KR20110086006A

KR20110086006A - 세포 증식을 위한 조사된 멤브레인

Info

Publication number: KR20110086006A
Application number: KR1020117009458A
Authority: KR
Inventors: 베른트 크라우제; 마르쿠스 뉴바우어; 조아힘 뢰르헤르
Original assignee: 감브로 룬디아 아베
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2011-07-27
Also published as: US11596902B2; CN102202771B; PL2331243T3; KR101590666B1; JP5596035B2; US20210178333A1; CN102202771A; CA2736533C; JP2014087344A; CA2736533A1; US10974201B2; WO2010034466A1; ES2663430T3; JP2012503688A; US20110263022A1; EP2331243B1; EP2168666A1; JP5792262B2; EP2331243A1

Abstract

본 발명은 유착 또는 부유 세포, 특히 유착 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 멤브레인에 관한 것으로, 여기서 상기 멤브레인은 산소의 존재 하에 12.5 kGy 내지 175 kGy의 선량으로 감마선 또는 베타선 또는 전자빔에 의한 습윤 및 건조 멤브레인의 조사로 인하여 세포의 유착 및 증식을 고려한 것이다. 그 결과로 형성된 멤브레인은 표면 개질 물질에 의한 임의의 예비 처리 없이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포, 특히 유착 세포의 배양에 사용될 수 있는 상기 조사된 멤브레인을 제조하는 방법 및 세포, 특히 유착 세포의 배양에 그러한 멤브레인을 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포 증식을 위한 조사된 멤브레인{IRRADIATED MEMBRANE FOR CELL EXPANSION}

본 발명은 유착(adherent) 또는 부유(suspension) 세포, 특히 유착 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 멤브레인에 관한 것으로, 여기서 상기 멤브레인은 산소의 존재 하에 12.5 내지 175 kGy의 선량으로 감마선 또는 베타선 또는 전자빔에 의한 습윤 또는 건조 멤브레인의 조사로 인한 세포의 유착 및 증식을 고려한 것이다. 결과로 형성된 멤브레인은 표면 개질 물질에 의한 임의의 전처리 없이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포, 특히 유착 세포의 배양에 사용될 수 있는 상기 조사된 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것이며, 그리고 세포, 특히 유착 세포의 배양에 그러한 멤브레인을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 배양 플라스크 또는 세포 스택을 사용하는 세포 증식에 대한 현재 황금 표준을 나타내는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS: tissue culture polystyrene) 플레이트와 실질적으로 유사한 성장 특징을 나타내는 멤브레인의 식별(identification)에 있다. 측정하고자 하는 주요 특징은 세포 증식 속도, 멤브레인 상으로의 세포의 재부착 효율, 및 형태 제어, 표현형 및 분화 가능성을 비롯한 세포 후-증식(post-expansion)의 특징이다. 그러한 멤브레인은 다양한 기하구조, 예컨대 평평한 시이트 멤브레인(flat sheet membrane) 또는 중공 섬유 멤브레인(hollow fiber membrane)으로 제조되는 것에 적합해야 한다.

본 발명은 구체적으로 예를 들면 다양한 유형의 유착 세포를 배양, 성장, 저장 및/또는 증식시키는데 사용될 수 있는 멤브레인에 관한 것이다. 본 발명의 문맥에서, 표현 "세포 배양" 또는 "세포를 배양하는(세포의 배양)"은 그러한 모든 용도, 즉 상이한 유형 세포의 유착, 유지, 성장, 증식, 분화, 분자 생물학적 변형(예를 들면, 트랜스펙션) 및/또는 저장을 포함한다.

생체내 대부분 세포와 같이, 수 많은 세포는 유착 세포 또는 부착 의존성 세포(anchorage dependent cell)이다. 즉, 그 세포는 단지 표면 또는 기질에 부착되어 있기만 하면 대사 또는 분할할 수 있다. 단지 순환계의 세포(예를 들면, 림프구 및 적혈구) 및 다른 세포 유형, 예컨대 조혈 줄기 세포, 간세포, CHO 세포 등은 시험관내에서 용액 중에 비부착 및 부유 상태로 성장한다. 수 많은 부착 의존성 세포는 유리 또는 합성 표면 상에서 성장할 수 있지만, 이러한 세포는 종종 분화하고 호르몬에 반응하는 그 능력을 상실하기도 한다. 세포 형태의 상실은 기능의 상실을 필히 수반할 뿐만 아니라 장기간 배양 시스템에서 재생력을 방해한다. 그러나, 장기간 배양, 예를 들면 조직 배양을 위한 인간 세포의 사용에 의한 것은 매우 중요하며, 그리고 수 많은 세포는 임의의 분량으로도 이용가능하지 않다. 이러한 이유로, 그러한 조직 배양 접시는 종종 세포외 기질 성분, 예컨대 콜라겐 또는 피브로넥틴에 의해 코팅된다. 그러나, 이종 인자(xenogenic factor)의 사용은, 특히 세포 자체 또는 기질 상의 세포가 인간의 의학적 치료에 사용된되는 경우, 명백한 단점이 되는데, 그것이 오염 위험을 야기하여 결과적으로 치료 중인 환자에서 유해 반응을 초래할 수 있기 때문이다.

세포가 그러한 표면 상에 성장하거나 그 능력을 유지하지 못하는 것은, 예를들면 현행 조직 배양 기법의 주요 제한이 된다. 조직 배양액은 인간 내로의 이식에 사용될 수 있는 조직 및 기관의 잠재적 공급원이다. 예를 들면, 조직 배양된 피부 세포는 잠재적으로 피부 이식편에 사용될 수 있다. 이 목적은, 예를 들면 새로운 조직 성장의 적당한 배향 및 방향을 위해 재생할 수 있는 신체 능력에 의존적인 비세포 기질의 사용에 의해, 또는 세포가 유착된 기질 또는 멤브레인의 사용에 의해, 정상 기능을 복원 및 유지할 수 있는 생물학적 치환체를 개발하기 위한 것이다(Atala(2006) : Recent developments in tissue engineering and regenerative medicine. Curr . Opin . Pediatr . 16, 167-171). 세포는 또한 캐리어 또는 단독에 의한 주입을 통해 요법에 사용될 수 있다. 이러한 경우, 세포는 배양액 중에서 증식되고, 지지체 기질에 부착되며, 그리고 이어서 증식후 호스트 내로 재이식되는 것이 필요하다. 현재 수의학적 치료 용도가 이용가능하고, 세포 배양에 멤브레인의 추가적 용도를 나타낼 수 있다.

세포, 특히 유착 세포를 배양할 수 있는 능력이 또한 중요하며, 왜냐하면 세포는 다량의 바이오 생성물, 예컨대 성장 인자, 항체 및 바이러스를 생산할 수 있는 생물학적 "공장"을 나타내기 때문이다.

추가적으로, 세포 배양은 약학 및 생명 과학 산업의 분야에서 생체적합성 및 독성학 연구를 위한 도구로서 출현되고 있다.

최종적으로, 조직 배양은 일반적으로 단지 하나 또는 소수의 조직 또는 기관으로부터 유래된 세포를 포함한다. 결과적으로, 세포 배양은 전체 유기체를 사용하여 연구하는 복잡함이 없이 개별 세포 유형의 특성을 연구하는 시스템을 과학자에게 제공한다.

유착 세포를 배양하기 위한 공지된 방법은 중공 섬유 멤브레인 생물반응기를 포함한다. 이 시스템에서, 세포는 일반적으로 원통형 중공 섬유 멤브레인의 내강에 부착된다. 배양 배지 및 산소는 그 원통형 중공 섬유 멤브레인의 중심을 통해 유동한다. 멤브레인의 분자량 컷-오프는 세포가 배출되는 것을 허용하는 일 없이 영양성분 및 산소가 세포에 도달하는 것을 허용한다.

다양한 중합체가 세포 및 조직 배양을 위한 반투과성 멤브레인을 제조하는데 제안되어 오고 있다(US 2007/269489). 그 중합체로는 폴리알기네이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리우레탄 이소시아네이트, 셀룰로즈 아세테이트, 셀룰로즈 디아세테이트, 셀룰로즈 트리아세테이트, 셀룰로즈 니트레이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드 및 이러한 중합체들의 조합이 포함된다. 중합체 지지체는 또한 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리카르보네이트로 구성될 수 있다. 예를 들면, 이식가능한 조직 물질을 위한 스캐폴드로서 제안되어 있는 추가 물질로는 셀룰로즈 또는 매크로다공성 콜라겐 캐리어 또는 생분해가능한 기질이 있다.

WO 93/00439 Al에는 세포가 자극되어 활성 인자를 분비하는 생체적합성의 반투과성 멤브레인 내에 세포 배양액을 유지하는 공정이 기술되어 있다. 그 사용된 반투과성 멤브레인은 외부 환경에 존재하는 유해 약물이 배양액에 대한 엑서스를 얻는 것을 배제하면서 그 멤브레인을 통과하는 활성 인자의 확산을 허용한다. 그 기술된 멤브레인은 관형 형상을 가지며, 그리고 150 kDa 이하의 분자량을 갖는 분자의 확산을 가능하게 하는 것으로 언급되어 있다. 상기 멤브레인에 대하여 제안된 물질은 아크릴 공중합체, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리설폰, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리우레탄-이소시아네이트, 폴리알기네이트, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리설폰, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 이들의 유도체 및 혼합물이 있다. 그러한 멤브레인을 제조하는데 임의의 조사를 사용하는 것은 기술되어 있지 않다. 개시내용에서 그 멤브레인은 세포 유착을 위한 기질로서 작용을 해야하는데 사실 그렇지 못하다.

WO 90/11820 A2에는 시험관내 세포 성장에 사용 가능한 표면을 지닌 평평한 멤브레인 또는 생체내 인공 임플란트가 개시되어 있다. 그 멤브레인은 0.1 내지 100 마이크론 범위의 소공 크기를 지닌 다공성인 것으로서 그리고 중간 층 내에 핑거 유사 구성을 갖는 것으로서 기술되어 있다. 그 멤브레인은 소수성 중합체 및 친수성 중합체를 포함한다. 소수성 중합체에 대하여 주어진 예는 폴리설폰, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 바람직하게는 폴리에테르 우레탄, 및 이들의 공중합체를 포함한다. 상기 참고 문헌은 그 멤브레인이 세포를 유착 및 배양하는데 사용될 수 있는지의 여부에 관해서는 보고되어 있지 않다. 임의의 조사 기법의 이용은 기술되어 있지 않다.

유착 세포의 배양을 위한 기질로서 사용될 수 있는 멤브레인 조성물을 식별하는 문제와는 별도로, 해당 기술 분야에 현행 공지된 멤브레인은 상기 멤브레인 또는 기질의 전처리 없이 유착, 증식, 분화 및 장기간 수명을 충분히 촉진 및 유지할 수 없는 그의 무능력으로부터, 또는 예를 들면 피브로넥틴, 라미닌 또는 콜라겐과 같은 외이성 인자의 첨가로부터 어려움을 겪고 있다.

예를 들면, 문헌[Fissell(2006), Expert Rev . Med . Devices 3(2), 155]에는 합성 폴리설폰계 중공 섬유 멤브레인에 신장 세뇨관 세포를 유착시키는 것을 기초로 하는 인공 신장의 개발에 관한 성과가 개관되어 있다. 이러한 경우, 멤브레인은 세포의 부착을 촉진하기 위해서 ProNectin-L™으로 코팅되어야 한다.

US-A 6,150,164 및 US-A 6,942,879 둘 다는 중공 섬유 내로 시딩되어 있는, 예를 들면 내피 세포 또는 일명 신장 줄기 세포와 같은 신장 세포를 기초로 한 생체인공 신장(biooartificial kidney)에 대한 정교한 방식이 제시되어 있다. 유용한 것으로 언급되어 있는 중공 섬유 멤브레인은 셀룰로즈, 폴리아크릴로니트릴, 폴리설폰 및 다른 성분 또는 이들의 공중합체를 기초로 한다. 중공 섬유의 내부 표면 및 외부 표면은 유형 I 콜라겐, 유형 IV 콜라겐, 라미닌, 마트리겔, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 및 이들의 조합을 비롯한 적합한 세포외 기질 성분(EMC: extracellular matrix component)으로 예비 코팅되어 있다. 그러한 처리후에만 세포를 시딩할 수 있다.

합성 멤브레인의 특정 성분, 예컨대 PVP 등을 가교결합시키기 위해서 또는 합성 멤브레인을 멸균시키기 위해서 합성 멤브레인, 예컨대 폴리설폰계 멤브레인을 감마-조사로 처리하는 절차는 공지되어 있다. 방사선 선량은 일반적으로 10 내지 50 kGy 범위, 바람직하게는 20 내지 35 kGy 범위에 있다(예를 들면, US 6,960,297 B2 또는 US-A 6,103,117 참조). 보다 높은 선량은 멤브레인의 열화를 최소화하기 위해서 회피된다. 또한, 상기 공지된 공정은 일반적으로 동일한 이유, 즉 공격적인 산소 유도체, 예컨대 산소 라디칼 및 H₂O₂의 형성 및 그 산소 유도체에 의한 멤브레인 열화로 산소의 존재를 생략하는 방식으로 디자인되어 있다. 감마-조사에 의한 멸균 처리는 일반적으로 수성 조건 하에, 즉 습윤 멤브레인을 사용하여 수행하며, 여기서 용액은 산소를 제거하기 위해서 탈기된다. 건조 조건이 사용되는 경우, 산소는 또한 불활성 가스 대기, 산소 스캐빈저 등을 사용함으로써, 그 시스템으로부터 제거된다.

추가로, 선행 기술의 상기 멤브레인 및 공정의 명백한 목적은 투석 처리에 일반적으로 사용되는 멤브레인에 대한 세포의 유착을 회피하거나 최소화하기 위한 것이다. 이는 세포의 유착 및 성장에 바람직한 표면을 제공하는 것에 중점을 둔 본 발명의 목적과는 상반된다. 따라서, 선행 기술에 기술된 방법은 본 발명의 목적, 즉 세포의 배양에 유용하지 않는 멤브레인을 제공하도록 디자인되어 있다.

EP 1 795 254 Al에는 폴리설폰계 멤브레인의 형성이 기술되어 있으며, 여기서 멤브레인은 멤브레인 둘레 주위 대기 중의 산소 농도가 0.001 내지 0.1% 이하이고 멤브레인의 수분 함량이 그 중량과 관련하여 0.2 내지 7 중량%인 조건 하에, 방사선, 예컨대 감마선에 노출된다. 이 참고 문헌에서, 보다 높은 산소 농도, 특히 대기의 공기의 사용이 결과적으로 여기된 산소 라디칼을 야기하여 중합체의 주사슬을 파괴하고 중합체를 분해하는 것으로 언급되어 있으며, 그리고 불활성 기체의 대기를, 바람직하게는 또한 산소 스캐빈저의 존재 하에, 갖는 것이 바람직한 것으로 언급되어 있다. 임의의 산소를 절대 배제하는 것이 어렵기 때문에, 상기 언급된 한계치는 가장 높은 산소 수치로서 제시되어 있다. 추가로, EP 1 795 254 Al에는 방사선 선량이, 감마선을 사용하는 경우, 1 내지 50 kGy, 또는 보다 양호하게는 10 내지 30 kGy이 되어야 하는 것으로 주의되어 있다. 보다 낮은 선량은 결과적으로 불충분한 멸균 처리를 야기하고, 반면에 보다 높은 선량은 멤브레인의 성분을 분해한다. 상기 참고 문헌은 세포 배양에 멤브레인을 사용하는 것을 고려하고 있지 않다.

