CN102202771B - 用于细胞扩增的辐照膜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于培养贴壁或悬浮细胞，尤其是贴壁细胞的膜，其中由于在氧气存在下使用从12.5到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束辐照干的或湿的膜，使得所述膜允许细胞的粘附和增殖。得到的膜可以不需任何表面改性物质的预处理而进行使用。本发明进一步涉及制备所述辐照膜的方法，该膜能够用于细胞，尤其是贴壁细胞的培养，并涉及将这样的膜应用于细胞，尤其是贴壁细胞的培养的方法。

Description

用于细胞扩增的辐照膜
技术领域
本发明涉及一种用于培养贴壁或悬浮细胞，尤其是贴壁细胞的膜，其中由于使用从12.5到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束在氧气存在下辐照湿的或干的膜，使得所述膜允许细胞的粘附和增殖。得到的膜的使用可以不需任何表面改性物质的预处理。本发明进一步涉及制备所述辐照膜的方法，该膜能够用于细胞，尤其是贴壁细胞的培养，并涉及将这样的膜应用于细胞，尤其是贴壁细胞的培养的方法。
背景技术
本发明旨在确定一种膜，其表现出与代表了当今使用培养烧瓶或多层细胞培养器的细胞扩增的金标准的组织培养聚苯乙烯(TCPS)板大致相似的生长特性。需要测量的首要特性是细胞扩增率，细胞在膜上的再附着效率，和包括形态控制、表型和分化潜能在内的扩增后细胞的特性。这样的膜应当适于制成不同的几何形状，例如平板或中空纤维膜。
本发明尤其涉及能够用于例如培养、生长、储存和/或扩增不同种类的贴壁细胞的膜。在本发明中，“细胞培养”或“细胞的培养”的表达形式包括以下全部应用，即不同类型细胞的贴壁、维持、生长、扩增、分化、分子生物修饰(如转染)、和/或储存。
与体内的大部分细胞相类似，许多细胞是贴壁细胞，或锚定依赖性细胞；也就是说，只有当它们附着在表面或基质上时才能够新陈代谢和分裂。仅有循环系统的细胞(如淋巴细胞和红血球)和其它类型的细胞例如造血干细胞、肝细胞、CHO细胞等能够在体外溶液中悬浮地和非附着地生长。当许多锚定依赖性细胞在玻璃器皿或合成的表面上生长时，这些细胞通常会丧失其分化和对激素产生响应的能力。细胞形态的损失不仅使细胞蒙受了功能上的损失，而且阻止了长期培养系统的再生能力。然而长期培养具有重要意义，例如，在使用人体细胞进行组织培养方面，并且许多细胞无论在任何数量都是不能用的。鉴于此种原因，这样的组织培养盘通常涂覆有细胞外基质组分如胶原或纤连蛋白。但是，异体因子的使用显然是不利的，尤其是当这样的细胞或其所处的基质是用于人类医疗时，因为其将会带来污染的风险并可能导致被治疗患者的有害反应。
例如，细胞在这样的表面上生长或是保持其能力的丧失，是目前组织培养技术的一个主要限制。组织培养是那些能用来移植到人体中的组织和器官的一个潜在的来源。例如，组织培养的皮肤细胞能够潜在地用于皮肤移植。其目的旨在研发能够恢复和保持正常功能的生物替代品，例如，通过使用无细胞基质，这取决于身体在新组织生长的适当取向和方向方面再生的能力；或是通过使用带有粘附着其上的细胞的膜或基质(Atala(2006)：Recent development intissue engineering and regenerative medicine，Curr.Opin.Pediatr.16，167-171)。细胞还能够通过注射与载体一起或单独用于治疗。此时，细胞需要在培养中扩增、附着在载体基质上，并随后在扩增后再植入到宿主体内。兽医治疗方面的应用在当今是可行的，并且代表了用于细胞培养的膜的一个附加用途。
培养细胞，尤其是贴壁细胞的能力也是重要的，因其代表着能够生产大量的生物产品例如生长因子、抗体和病毒的生物“工厂”。随后这些产品能够从细胞培养中分离出来并用于例如治疗人类疾病。
此外，细胞培养是在制药和生命科学工业领域进行生物相容性和毒理学研究的新兴工具。
最后，组织培养通常包括仅来自一个或少数几个组织或器官的细胞。其结果是，细胞培养为科学家提供了一个系统用于研究某个细胞类型的性质，而不会产生使用整个有机体进行研究的复杂性。
一种已知用于培养贴壁细胞的方法涉及中空纤维膜生物反应器。在该系统中，细胞通常附着到柱状中空纤维膜的内腔中。培养介质和氧气流过该柱状中空纤维膜的中心，膜的分子量截止性能允许营养和氧气到达细胞而不会使得细胞逃逸。
