. 또한, T 다이로부터 필름형으로 성형한 폴리에테르술폰 용액을 그대로 응고욕에 투입할 수도 있다. 또한, 필요에 따라 유연물의 한쪽 면 또는 양면을, 수증기 등을 포함하는 가스(공기, 불활성 가스 등)와 접촉시켜도 좋다.

(공공을 갖는 응고막의 제작)

다음으로, 유연물을, 폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매를 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시키고, 폴리에테르술폰을 석출시켜 다공질화를 행함으로써, 공공을 갖는 응고막을 제작한다. 얻어진 공공을 갖는 응고막은, 필요에 따라 세정 및/또는 건조를 행한다.

폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매는, 바람직하게는 물이다. 응고 용매 중의 물의 비율은, 바람직하게는 20~100 질량%, 보다 바람직하게는 20~80 질량%, 더욱 바람직하게는 30~70 질량%, 특히 바람직하게는 40~60 질량%이다. 매크로보이드를 양호하게 형성하는 관점에서, 물과 유기 극성 용매를 포함하는 응고 용매를 이용하는 것이 바람직하다. 유기 극성 용매로서는, N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 바람직한 유기 극성 용매는, N-메틸-2-피롤리돈이다. 응고 용매가 물과 유기 극성 용매의 혼합액인 경우의 응고 용매 100 질량% 중의 물 및 유기 극성 용매의 함유량은, 바람직하게는 물 20~80 질량% 및 유기 극성 용매 20~80 질량%, 보다 바람직하게는 물 30~70 질량% 및 유기 극성 용매 30~70 질량%, 더욱 바람직하게는 물 40~60 질량% 및 유기 극성 용매 40~60 질량%이다.

응고 용매의 온도는, 목적에 따라 적절히 선택하면 되고, 예컨대 -30℃~70℃, 바람직하게는 0℃~60℃, 더욱 바람직하게는 10℃~50℃의 범위이다.

계속해서, 상기에서 얻어진 공공을 갖는 응고막을 열처리하여 공공, 특히 표면층의 공공을 조대화(즉, 공공 사이즈를 증대시키는 것)시켜, 폴리에테르술폰 다공질막을 얻는다. 열처리는, 공공을 갖는 응고막을, 80℃ 이상의 온도 영역에서, 바람직하게는 10℃ 이상, 보다 바람직하게는 30℃/분 이상, 더욱 바람직하게는 40℃/분 이상, 한층 바람직하게는 50℃/분 이상, 특히 바람직하게는 100℃ 이상의 승온 속도로 승온시키는 것을 포함한다. 상기 승온 속도는, 공공을 양호하게 조대화시키는 점에서 유리하다. 승온 속도는, 원하는 형상의 매크로보이드를 안정되게 형성하는 관점에서, 바람직하게는 300℃/분 이하, 보다 바람직하게는 270℃/분 이하일 수 있다.

공공을 양호하게 조대화시키는 점에서, 승온은, 바람직하게는 폴리에테르술폰의 유리 전이 온도 이상, 또는, 바람직하게는 240℃ 이상, 혹은 250℃ 이상, 혹은 260℃ 이상까지 행한다. 한편, 열처리 중의 폴리에테르술폰의 분해를 방지하는 관점에서, 승온은, 바람직하게는 350℃ 이하, 또는 300℃ 이하까지 행한다.

폴리에테르술폰 다공질막에 있어서는, 이용하는 폴리머의 종류, 폴리머 용액의 폴리머 농도, 점도 및 용매종, 응고 조건(용매 치환 속도의 제어, 온도, 응고 용매종 등) 등을 적절히 선택함으로써, 공공률, 막 두께, 평균 구멍 직경, 최대 구멍 직경 등을 조정할 수 있다.

폴리에테르술폰 다공질막에 있어서는, 목적에 따라 적어도 한쪽 면에 코로나 방전 처리, 저온 플라즈마 방전 또는 상압 플라즈마 방전 등의 플라즈마 방전 처리, 화학 에칭 등을 실시함으로써, 막의 표면 처리를 행해도 좋다. 또한, 표면층 A 및/또는 B를 면 절삭하여 이용해도 좋다. 이들 처리에 의해 막의 물질 투과성, 표면 구멍 직경, 젖음성을 제어할 수 있다.

3. 본 발명의 세포의 조제 방법에 대해

본 발명의 세포의 조제 방법은, 세포를 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은, 폴리에테르술폰 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리에테르술폰 다공질막의 표면 또는 내부에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

(1) 세포의 폴리에테르술폰 다공질막에의 적용

세포의 폴리에테르술폰 다공질막에의 적용의 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은 세포를 막형의 담체에 적용하는 데 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 있어서, 세포의 폴리에테르술폰 다공질막에의 적용은, 예컨대, 이하와 같은 양태를 포함한다.