JP 2003/245526에는 또한 습윤(물 충전된) 섬유를 사용하는 일 없이 중공 섬유 멤브레인을 조사하는 방법이 기술되어 있다. 이 방법에서, 수분 함량은 중공 섬유 멤브레인의 중량에 대하여 4% 이상으로 조정된다. 중공 섬유 멤브레인 모듈에서 산소 농도는 0.1 내지 3.6%로 설정된다.

US 2006/191844에는 탈기된 수성 RO 용액으로 충전하고, 이어서 밀봉함으로써 수행하는 멤브레인 모듈의 처리가 기술되어 있으며, 여기서 이후 그 모듈은 10 내지 60 kGy 감마선에 노출된다. 감마선의 선량이 너무 높을 때, 소수성 중합체, 친수성 중합체 및/또는 하우징이 분해 및 악화될 수 있다. 따라서, 감마선의 선량은 바람직하게는 50 kGy 이하, 특히 30 kGy 이하인 것으로 개시되어 있다. 비탈기된 물이 사용될 때, 물 속에 용해된 산소가 멤브레인의 성분을 산화 및 악화시키게 된다.

WO 2006/135966 Al에는 감마 방사선을, 임의로 화학 용액 처리 공정과의 조합으로, 사용하여 멤브레인의 친수성 성분, 예를 들면 PVP를 가교결합시키는 방법이 개시되어 있다. 사용된 선량은 1 내지 100 kGy, 바람직하게는 10 내지 50 kGy이다. 이 조사는 건조 또는 습윤 멤브레인에 적용가능한 것으로 언급되어 있다. 그러나, 제시된 예는 습윤 멤브레인 및 35 kGy를 초과하지 않는 선량을 사용한다. 세포 배양에 대한 상기 참고 문헌에 따라 제조된 멤브레인의 용도는 언급되어 있지 않다.

또한, EP 1 439 212 Al에는 감마선에 의한 폴리설폰 및 PVP 계 멤브레인의 조사가 설명되어 있다. 마찬가지로, 그 멤브레인은 습윤 상태에서 조사되고, 여기서 그 멤브레인은 1 중량% 이상의 물을 함유해야 하거나 또는 수 중에 함침되어 있어야 하며, 멤브레인의 임의의 열화를 피하기 위해서 50 kGy를 초과해서는 안된다. 그 조사는 멤브레인 표면에 대한 혈소판의 유착을 감소시키고, 이는 본 발명의 목적, 즉 멤브레인 표면에 대한 세포의 유착과는 대조적인 것이다.

JP 2004/305840에는 스피닝 후 감마선을 사용한 조사에 의해 멸균되는 소수성 중합체 및 친수성 중합체로 구성된 중공 섬유 멤브레인이 기술되어 있다. 조사는 건조되고 저온인 탈산소화 밀폐적 단힌 상태에서 수행한다. 마찬가지로 산소의 배제가 결정적이라는 점을 유의하는 것이 중요하다.

발명의 개요

본 발명에는, 제조후 산소의 존재 하에 12.5 내지 175 kGy의 선량으로 베타선 또는 감마선 또는 전자빔에 의해 처리되는 멤브레인이 개시되어 있다. 조사 동안, 그 멤브레인은 건조 또는 습윤 상태로 존재할 수 있고, 공기, 물 또는 수성 용액 각각에 의해 커버될 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 임의의 세포외 기질 성분으로 멤브레인을 전처리하거나 예비 코팅할 필요 없이 세포 부착의 촉진에 그리고 세포, 특히 유착 세포의 배양에 멤브레인을 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 멤브레인은 PVP 및 임의로 저량의 추가 중합체, 예를 들면 폴리아미드 또는 폴리우레탄 등을 또한 포함하는 폴리설폰계, 폴리에테르설폰계 또는 폴리(아릴)에테르설폰계 합성 멤브레인이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 제1 (14일) 및 제2 (7일) 성장기 후 표준 TCPS 상에서 성장된 MSC의 수에 상대적인 다양한 멤브레인 유형 상에 미처리된 골수로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다(실험 1). 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다. 사용된 약어는 표 I를 참조한다.

도 2는 제1 (14일) 및 제2 (7일) 성장기 후 표준 TCPS 상에서 성장된 MSC의 수에 상대적인 다양한 멤브레인 유형 상에 미처리된 골수로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다(실험 2). 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다. 사용된 약어는 표 I을 참조한다.

도 3은 제2 성장기의 5일째 통상적인 TCPS 접시 상에 재-플레이팅된(re-flated) MSC의 형태를 도시한 것이다. 그 MSC는 실시예 10에서 설명된 바와 같이 실험 2로부터 유도된다. 약어는 표 I에 기재되어 있다. (A) VTK 멤브레인, 물-커버됨(water-covered), 0% 아크릴산, 75 kGy. (B) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.000% 아크릴산, 75 kGy. (C) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.001% 아크릴산, 75 kGy. (D) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산, 75 kGy. (E) TCPS.(F) VTK 멤브레인, 공기-커버됨(air-covered), 25 kGy. (G) VTK 멤브레인, 공기-커버됨, 75 kGy.(H) VTK 멤브레인, 미처리됨. (J) VTK 멤브레인 + FN 코팅.

도 4는 제1 (9일) 및 제2 (7일) 성장기 후 표준 TCPS 상에 성장된 MSC의 수에 상대적인 다양한 멤브레인 유형 상에 예비 선택된 MSC로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다(실험 1). 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다. 사용된 약어는 표 II 및 실시예 11을 참조한다.

도 5는 제1 (10일) 및 제2 (11일) 성장기 후 표준 TCPS 상에 성장된 MSC의 수에 상대적인 다양한 멤브레인 유형 상에 예비 선택된 MSC로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다(실험 2). 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다. 사용된 약어는 표 II 및 실시예 11을 참조한다.

도 6은 직접 감마선 조사되는 멤브레인과 감마선 조사 전에 스팀 멸균된 멤브레인의 비교를 도시한 것이다. 실시예 12에서 설명된 바와 같은 실험은 표준 TCPS 표면에 유착하는 MSC의 수에 상대적인 주어진 멤브레인의 표면에 유착하는 MSC의 수[%]에 관한 것이다. 수평선은 TCPS 수치를 도시한 것이다.

도 7은 제1 (11일) 및 제2 (7일) 성장기 후 표준 TCPS 상에 성장된 MSC의 수에 상대적인, w/o 스팀 및 ETO 멸균과 함께 75 kGy에 의해 조사된 멤브레인 상에 미처리된 골수로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다. 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다.

도 8은 본 발명의 멤브레인 상에 성장된 MSC의 성공적인 지방세포형성(adipogenesis)을 도시한 것이다. (A) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산, 75 kGy. (B) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 알릴아민, 75 kGy. (C) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산 및 0.01% 알릴아민, 25 kGy.

도 9는 본 발명의 멤브레인 상에 성장된 MSC의 성공적인 불완전 골형성(osteogenesis)을 도시한 것이다. (A) TCPS 멤브레인(비교). (B) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산, 75 kGy. (C) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 알릴아민, 75 kGy. (D) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산 + 0.01% 알릴아민, 75 kGy. (E) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.01% 아크릴산, 25 kGy. (F) VTK 멤브레인, 물-커버됨, 0.5% 아크릴산, 25 kGy.

도 10은 TCPS와 비교시 25 kGy(공기-커버됨) 또는 75 kGy(물-커버됨)에 의해 조사된 VTK 멤브레인 상에 인간 피부 섬유아세포(NHDF)의 단기간 세포 배양의 결과를 도시한 것이다. 좌측 컬럼은 TCS 상의 세포 수에 상대적인 1일 후 NHDF 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 유착의 효율을 도시한 것이다. 우측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 5일 후 NHDF 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 증식의 효율을 도시한 것이다.

도 11은 TCPS와 비교시 25 kGy(공기-커버됨) 또는 75 kGy(물-커버됨)에 의해 조사된 VTK 멤브레인 상의 인간 간암 세포(hepatocarcinoma cell)(HepG2)의 단기간 세포 배양의 결과를 도시한 것이다. 좌측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 1일 후 HepG2 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 유착의 효율을 도시한 것이다. 우측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 5일 후 HepG2 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 증식의 효율을 도시한 것이다. 본 발명에 따른 멤브레인은 TCPS 표면보다 매우 우수한 세포 유착 및 증식을 나타낸다.

도 12는 TCPS와 비교시 25 kGy(공기-커버됨) 또는 75 kGy(물-커버됨)에 의해 조사된 VTK 멤브레인 상의 인간 신장 상피 세포(HK-2)의 단기간 세포 배양의 결과를 도시한 것이다. 좌측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 1일 후 HK-2 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 유착의 효율을 도시한 것이다. 우측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 5일 후 HK-2 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 증식의 효율을 도시한 것이다.

도 13은 TCPS와 비교시 25 kGy(공기-커버됨) 또는 75 kGy(물-커버됨)에 의해 조사된 VTK 멤브레인 상의 개 상피 세포(MDCK)의 단기간 세포 배양의 결과를 도시한 것이다. 좌측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 1일 후 MDCK 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 유착의 효율을 도시한 것이다. 우측 컬럼은 TCPS 상의 세포 수에 상대적인 5일 후 MDCK 세포의 수를 도시한 것이고, 즉 그것은 세포 증식의 효율을 도시한 것이다.

도 14는 표준 플라스크 배양과 비교된 본 발명에 따른 멥브레인을 기초로 한 생물반응기에서 세포의 배가 시간 비율을 도시한 것이다(실시예 15 참조). 그 배가 시간은 주어진 생물반응기에서 세포의 배가 시간/ 대조군 플라스크에서 세포의 배가 시간을 의미한다.

도 15는 미처리된 골수로부터 배양된 MSC의 생존 능력을 도시한 것이다. 그 수집된 세포의 생존 능력은 시험된 모든 생물반응기에 대하여 90% 이상이다.

도 16은 본 발명에 따른 생물반응기로부터 수집된 세포의 표현형을 도시한 것이다. MSC는 미처리된 골수로부터 배양된다. 알 수 있는 바와 같이, VTK 물-충전된 생물반응기(75 kGy)에서 증식된 세포는 CD45 및 HLA-DR에 대하여 비교적 높은 값을 나타내었다. 다른 모든 생물반응기로부터 수집된 세포는 CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 및 HLA-DR에 관하여 예상된 MSC의 표현형을 나타낸다.

도 17은 제1 (10일) 및 제2 (11일) 성장기 후 표준 TCPS 상에 성장된 MSC의 수에 상대적인 다양한 멤브레인 유형 상에 예비 선택된 MSC로부터 성장된 MSC의 수[%]를 도시한 것이다. 그 결과는 멤브레인의 세포 증식 특성에 미치는 감마 선량의 효과를 나타낸다. 수평선은 TCPS 수치를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은, 건조 상태 또는 습윤 상태에서, 산소의 존재 하에 12.5 내지 175 kGy의 선량으로 베타선 또는 감마선 또는 전자빔 조사로 처리되는 중합체 멤브레인에 있다. 그 멤브레인은, 조사 동안, 공기에 의해, 물에 의해 또는 낮은 양의 첨가제를 포함하는 수성 용액에 의해 둘러싸일 수 있고, 그 공기에서 산소는 조사 동안 4 내지 100 부피%, 예를 들면 5 부피% 내지 30 부피% 또는 15 부피% 내지 25 부피%의 농도로 존재한다.

그 중합체 멤브레인은 소수성 또는 친수성 중합체 또는 둘 다를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 멤브레인은 하나 이상의 친수성 중합체와 하나 이상의 소수성 중합체의 블렌드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 멤브레인은 친수성 공중합체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 멤브레인은 친수성 공중합체 및 소수성 중합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 멤브레인은 친수성 단독중합체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 멤브레인은 친수성 단독중합체 및 소수성 중합체를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 멤브레인을 제조하는데 사용된 중합체는 중합체 용액 중의 소수성 중합체의 분율이 5 내지 20 중량%이고 친수성 중합체의 분율이 2 내지 13 중량%이도록 하는 양으로 소수성 중합체 및 친수성 중합체를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 멤브레인은 제1 소수성 중합체 성분, 제2 친수성 중합체 성분, 및 임의로 제3 소수성 중합체 성분을 포함한다.

상기 제1 소수성 중합체는 폴리아미드(PA), 폴리아르아미드(PAA), 폴리(아릴)에테르설폰(PAES), 폴리에테르설폰(PES), 폴리설폰(PSU), 폴리아릴설폰(PASU), 폴리카르보네이트(PC), 폴리에테르, 폴리우레탄(PUR), 폴리에테르이미드 및 상기 중합체들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 제2 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜 모노에스테르, 수용성 셀룰로즈계 유도체, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌옥사이드-폴프로필렌옥사이드 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 제3 소수성 중합체는 폴리아미드(PA), 폴리아르아미드(PAA), 폴리(아릴)에테르설폰(PAES), 폴리에테르설폰(PES), 폴리설폰(PSU), 폴리아릴설폰(PASU), 폴리카르보네이트(PC), 폴리에테르, 폴리우레탄(PUR), 폴리에테르이미드 및 상기 중합체들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그 멤브레인은 평평한 시이트 또는 중공 섬유 멤브레인의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 멤브레인은 EMC에 의한 멤브레인의 예비 처리 또는 예비 코팅할 필요가 없이 세포 부착 또는 유착, 세포 성장 및 증식 또는 세포의 저장에 유용할 수 있다. 세포 배양에 임의의 그러한 EMC 없이 멤브레인을 사용하는 이점은, 예를 들면 시간 절약 및 보다 적은 수의 공정 단계의 관점에서 보다 적은 비용, EMC(GMP-컴플라이언스) 또는 멤브레인을 코팅하는데 요구되는 보다 많은 수의 공정 단계에 따라 야기된 오염 위험의 현저한 감소 및 세포 생산을 위한 유의적으로 매우 잘 한정된 물질 및 프로토콜에 있다.

물론, 본 발명의 멤브레인을 일반적으로 해당 기술 분야에 공지되어 있는 하나 이상의 EMC로 추가로 예비 처리 또는 예비 코팅하는 것이 가능하다. 특히, 호스트 내로의 재이식을 위해서 세포 또는 조직을 증식 또는 성장시키고자 하는 것이 아닌 용도의 경우, 그러한 예비 처리는 유착 또는 증식의 관점에서 멤브레인의 성능을 더욱더 개선시킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 멤브레인을 EMC에 의한 임의의 코팅 없이 사용하는 것이 항상 바람직하다.