已经有多种聚合物被建议用来生产用于细胞和组织培养方面的半透膜(US2007/269489)。其包括聚藻酸盐，聚氯乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯异氰酸酯，醋酸纤维素，二醋酸纤维素，三醋酸纤维素，硝化纤维素，聚砜，聚醚砜，聚苯乙烯，聚氨酯，聚乙烯醇，聚丙烯腈，聚酰胺，聚甲基丙烯酸甲酯，聚四氟乙烯，聚环氧乙烷以及这些聚合物的组合。聚合物支持体也可以由聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)或聚碳酸酯组成。进一步建议的材料，例如，作为支架用于可移植的组织材料，是纤维素或大孔胶原载体或可生物降解的基质。
WO93/00439A1公开了在生物相容的半透膜中保持细胞培养，其中该细胞被刺激并分泌活性因子。所用的半透膜允许该活性因子的穿透扩散却拒绝外部环境中的有害物质到达该培养物。所述的膜具有管状形状并且据称能够允许分子量高达150kDa的分子的扩散。建议用于所述膜的材料是丙烯酸共聚物，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚氨酯，聚酰胺，聚甲基丙烯酸酯，聚砜，聚丙烯酸酯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯异氰酸酯，聚藻酸酯，醋酸纤维素，聚砜，聚乙烯醇，聚丙烯腈，聚环氧乙烷及其衍生物和它们的混合物。在制备这些膜的过程中未见到使用任何辐照的描述。由此该膜不能用作本发明中细胞粘附的基质。
WO90/11820A2公开了平板膜，其表面可以用于体外的细胞生长或作为体内人工植入体。根据描述，该膜是多孔的，具有在0.1到100微米范围的孔径并且在一个中间层上具有指状形状。该膜包括疏水聚合物和亲水聚合物。疏水聚合物的例子包括聚砜，聚酰胺，聚醚砜，聚酯，聚碳酸酯，优选聚醚聚氨酯及其共聚物。该参考文献并未报导该膜是否能够用于粘附和培养细胞。也未描述使用任何的辐照技术。
除了鉴定膜组成能够作为基质用于贴壁细胞培养的问题外，目前现有技术中已知的膜没有能力充分地促进和维持粘附、扩增，分化和延长生命周期，如果不对这些膜或基质加以预处理或添加外源因子如纤连蛋白，层粘连蛋白或胶原的话。
例如，Fissell(2006)在Expert Rev.Med.Devices 3(2)，155中对基于将肾小管细胞粘附到合成的聚砜基中空纤维膜的人工肾脏的研究进展进行了综述。在这种情况下，膜必须涂覆ProNectin-L以促进细胞的附着。
US-A 6,150,164和US-A 6,942,879均详细展示了得到基于肾细胞的生物人工肾脏的方式，将例如内皮细胞或所谓的肾干细胞种植到中空纤维膜内部。其中提到有用的中空纤维膜是基于纤维素，聚丙烯腈，聚砜或其它组分及其共聚物。该中空纤维的内表面和外表面都预涂覆有适用的细胞外基质组分(EMC)包括I型胶原，IV型胶原，层粘连蛋白，基质胶，蛋白多糖，纤连蛋白及其组合。只有在进行这样的处理之后才能够进行细胞的种植。
在已知的程序中使合成膜例如聚砜基膜经受伽马-辐照以使膜内部的特定组分例如PVP交联，或是使膜消毒。辐照剂量通常在10到50kGy，优选在20到35kGy的范围内(参见例如US 6,960,297B2或US-A 6,103,117)。通常避免更高的剂量以使得膜的降解最小化。此外，所述的已知方法通常设计成避免氧气的存在，也是出于同样的原因，即形成侵蚀性的氧衍生物例如氧自由基或H2O2使膜降解。通过伽马-辐照消毒通常在水溶液条件下进行，即使用湿膜，其中该溶液经过脱气以去除氧气。当使用干的条件时，也要通过使用惰性气氛，除氧剂等从系统中去除氧气。
更进一步地，现有技术中所述的膜和方法的目标是避免细胞在通常用于渗析治疗的膜上的粘附或使其最小化。这与本发明致力于提供有利于细胞粘附和生长的表面的目的相对立。因此，现有技术中所述的用于提供膜的方法无助于本发明的目的，即细胞的培养。
EP 1 795 254 A1公开了一种聚砜基膜的制备，其中在一定条件下将膜暴露于放射性射线，例如伽马射线中，该条件为膜周围环境空气中氧浓度从0.001到0.1％或更低，膜的含湿量从0.2到7wt.％，相对于其重量。在该参考文献中提到更高的氧浓度，尤其是环境空气的使用，会导致激发氧自由基破坏聚合物的主链并使其分解，由此期望使用惰性气氛，优选还有除氧剂的存在。由于难以绝对地排除氧气，以上提到的限止建议作为最高的氧气水平。EP 1 795 254A1进一步指出在使用伽马射线的情况下，辐照剂量应当为1到50kGy，或者最好为10到30kGy。更低的剂量会导致不够充分地消毒而更高的剂量会使膜的组分解体。该参考文献并未考虑该膜在细胞培养方面的用途。