(A) 세포를 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;

(B) 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올려 놓고,

방치하거나, 혹은 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,

공정을 포함하는 양태; 및

(C) 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고,

공정을 포함하는 양태.

(A)의 양태는, 폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 세포, 세포 덩어리를 직접 파종하는 것을 포함한다. 혹은, 폴리에테르술폰 다공질막을 세포 현탁액 중에 넣어, 막의 표면으로부터 세포 배양액을 침윤시키는 양태도 포함한다.

폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리에테르술폰 다공질막에 접착하여, 다공의 내부로 들어간다. 바람직하게는, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포는 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착한다. 폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정되게 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다.

(B)의 양태에 있어서, 폴리에테르술폰 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올려 놓는다. 폴리에테르술폰 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시킴으로써, 세포 현탁액이 막 중에 침투한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것은 폴리에테르술폰 다공질막의 각 표면 형상 등에서 유래하는 성질에 의한 것이라고 생각된다. 본 양태에 의해, 막의 세포 현탁액이 장전된 개소에 세포가 흡입되어 파종된다.

혹은, (C)의 양태와 같이, 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 한쪽 면 또는 양면의 부분 또는 전체를, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고 나서, 습윤한 폴리에테르술폰 다공질막에 세포 현탁액을 장전해도 좋다. 이 경우, 세포 현탁액의 통과 속도는 크게 향상된다.

예컨대, 막의 비산 방지를 주목적으로 하여 막 극히 일부를 습윤시키는 방법(이후, 이것을 「일점 웨트법」이라고 기재한다.)을 이용할 수 있다. 일점 웨트법은, 실질상은 막을 습윤시키지 않는 드라이법((B)의 양태)에 거의 가까운 것이다. 단, 습윤시킨 작은 부분에 대해서는, 세포액의 막 투과가 신속해진다고 생각된다. 또한, 폴리에테르술폰 다공질막의 한쪽 면 또는 양면 전체를 충분히 습윤시킨 것(이후, 이것을 「웨트막」이라고 기재한다.)에 세포 현탁액을 장전하는 방법도 이용할 수 있다(이후, 이것을 「웨트막법」이라고 기재한다.). 이 경우, 폴리에테르술폰 다공질막 전체에 있어서, 세포 현탁액의 통과 속도가 크게 향상된다.

(B) 및 (C)의 양태에 있어서, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시킨다. 이에 의해 세포 현탁액 중의 세포의 농도를 농축하는, 세포 이외의 불필요한 성분을 수분과 함께 유출시키는 등의 처리도 가능해진다.

(A)의 양태를 「자연 파종」, (B) 및 (C)의 양태를 「흡입 파종」이라고 호칭하는 경우가 있다.

한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 폴리에테르술폰 다공질막에는 생세포가 선택적으로 머문다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 생세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막 내에 머물고, 사세포는 우선적으로 수분과 함께 유출된다.

양태 (C)에 있어서 이용하는 멸균된 액체는 특별히 한정되지 않으나, 멸균된 완충액 혹은 멸균수이다. 완충액은, 예컨대, (+) 및 (-) Dulbecco's PBS, (+) 및 (-) Hank's Balanced Salt Solution 등이다. 완충액의 예를 이하의 표 1에 나타낸다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 세포의 폴리에테르술폰 다공질막에의 적용은, 부유 상태에 있는 접착성 세포를 폴리에테르술폰 다공질막과 현탁적으로 공존시킴으로써 세포를 막에 부착시키는 양태(포박)도 포함한다. 예컨대, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 세포를 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하기 위해서, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 넣어도 좋다. 세포 배양 배지가 액체인 경우 폴리에테르술폰 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태이다. 폴리에테르술폰 다공질막의 성질로부터, 세포는 폴리에테르술폰 다공질막에 접착할 수 있다. 따라서, 본래 부유 배양에 적합하지 않은 세포여도, 폴리에테르술폰 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 배양하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 세포는, 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착한다. 「자발적으로 접착한다」란, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포가 폴리에테르술폰 다공질막의 표면 또는 내부에 머무는 것을 의미한다.