본 발명의 추가 양태에서, 세포 배양시 성능은 본 발명의 중공 섬유 멤브레인을 제조함으로써 그리고 상기 중공 섬유 멤브레인 또는 이의 다발을 플레이트 배양 기법에 대한 대안으로서 연속적 배양 공정에서 사용함으로써 유의적으로 개선될 수 있다. 연속적 공정 이외에도, 그 중공 섬유 멤브레인은 정적 또는 반연속적 공정에서 사용될 수 있다

본 발명의 멤브레인은 중공 섬유 멤브레인의 외부 및 내부에, 멤브레인 전체에 특이적 유착 특성을, 예를 들면 연속적 용도를 위한 중공 섬유 멤브레인의 경우, 제공하는 방식으로 제조될 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 멤브레인은 또한 2 이상의 상이한 세포 유형의 세포 공동 배양을 위한 시스템을 제공한다.

본 발명의 추가 양태는 멤브레인이 멤브레인 표면을 임의의 EMC로 예비 코팅할 필요 없이 분화 또는 일체성에 관점에서 최적합한 세포 단일층의 형성을 촉진시킨 것이다. 본 발명의 멤브레인은 전형적인 세포 형태의 보유를 제공하고, 단일층이 용이하게 형성되며, 그리고 단단한 접합이 생성될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 단일층은 세포가 별개로 정상쪽에서만 성장하는 것이 아니라, 모두가 양쪽에서 성장하며, 수 많은 경우 동일 성장 표면 상에서 서로 접촉해 있는 세포의 층을 의미하며, 하지만 이는 그 멤브레인의 모든 잠재적인 용도에 반드시 그런 것이 아니다.

따라서, 본 발명의 멤브레인은, 예를 들면,

(a) 조직 배양 기법에, 즉 생합성 임플란트, 예컨대 생합성 신장 또는 간을 달성하기 위한 것에(또한, Atala(2006) 참조할 수 있음);

(b) 호스트 내로 재이식되기 전에 시험관 내에서 증식될 필요가 있는, 세포의 주입을 통한 의학 요법에서 사용하기 위한, 예를 들면 MSC, 평활근 세포, 피부 세포, 신경 세포, 전신내 신경교 또는 내피 세포, 또는 부유 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포, 제대혈 세포, 신경 줄기 세포 등과 같은 유착 세포를 배양하기 위한 것에,

(c) 성장 인자, 재조합 단백질, 사이토킨 또는 항체, 예컨대 모노클로날 항체와 같은 바이오 생성물의 생산자로서 작용을 하는 세포를 증식 및 제공하기 위한 것에,

(d) 유착 세포의 배양물, 바람직하게는 세포 단일층 배양물을 제조하기 위한 것에, 특이적 세포 유형을 연구하기 위한 것에, 또는 세포에 미치는 임의의 약물, 예를 들면 항암제, 항균제, 안티-바이오틱스, (anti-HIV 바이러스를 비롯한) 항바이러스제 또는 항기생충제의 영향을 연구하기 위한 것에(스크리닝 절차), 또는

(e) 시험관내 시스템에서 유착 또는 부유 세포의 배양 증식 또는 저장을 기초로 하거나 그 증식 또는 배양을 필요로 하는 임의의 다른 용도에

유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 멤브레인은 의도한 용도의 필요성에 따라 임의의 적합한 기하구조를 가질 수 있으며, 즉 그것은 평평한 시이트, 중공 섬유, 또는 중공 섬유 다발일 수 있거나, 또는 형상화되어 체임버 또는 원하는 다른 기하구조를 형성할 수 있다. 세포 증식을 위한 코어 유닛은 O₂ 및 CO₂의 충분한 교환, 영양분의 공급 및 폐 생성물의 제거를 허용하는 중공 섬유계 멤브레인 시스템인 것이 바람직하다. 그 멤브레인의 표면은 특정한 표면 특징을 통해 소정의 특성을 갖는 세포의 유착 및 증식을 가능하도록 디자인되어 있다. 중공 섬유의 내부에서 세포 배양의 이점은 통상적인 플라스크 또는 세포 스택 배양 방법과 비교시 배양 공정에서 배지 소모의 최소화, 공간 요건의 최소화 및 노동의 최소화를 결과로 형성하는 유리한 표면 대 부피 비율을 기초로 한 점이다. 중공 섬유 구조의 또다른 이점은 균일하게 제어된 흐름 경로이다.

본 발명의 멤브레인은, 예를 들어 US 2003/0203478 Al, US 6,150,164 또는 US 6,942,879에서 설명된 바와 같은 다양한 유형의 세포 증식 또는 세포 배양 장치 또는 시스템에 사용될 수 있다.

본 발명의 멤브레인은 일반적으로 유착 세포를 배양하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 유착 세포는, 본 발명의 문맥에서, 유지, 증식, 분화, 저장 등 하고자 하는 기질에 부착하는 세포로서 정의되어 있다. 본 발명의 멤브레인은, 예를 들면 배아 줄기 세포 및 성인 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포(MSC)를 비롯한 줄기 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 간세포, 내피 세포, 근세포, 연골세포 등을 배양하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 제1 양태에서, 본 발명의 멤브레인은, 멤브레인을 제조하는데 사용되는 중합체 용액 중의 소수성 중합체의 분율이 5 내지 20 중량%이고 친수성 중합체의 분율이 2 내지 12 중량%이도록 한 양으로 소수성 중합체 및 친수성 중합체를 포함하는 중합체 혼합물로부터 제조된다. 상기 하나 이상의 소수성 중합체는 폴리아미드(PA), 폴리아르아미드(PAA), 폴리아릴에테르설폰(PAES), 폴리에테르설폰(PES), 폴리설폰(PSU), 폴리아릴설폰(PASU), 폴리카르보네이트(PC), 폴리에테르, 폴리우레탄(PUR), 폴리에테르이미드 및 상기 중합체의 공중합체, 바람직하게는 폴리에테르설폰 또는 폴리아릴에테르설폰과 폴리아미드의 혼합물로 이루어진 군으로부터선택되는 것이 바람직하다. 상기 하나 이상의 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜 모노에스테르, 수용성 셀룰로즈 유도체, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명이 문맥에서, 바람직하게 사용될 수 있는 멤브레인은, 그 멤브레인을 제조하기 위한 중합체 용액 중에, 폴리설폰(PS), 폴리에테르설폰(PES) 및 폴리아릴에테르설폰(PASES)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 중합체 11 내지 19 중량%, 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 제2 중합체 0.5 내지 13 중량%, 폴리아미드(PA) 0 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%, 물 0 내지 7 중량%, 및 N-메틸-2-피롤리돈(NNP), 바람직하게는 N-에틸-2-피롤리돈(NEP), N-옥틸-2-피롤리돈(NOP), 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 감마-부티로락톤(GBL)로 이루어진 군으로부터 선택된 용매 100 중량%에 이르는 그 잔량을 포함한다.

바람직하게는, 중합체 용액 중의 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 폴리비닐피롤리돈의 적어도 2가지 단독중합체로 된 블렌드로 구성되고, 여기서 폴리비닐피롤리돈의 단독중합체 중 하나(= 저분자량 PVP)는 약 10,000 g/mol 내지 100,000 g/mol, 바람직하게는 약 30,000 g/mol 내지 70,000 g/mol의 평균 상대 분자량을 갖고, 폴리비닐피롤리돈의 단독중합체 중 나머지 하나(= 고분자량 PVP)는 약 500,000 g/mol 내지 2,000,000 g/mol, 바람직하게는 약 800,000 g/mol 내지 2,000,000 g/mol의 평균 상대 분자량을 갖는다. 그러한 PVP 단독중합체의 예로는 PVP K85, 약 825,000 Da의 분자량을 갖는 고분자량 PVP 및 PVP K30, 약 66,800 Da의 분자량을 갖는 저분자량 PVP가 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 멤브레인을 제조하기 위한 중합체 용액은 0.5 내지 5 중량%의 고분자량 PVP 및 1 내지 8 중량%의 저분자량 PVP를 포함한다.

그러한 멤브레인을 제조하는 방법은, 예를 들면 US-A 4,935,141, US-A 5,891,338 및 EP 1 578 521 Al에 상세히 설명되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고 인용되어 있다. 본 발명에 따라 효과적으로 처리될 수 있는 이러한 유형의 멤브레인에 대한 예로는 Gambro Polyflux™ 멤브레인(폴리아릴에테르설폰/PVP/폴리아미드)(이것은 예를 들면 Polyflux™ L 및 H 시리즈와 같은 상업적 제품으로 현재 사용되고 있음); Arylane™ 멤브레인(폴리(아릴)에테르설폰/PVP); 또는 DIAPES™ 또는 PUREMA™ 멤브레인(폴리(아릴)에테르설폰/PVP) 또는 친수성 중합체와 소수성 중합체의 블렌드, 예를 들면 PVP 및 PES 또는 폴리설폰을 포함하는 블렌드에 기초한 다른 상업적 투석 멤브레인이 있다.

본 발명의 제2 양태에서, 본 발명의 멤브레인을 제조하는데 사용된 중합체 용액은 소수성 중합체로서 폴리에테르설폰 또는 폴리설폰 12 내지 15 중량% 및 PVP 5 내지 10 중량%를 포함하고, 여기서 상기 PVP는 저분자량 PVP 성분 및 고분자량 PVP 성분으로 구성된다. 그 스피닝 용액 중에 함유된 전체 PVP는 22 내지 34 중량%, 바람직하게는 25 내지 30 중량%의 고분자량(> 100 kDa) 성분 및 66 내지 78 중량%, 바람직하게는 70 내지 75 중량%의 저분자량(≤ 100 kDa) 성분으로 구성된다. 고분자량 및 저분자량 PVP에 대한 예로는 예를 들면 PVP K85/K90 및 PVP K30이 각각 있다. 본 발명의 공정에 사용된 중합체 용액은 66 내지 86 중량%의 용매 및 1 내지 5 중량%의 적합한 첨가제를 더 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 첨가제로는 예를 들면 물, 글리세롤 및/또는 다른 알콜이 있다. 물이 특히 바람직하고, 사용될 때, 1 내지 8 중량%, 바람직하게는 2 내지 5 중량%의 양으로 스피닝 용액 중에 존재한다. 본 발명의 공정에서 사용된 용매는 N-메틸피롤리돈(NMP), 디메틸 아세트아미드(DMAC), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), 부티로락톤 및 상기 용매들의 혼합물로부터 선택되는 것이 바람직하다. NMP가 특히 바람직하다. 멤브레인을 제조를 제조하는데 사용되는 중심(center) 유체 또는 보어(bore) 액체는 상기 언급된 용매 중 하나 이상 및 물, 글리세롤 및 다른 알콜로부터 선택된 침전 매질을 포함한다. 가장 바람직하게는, 중심 유체는 45 내지 70 중량%의 침전 매질 및 30 내지 55 중량%의 용매로 구성된다. 바람직하게는, 중심 유체는 51 내지 57 중량%의 물과 43 내지 49 중량%의 NMP로 구성된다.

그러한 멤브레인을 제조하는 방법은 본원에 명백하게 참고 인용되어 있는 유럽 특허 출원 번호 08008229에 상세히 개시되어 있다. 본 발명에 따라 효과적으로 처리될 수 있는 이러한 유형의 멤브레인에 대한 예로는 예를 들면 Gambro Revaclear™ 멤브레인 및 이의 유도체가 있다. 또한, 본 발명의 문맥에서, 예를 들면 Fresenius FX™-부류 멤브레인(Helixone™ membranes) 또는 Optiflux™ 유형 멤브레인과 같은 상업적 제품으로 현재 사용되는 멤브레인 또는 친수성 중합체와 소수성 중합체의 블렌드, 예를 들면 PVP 및 PES 또는 폴리설폰을 포함하는 블렌드를 기초로 한 다른 상업적 투석 멤브레인을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 제3 양태에서, 본 발명의 멤브레인을 제조하는데 사용된 중합체 용액은 폴리설폰(PS), 폴리에테르설폰(PES) 및 폴리아릴에테르설폰(PAES)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 중합체 11 내지 19 중량%, 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 제2 중합체 0.5 내지 13 중량%, 폴리우레탄(PU) 0.001 내지 20 중량%, 물 0 내지 7 중량%, 및 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), N-에틸-2-피롤리돈(NEP), N-옥틸-2-피롤리돈(NOP), 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 감마-부티로락톤(GBL)으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매 100 중량%에 이르는 잔량을 포함한다. 상기 제1 중합체는 중합체 용액 중에 13 내지 14 중량%의 양으로 존재하는 것이 바람직하고, 13.6 내지 14 중량%의 양으로 존재하는 것이 특히 바람직하다. 폴리에테르설폰(PES) 및 폴리아릴에테르설폰(PAES)이 본 발명의 멤브레인을 제조하는데 사용되는 것이 바람직하다. 중합체 용액 중의 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 폴리비닐피롤리돈의 적어도 2가지 단독중합체로 된 블렌드로 구성되는 것이 바람직하고, 여기서 폴리비닐피롤리돈의 단독중합체의 하나((= 저분자량 PVP)는 약 10,000 g/mol 내지 100,000 g/mol, 바람직하게는 약 30,000 g/mol 내지 70,000 g/mol의 평균 상대 분자량을 갖고, 폴리비닐피롤리돈의 단독중합체의 또다른 하나(= 고분자량 PVP)는 약 500,000 g/mol 내지 2,000,000 g/mol, 바람직하게는 ㅇ야약 800,000 g/mol 내지 2,000,000 g/mol의 평균 상대 분자량을 갖는다. 그러한 단독중합체에 대한 예로는 PVP K85, 약 825,000 Da의 분자량을 갖는 고분자량 PVP, 및 PVP K30, 약 66,800 Da의 분자량을 갖는 저분자량 PVP가 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 멤브레인을 제조하기 위한 중합체 용액은 0.5 내지 5 중량%의 고분자량 PVP 및 1 내지 8 중량%의 저분자량 PVP를 포함한다. 스피닝 용액의 물 함량은 바람직하게는 1 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 약 3 중량%이다. 다양한 용매, 예컨대 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), N-에틸-2-피롤리돈(NEP), N-옥틸-2-피롤리돈(NOP), 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 감마-부티로락톤(GBL) 및 이들의 혼합물이 본 발명의 멤브레인을 제조하는데 사용될 수 있다. 용매는 중합체 용액의 100 중량%에 이르는 양으로 존재한다. 중합체 용액 중 용매의 함량은 바람직하게는 60 내지 80 중량%, 보다 바람직하게는 67 내지 76.4 중량%이다.