JP 2003/245526还描述了一种不需要使用湿(充水)纤维的中空纤维膜的辐照方法。在该方法中，含湿量调整到该中空纤维膜重量的至少4％。中空纤维膜组件中的氧浓度调整到0.1到3.6％。
US2006/191844描述了膜组件的处理方法，通过将膜组件中充满脱气的RO水溶液，然后密封，之后将该组件暴露于10到60kGy的伽马射线中。当伽马射线的剂量过高时，疏水聚合物，亲水聚合物和/或壳体可能会解体和劣化。由此，公开的伽马射线的剂量优选在50kGy或更低，尤其是30kGy或更低。当使用未脱气的水时，溶解在水中的氧使得膜的组分氧化并劣化。
WO2006/135966 A1公开了一种用于使膜的亲水组分，例如PVP交联的方法，其使用伽马射线，可选地与化学溶液处理方法结合。使用的剂量从1到100kGy，优选10到50kGy。据称该辐照可以用于干膜或湿膜。但是，其给出的实施例是使用湿膜并且剂量不超过35kGy。未提到根据该参考文献制备的膜用于培养细胞。
EP 1 439 212 A1还描述了对聚砜和PVP基膜使用伽马射线辐照。又是将膜在湿的状态下辐照，其中膜应当含有至少1wt.％或更多的水或者浸没在水中，并且剂量不超过50kGy以避免膜的降解。其教导辐照会减少血小板在膜表面的粘附，这与本发明的目标，即细胞在腊表面的粘附相对立。
JP 2004/305840描述了由疏水性聚合物和亲水性聚合物组成的中空纤维膜，其在纺丝后使用伽马射线辐照消毒。辐照是在干的低温脱氧密封状态下进行。需要再次指出的很重要的一点是氧气的排除是很关键的。
发明内容
在本发明中，公开的膜是在制备出来后，在氧的存在下以伽马-或贝塔-射线或电子束以从12.5到175kGy的剂量处理过的。在辐照过程中，膜可以是处于干的或湿的状态，并且可以分别被空气，水，或者水溶液覆盖。本发明还指出了制备这样的膜的方法。本发明还指出了使用该膜用于促进细胞粘附和培养细胞，尤其是贴壁细胞的方法，而无需预处理该膜或使用任何细胞外基质组分来预涂覆该膜。本发明中优选的膜是聚砜基，聚醚砜基或聚(芳基)醚砜基的合成膜，此外还包括PVP和可选地少量其它聚合物，例如聚酰胺或聚氨酯。
附图简介
图1显示了在第一(14天)和第二(7天)生长阶段后，未处理的骨髓在不同类型的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计(试验1)。水平线表示TCPS水平。使用的简写见表I。
图2显示了在第一(14天)和第二(7天)生长阶段后，未处理的骨髓在不同类型的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计(试验2)。水平线表示TCPS水平。使用的简写见表I。
图3显示了在第二生长阶段的第5天在常规的TCPS盘上再涂覆的MSC的形态。该MSC来自如实施例10所述的试验2。简写如表I所述。(A)VTK膜，水覆盖，0％的丙烯酸，75kGy。(B)VTK膜，水覆盖，0.0001％的丙烯酸，75kGy。(C)VTK膜，水覆盖，0.001％的丙烯酸，75kGy。(D)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸，75kGy。(E)TCPS。(F)VTK膜，空气覆盖，25kGy。(G)VTK膜，空气覆盖，75kGy。(H)VTK膜，未经处理。(J)VTK膜+FN涂层。
图4显示了在第一(9天)和第二(7天)生长阶段后，预先选择的MSC在不同类型的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计(试验1)。水平线表示TCPS水平。使用的简写见表II和实施例11。
图5显示了在第一(10天)和第二(11天)生长阶段后，预先选择的MSC在不同类型的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计(试验2)。水平线表示TCPS水平。使用的简写见表II和实施例11。
图6显示了直接用伽马射线辐照过的膜与在伽马射线辐照前用蒸汽消毒的膜之间的对比。如实施例12所述的试验表明粘附到给定的膜表面的MSC数目相对于粘附到标准的TCPS表面的MSC数目，以[％]形式计。水平线表示TCPS水平。
图7显示了在第一(11天)和第二(7天)生长阶段后，未处理的骨髓在使用75kGy辐照与w/o蒸汽和ETO消毒的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计。水平线表示TCPS水平。