세포 배양은, 세포 배양에 있어서의 존재 형태에 따라 배양 세포는 접착 배양계 세포와 부유 배양계 세포로 분류할 수 있다. 접착 배양계 세포는 배양 용기에 부착되어 증식하는 배양 세포이고, 계대에는 배지 교환을 행한다. 부유 배양계 세포는 배지 중에 있어서 부유 상태로 증식하는 배양 세포이고, 일반적으로는 계대 시에는 배지 교환은 행하지 않고, 희석 배양을 행한다. 부유 배양은, 부유 상태, 즉 액체 중에서의 배양이 가능하기 때문에, 대량 배양이 가능하고, 배양 용기 표면에만 생육하는 부착 세포와 비교하면, 입체적인 배양이기 때문에, 단위 공간당 배양 가능 세포수는 많다고 하는 이점이 있다.

본 발명에 의해, 개념적으로는, 세포의 종류에 한정되지 않고 부유 배양과 유사한 형태로 세포를 육성하는 것이 가능해짐으로써, 대량의 세포를 간편하게 배양하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 세포 배양 방법에 있어서, 폴리에테르술폰 다공질막을 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 이용하는 경우, 2 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 소편을 이용해도 좋다. 폴리에테르술폰 다공질막은 플렉시블한 박막이기 때문에, 예컨대 그 소편을 배양액 중에 부유시켜 이용함으로써, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 표면적을 갖는 폴리에테르술폰 다공질막을 반입하는 것이 가능해진다. 통상 배양의 경우, 용기 바닥 면적이 세포 배양 가능한 면적의 상한이 되지만, 본 발명의 폴리에테르술폰 다공질막을 이용한 세포 배양에서는, 앞의 반입된 폴리에테르술폰 다공질막의 대표면적 전체가 세포 배양 가능한 면적이 된다. 폴리에테르술폰 다공질막은 세포 배양액을 통과시키기 때문에, 예컨대 절첩된 막 내에도 영양이나 산소 등의 공급이 가능해진다.

폴리에테르술폰 다공질막의 소편의 크기, 형상은, 특별히 한정되지 않는다. 형상은, 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈형 등 임의의 형태를 취할 수 있다. 예컨대, 한 변의 길이가 약 0.1 ㎜~약 20 ㎜, 바람직하게는 약 0.2 ㎜~약 10 ㎜의, 보다 바람직하게는, 약 1 ㎜~약 5 ㎜의 사각형(정사각형, 직사각형 등), 삼각형 등이 포함된다. 혹은, 예컨대, 바람직하게는, 직경이 약 0.1 ㎜~약 20 ㎜, 보다 바람직하게는 약 0.5 ㎜~약 10 ㎜의 원형이어도 좋다. 이들 소편을 액 중에 분산시킴으로써, 부유 배양과 근사한 형태가 형성되게 된다.

본 발명의 폴리에테르술폰 다공질막은 유연성이 있기 때문에 형상을 변화시켜 이용할 수 있다. 폴리에테르술폰 다공질막을 평면형이 아니라, 입체형으로 형상을 가공하여 이용해도 좋다. 예컨대, 폴리에테르술폰 다공질막을, ⅰ) 절첩하여, ⅱ) 롤형으로 감아, ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은 ⅳ) 새끼줄형으로 묶어, 세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜도 좋다. ⅰ)-ⅳ)와 같이 형상을 가공함으로써, 소편을 이용하는 경우와 마찬가지로, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 폴리에테르술폰 다공질막을 넣을 수 있다. 또한, 각 소편을 집합체로서 취급할 수 있기 때문에, 세포체를 집합화하여 이동시키는 것이 가능해지고, 종합적인 응용성이 높다.

소편 집합체와 동일한 사고 방식으로서, 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용해도 좋다. 적층이란, 폴리에테르술폰 다공질막이 일부 겹쳐지는 양태도 포함한다. 적층 배양에 의해, 좁은 스페이스에서 고밀도로 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 이미 세포가 육성되고 있는 막 상에 막을 더 적층시켜 설치하여 별종 세포와의 다층계를 형성하는 것도 가능하다. 또한, 입체 환경하에서의 세포 간 상호 작용 검증이나, 스트레스가 없는 세포 배양 방법 등, 창약(創藥)에의 이용도 가능하다. 적층하는 폴리에테르술폰 다공질막의 수는 특별히 한정되지 않는다.

전술한 본 발명의 세포의 배양 방법을, 2종류 또는 그보다 많은 방법을 조합하여 이용해도 좋다. 예컨대, 양태 (A)~(C) 중 어느 하나의 방법을 이용하여 먼저 폴리에테르술폰 다공질막에 세포를 적용하고, 계속해서, 세포가 접착한 폴리에테르술폰 다공질막을 부유 배양해도 좋다. 혹은, 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하는 공정으로서, 상기 양태 (A)~(C) 중 어느 방법을 2종류 또는 그보다 많은 것을 조합하여 이용해도 좋다.