본 발명의 멤브레인은, 예를 들면 평평한 시이트 또는 중공 섬유 기하구조로 제조될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 멤브레인은 비대칭성 구조를 갖는다. 중공 섬유의 경우, 섬유의 내부 면 상에 얇은 분리 층이 존재한다. 본 발명의 멤브레인의 구조 또는 형태는 그 세포 유착 및 증식에 관한 성능에 미치는 유의적인 영향 없이 달리 다양할 수 있다. 멤브레인은, 예를 들면 3-층 구조 또는 스펀지 유사 구조 또는 발포체 유사 구조를 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 멤브레인은 세포 유착 면의 평활성 또는 낮은 조도에 의해 추가 특징 지워진다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 멤브레인의 수압 투과율(hydraulic permeability)은 약 0.1ㆍ10^-4 cm³ 내지 200ㆍ10^-4 cm³/(cm² bar sec), 예를 들면 0.1ㆍ10^-4 cm³ 내지 10ㆍ10^-4 cm³/(cm² bar sec), 또는 심지어는 0.1ㆍ10^-4 cm³ 내지 5ㆍ10^-4 cm³/(cm² bar sec)로 다양할 수 있다. 멤브레인 구조에서 결함을 얻는 일 없이 그러한 수압 투과율을 달성하기 위해서, 중합체 용액의 점도는 종공 섬유 제조의 경우 보통 2,500 cP 내지 200,000 cP, 또는 심지어는 10,900 cP 내지 25,600 cP의 범위 내에 있다. 평평한 시이트 멤브레인 제조의 경우, 그 점도는 일반적으로 2,500 cP 내지 500,000 cP, 또는 심지어는 4,500 cP 내지 415,000 cP의 범위 내에 있다.

본 발명의 멤브레인을 제조하는 경우, 중합체는 일정한 온도 및 압력에서 용매 중에 용해된다. 그 중합체 용액의 탈기 공정은 진공(대략 100 mbar)을 생성하는 건조 오븐에서 수행된다. 중합체 용액의 온도는 비교적 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 실온 내지 60℃의 범위 내에 있는 온도를 선택하는 것이 유리하다.

평평한 시이트 멤브레인을 제조하는 경우, 최종 중합체 용액은, 특수 코팅 나이프를 사용함으로써, 지지 영역으로서 작용하는 유리 슬라이드와 같은 평활한 표면 상에 균일한 필름으로서 캐스팅된다. 그 중합체 필름을 캐스팅하는 속도는 비교적 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 10 내지 20 mm/s의 속도가 적당할 수 있다. 예시적인 실험실 규모 공정에서, 중합체 용액은 제일 먼저 주사기를 사용하여 유리 슬라이드 상에 일정하게(steady-going) 도포한다. 기포 발생 없이 작업하는 것 중요하다. 한정된 갭 높이를 지닌 코팅 나이프는 일정 속도로 작용하며, 이는 균일한 중합체 필름을 형성하게 된다. 우수한 두께 분포를 위해서, 균일한 갭을 갖는 코팅 나이프가 바람직하다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 침전 조는 30 내지 100 중량%의 양, 바람직하게는 56 내지 66 중량%의 양으로 존재하는 H₂O 및, 0 내지 70 중량%, 바람직하게는 34 내지 44 중량%의 양으로 존재하는 용매, 예컨대 NMP를 포함한다. 침전 조의 온도는 비교적 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 0℃ 내지 80℃, 또는 30℃ 내지 50℃의 온도를 적용하는 것이 유리할 수 있다. 침전 시간은 또한 다양할 수 있다. 예로서, 침전 시간은 약 5 분일 수 있다. 침전 조는 H₂O 및 용매로 구성되는 것이 바람직하다. 그 침전 조는 30 중량% 내지 100 중량%의 양으로 존재하는 H₂O, 및 70 중량% 내지 0 중량%의 양으로 존재하는, N-메틸-2-피롤리돈(NMP), N-에틸-2-피롤리돈(NEP), N-옥틸-2-피롤리돈(NOP), 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 감마-부티로락톤(GBL) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 침전 조는 56 내지 66 중량%의 양으로 존재하는 H₂O, 및 34 내지 44 중량%의 양으로 존재하는 용매를 포함한다. NMP는 본 발명의 문맥에서 특히 적합한 용매이다.

이어서, 침전된 멤브레인은 이 멤브레인이 절단될 때까지 비용매 중에 저장된다. 절단 후, 멤브레인은 세척, 건조 및 멸균된다.

본 발명의 플랫 시이트 멤브레인의 두께는 15 μm 내지 200 μm로 다양할 수 있다. 35 μm 내지 50 μm의 두께가 대부분의 용도에 특히 유리할 수 있다.

본 발명의 멤브레인은 또한 중공 섬유 기하구조로 제조될 수 있다. 그러한 중공 섬유 멤브레인을 제조하는 경우, 그 용액은 스피닝 다이를 통하도록 펌핑되고, 액체 중공 섬유가 형성된다. 중심에서 용매 농도는 멤브레인의 내부 면에서 개방 구조를 결과로 형성하게 된다. 가장 작은 소공은 멤브레인의 내부 면에서 직접 형성된다. 사용시, 내부에서 선택적 층이 세포 배지와 직접 접촉하게 된다.

하나의 실시양태에서, 침전 조는 물로 구성되어 있다. 침전 조의 온도는 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있지만, 주위 온도 내지 약 40℃가 공정에 유리하게 사용된다. 다이와 침전 조 간의 거리는 0 내지 100 cm, 예를 들면 50 내지 100 cm의 범위 내에 있다. 다이(방적돌기: spinneret) 온도가 또한 다양할 수 있다. 20 내지 80℃의 온도가 사용될 수 있다. 40 내지 50℃의 온도를 적용하는 것이 유리할 수 있다. 스피닝 속도는 5 내지 80 m/min, 예를 들면 11 내지 40 m/min의 범위 내에서 선택될 수 있다.

본 발명의 중공 섬유 멤브레인의 치수는 그 멤브레인의 의도한 용도에 따라 달라질 수 있다. 내부 직경은 일반적으로 50 내지 2,000 μm 범위 내에 있다. 수 많은 용도의 경우, 100 내지 950 μm의 내부 직경이 유리할 수 있다. 전체 두께는 일반적으로 25 내지 55 μm 범위 내에 있다.

본 발명의 멤브레인에 대한 결과로 형성된 Lp는 0.1ㆍ10^-4 내지 200ㆍ10^-4 cm³ /(cm² ㆍbarㆍs), 예를 들면 0.1ㆍ1^-4 내지 10ㆍ10^-4 cm³/(cm²ㆍbarㆍs), 또는 심지어는 0.1ㆍ10^-4 내지 5ㆍ10^-4 cm³/(cm²ㆍbarㆍs)의 범위 내에 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 멤브레인의 Lp는 2ㆍ10^-4 내지 18ㆍ10^-4cm³/(cm² ㆍbarㆍs)의 범위 내에 있다 . 본 발명의 또다른 실시양태에서, 멤브레인의 Lp는 5ㆍ10^-4 내지 15ㆍ10^-4 cm³ /(cm²ㆍbarㆍs)의 범위 내에 있다. 즉, 세포 배양에 사용하고자 하는 멤브레인은 일명 저 플럭스 멤브레인일 수 있다.

"습윤" 및 "건조"라고 칭할 수 있는 본 발명의 멤브레인을 제조하는 2가지 방식이 있다. "습윤" 멤브레인이 제조되는 경우, 그 멤브레인은 제조후 튜브 또는 오븐에서 별도로 건조되어야 한다. 이 목적을 위해, 섬유의 다발(예를 들면, 30 내지 15,000개의 섬유)가 플라스틱 또는 금속 용기 내에 배치된다. 이 용기에 고온 공기가 통과되어 멤브레인을 건조시키게 된다. 제2 방식은 스피닝 기기 상에서 건조 중공 섬유를 직접 제조하는 효율적인 방식인 일명 "온라인 건조"이다. 양자의 절차는 본 발명에 따라 처리되어 사용될 수 있는 멤브레인을 달성하도록 적용가능하다.

본 발명에 따르면, 앞에서 설명된 바와 같은 멤브레인은 그 멤브레인을 공기 또는 물 또는 예를 들면 아크릴산, 알릴아미드 또는 아크릴아미드와 같은 첨가제를 0.00001 중량% 내지 5 중량%, 예를 들면 0.0001 내지 0.01 중량%의 농도로 함유하는 수성 용액으로 커버하여 처리하고, 산소의 존재 하에 감마, 베타 또는 전자빔 조사로 처리한다.

세포 배양 목적으로 작용할 수 있는 멤브레인을 달성하기 위해서, 멤브레인은 조사 체임버 내에 배치하여 12.5 내지 175 kGy, 바람직하게는 70 내지 175 kGy의 방사 선량을 사용하는 감마, 베타 또는 전자빔 조사, 특히 감마선 조사로 처리할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 사용된 선량은 25 내지 125 kGy이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 50 내지 175 kGy의 선량이 사용된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서는, 50 내지 125 kGy의 선량이 사용된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 70 내지 100 kGy의 선량이 사용된다.

감마선 조사는, 예를 들면 Co-60 공급원을 사용하여 수행할 수 있다. 전자빔 조사는 전자빔 가속기를 사용하여 수행할 수 있다. 베타선 조사는 베타 방사선 공급원, 예를 들면 Sr-90 또는 Ru-106을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 멤브레인은 건조 조건 하에 조사로 처리되고, 즉 멤브레인은 공기로 커버되거나 또는 공기에 의해 둘러싸인다. 본 발명의 문맥에서, "건조" 표현은 물이 멤브레인의 다공성 구조 내에 존재한다는 점을 배제하지 않고, 즉 물의 완전 부재에서 멤브레인 벽의 완전 다공성 구조가 물로 충전되는 조건에 이르는 범위를 포함하는 것으로 의도된다.

예를 들면, 멤브레인을 멸균 처리하기 위해서 또는 예를 들면 PVP와 같은 멤브레인의 특정 성분을 가교결합하기 위해서, 행한 멤브레인의 공지된 감마선과는 대조적으로, 조사 동안 산소의 존재는 세포 배양 목적에 적합한 멤브레인을 얻는데 결정적이다. 조사 동안 주위 공기는, 본 발명의 한 양태에서, (몰 함량/부피의 단위) 78.08% 질소, 20.95% 산소, 0.93% 아르곤, 0.038% 이산화탄소, 미량의 다른 기체, 및 가변량의 수증기를 대략 함유하는 미변형된 공기일 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 주위 공기의 산소 함량은, 예를 들면 시스템 내로 산소 기체를 부가적으로 도입함으써, 증가될 수 있다. 산소 농도는 약 100%의 한계치, 예를 들면 30%까지 증가될 수 있다. 본 발명의 또다른 양태에서, 산소 농도는 약 4%의 한계치까지 저하될 수 있다. 4% 내지 100%, 예를 들면 4% 내지 30%(몰 함량/부피의 단위)가 일반적으로 소정의 결과를 달성하는데 사용될 수 있다. 산소의 농도를 5% 내지 25%, 또는 심지어는 15% 내지 22%로 사용하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 멤브레인은 습윤 상태에서, 또는 바꾸어 말하면, 수성 조건에서 조사 처리된다. 표현 "습윤" 및 "수성 조건"은, 본 발명의 문맥에서, 조사 과정 동안 물의 존재를 의미하고, 즉 멤브레인은 물로 커버될 수 있거나 수 중에 함침될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, RO 물이 사용된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 첨가제는 저 분량으로 물과 혼합될 수 있다. 그러한 첨가제는 멤브레인 표면에 작용기를 도입함으로써 일반적으로 세포 배양 목적상 또는 특정 세포 유형상 조사된 멤브레인의 성능을 개선시킬 수 있다. 그러한 첨가제의 예로는 아미노, 카르복실 또는 카르복사미드 작용기를 갖는 비닐기 함유 단량체, 예를 들면 아크릴산, 알릴아미드 또는 아크릴아미드가 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 알릴아미드가 사용된다. 첨가제는 수성 용액 중에 0.00001 중량% 내지 5 중량%의 농도로 존재할 수 있다. 0.0001 중량% 내지 1 중량%, 또는 0.0001 중량% 내지 0.1 중량%의 농도를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 첨가제의 저 농도, 예컨대 0.0001 중량% 내지 0.01 중량%가 특히 효과적으로 입증될 수 있다.

습윤 상태에서 멤브레인의 조사에 보다 많은 방사선 선량, 예컨대 70 내지 175 kGy의 선량을 사용하는 것이 유리할 수 있다.

그 선택된 선량을 달성하는데 필요한 시간은 비교적 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 예로서는 Co-60 공급원을 사용하면, 25 kGy 선량의 경우에 약 6 내지 7 시간, 그리고 75 kGy 선량의 경우에 약 17 내지 20 시간이 필요할 수 있고, 즉 조사 시간이 3배이다. 필요한 시간은 공급원 자체 및 조사시 세기 및 조정하고자 하는 필요성에 따라 좌우된다.

온도는 또한 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있고, 또한 멤브레인에 대한 하우징의 재료에 따라 달라지며, 즉 그 하우징이 금속 또는 합성 재료로 만들어지는 경우, 일반적으로 그 온도는 0℃ 내지 41℃의 범위 내에 있다. 대부분의 경우, 실온을 사용하는 것이 용이하다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 멤브레인은, 소정의 저 플럭스 특징을 보유하기 위해서, 조사 전에 건조, 바람직하게는 온라인-건조, 이서 스팀 멸균 처리로 수행한다. EtO(에틸렌 옥사이드)에 의한 추가 멸균 처리는, 제조 공정에서 그와 같이 원하거나 필요한 경우, 세포 배양 목적상 그 용도에 관한 본 발명의 멤브레인의 효율에 부정적인 영향을 미치는 일 없이 부가될 수 있다. 멤브레인을 스팀 멸균 처리 또는 EtO 멸균 처리하는 방법은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다.

이어서, 조사된 멤브레인은 상이한 유형의 세포, 바람직하게는 유착 세포를 배양하는데 직접 사용될 수 있다. 본 발명의 멤브레인은 배양 플라스크 또는 세포 스택을 이용하는 세포 증식에 대한 현재 황금 표준을 나타내는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트와 실질적으로 유사하거나 그보다 더 매우 우수한 성장 특징을 나타낸다.

본 발명의 멤브레인은, 세포 증식 속도, 멤브레인 상으로의 세포 재부착 효율, 및 간엽 줄기 세포(MSC), 섬유아세포, 상피 세포 및 간세포에 의해 수행된 시험에서 나타난 바와 같이, 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)과 유사하거나 매우 우수한 형태 제어를 비롯한 세포의 후증식 특징을 나타낸다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명의 멤브레인을 포함하는 세포 배양 장치이다. 본 발명의 멤브레인을 포함하도록 변형될 수 있는 세포 증식 또는 세포 배양 장치 또는 시스템의 예들은 US 2003/0203478 Al, US-A 6,150,164, 또는 US-A 6,942,879에 개시되어 있고, 이들 모두는 본원에 참고 인용되어 있다. 그 장치는 본 발명의 평평한 시이트 멤브레인의 스택 또는 본 발명의 중공 섬유 멤브레인의 다발을 포함할 수 있다.

그 장치의 한 실시양태에서, 멤브레인은 그 장치 중의 2개 유체 구획 사이에 계면을 형성한다. 장치는 예를 들면 혈액 투석 또는 혈액 여과에 사용된 상업적으로 이용가능한 사용된 여과 장치와 구성상 유사할 수 있다.

예시적인 장치는 케이싱 내에 장입된 반투과성 멤브레인에 의해 분리된 2개의 구획을 포함하며, 제1 내부 구획은 2개의 엑서스에 의해 적합하게 되고, 제2 외부 구획은 1개 또는 2개의 엑서스를 포함하며, 양자 구획은 또한 적용가능한, (i) 상기 정의된 바와 같은 중공 섬유 다발 유형의 반투과성 멤브레인을 함유하는 상기 장치의 양자의 구획을 분리하는 실리더형 파티션 또는 (ii) 상기 정의된 바와 같은 시이트 멤브레인 유형의 반투과성 멤브레인을 포함하는 상기 장치내 기밀한 시일(seal)로서, 형성하도록 의도된, 적당한 접착제 화합물을 기초로 한 포팅 화합물(potting compound)에 의해서도 분리된다.

다른 예시적인 장치는 외부 쉘 내에 함유되며, 그리고 중공 섬유 외부 공간(즉, 모세관외 구획) 내에 있는 유체가 중공 섬유 및 상응하는 오리피스를 통해 통과하는 유체와 격리되도록 구성된 복수의 중공 섬유 멤브레인을 포함한다. 추가적으로, 그 장치는 장치의 대향 단부 상의 외부 쉘 내에 2개의 메너폴드 및 체임버를 포함한다. 중공 섬유의 2개 입구 각각은 상이한 단부 체임버에 연결되어 있다. 그 단부 체임버 및 모세관외 구획은 중공 섬유의 반투과성 멤브레인에 의해 분리된다. 모세관외 구획 내의 조성물은, 중공 섬유의 멤브레인의 분자량 컷오프 또는 소공 크기에 의해, 특정한 정도로, 제어될 수 있다.

장치를 작동하는 한가지 방식에서, 세포는 영양 배지를 중공 섬유를 통해 통과시키면서 모세관외 구획에서 성장된다. 배지는 모세관외 또는 모세관내 구획을 통해 통과할 수 있다. 장치를 작동하는 다른 방식에서, 세포는 영양 배지를 모세관외 및/또는 모세관내 구획을 통해 통과시키면서 중공 섬유의 모세관내 공간(즉, 루멘)에서 성장된다. 그 중공 섬유의 반투과성 성질은 영양분, 가스 및 세포 폐기 생성물이 중공 섬유의 벽을 통해 통과하는 것을 허용하고, 동시에 세포가 그와 같이 하는 것을 차단하는 것이다.

쉘-앤드-튜브 유형 생물반응기는 몇가지 이점을 제공한다. 유착 세포의 경우, 몇가지 중공 섬유의 사용은, 비교적 적은 부피 내에서, 세포가 성장할 수 있는 표면적을 다량 제공한다. 이러한 다량의 표면적은 또한 성장 세포에 대한 영양 배지의 국소화된 분배 및 세포 폐 생성물의 즉각적인 수집을 용이하게 한다. 쉘 앤드 튜브 유형 생물반응기는 다른 세포 배양 장치에 의해 가능한 것보다 훨씬 더 높은 밀도 속도로 세포 성장을 가능하게 한다. 그 생물반응기는 밀리리터 당 10⁸개 세포 초과의 세포 밀도를 지지할 수 있고, 반면에 다른 세포 배양 장치는 전형적으로 밀리리터 당 약 10⁶개 세포의 밀도로 제한된다.

본 발명의 추가 양태는 세포 및 본 발명의 멤브레인을 포함하는 체액의 체외 치료를 위한 장치를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 그 세포는 멤브레인의 표면 상에, 실제 예를 들면 본 발명의 중공 섬유 멤브레인의 내강의 표면 상에 또는 본 발명의 중공 섬유의 외부 표면 상에 컨플루언트 층(confluent layer)을 형성하는 유착 세포이다. 나머지는, 장치의 디자인이 세포 배양 장치에 대하여 상기 설명된 디자인과 유사할 수 있다. 처리하고자 하는 체액은 장치의 유체 공간을 통해 전도되고, 여기서 유체는 세포 층 위로 통과하여, 세포가 체액으로부터 성분을 추출하거나, 체액의 성분을 대사하거나, 또는 성분을 체액 내로 격리하는 것을 허용한다.

실시예

본 발명의 멤브레인의 적합성 및 효율의 평가는 일반적으로 다음의 주요 특징: 세포 증식 속도, 멤브레인 상의 세포의 재부착 효율, 및 형태 제어를 비롯한 세포의 후증식의 특징에 기초하였다. 시험은, 본 발명에 따른 멤브레인이 다양한 유착 세포 유형의 배양에 적합하다는 점을 입증하기 위해서, 간엽 줄기 세포(MSC), 섬유아세포, 상피 세포 및 간세포로 수행하였다. MSC는 세포 배양에 대한 본 발명의 멤브레인의 성능의 심도 분석을 위해 선택하였다.

방법

핸드 다발, 미니모듈, 필터 및 평평한 시이트 인서트의 제조

(A) 핸드 다발

스피닝 공정 후 멤브레인 다발의 제조는 성공적인 성능 시험에 적합한 방식으로 섬유 다발을 제조하는데 필요하다. 제1 공정 단계에서는 섬유 다발을 한정된 길이 23 cm로 절단한다. 다음의 공정 단계는 섬유의 단부를 용융하는 과정으로 구성된다. 광학 조절은 모든 섬유가 우수하게 용융되는 것을 보장한다. 이어서, 섬유 다발의 단부를 포팅 캡 내로 옮긴다. 그 포팅 캡을 기계적으로 고정하고, 포팅 튜브는 포팅 캡 위로 배치한다. 이후, 포팅을 폴리우레탄으로 수행한다. 포팅을 폴리우레탄이 1일 이상 동안 경화되도록 수행해야 한다. 마지막 공정 단계는 섬유 다발의 광학 제어 과정으로 구성된다. 이 공정 단계 동안에는, 다음의 사항들: (i) 컷의 품질(컷이 매끄러운지 또는 나이프의 임의 손상이 있는지),(ii) 포팅의 품질(포팅되는 섬유에 의해 감소된 스피닝 공정의 개방 섬유의 수가 있는지 또는 폴리우레탄이 없는 임의의 가시적 공극이 있는지)을 조절한다. 광학 제어 후, 멤브레인 다발을 상이한 성능 시험에 사용하기 전에 건조 저장한다.

(B) 미니모듈의 제조

미니모듈[= 하우징 내의 섬유 다발]은 관련 공정 단계들에 의해 제조한다. 이 미니모듈은 섬유의 보호 및 매우 깨끗한 제조 공정을 보장하는데 필요하다. 미니모듈의 제조 공정은 다음의 사항들에서 다르다: (i) 섬유 다발은 한정된 길이 20 cm로 절단하고, (ii) 섬유 다발은 용융 공정 전에 하우징 내로 옮기며, (iii) 미니모듈은 포팅 공정 전에 밤새 동안 진공 건조 오븐 내에 넣어 둔다.

(C) 필터의 제조

필터는 유효 표면적이 0.9 내지 1.7 m²인 약 8,000 내지 15,000개 섬유를 포함한다. 필터는 배양 배지 유체를 공급하기 위한 2개의 커넥터, 및 각각 중앙에 하나의 커넥터가 있도록 양쪽에 적용된 캡을 지닌 원통형 하우징을 특징으로 한다. (와이딩 후) 제조 공정은 다음의 주요 단계들: (i) 컷(대략 30 cm의 길이) 다발을 특수 다발 클로(claw)에 의해 하우징 내로 옮기는 단계, (ii) 다발의 양 단부를 클로징 공정으로 클로징하는 단계, (iii) 섬유를 폴리우레탄(PUR)에 의해 하우징 내로 포팅하는 단계, (iv) 단부를 절단하여 섬유를 개방하는 단계(여기서는 평활한 표면을 필요로 함), (v) 단부를 PUR 블록에서 클로징된 섬유 또는 불완정성에 대한 시각적으로 검사하는 단계, (vii) 최종 처리: 세정, 일체성 시험, 최종 건조를 수행하는 단계, (viii) 추가 단계(예를 들면, 조사)를 위한 특수 백 내에 포장하는 단계로 구분할 수 있다.

(D) 평평한 시이트 인서트의 제조

평평한 멤브레인을 유리 플레이트 상에 고정한다. 인서트를 위한 아교로서 작용하는 폴리우레탄을 플레이트 상에 균일하게 분포시킨다. 그 인서트를 폴리우레탄 중에 약하게 침지시키고, 바로 각 멤브레인 상에 아교로 부착시킨다. 인서트를 유리 및 철 플레이트 구비한 채로 평량하고, 16 내지 18 시간 동안 건조시킨다. 평평한 멤브레인 인서트를 절단하고, 멸균 처리용 백 내로 넣어 용접한다. 최종적으로, 인서트를 121℃의 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다.

핸드 다발 및 미니모듈의 수압 투과율( Lp : Hydraulic Permeability )

멤브레인 다발의 수압 투과율은 한쪽 밀봉되어 있는 멤브레인 다발을 통과하는 압력 하에 물의 정확한 한정된 부피를 가압하고, 요구되는 시간을 측정함으로써 결정한다. 그 수압 투과율은 결정된 시간, 멤브레인 유효 표면적, 적용된 압력 및 멤브레인을 통과하는 가압된 물의 부피로부터 계산할 수 있다. 섬유의 갯수, 섬유 길이 뿐만 아니라 섬유의 내부 직경으로부터, 멥브레인의 유효 표면적을 계산한다. 멤브레인 다발은 Lp 시험을 수행하기 전에 30 분 습윤시켜야 한다. 이 목적을 위해서, 멤브레인 다발은 초순수 500 ml를 함유하는 박스 내에 넣어 둔다. 30 분 후, 그 멤브레인 다발을 시험 시스템으로 옮긴다. 그 시험 시스템은 37℃에서 조절되어 있는 수조, 및 멤브레인 다발을 기계적으로 수행할 수 있는 장치로 구성된다. 수조의 충전 높이는 멤브레인 다발이 지정된 장치에서 물 표면 아래에 위치하는 것을 보장하도록 해야 한다. 멤브레인의 누설이 잘못된 시험 결과를 유발하는 것을 피하기 위해서, 멤브레인 다발의 일체성 시험 및 시험 시스템은 미리 수행해야 한다. 일체성 시험은 멤브레인의 한쪽이 클로징되어 있는 멤브레인 다발을 통과하도록 공기를 가압함으로써 수행한다. 공기 기포는 멤브레인 다발 및 시험 장치의 누설을 나타낸다. 누설이 시험 장치에서 멤브레인 다발의 잘못된 수행과 관련될 수 있는지 또는 실제 멤브레인 누설이 나타는지를 체크해야 한다. 멤브레인 다발은 멤브레인 다발의 누설이 검출된다면 폐기해야 한다. 일체성 시험의 가압된 압력은, 임의의 누설이 수압 투과율의 측정 동안 너무 높게 적용된 압력 때문에 발생할 수 없다는 점을 보장하도록 하기 위해서, 수압 투과율의 측정 동안 적용된 압력과 적어도 동일해야 한다.

핸드 다발의 확산 투과율

투석 유체 중에 희석된 포스페이트(100 mg/l) 뿐만 아니라 등장성 클로라이드 용액에 의한 확산 실험은 멤브레인의 확산 특성을 측정하기 위해서 수행한다. 핸드 다발을 측정 셀에 배치한다. 이 측정 셀은 중공 섬유의 내부에서 특정한 용액을 통과시키는 것을 허용한다. 추가적으로, 그 측정 셀은 물로 완전 충전하고, 증류수의 높은 교차 유동은 중공 섬유의 내부에서 외부로 멤브레인 단면적을 통과하는 특정한 이온을 운반해 가도록 설정한다. 압력 비율을 정확하게 조정함으로써, 제로 여과가 달성되어, 멤브레인의 확산 특성만을 측정하고(중공 섬유의 내부와 중공 섬유의 주위 간의 특정한 이온의 최대 농도 구배를 달성함으로써), 확산 특성과 대류 특성의 조합을 측정하지 않게 된다. 풀(pool)로부터 유래된 샘플을 개시에서 취하고, 보유물의 샘플을 10 분과 20 분에 취한다. 이어서, 클로라이드 샘플을 질산은 용액으로 적정하여 클로라이드 이온을 측정한다. 포스페이트 샘플을 광도계로 분석한다. 측정된 농도, 멤브레인 유효 표면적 A 및 유동 조건으로부터, 클로라이드 또는 포스페이트 각각의 투과율 P를 하기 방정식(2)에 따라 계산할 수 있다.

Px [10^-4cm/s] = [Q_B/60/A]*ln[(C_A-C_D)/C_R]*10⁴(2)

상 기 식 중,

P = 확산 투과율[cm/s]

c = 농도[mmol]

A = 멤브레인 유효 표면적[cm²]

지수:

x = 물질(여기서는 각각 클로라이드 또는 포스페이트임)

A = 출발 농도(공급물)

D = 투석물

R = 보유물

QB = 혈액 흐름[ml/min]

( 핸드 다발의) 수성 용액 중의 미오글로빈에 체질 계수( sieving coefficient )

미오글로불린 및 알부민의 수성 용액 중에서 체질 계수 실험은 별도의 용액을 구비한 2가지 상이한 실험 셋업을 사용하여 수행한다. 제1 시험으로서 미오글로빈의 체질 계수를 측정한다.

PBS 버퍼 중에 용해된 미오글로빈의 농도는 100 mg/L이다. 수성 용액의 종료 일자는 4 내지 8주이다. 그 용액은 냉장고에 저장해야 한다. 체질 계수 실험 전에, Lp-시험은 보다 앞에서 설명된 방법을 이용하여 수행한다. 미오글로빈 체질 계수 실험은 단일 패스로 수행하고, 반면에 시험 조건은 다음과 같이 정의한다: 고유 유량(Jv, cm/s) 및 벽 전단 속도(γD, s^-1)는 고정하고, 반면에 혈액 유량(Q_B) 및 여과 속도(UF)를 계산하고(방정식 (4) + (5) 참조), A를 방정식(1)에 따라 계산한다.

QB [ml/min] = γ * n * π * di³ * 60/32 (4)

UF [ml/min] = Jv * A * 60 (5)

여기서,

n = 섬유의 양

d_I = 섬유의 내부 직경 [cm]

γ = 전단 속도[s^-1]

A = 멤브레인 유효 표면적[cm²]

핸드 다발 및 미니모듈을 시험하기 위해서, 전단 속도는 500 s^-1로 설정하고, 고유 유량을 0.38ㆍ10^-04 cm/s인 것으로 정의한다.

제1 샘플을 15 분 후에 취하고(풀, 보유물 및 여과물), 60분 후 2번째로 취한다. 최종에서는 시험 다발을 몇분 동안 PBS 버퍼로 세정하고, 이어서 시험을 중지한다.

실시예 1

평평한 시이트 메브레인의 제조

중합체 용액은 폴리에테르설폰(Ultrason(등록상표) 6020, BASF), 폴리비닐피롤리돈(K30 및 K85, BASF), 폴리우레탄(Desmopan(등록상표) 9665 DU, Bayer MaterialScience AG) 뿐만 아니라 증류수를 60℃에서 N-메틸피롤리돈(NMP) 중에, 투명한 고점성 용액이 얻어질 때까지 용해시킴으로써 제조하였다.

중합체 스피닝 용액 중의 상이한 성분들의 중량 분율, PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665DU/H₂O/NMP는 14/3/5/2/3/73이었다. 결과로 형성된 중합체 용액의 점도는 21,000 mPaㆍs이었다.