본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, 세포는 폴리에테르술폰 다공질막의 표면 및 내부에 생육하여 증식한다. 세포가 입체 구조체의 내부에 생육하여 증식하는 것을 나타낸 보고예는 없다. 본 발명에 있어서 폴리에테르술폰 다공질막의 이용에 의해, 세포의 계속적인 삼차원 배양이 가능해졌다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 의해, 세포는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 더욱 바람직하게는 6일 이상 계속 증식한다.

(2) 본 발명에서 사용될 수 있는 세포

본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 세포의 증식에 이용 가능하다.

예컨대, 세포는, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택된다. 동물 세포는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추 동물(척추 동물문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 크게 나뉜다. 본 명세서에 있어서의, 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포를 의미한다. 척추 동물문은, 무악상강(無顎上綱)과 악구상강(顎口上綱)을 포함하고, 악구상강은, 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로, 포유 동물이라고 말해지는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유 동물은, 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.

본 명세서에 있어서의 식물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 이끼 식물, 양치 식물, 종자 식물을 포함하는 식물의 세포가 대상이 된다.

종자 식물 세포가 유래하는 식물은, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물의 어느 것이나 포함된다. 한정되는 것은 아니지만, 단자엽 식물에는, 난초과 식물, 벼과 식물(벼, 옥수수, 대맥, 소맥, 수수 등), 사초과 식물 등이 포함된다. 쌍자엽 식물에는, 국화아강, 목련아강, 장미아강 등 대부분의 아강에 속하는 식물이 포함된다.

조류(藻類)도, 세포 유래 생물로서 간주할 수 있다. 진정 세균인 시아노박테리아(남조(藍藻))로부터, 진핵 생물이고 단세포 생물인 것(규조, 황록조, 와편모조(渦鞭毛藻) 등) 및 다세포 생물인 해조류(홍조, 갈조, 녹조) 등의 상이한 그룹을 포함한다.

본 명세서에 있어서의 고세균(古細菌) 및 세균의 종류도 특별히 한정되지 않는다. 고세균은, 메탄균·고도 호염균·호열 호산균·초호열균 등으로 이루어지는 군으로 구성된다. 세균은, 예컨대, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아 등으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 방법에 이용할 수 있는 동물 세포 또는 식물 세포의 종류는, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포, 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명에 있어서 「다능성 줄기 세포」란, 모든 조직의 세포로 분화하는 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기 세포는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배아 생식 줄기 세포(EG 세포), 생식 줄기 세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없는 등의 이유에 의해 특히 바람직하다. 다능성 줄기 세포로서는 공지된 임의의 것을 사용 가능하지만, 예컨대, 국제 공개 WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기 세포를 사용 가능하다.

「조직 줄기 세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정한 조직에 한정되어 있으나, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기 세포는 혈구의 기초가 되고, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화한다. 이외에도 간장을 만드는 간 줄기 세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기 세포 등 여러 가지 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포에서 선택된다.

「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대에는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는, 간 세포, 췌장 세포, 근세포, 골세포, 골아세포, 파골 세포, 연골 세포, 지방 세포, 피부 세포, 섬유아세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 또는, 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구(單球), 매크로파지 혹은 거핵구의 혈구 세포에서 선택된다.

「생식 세포」는, 생식에 있어서 유전 정보를 차세대에 전달하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.

세포는, 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택해도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암으로, 연부 육종, 악성 골종양 등을 포함한다. 육종 세포는, 육종에 유래하는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되고, 일정한 안정된 성질을 갖기에 이르며, 반영구적인 계대 배양이 가능해진 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니스 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁 경부암 유래), Vero 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 유래), MDCK 세포(개 신장 세뇨관 상피 세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래) 등 인간을 포함하는 여러 가지 생물종의 여러 가지 조직에 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질 전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여, 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다. 동물 세포, 식물 세포, 세균의 형질 전환에 대해서는, 각각 적합한 방법이 공지이다.

(3) 세포의 배양 시스템 및 세포 배양 조건

본 발명의 방법에 있어서, 세포의 배양 시스템 및 배양 조건은, 세포의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 동물 세포, 식물 세포, 및 세균의 각 세포에 적합한 배양 방법이 공지이고, 당업자는 임의의 공지된 방법을 이용하여 폴리에테르술폰 다공질막에 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 배지도 세포의 종류에 따라 적절히 조제할 수 있다.

동물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, 론자사의 세포 배양 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 식물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, WAKO사의 식물 조직 배지 시리즈 등에 기재되어 있다. 세균의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, BD사의 일반 세균용 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에 이용하는 것의 세포 배양 배지는, 액체 배지, 반고형 배지, 고형 배지 등의 어느 형태여도 좋다. 또한, 액적형으로 한 액체 배지를 세포 배양 용기 중에 분무함으로써, 세포를 담지한 폴리에테르술폰 다공질막에 배지가 접촉하도록 해도 좋다.

폴리에테르술폰 다공질막을 이용하는 세포의 배양에 대해, 마이크로 캐리어나 셀룰로오스 스펀지 등, 다른 부유형 배양 담체와 공존시킬 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양에 이용하는 시스템의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양용의 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관으로부터 대형의 탱크까지 적절히 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 한편, 본 발명에 있어서 폴리에테르술폰 다공질막을 이용함으로써, 본래 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 대해서도 부유 배양용 장치로, 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행하는 것이 가능해졌다. 부유 배양용의 장치로서는, 예컨대, 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등이 사용 가능하다. 또한, 동일한 기능을 실현할 수 있는 환경으로서, VERITAS사의 FiberCell(등록 상표) System과 같은 중공사 배양도 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서의 배양은, 폴리에테르술폰 다공질막 상에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 것과 같은 연속 순환 혹은 개방형의 장치를 이용하여, 공기 중에 폴리에테르술폰 다공질막 시트를 노출시키는 것과 같은 형식으로 실행하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 세포의 배양은, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행해도 좋다. 그때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계일 수 있다.

세포의 배양을, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행하는 경우, 그 계는, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치여도 좋고, 여기서

배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 1 또는 복수의 폴리에테르술폰 다공질막을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이며,

배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 연속적 또는 간헐적으로 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하고, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인

세포 배양 장치여도 좋다.

또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛은 공기 공급구, 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 배양 유닛이어도 좋고, 또한, 공기 공급구 및 공기 배출구, 또는 산소 교환막을 구비한 배양 유닛이어도 좋다. 배양 유닛은 공기 공급구 및 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 것이어도, 세포의 배양에 필요한 산소 등이 배지를 통해 충분히 세포에 공급된다. 또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속되며, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되고, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능해도 좋다.

4. 본 발명의 세포 배양 장치에 대해

본 발명은 또한, 폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, 본 발명의 조제 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 장치에 있어서, 폴리에테르술폰 다공질막은 고정되어 이용되어도 좋고, 혹은 세포 배양 배지 중에 부유하여 이용되어도 좋다. 세포 배양 장치에 있어서, 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어도 좋다.

5. 본 발명의 키트에 대해

본 발명은 또한, 폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, 세포의 조제 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는, 폴리에테르술폰 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 세포 배양 장치, 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.

한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리에테르술폰 다공질막이 단독으로 또는 복수 매 보존되고, 그대로 세포 배양에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은 동 파우치 내에 폴리에테르술폰 다공질막과 함께 멸균 액체가 봉입되어 있고, 효율적 흡입 파종이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.

실시예

이하에 나타내는 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위는, 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아닌 것은 물론이다.

실시예 1

폴리에테르술폰 다공질막을 이용하여 배양된 인간 피부 섬유아세포의 세포수의 경시 변화

(1) 폴리에테르술폰 다공질막 1 및 2의 조제

500 ㎖의 세퍼러블 플라스크에, N-메틸-2-피롤리돈(NMP)을 용매로서 이용하고, 폴리에테르술폰(스미카엑셀 7600P: 스미토모 가가쿠(주) 제조, 대수 점도: 0.701)을 폴리머 농도가 10 질량%가 되는 양을 측정하여 투입하였다. 그 후, 교반 날개, 질소 도입관, 배기관을 부착한 세퍼러블 커버로 뚜껑을 덮고, 오일 배스를 이용하여 50℃로 유지하면서 24시간 교반을 행하여, 점조하고 투명한 액체인 폴리에테르술폰 용액을 얻었다.