그 용액을 여과시키고 탈기시켰다. 중합체 용액의 탈기 공정은 상승된 온도(＜100℃) 및 감압(대략 100 mbar) 하에 건조 오븐에서 수행하였다. 이어서, 최종 중합체 용액은 특수 코팅 나이프를 사용하여 지지 영역으로서 작용한 평활한 표면(유리 슬라이드) 상에 균일한 필름으로서 (자동적으로) 캐스팅하였다. 제일 먼저, 그 중합체 용액을 오븐에서 60℃로 가열한 후, 주사기를 사용하여 유리 슬라이드 상에 직접 일정하게 도포하였다. 갭의 한정된 높이(lOOμm)를 지닌 코팅 나이프를 12.5 mm/s의 일정 속도로 작동시킴으로써 균일한 중합체 필름을 형성하게 하였다. 중합체 필름을 지닌 그러한 유리 슬라이드를 급속히 응고 조 내로 침지시켰다. 응고 조로서, 56 중량%의 물 및 44 중량%의 NMP를 함유하는 물/NMP 혼합물을 50℃에서 사용하였다. 멤브레인의 침전은 약 5 분이 소요되었다. 이어서, 침전된 멤브레인을 꺼내고, 시리즈의 모든 멤브레인이 제조될 때까지 비용매 중에 저장한 후, 한정된 크기로 절단하였다. 절단 후, 멤브레인을 증류수로 30 분 동안 70℃에서 세척하였다. 다음의 단계들은 밤새 동안 60℃의 오븐에서 수행한 건조 단계, 및 최종으로 멸균 처리에 사용된 특수 백 내에 포장하는 단계이었다. 멤브레인 두께는 35 μm이었다.

실시예 2

평평한 시이트 멤브레인의 제조

중합체 용액은 폴리에테르설폰(Ultrason(등록상표) 6020, BASF), 폴리피닐피롤리돈(K30 및 K90, BASF) 뿐만 아니라 증류수를, 투명한 고점성 용액이 얻어질 때까지, 60℃에서 N-메틸피롤리돈(NMP) 중에 용해시킴으로써 제조하였다.

중합체 스피닝 용액 중의 상이한 성분들의 중량 분율, PES/PVP(K90)/PVP(K30)/H₂O/NMP는 13.6/2/5/3/76.4이었다. 결과로 형성된 중합체의 점도는 5,900 mPaㆍs이었다.

멤브레인은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조하였다. 멤브레인 두께는 50 μm이었다.

실시예 3

중공 섬유 멤브레인의 제조

중합체 용액은 폴리에테르설폰 13.5 중량%, 폴리아미드 0.5 중량%, PVP K30 7.5 중량% 및 NMP 78.5 중량%를 혼합함으로써 제조하였다. 물 59 중량%와 NMP 41 중량%의 혼합물을 중심 유체로서 작용하였다. 그 중합체 용액의 점도는, 온도 22℃에서 측정했을 때, 4,230 mPaㆍs이었다.

중심 유체를 55℃로 가열하고, 2성분 중공 섬유 방적돌기를 통과하도록 펌핑하였다. 중합체 용액을 0.5 mm의 외부직경 및 0.35 nm의 내부 직경을 지닌 환형 슬릿을 통해 방적돌기에서 배출하였다. 중심 유체는, 내부로부터 중합체 용액의 침전을 개시하고 중공 섬유의 내부 직경을 측정하기 위해서, 환형 중합체 용액 튜브의 중심에서 방적돌기에서 배출하였다.

동시에, 2성분(중합체 용액과 중심 유체)을 실험실 대기로부터 분리된 공간으로 유입하였다. 그 공간은 스피닝 샤프트라고 칭한다. 스팀(100℃)과 공기(22℃)의 혼합물을 스피닝 샤프트 내로 주입하였다. 그 스피닝 샤프트 내의 온도를 49℃로 조정하고, 거기에서 스팀 및 공기와 용매 함량의 비율에 의해 상대 습도 99.5%를 물 함량과 관련하여 3.9 중량%로 조정하였다. 그 용매는 NMP이었다. 스피닝 샤프트의 길이는 890 mm이었다. 중력 또는 모터-구동된 롤러의 보조로, 중공 섬유가 방적돌기로부터 수직 방향으로 스피닝 샤프트를 통과하여 수조 내로 정상에서 바닥으로 인발되었다. 그 스피닝 속도는 50 m/min이었다. 이어서, 중공 섬유는 다단계 수조 및 20℃에서 90℃로 증가하는 온도를 통해 유도되었다. 세정 수조에서 배출되는 습윤 중공 섬유를 대류식 온라인 건조 단계에서 건조시켰다. 임의의 텍스처라이징 단계 후, 중공 섬유를 다발 형상의 스피닝 휠 상에 수집하였다. 본 실시예에 따른 중공 섬유의 외부 표면은 0.5 to 3 μm 범위의 소공 직경을 갖는 mm² 당 62,500개의 소공을 보유하였다.

실시예 4

중공 섬유 멤브레인의 제조

중합체 용액은 폴리에테르설폰 14.0 중량%, PVP K30 5.0 중량%, PVP K85/K90 2.0 중량%, 물 3 중량% 및 NMP 76.0 중량%를 혼합함으로써 제조하였다. 물 55 중량%와 NMP 45 중량%의 혼합물을 중심 유체로서 작용하였다. 중합체 용액은, 22℃의 온도에서 측정했을 때, 5,400 mPaㆍs이었다.

중심 유체를 55℃로 가열하고, 2성분 중공 섬유 방적돌기를 통과하도록 펌핑하였다. 중합체 용액을 0.5 mm의 외부 직경 및 0.35 nm의 내부 직경을 지닌 환형 슬릿을 통해 방적돌기에서 배출하였다. 중심 유체는, 내부로부터 중합체 용액의 침전을 개시하고 중공 섬유의 내부 직경을 측정하기 위해서, 환형 중합체 용액 튜브의 중심에서 방적돌기에서 배출하였다. 동시에, 2성분(중합체 용액과 중심 유체)을 실험실 대기로부터 분리된 공간으로 유입하였다. 그 공간은 스피닝 샤프트라고 칭한다. 스팀(100℃)과 공기(22℃)의 혼합물을 스피닝 샤프트 내로 주입하였다. 그 스피닝 샤프트 내의 온도를 45℃로 조정하고, 거기에서 스팀 및 공기와 용매 함량의 비율에 의해 상대 습도 99.5%를 얻었다. 스피닝 샤프트의 길이는 890 mm이었다. 중력 또는 모터-구동된 롤러의 보조로, 중공 섬유가 방적돌기로부터 수직 방향으로 스피닝 샤프트를 통과하여 수조 내로 정상에서 바닥으로 인발되었다. 그 스피닝 속도는 50 m/min이었다. 이어서, 중공 섬유는 다단계의 수조 및 15℃에서 40℃로 증가하는 온도를 통해 유도되었다. 세정 수조에서 배출되는 습윤 중공 섬유를 대류식 온라인 건조 단계에서 건조시켰다. 텍스처라이징 단계 후, 중공 섬유를 다발 형상의 스피닝 휠 상에 수집하였다. 대안으로, 핸드 다발을 형성할 수 있었다.

실시예 5

중공 섬유 멤브레인의 제조

중합체 용액은 폴리에테르설폰(Ultrason(등록상표) 6020, BASF), 폴리비닐피롤리돈(K30 및 K85, BASF), 폴리우레탄(Desmopan(등록상표) PU 9665 DU, Bayer MaterialScience AG) 뿐만 아니라 증류수를 50℃에서 N-메틸피롤리돈(NMP) 중에, 투명한 고점성 용액이 얻어질 때까지 용해시킴으로써 제조하였다.

중합체 스피닝 용액 중의 상이한 성분들의 중량 분율, PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665 DU/H₂O/NMP는 14/3/5/2/3/73이었다. 결과로 형성된 중합체 용액의 점도는 22,900 mPaㆍs이었다.

가온 용액을 20℃로 냉각하고, 탈기시켰다. 중합체 용액을 50℃로 가열하고, 그 용액을 스피닝 다이를 통해 통과시킴으로써 형성시켰다. 보어 액체로서, 물 56 중량%와 NMP 44 중량%를 함유하는 물/NMP 혼합물을 사용하였다. 다이의 온도는 50℃이었다. 중공 섬유 멤브레인은 스피닝 속도 40 m/min으로 형성되었다. 다이에서 배출되는 액체 모세관을 주위 온도를 보유한 수조 내로 통과시켰다. 다이와 침전 조 간의 거리상 길이는 100 cm이었다. 그 형성된 중공 섬유 멤브레인은 시리즈의 수조를 통과하도록 유도되었다. 이어서, 습윤 중공 섬유 멤브레인은 건조시켰고, 216 μm의 내부 직경 및 318 μm의 외부 직경을 보유하였다. 그 멤브레인은 완전 비대칭 멤브레인 구조를 보유하였다. 멤브레인의 활성 분리 층은 내부에 존재하였다. 그 활성 분리 층은 가장 작은 소공을 지닌 층으로서 정의하였다. 그 구조는 전반적인 스펀지 유사 구조를 나타내었다. 내부 표면은 매우 평활한 소공을 나타내었다. 멤브레인을 와이딩 휠 상에 감고, 200개의 섬유를 지닌 핸드 다발을 하기 설명된 방법에 따라 제조하였다. 멤브레인의 수압 투과율(Lp 값)을 수동으로 측정하였다. 멤브레인은 3.7 x 10^-4 cm³/(cm² bar sec)의 수압 투과율을 나타내었다. 추가적으로, (수성 용액 중의) 미오글로빈의 체질 계수를 측정하였다. 15 분 후에 체질 계수 1.5%를 얻었고, 60 분에 체질 계수 1.1%를 얻었다. 이어서, 멤브레인의 수압 투과율(Lp 값)은 다시 측정하였고, 37℃에서 2.7 x 10^-4 cm³/(cm² bar sec)이었다. 더구나, 멤브레인의 확산 투과율을 관한 실험은 클로라이드, 이눌린 및 비타민 B₁₂로 수행하였다. 클로라이드, 이눌린 및 비타민 B₁₂에 대한 투과율은 37℃에서 각각 10.5 x 10^-4 cm/sec, 3.7 x 10^-4 cm/sec 및 4.O x 10^-4 cm/sec이었다.

실시예 6

세포 배양을 위한 인서트 및 제제의 조사

공기-커버된 멤브레인(산소 농도는 증가 또는 감소하지 않았음)은 실온에서 각각 6.3 및 18.9 h 동안 통상적인 멸균 백에서 감마 조사(각각 25 및 75 kGy)로 처리하였다.물- 또는 아크릴산 용액-커버된 멤브레인 인서트는 대략 70 ml 용액을 함유하는 플라스틱 용기 중에서 감마 조사로 처리하였다. 유체-커버된 멤브레인 인서트를 세척하기 위해서, 대략 300 ml 통상적인 PBS 배지(증류수 800 ml 중에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄를 용해시키고, HCl를 사용하여 pH 7.4로 조정하며, 물을 첨가하여 1 리터로 만들고, 오토클레이브로 멸균시킨 것)를 함유하는 각 멤브레인 유형에 대한 접시를 준비하였다. 인서트를 그 용기로부터 멸균된 상태로 제거하고, PBS 접시 중에 세척하며, 추가 세정을 위해서 6-웰 플레이트로 옮겼다. 모든 인서트 유형을 6-웰 플레이트로 옮기고, 정상쪽 및 바닥쪽에서 각각 3 ml 및 5 ml PBS로 5회 세정하였다. 각각 세정 단계의 경우, 인서트는 감마 조사 동안 발생된 잔류 시약 및 부산물을 제거하기 위해서 10 분 이상 동안 항온 처리하였다. 세정 절차를 완료한 후, 인서트는 세포 배양을 위해 새로운 웰 플레이트에 옮겼다. 웰에서 각각 3 ml MSC 배지를 정상쪽에, 5 ml를 인서트의 바닥쪽에 첨가하였다. 인서트를 밤새 동안 인큐베이터 내의 MSC 배지 중에서 항온 처리하였다.

비교에 사용하고자 하는, 프브로넥틴-코팅된 멤브레인(실시예 2에 따른 멤브레인을 기초로 한 것)은 예외사항을 나타내었다. 인서트의 세척 및 세정을 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 인서트의 정상에는 21 μg 피브로넥틴을 함유하는 1 ml PBS 버퍼를 첨가하고, 인큐베이터 내에 밤새 항온 처리하였다. 다음날, 그 피브로넥틴 용액을 제거하고, 인서트를 PBS로 1 회 세척하고, 세포 시딩 전에 세포 배지로 항온 처리하였다. 미처리된 멤브레인 인서트(실시예 2) 및 TCPS 배양 플레이트를 음성 및 양성 대조군으로서 각각 사용하였다.

실시예 7

중공 섬유 멤브레인의 조사

감마선 조사로 처리한 생물반응기(하우징 내의 중공 섬유를 지닌 것)은 중공 섬유 기하구조(실시예 4 내지 6 참조)로 존재하는 본 발명의 멤브레인으로 구성되었다. 하우징, 헤더 및 포팅을 위한 재료는 감마에 안정하였고, Fibasol 블루(하우징/헤더) 및 감마 안정한 폴리우레탄(포팅)과 함께 Makrolon^®DP1-1262(Bayer MaterialScience AG)로 구성되었다. PES/PVP/PA-기초한 멤브레인(실시예 4 참조)을 함유하는 생물반응기를 주위 공기, 물(RO-water), 0.001% 아크릴산(1 l RO-water 중의 0.01 g AA)의 수성 용액 또는 0.01% 아크릴산(1 l RO-water 중의 0.1 g AA)의 수성 용액으로 충전하고, 25 또는 75 kGy를 인가하는 감마 조사로 처리하였다. 수성 용액 및 물에 의한 반응기의 충전은 모세관내(IC: intra-capillary) 측면으로부터 100 ml/min으로 플러싱하여 수행하고, 공기를 제거하였다. IC-아웃-라인을 고정하고, 모세관외(EC: extra-capillary) 측면을 한외여과로 충전하였다. 그 단계들은 생물반응기 내에 잔류 공기가 남아 있지 않을 때까지 반복하였다. 감마 조사는 실온에서 6.3 및 18.9 시간 동안 25 또는 75 kGy를 인가하는 Co-공급원으로 수행하였다.

실시예 8

평평한 시이트 멤브레인 상에서 미처리된 골수의 배양

MSC 배지(900 ml 알파-MEM 배지(Lonza, Cat. No. BE12- 169F), 100 ml FBS, 10 ml 페니실린/스트렙토마이신 및 10 ml 울트라글루타민 I; 세포 배양 사용 전에, MSC 배지는 37℃로 가온함)을 인서트 멤브레인 상에서 밤새 항온 처리한 후 새로운 MSC 배지로 인서트의 정상쪽에(2 ml) 그리고 바닥쪽에(4 ml) 교체하였다. 이들 배지 부피를 모든 추가 단계에서 적용하였다. 각 부피의 미처리 골수를 표 I에 나타낸 바와 같이 각 인서트에 첨가하였다. 그 골수를 멤브레인 상에 접시를 진동시킴으로써 균일하게 분포시켰다. 인서트를 인큐베이터 내에 3일 동안 배치하여 MSC 유착을 허용하였다. 3 일째, 배지를 인서트 배양의 정상쪽 및 바닥쪽에서 제거하였다. 멤브레인을 정상쪽에서 각 세정 단계의 경우 2 ml PBS로 2회 세정하였다. 정상쪽 및 바닥쪽에 새로운 MSC 배지를 첨가하였다. 제1 성장기(즉, 골수 시딩에서 제1 MSC 탈착에 이르는 배양기)에서는, 배지를 12일 또는 14일이 될 때까지 2 내지 3일 마다 인서트의 정상쪽 및 바닥쪽에서 교체하였다. 12일 또는 14일째, MSC는 인서트 당 500 μl 트립신(10 min, 37℃)을 사용하여 4개의 인서트 중 3개로부터 탈착시켰다. 트립신은 인서트 당 1.5 ml MSC 배지를 사용하여 불활성화시키고, MSC 현탁액을 멸균 튜브에서 수집하고, 샘플은 CASY 카운더를 사용하는 MSC 계수를 위하여 취하였다. 4개의 인서트 중 하나를 고정하고, SEM용으로 준비하였다. 그러므로, 인서트를 정상쪽에서 PBS로 1회 세척하고, 2% 글루타르알데히드 용액 1 ml를 첨가하고, 40℃에서 밤새 동안 저장하였다. 이어서, 인서트를 증류수로 3회 세척하고, 공기 건조시키며, SEM으로 처리하였다. 제2 실험에서는, SEM을 수행하지 않았다. 새로운 배지는 MSC의 재시딩 전까지 인큐베이터에서 MSC 배지의 예비 가온 및 가스에 의한 조건화 후에 동일 인서트의 정상쪽 및 바닥쪽에 첨가하였다. 10,500개 MSC/cm²를 동일 인서트 상에 밤새 재부착시켰다. 제2 성장기에서는, 재부착된 MSC를 추가 7일 동안 멤브레인 상에서 증식시켰다. MSC 배지는 2 내지 3일 마다 교환하였다. MSC는 37℃에서 10 분 동안 트립신을 사용하여 19일 또는 21일째에 4개의 인서트 중 3개 인서트로부터 수집하였다. MSC는 MSC 형태 및 증식 가능성의 대조를 위해서 TCPS 상에 재-플레이팅하였다. 그러므로, 수집된 MSC를 형태의 대조를 위해 5,000개 MSC/cm²로, 그리고 4 또는 5일 동안 증식 대조를 위해 500개 MSC/cm²로 TCPS 상에 재시딩하였다. 형태 및 증식 가능성은 형태 평가를 위해 1 또는 2일째에 그리고 증식 가능성의 평가를 위해 4 또는 5일째에 현미경 사진을 촬영하여 기록하였다.

미처리된 골수를 다양한 기질 상에 플레이팅하였다(표 I). TCPS 또는 VTK-FN(피브로넥틴-코팅됨) 및 VTK(증기 멸균되고 미코팅됨)을 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 12-14일의 제1 성장기 후, 트립신화하여 계수하였다. TCPS에 대한 각 MSC 수를 도 1 및 2에서 엷은 색상 바로 나타내었다. 제2 성장기의 경우, MSC를 동일 인서트 상에 500개 MSC/cm²의 밀도로 재-플레이팅하였고, 추가 10 일 동안 제2 성장기로 증식하였다. 제2 성장기의 7일 후, MSC 수의 측정(도 1 및 2에서 검정 바로 표시됨), 형태를 위한 재-플레이팅(도 3) 및 SEM을 위한 고정화를 수행하였다. 표준으로서 TCPS에 대한 MSC 수(n=3)를 도 1 및 2에 나타내었고, 라인은 표준 TCPS 수준을 나타내었다. 미처리된 골수에 의한 실험을 2회 수행하였다.

[표 1]

미처리된 골수로부터 MSC의 배양에 사용된 멤브레인 유형 및 조사 조건의 개관

"n"은 각 셋-업에 대하여 수행된 시험의 회수를 나타낸다. "AA'는 "아크릴산"을 나타낸다. 표현 "VTK"은 실시예 2에서 사용된 중합체 용액을 기초로 한 멤브레인을 나타낸다. "FN"은 "피브로넥틴"을 나타낸다. "멤브레인 AN69ST™은 폴리아크릴로니트릴을 기초로 한 상업적 멤브레인이다.

도 1 내지 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, MSC는 TCPS에 필적할 만한 제1 성장기에서의 피브로넥틴-코팅된 VTK 멤브레인 상의 성장을 나타내었고, 즉 피브로넥틴-코팅된 VTK 멤브레인은 재-시딩 배양에 적합하지 않았다. 트립신화 후 피브로넥틴-코팅된 멤브레인의 성능 부족에 대한 이유가 트립신에 의한 피브로넥틴의 열화인 것으로 추정된다. 실험 2(도 2)에서, 피브로넥틴-코팅된 VTK 멤브레인은 제1 성장에서도 제2 성장에서도 작용하지 않았다. 미코팅된 VTK 멤브레인은 양 실험에서 MSC의 매우 약한 성장을 나타내었다. 25 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트는 실험 1 및 2를 비교하면 반대의 결과를 나타내었다: 도 1에서, 그 멤브레인 유형은 제1 성장기에서 TCPS에 필적할 만한 성능을 나타내었지만 제2 성장기에서 MSC의 강한 감소를 나타내었고, 반면에 멤브레인 유형은 실험 2에서 그 반대로 거동하였다. 75 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트는 양쪽 성장기에서 TCPS에 필적할만 하거나 더 우수한 성장을 나타내었다. 감마 조사 절차 동안 상이한 농도를 지닌 수성 아크릴산 용액 및 물에 의한 VTK 멤브레인의 커버력(coverage)은 75 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트와 유사한 결과를 결과적으로 나타내었다. AN69ST 인서트는 실험 1에 포함되어 MSC 배양에 적합하지 않는 것으로 입증되었다.제2 성장기 후 재-플레이팅된 MSC는 대부분 스핀들 형상화된 형태 및 정상적인 증식을 나타내었다(도 3 참조) .

실시예 9

평평한 시이트 멤브레인 상에서 예비 처리된 MSC 의 배양

MSC 배지는 밤새 항온 처리후 인서트로부터 인서트의 정상쪽 및 바닥쪽에서 새로운 배지로 교체하였다. MSC는 MSC에 대한 표준 플라스크 조건(0.25% 트립신, 5 분, 및 37℃, 모든 세포가 탈착될 때까지 녹킹(knocking) 및 배지의 첨가에 의한 트립신의 불활성화)을 적용하여 그 플라스크로부터 트립신화하였다. MSC는 CASY 카운터를 사용하여 계수하였다. MSC 현탁액은 TCPS-웰 또는 인서트 내에 500개 MSC/cm²를 시딩하는 것으로 제조하였다. 웰-플레이트 및 인서트를 인큐베이터 내에 넣어 MSC 유착을 허용하였다. MSC 배지를 7일 또는 9일이 될 때까지 TCPS에서 -80% 이하의 컨플루언스를 목표로 함) 2 내지 3일 마다 정상쪽 및 바닥쪽에서 교환하였다. 7일 및/또는 9일 째, MSC는 500 μl 트립신을 사용하여 탈착시켰다(10 분, 37℃). 이어서, 트립신을 1.5 ml MSC 배지를 사용하여 불활성화시키고, MSC를 멸균 튜브 내에 세포 현탁액으로서 수집하였다. 샘플은 CASY 카운터를 사용하여 세포 계수를 위해 취하였다. 하나의 인서트를 고정화하고, SEM에 대하여 준비하였다. 그러므로, 인서트를 정상쪽에서 PBS 1 ml로 1회 세척하고, 이어서 2% 글루타르알데히드 용액 1 ml를 첨가하고, 모두를 4℃에서 밤새 저장하였다. 이서, 인서트를 증류수로 세척하고, 공기 건조시키며, SEM으로 처리하였다. 새로운 MSC 배지를 인서트의 정상쪽(2 ml) 및 바닥쪽(4 ml)에 첨가하였다. 배지는 세포 재-시딩할 때까지 예비 가온하고, 가스로 조건화하였다. 500개 MSC/cm²를 인큐베이터에서 동일 인서트 상에 재-부착하였다. 재-부착된 MSC를 멤브레인 상에서 추가 10 또는 11일 동안 증식시켰다. MSC 배지를 2 내지 3 일마다 교환하였다. MSC를 16 및 21 일째 3개의 인서트로부터 수집하였다. MS를 MSC 형태 및 증식 가능성의 대조를 위해 TCPS 상에 재-플레이팅하였다. MSC를 MSC 형태 및 증식 가능성의 대조를 위해 TCPS 상에 재-플레이팅하였다. 그러므로, 수집된 MSC를 형태의 대조를 위해 5,000개 MSC/cm²으로 그리고 4 또는 5 일 동안 증식의 대조를 위해 500 MSC/cm²으로 TCPS 상에 재-시딩하였다. 형태 및 증식 가능성은 형태 평가를 위해 1 또는 2일째 그리고 증식 가능성의 평가를 위해 4 또는 5일째 현미경 사진을 촬영함으로써 기록하였다. 표 2는 이들 실험에서 사용된 모든 멤브레인 유형 및 변형 뿐만 아니라 조사 조건에 걸친 개관을 제공한다.

[표 II]

예비 선택된 MSC의 배양에 사용된 멤브레인 유형 및 조사 조건에 대한 개관

"n"은 각 셋업에 대하여 수행된 시험 회수를 나타낸다. "AA"는 "아크릴산"을 나타낸다. 표현 "VTK"는 실시예 2에서 사용된 중합체 용액을 기초로 한 멤브레인을 나타낸다. 'FN"는 "피브로넥틴"을 나타낸다.

예비 선택된 MSC를 사용하는 실험은 2회 수행하고, 결과는 도 4(실험 1) 및 도 5(실험 2)에 도시하였다. MSC는 TCPS에 필적할만한 실험 1 및 2의 제1 성장기에서 피브로넥틴-코팅된 VTK 멤브레인 상의 성장을 나타내었지만, 제2 성장기에서 강하게 감소된 성장을 나타내었으며, 즉 피브로넥틴-코팅된 멤브레인은 실험 1에서 재-시딩에 적합하지 않았다. 트립신화 후 피브로넥틴-코팅된 멤브레인의 성능 부족에 대한 이유는 트립신에 의한 피브로넥틴의 열화인 것으로 추정되었다. 미코팅된 VTK 멤브레인은 양 실험에서 MSC의 매우 약한 성장을 나타내었다. 25 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트는 실험 2에 대해서만 시험하였고, TCPS에 필적할만하고 75 kGy 감마 조사후 모든 VTK 멤브레인 유형에 필적할만한 성능을 나타내었다. 75 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트는 TCPS에 필적한만 하거나 대부분의 경우 TCPS보다 더 우수한 양 성장기에서의 MSC 성장을 나타내었다. 감마 조사 절차 동안 상이한 농도를 지닌 수성 아크릴산 용액 및 물에 의한 VTK 멤브레인의 커버력은 75 kGy에 의해 조사되는 공기-커버된 VTK 인서트와 유사한 결과를 결과적으로 형성하였다. AN69ST 인서트는 실험 2에 포함되었고, MSC 배양에 적합하지 않는 것으로 입증되었다. 제2 성장기 후 통상적인 TCPS 접시 상의 재-플레이팅된 MSC는 대부분 스핀들 형상화된 형태 및 정상적인 증식을 나타내었다.

실시예 11

감마 조사 전에 스팀 멸균 처리의 영향

실시예 10에 따른 실험은 수행하였고, 여기서 TCPS에 상대적인 멤브레인 표면에 유착된 MSC의 수를 (%)로 측정하였다. 세포 수는 피브로넥틴 코팅을 지닌 TCPS 및 VTK 멤브레인 뿐만 아니라 25 또는 75 kGy에 의해 조사되고, 공기-충전 또는 물-충전된 VTK 멤브레인에 대하여 측정하였다. 실험의 3개 세트를 수행하였다. 제1 세트에서, 멤브레인을 제조후 직접 감마선 조사하였다. 제2 세트에서, 멤브레인을 각각의 감마선 처리를 수행하기 전에 증기-멸균 처리하였다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 감마선 조사 전에 스팀-멸균된 멤브레인은 스팀-멸균 처리하지 않은 멤브레인에 비하여 MSC의 부착에 관하여 보다 우수한 성능을 수행하였다.

제3 세트에서, 추가의 EtO 멸균 처리 단계의 영향을 연구하였다. 75 kGy에 의해 조사되고 w/o 스팀 및 EtO 멸균 처리된 멤브레인 상의 미처리된 골수로부터 성장된 MSC의 수는, 제1 (11일) 성장기 및 제2 (7일) 성장기 후 표준 TCPS 상에서 성장된 MSC의 수에 대하여 상대적으로 측정하였다. 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, EtO 멸균 처리는 멤브레인의 성능에 대한 현저한 부작용을 갖지 않았다.

실시예 12

세포의 분화

본 발명에 따른 멤브레인 상에 배양된 세포의 분화 능력을 평가하기 위해서, 지방세포형성(adipogenesis) 및 골형성(osteogenesis) 분화 시험을 수행하여 MSC가 분화하는 능력을 측정하였다.

(A) 지방세포형성

MSC를 대략 10,000개 MSC/cm²의 밀도로 24-웰 플레이트 내로 시딩하였다. 3개의 웰, 하기 설명된 바와 같이 MSC를 지방세포로 분화시키는 하나의 웰, 표준 MSC 증식 배지(지방세포형성을 유도하지 않음)에서 MSC를 성장시키는 하나의 웰 및 염색을 위한 대조군으로서 하나의 웰을 사용하였다. MSC는 표준 MSC 증식 배지(900 ml 알파-MEM 배지, 100 ml FBS, 10 ml 페니실린/스트렙토마이신, 및 10 ml 울트라글루타민 I; 세포 배양 사용 전에, MSC 배지는 37℃까지 가온하였음)를 사용하여 컨플루언시(confluency) 또는 컨플루언시 지나 10일까지 성장시켰다. 지방세포형성은 지방세포형성성 유도 배지(표준 MSC 배지 1 ml 중의 IBMX 스톡 용액(증류수 10 ml 중에 IBMX 55.55 mg이 용해되고, 이어서 그 용액에 탄산나트륨 20 to 40 mg이 첨가됨) 20 μl, 덱사메타손 스톡 용액(순수 에탄올 50 mL 중의 덱사메타손 19.62 mg) 1 μl, 인슐린 스톡 용액(10 mg/ml) 1 μl, 및 인도메타신(순수 에탄올 10 ml 중의 인도메타신 178.9 mg) 2 μl)를 사용하여 11일(0일에서 11일일까지) 동안 유도하였다. 배지를 2-3일 마다 교환하였다. 지방세포형성성 보존 배지(표준 MSC 배지 1 ml 중의 인슐린 스톡 용액 1 μl)를 3 또는 5일 동안(12-14일 또는 12-16일) 사용하였고, 2-3일마다 교환하였다. 세포를 표준 PBS 버퍼로 세정하였다. 세포는 실온에서 4 시간 이상 동안 포름알데히드 용액(~10%)을 사용하여 고정화하였다. 이어서, 오일 레드 O 용액(새롭고 멸균되며 여과된 것) 약 0.5 ml를 각 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 30 분 내지 2 시간 동안 항온 처리하며, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 이어서 50% 에탄올로 세정하였다. 세포는 실온에서 5 분 동안 Mayer 헤마톡실린 용액으로 대조염색하고, 수돗물로 1 분 동안 3회 세정하고, 포름알데히드 용액으로 고정화하였다. 도 8은 감마선 조사된(75 또는 25 kGy, 아크릴산 또는 알릴아민의 존재 하에) VTK 멤브레인 상에서 배양된 세포 상에서 MSC의 성공적인 지방세포형성을 도시한 것이다.