실온하에서, 탁상의 자동 코터를 이용하여, 표면에 경면 연마를 실시한 스테인리스제의 가로세로 20 ㎝의 기판 상에, 상기에서 조제한 폴리에테르술폰 용액을 두께 약 100~300 ㎛로, 균일하게 유연 도포하였다. 그 후, 90초간, 온도 23℃, 습도 40%의 대기 중에 방치하고, 그 후, NMP 비율 40 질량%의 수용액인 혼합 응고욕 중에 기판 전체를 투입하였다. 투입 후, 10분간 정치(靜置)하여, 기판 상에 폴리에테르술폰막을 석출시켰다. 그 후, 기판을 욕 중으로부터 꺼내고, 기판 상에 석출한 폴리에테르술폰막을 박리한 후에, 순수 중에 5분간 침지하여, 폴리에테르술폰막을 얻었다. 이 폴리에테르술폰막을 온도 23℃, 습도 40%의 대기 중에서 건조시킨 후, 가로세로 10 ㎝의 핀 텐터에 부착하여 전기로 내에 세트하였다. 약 10℃/분의 승온 속도로 80℃까지 가열하고, 그 후, 10℃/분의 승온 속도로 270℃까지 가열하며, 그대로 3분간 유지하는 온도 프로파일로 열처리를 행하여, 두께가 상이한 폴리에테르술폰 다공질막 1(총 막 두께 25 ㎛), 폴리에테르술폰 다공질막 2(총 막 두께 50 ㎛)를 조제하였다. 폴리에테르술폰 다공질막 1 및 2를, 각각 이하에서 「PES 다공질막 1」 및 「PES 다공질막 2」라고도 부른다. 모두, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막이었다.

PES 다공질막 1의 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 14 ㎛이고, 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 27 ㎛이며, 공공률이 58%였다.

PES 다공질막 2의 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 16 ㎛이고, 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 31 ㎛이며, 공공률이 61%였다.

(2) PES 다공질막 1 및 2를 이용한, 인간 피부 섬유아세포의 배양

2 ㎝×2 ㎝의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사, cat.103)에 세포 배양 배지 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로세로 1.4 ㎝의 정사각형의 PES 다공질막 1 및 2를, 메시 구조의 A면을 위로 하여 용기에 설치하며, 1장의 PES 다공질막당 4×10⁴개의 인간 피부 섬유아세포를 파종하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 배양을 계속하고, 주 2회 정기적으로 배지를 교환하였다. 배양 개시 후, 3일, 7일, 15일, 22일 후에 Cell Counting Kit-8(도진 가가쿠 겐큐쇼 제조, 이하에서 「CCK8」이라고 부른다.)을 이용하여 세포수를 계측하고, 세포 생육 거동을 관찰하였다. 결과를 도 1에 도시한다. PES 다공질막 상에서 안정된 세포의 생육이 관측되었다.

실시예 2

PES 다공질막 상에서의 인간 간엽계 줄기 세포의 장기 배양

인간 간엽계 줄기 세포를 타입 I 콜라겐 코트 디쉬(IWAKI 제조, 구내 직경 6 ㎝)에 파종하여 배양 후, 트립신 처리에 의해 박리하여, 세포 현탁액을 조제하였다. 2 ㎝×2 ㎝의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사, cat.103)에 세포 배양 배지(GIBCO 제조, DMEM+FBS 10%) 0.5 ㎖를 첨가하였다. 실시예 1에서 조제된, 멸균한 가로세로 1.4 ㎝의 정사각형의 PES 다공질막 1을, 메시 구조의 A면을 위로 하여 용기에 설치하고, 1장의 PES 다공질막당 4×10⁴개의 인간 간엽계 줄기 세포를 막 상부에 첨가하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 배양을 계속하고, 주 2회 정기적으로 배지를 교환하였다. 배양 개시 후, 정기적으로 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하면서 143일간 배양하였다. 결과를 도 2에 도시한다. PES 다공질막 1 상에서, 안정된 간엽계 줄기 세포의 생육이 관측되었다. PES 다공질막을 사용한 상기 배양을 이하에서 「부재 배양」이라고 부르고, 얻어진 세포 샘플을 「부재 배양 세포 샘플」이라고 부른다.

실시예 3

PES 다공질막 상에서 배양된 인간 간엽계 줄기 세포의 지방 세포로의 유도

실시예 2의 배양 개시 99일째에 있어서, 세포가 생착된 PES 다공질막을 지방 세포 유도 배지(PromoCell사 제조, C-28016)에 옮겨, 21일간 배양하였다. 21일간의 지방 세포로의 유도 후, 세포가 생착된 PES 다공질막을 포르말린 고정하고, BODIPY로 지방 방울을 형광 염색하였다. 광학 관찰, 및 공초점 레이저 현미경에 의한 동시야의 광학 및 형광 관찰의 결과를 도 3에 도시한다. 시인성이 높은 PES 다공질막의 특성에 의해, 지방 방울의 존재를 광학적으로도 용이하게 시인할 수 있었다. PES 다공질막 상에서 장기 배양한 후에 있어서도, 간엽계 줄기 세포가 갖는 유도 특성이 유지되어 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 4