(B) 골형성

MSC를 대략 10,000개 MSC/cm의 밀도로 24-웰 플레이트 내로 시딩하였다. 3개의 웰, 하기 설명된 바와 같이 MSC를 골아세포로 분화시키는 하나의 웰, 표준 MSC 증식 배지(골형성을 유도하지 않음) 중에서 MSC를 성장시키는 하나의 웰 및 염색을 위한 대조군으로서 하나의 웰을 사용하였다. MSC를 표준 MSC 배지를 사용하여 컨플루언시 또는 컨플루언시 지나 10일까지 성장시켰다. MSC 배지는 골형성성 분화 배지(표준 MSC 배지 1 ml 중의 글리세롤 포스페이트 스톡 용액(표준 MSC 배지 100 ml 중의 글리세롤 포스페이트 2.16 g) 100 μl, 덱사메타손 스톡 용액 1 μl 및 아스코르브산 스톡 용액 1 μl(기초 배지, 알파-MEM 10 ml 중의 아스코르브산 0.145 g))로 교체하고, 3-4 일 마다 변경하였다. 2-3 주 후, 세포 내에 또는 세포 주위에 석회화된 퇴적물이 존재하였다. 세포를 PBS 중에 세척하였다. PBS를 제거하고, 세포를 10% 포름알데히드로 10 분 동안 고정화하고, 이어서 PBS로 1회 세척하고, 탈이온수로 2회 세척하였다. 세포를 공기 건조시키고, UV 광 하에 질산은으로 10 분 동안 염색하였다. 탈이온수로 2-3회 세척한 후, 세포를 Mayer 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 이어서 수돗물로 1 분 동안 세척한 후, 탈이온수로 2회 세척하였다. 세포를 10% 포름알데히드 중에 엠베딩하였다. 도 9는 본 발명에 따른 멤브레인 상에서 성장된 세포의 성공적인 골형성을 도시한 것이다.

실시예 13

다양한 세포 유형의 증식에 대한 적합성

다양한 세포 유형의 배양을 위한 본 발명에 따른 감마-조사된 멤브레인의 적용성을 평가하기 위해서, 평평한 멤브레인을 예시적으로 시험하였다. 사용된 멤브레인은 실시예 10 및 11에서 설명된 바와 같고, "VTK" 멤브레인이라고 칭하였다. 그 멤브레인을 25 kGy(공기-커버됨) 및 75 kGy(물-커버됨)로 각각 조사하였다. 멤브레인을 단기간 배양에 시험하였고, 이로써 세포 유착(시딩 후 1일) 및 세포 증식(재-시딩 후 5일)을 표준 TCPS와 비교하여 평가하였다. 사용된 세포는 (a) NHDF, 정상 인간 피부 섬유아세포, (b) HepG2, 인간 간암 세포주, (c) HK-2, 인간 신장 근위 상피 세포주, 및 (d) MDCK, Madin-Darby 개과 신장 상피 세포이었다. 세포 (a) 내지 (d)를 본 발명에 따른 멤브레인 및 TCPS에 대하여 시험하였다. 세포를 다음과 같이 시딩하였다:(a) NHDF: 배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신) 중의 5ㆍ10³ 개 세포/cm²; (b) HepG2: 배지(RPMI + 10% FBS + 0.5% 젠타마이신) 중의 5.6× 10⁴ 개 세포/cm²; (c) HK-2: 배지(Keratinocyte SFM(Gibco, Cat# 17005) + Supplements for Keratinocyte SFM(Gibco, Cat# 37000-015) + 10 μg/ml Meronem + 1% FBS +1% CaCl₂) 중의 10⁴개 세포/cm²; (d) MDCK: 배지(M199 + 10 μg/ml Meronem + 10% FBS(열 불활성화됨) 중의 10⁴ 개 세포/cm². 세포 수를 세포 시딩 후 CASY 계수에 의해 1일(유착) 및 5일(증식) 측정하였다. 도 10 내지 도 13은 모든 세포 유형이 75 kGy 조사된 멤브레인 상에서 효율적으로 증식될 수 있었다는 점을 보여준다. 그 결과는 그 멤브레인이 특히 세포 증식에 관하여 적어도 표준 TCPS만큼 효율적이었다는 점을 입증해 보여 준다. 그 결과는 보다 높은 선량으로 처리된 멤브레인이 보다 낮은 선량으로 처리된 멤브레인보다 세포 배양에 약간 더 우수하게 적합하게 되었다는 점을 보여준다. 멤브레인 VTK 25kGy는 HK-2 세포에 효율적으로 작용하지 않았고(도 12), 이는 아마도 제1일 후 세포의 제1 제거에서의 문제로 기인한 것이다.

실시예 14

미처리된 골수로부터 감마선 조사된 중공 섬유 멤브레인 (생물반응기) 상의 MSC 증식

미처리된 골수로부터 MSC의 증식 및 예비 선택된 MSC의 증식을 세포 증식 시스템(CES: Cell Expansion System)에서 다양한 중공 섬유 생물반응기 내에서 수행하였다. 예비 선택된 MSC에 적합한 것으로 입증된 생물반응기를 미처리된 골수로 추가 시험하였다. 본 발명에 따른 생물반응기에서 배가 시간을 시딩시 동일한 세포 밀도로 출발하는 대조 플라스크(TCPS)에서 배가 시간과 비교하였다. 배가 시간은 다양한 멤브레인/TCPS의 성능을 평가하는 방법으로서 작용하였다.

예비 선택된 MSC: 사용된 MSC는 최대 계대배양 4로 골수로부터 유래하는 예비 선택된 냉동 보존 MSC이었다. MSC를 2 이상의 계대배양으로 통상적인 TCPS 플라스크에서 골수-유도된 MSC의 증식에 의해 예비 선택하였다. 대략 2.8 Mio MSC를 164개 MS/cm²에 상응하는 것으로 1.7 m² 생물반응기에 로딩하였다. 표면적이 1.7 m²보다 더 작은 경우, 로딩된 MSC의 수를 평가하였다. 배양 기간은 7일이었다.

미처리된 골수: 골수 대략 10-12 ml를 1.7 m² 생물반응기에 로딩하였고, 표면적이 1.7 m² 미만인 경우, 로딩된 골수의 부피를 평가하였다. 그 배양 기간은 13일이었다.

T75 TCPS 플라스크는 대조 플라스크로서 작용하였다. 예비 선택된 MSC를 생물반응기에서와 같이 동일 밀도((164개 MSC/cm²)로 플라스크 내에 시딩하였다. 미처리된 골수를 출발 물질로 할 때, 골수 234 μl를 플라스크에 시딩하였고(3.12 μl/cm²), 골수 12 ml를 1.7 m² 생물반응기 내에 로딩하였다(0.71 μl/cm²).

이 실험에서 사용된 멤브레인 유형을 하기 표 III에 요약하였다. PES/PVP/PA로 기초한 멤브레인은 실시예 3에서 설명된 바와 같이 제조하였다. PES/PVP/PU에 기초한 멤브레인을 실시예 5에서 설명된 바와 같이 제조하였다. 표현 PAN는 폴리아크릴로니트릴을 의미하였다.

[표 III]

예비 선택된 MSC 및 미처리된 골수 세포의 증식에 관하여 시험되는 멤브레인 유형의 개관

멤브레인에 대한 결과는 표준 TCPS 플라스크와 비교하였다. 감마선 조사되지 않았지만 대신 피브로넥틴에 의해 코팅된 멤브레인(1)은 비교 이유로 본 실험에 포함되었다.

골수를 0일째에 생물반응기 및 플라스 내로 시딩하였다. 2일째, 배지를 제1 회로 교환하고, 이어서 다시 4 또는 5일째, 6 또는 7일째, 8 내지 10일째, 및 10 내지 12일째에 교환하였다. 13일째에, 세포를 수집하고(트립신), 세포를 계수하였다. 세포의 생존 능력 뿐만 아니라 그 표현형 및 형태 및/또는 증식 거동을 시험하였다.

미처리된 골수( CFC -F)를 사용할 때 세포 수의 계산을 위한 세포 콜로니의 계수

미처리된 골수 78 μl를, 5 ml MSC 배지를 함유하는 T25(TCPS) 플라스크 내로 시딩하였다. 비-유착 세포를 2 내지 3일 후에 PBS로 2회 세척하여 제거하고, 이어서 새로운 MSC 배지를 첨가하였다. MSC 배지를 2 내지 3일 마다 교환하였다. 7일째, 콜로니를 계수하였다(10배 확대/현미경).

배가 시간 및 배가 시간 비율의 계산

배가 시간(DT)은 세포가 숫자상 배가되는데 요구되는 시간의 기간이다. MSC의 DT 및 DT 비율은 다음과 같이 계산하였다.

MSC 배가 회수 = log₂(N/N₀)

N은 지시된 배양 시간 후에 관찰된 MSC의 수이이고, N₀은 시딩된 MSC의 수이다. DT(시간) = 배양 시간 기간(h)/배가 회수. DT 비율 = 생물반응기 중의 세포의 DT/대조 플라스크 중의 세포의 DT

미처리된 골수를 지닌 모든 선택된 감마 조사 생물반응기는 TCPS 및 VTK-FN 생물반응기에 필적할만한 성능을 나타내었다. 배가 시간은 28 내지 34 시간 범위이었고, 이는 대조 플라스크(23 내지 25 시간)보다 단지 약간 더 높았다. 그러므로, 배가 시간 비율은 1.1 내지 1.5 범위이었다(도 14). 0.5% PU 생물반응기는 감마-조사된 생물반응기 및 VTK-FN 생물반응기와 비교하여 약한 더 느린 세포 성장을 나타내었다.

수집된 세포의 생존 능력(도 15)을 MSC 배지 중의 FACS 튜브 당 50,000개 세포에 의한 FACS 분석으로 시험하였다. 하나의 샘플을 프로피듐 요오다이드 용액(목적 농도 1 μg/ml)으로 어두운 곳에서 실온 하에 10 내지 15 분 동안 염색하였다. 또다른 미염색된 샘플을 기준으로서 사용하였다. 수집된 세포의 생존 능력은 88 내지 99.5% 범위였다.

수집된 세포의 표현형(도 16 참조)을 세포의 트립신화 후에 시험하였다. 일백만개 세포를 블록킹 버퍼(세포 세척액 + 10% 인간 혈청) 5,000 μl 중에 재현탁시키고, 40℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 각 50 μl를 10개 튜브 내로 분배하였고, 항체를 첨가하였다(미염색된 것(항체 없음): CD34-PE - 2 μl, CD45-PE - 2 μl, CD73-PE - 2 μl, mlgGl-PE - 1 μl(CD34, CD45, CD73에 대한 이소타입 대조군), HLA-DR, DP, DQ-FITC - 2 μl, mIgG2a-FITC - 1 μl(HLA-DR에 대한 이소타입 대조군), CD90-FITC - 1 μl, CD105-FITC - 1 μl, mlgGl-FITC - 2 μl(CD90, CD105에 대한 이소타입 대조군). 그 혼합물을 잘 혼합하고, 어두운 곳에서 실온 하에 20 분 동안 저장하였다. 이어서, FACS 버퍼(세포 세척액 + 2% FBS(가열 불활성화됨))를 첨가하고, 보텍스 처리하며, 이어서 400 g으로 3 분 동안 원심분리하였다. 그 버퍼를 제거하고, 펠릿을 보텍스 처리하였다. 이어서, 고정화 버퍼(물에 의한 10:1로 희석된 것) 400 μl를 첨가하고, 보텍스 처리하였다. 세포를 40℃에서 저장하고, 4 일 내에 분석하였다.

감마-변형되고, 물-충전되며, 75 kGy에 의해 조사된 생물반응기에서 증식된 세포는 CD45 및 HLA-DR에 대하여 비교적 높은 값을 나타내었다(세포의 18% 및 16.7%가 각각 양성임). 모든 다른 생물반응기로부터 수집된 세포는 MSC의 예상된 표현형을 나타내었다.

증식 후 TCPS 상의 재부착의 검사는 재-플레이팅 후 정상 성장 거동을 나타낸 대부분의 스핀들-형상화 세포를 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).

실시예 15

방사선 선량의 영향

멤브레인 특성에 미치는 방사선 선량의 영향을 연구하기 위해서, 실시예 14는 12.5 kGy 내지 125 kGy의 감마선 방사선 선량에 의해 조사되는 공기-충전된 VTK 멤브레인을 사용하여 예비 선택된 MSC로 반복하였고, 제1 (10일) 성장기 및 제2 (11일) 성장기 후 표준 TCPS 상에서 성장된 MSC 수에 상대적인 성장된 MSC의 수를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.

Claims

4 내지 100 부피% 농도의 산소의 존재 하에 12.5 kGy 내지 175 kGy의 선량으로 감마선 또는 베타선 또는 전자빔에 의해 조사된, 폴리설폰, 폴리에테르설폰 또는 폴리아릴에테르설폰, 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 멤브레인.
제1항에 있어서, 폴리우레탄을 더 포함하는 멤브레인.
제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리아미드를 더 포함히는 멤브레인.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 멤브레인이 중공 섬유 멤브레인(hollow fiber membrane)인 멤브레인.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 멤브레인이 평평한 시이트 멤브레인(flat sheet membrnae)인 멤브레인.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 멤브레인을 제조하는 방법으로서, 폴리설폰, 폴리에테르설폰 또는 폴리아릴에테르설폰, 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 예비 형성된 멤브레인을 4 내지 100 부피% 농도의 산소의 존재 하에 12.5 kGy 내지 175 kGy의 선량으로 감마선 또는 베타선 또는 전자빔으로 조사하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 멤브레인 또는 제6항에 따라 제조된 멤브레인을 포함하는 세포 배양 장치.
세포, 및 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 멤브레인 또는 제6항에 따라 제조된 멤브레인을 포함하는, 체액을 체외 처리하기 위한 장치.
세포를 배양하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 멤브레인 또는 제6항에 따라 제조된 멤브레인의 용도.
제9항에 있어서, 상기 세포가 유착 세포인 용도.
제10항에 있어서, 상기 세포가 간엽 줄기 세포인 용도.
제10항에 있어서, 상기 세포가 간세포인 용도.
제10항에 있어서, 상기 세포가 신장 세포인 용도.
제10항에 있어서, 상기 세포가 상피 세포인 용도.