PES 다공질막 상에서 배양된 인간 간엽계 줄기 세포의 골아세포로의 유도 및 석회화 유도

실시예 2의 배양 개시 99일째에 있어서, 세포가 생착된 PES 다공질막을 골아세포 분화 유도 배지(PromoCell사 제조, C-28013)에 옮겨, 21일간 배양하였다. 그 후, 또한 21일간, 골아세포 석회화 배지(PromoCell사 제조, C-27020)로 석회화 유도를 행하였다. 석회화 유도 종료 후, 세포를 저온에서 메탄올 고정하고, 석회화 염색 키트(코스모·바이오)로 염색하였다. 광학 현미경 관찰을 행하여, 석회화 부위의 관찰을 행하였다. 적변 부위가 관찰되어, 석회화의 진행이 확인되었다(도 4). 지방 세포와 마찬가지로, 골아세포로도 유도 가능한, 간엽계 줄기 세포의 특성이 확인되었다. PES 다공질막의 고(高)시인성도, 관찰성 향상에 기여하고 있다.

실시예 5

PES 다공질막 상에서 장기간 배양된 인간 간엽계 줄기 세포의 유전자 해석

1. 샘플의 조제

실시예 2의 배양 개시 139일째에 있어서의 부재 배양 세포 샘플을 유전자 해석용 샘플로서 사용하였다. 또한, PES 다공질막을 사용하지 않는 것 이외에는 실시예 2와 동일한 조건으로, 타입 I 콜라겐 코트 디쉬(IWAKI 제조) 중에서 인간 간엽계 줄기 세포를 7일간 배양하였다. 배양된 세포를 유전자 해석용 샘플로서 사용하였다. PES 다공질막을 사용하지 않은 상기 배양을 이하에서 「통상 배양」이라고 부르고, 얻어진 세포 샘플을 「통상 배양 세포 샘플」이라고 부른다.

2. 유전자 해석

얻어진 샘플에 대해, 이하의 순서로 유전자 해석을 행하였다.

(1) RNA 추출

RNeasy Plus micro Kit(Qiagen)를 이용하여 부속의 프로토콜대로 RNA의 추출을 행하였다. RNA는 30 μL의 Nuclease Free Water로 추출하고, 그 후, TURBO DNA free Kit(Life Technologies)를 이용하여 DNase에 의한 게놈 DNA의 분해 처리를 행하였다. 분해 처리 후, RNA 용액의 농도를 Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였다.

(2) cDNA 합성

농도 측정 후의 RNA 용액을 12.5 ng/μL로 조제하고, 100 ng을 템플릿으로 하여 cDNA 합성을 행하였다. 합성에는 SuperScript(상표) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)을 사용하였다. cDNA 용액의 농도를 Nano Drop 2000으로 측정하였다.

(3) q-PCR 반응

cDNA 용액을 200 ng/μL로 조제하고, 200 ng을 템플릿으로 하여 리얼타임 PCR에 의한 측정을 행하였다. PCR은 CFX connect(Bio-Rad)로 행하고, 시약은 SsoAdvanced(상표) Unⅳersal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하였다. 간엽계 줄기 세포 양성 마커(CD166, CD44, CD105, CD146, CD90, CD106, CD29, CD71), 간엽계 줄기 세포 음성 마커(CD19, CD45, CD31, CD18, CD56, CD34, CD14, CD80, CD40, CD86)에 대해, 발현량을 측정하고, 내부 표준 유전자로서는 beta-Actin을 사용하였다.

(4) 측정 데이터 해석

측정으로 구해진 각 유전자의 Ct값을, 내부 표준 유전자로서 측정한 beta-Actin의 Ct값으로 뺀 값으로부터, 상대 발현량을 산출하여 비교하였다. 또한, 통상 배양 세포 샘플과 부재 배양 세포 샘플에서 유전자 발현의 경시 변화를 비교하기 위해서, 7일간 통상 배양한 세포 샘플의 발현량을 1로 한 경우의 변화를 각각 산출하여 비교하였다. 양성 마커의 발현량에 관한 결과를 도 5에 도시한다. 한편, 음성 마커의 발현량은 전부 낮은 값인 것을 확인하였다. 유전자 발현량의 결과로부터, PES 다공질막을 이용하여 장기 배양한 후라도, 줄기 세포 특성이 유지되는 것이 확인되었다.

실시예 6

PES 다공질막을 이용한, 인간 골아세포의 배양

2 ㎝×2 ㎝의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사, cat.103)에 골아세포 증식 배지(PromoCell사 제조, C-27001) 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로세로 1.4 ㎝의 정사각형의 PES 다공질막 1(실시예 1에서 조제된 것)을 배지에 침지시켰다. 1장의 PES 다공질막당 4×10⁴개의 인간 골아세포(PromoCell사 제조)를 파종하고, CO₂ 인큐베이터 내에서 배양을 계속적으로 행하였다. 주 2회 배지 교환(1 ㎖)을 계속하고, 정기적으로 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하였다. 결과를 도 6에 도시한다. 장기간 배양한 경우라도, 안정적으로 또한 고밀도로 인간 골아세포의 증식 및 생육이 관찰되었다.

실시예 7

PES 다공질막 상에서 배양된 인간 골아세포의 석회화 유도

실시예 6의 배양 개시 224일째에 있어서, 배지를 골아세포 석회화 배지(PromoCell사 제조, C-27020)로 대체하여 석회화 유도를 행하였다. 28일 후에, 석회화 염색 키트(코스모·바이오사 제조)를 이용하여 세포를 염색하였다. 광학 현미경 관찰을 행하여, 석회화 부위의 관찰을 행하였다. 적변 부위가 관찰되어, 석회화의 진행을 확인하였다(도 7). PES 다공질막 상에서 인간 골아세포를 장기간 배양한 후라도, 골아세포 특성이 유지되는 것이 확인되었다. PES 다공질막의 고시인성이, 적변의 관찰성의 향상에 기여하고 있다.

실시예 8

PES 다공질막을 이용한, CHO DP-12 세포의 배양

항인간 IL-8 항체 생성 CHO DP-12 세포(ATCC CRL-12445)를 디쉬(구내 직경 10 ㎝)에 파종하여 배양 후, 트립신 처리에 의해 박리하여, 세포 현탁액을 조제하였다. 2 ㎝×2 ㎝의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사, cat.103)에 세포 배양 배지(IMDM, 2% FBS) 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로세로 1.4 ㎝의 정사각형의 PES 다공질막 1 및 2(실시예 1에서 조제된 것)를, 메시 구조의 A면을 위로 하여 용기에 설치하며, 1장의 PES 다공질막당 4×10⁴개의 CHO DP-12 세포를 파종하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 배양을 계속하고, 주 2회 정기적으로 배지를 교환하였다. 배양 개시 후, 정기적으로 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하면서, 143일간 배양하였다. 결과를 도 8에 도시한다. 안정된 CHO DP-12의 증식 및 생육이 관찰되었다.

143일 후에 세포가 생육된 PES 다공질막 2를 고정하고, Alexa Fluor(등록 상표) 488 팔로이딘, CellMask Orange Plasma Membrane Stain, 및 DAPI로 염색하였다. 광학 관찰, 및 공초점 레이저 현미경에 의한 동시야의 광학 및 형광 관찰의 결과를 도 9에 도시한다. 시인성이 높은 PES 다공질막의 특성에 의해, 세포의 존재를 용이하게 시인할 수 있었다.

본 발명의 방법은, 세포를 간편하게, 효율적으로, 또한 안정되게 배양하기 위해서 적합하게 이용할 수 있다. 특히, 폴리에테르술폰 다공질막은 착색도가 낮기 때문에 시인성이 우수하고, 세포의 파종이나 생착 거동 등을 육안으로 확인할 수 있는 점에서 유용하다. 또한, 폴리에테르술폰 다공질막은 착색도가 낮기 때문에, 의장성이 우수한 점도 유용하다.

Claims

세포를 폴리에테르술폰 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는 세포의 조제 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리에테르술폰 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리에테르술폰 다공질막이고,
여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작으며,
상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 및 상기 표면층 A 및 B로 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖고,
상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되어 있는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포를 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올려 놓고,
상기 폴리에테르술폰 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양 배지 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리에테르술폰 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 생세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막 내에 머물고, 사세포는 수분과 함께 유출되는 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 멸균된 액체가 멸균수 혹은 멸균된 완충액인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막을 넣는 것을 포함하고, 여기에 있어서, 폴리에테르술폰 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태인 방법.
제8항에 있어서, 2 이상의 상기 폴리에테르술폰 다공질막의 소편을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에테르술폰 다공질막을
ⅰ) 절첩하여,
ⅱ) 롤형으로 감아,
ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은
ⅳ) 새끼줄형으로 묶어
세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시키는 방법.
제11항에 있어서, 세포가 상기 폴리에테르술폰 다공질막에 자발적으로 접착하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법의 2종류 또는 그보다 많은 방법을 조합하여 이용하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 폴리에테르술폰 다공질막의 표면 및 내부에 생육하여 증식하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제16항에 있어서, 동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 방법.
제16항에 있어서, 세균이, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가, 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 조제 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.
제21항에 있어서, 2 이상의 폴리에테르술폰 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어 있는 세포 배양 장치.
폴리에테르술폰 다공질막을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 조제 방법에 사용하기 위한 키트.