图8显示了在本发明的膜上生长的MSC的成功的脂肪形成。(A)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸，75kGy。(B)VTK膜，水覆盖，0.01％的烯丙胺，75kGy。(C)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸和0.01％的烯丙胺，25kGy。
图9显示了在本发明的膜上生长的MSC的成功的骨生成。(A)TCPS膜(对照)。(B)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸，75kGy。(C)VTK膜，水覆盖，0.01％的烯丙胺，75kGy。(D)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸+0.01％的烯丙胺，75kGy。(E)VTK膜，水覆盖，0.01％的丙烯酸，25kGy。(F)VTK膜，水覆盖，0.5％的丙烯酸，25kGy。
图10显示了人体皮成纤维细胞(NHDF)在使用25kGy(空气覆盖)或75kGy(水覆盖)辐照过的VTK膜上短期细胞培养的结果与TCPS进行对比。左边的柱显示了在1天后NHDF细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞粘附的效率。右边的柱显示了在5天后NHDF细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞增殖的效率。
图11显示了人体肝癌细胞(HepG2)在使用25kGy(空气覆盖)或75kGy(水覆盖)辐照过的VTK膜上短期细胞培养的结果与TCPS进行对比。左边的柱显示了在1天后HepG2细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞粘附的效率。右边的柱显示了在5天后HepG2细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞增殖的效率。本发明的膜表现出优于TCPS表面的细胞粘附和增殖性能。
图12显示了人体肾上皮细胞(HK-2)在使用25kGy(空气覆盖)或75kGy(水覆盖)辐照过的VTK膜上短期细胞培养的结果与TCPS进行对比。左边的柱显示了在1天后HK-2细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞粘附的效率。右边的柱显示了在5天后HK-2细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞增殖的效率。
图13显示了犬的肾上皮细胞(MDCK)在使用25kGy(空气覆盖)或75kGy(水覆盖)辐照过的VTK膜上短期细胞培养的结果与TCPS进行对比。左边的柱显示了在1天后MDCK细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞粘附的效率。右边的柱显示了在5天后MDCK细胞的数目相对于TCPS上的细胞数目，即显示了细胞增殖的效率。
图14显示了基于本发明的膜的生物反应器中细胞的倍增时间比与标准的烧瓶培养(见实施例15)进行对比。该倍增时间是指在给定的生物反应器中的细胞倍增时间/在对照烧瓶中的细胞倍增时间。
图15显示了由未处理的骨髓培养的MSC的成活率。对于全部的生物反应器测试，收获细胞的成活率在90％以上。
图16显示了从本发明的生物反应器中收获的细胞的表型。MSC是由未处理的骨髓培养而来。正如能够看出的那样，在充水的VTK生物反应器(75kGy)中扩增的细胞对于CD45和HLA-DR表现出比较高的值。从其它全部的生物反应器中收获的细胞表现出与CD34，CD45，CD73，CD90，CD105和HLA-DR有关的期望得到的MSC表型。
图17显示了在第一(10天)和第二(11天)生长阶段后，预先选择的MSC在不同类型的膜上生长的MSC数目相对于在标准的TCPS上生长的MSC数目，以[％]形式计。结果表明了伽马射线的剂量对于膜上的细胞增殖性质的影响。水平线表示TCPS水平。
发明详述
本发明的目标之一是一种聚合物膜，其在干的或湿的状态下，在氧的存在下受到贝塔-或伽马-射线或电子束以从12.5到175kGy剂量的辐照。该膜在辐照过程中可以被空气包围，其中在辐照过程中存在的氧气的浓度从4到100vol.％，例如5到30vol.％，或15到25vol.％，或者被水或含有少量添加剂的水溶液包围。
该聚合物膜包括疏水或亲水聚合物或二者兼有。在一种具体实施方式中，该膜包括至少一种亲水聚合物和至少一种疏水聚合物的共混体。在另一种具体实施方式中，该膜包括亲水共聚物。在另一种具体实施方式中，该膜包括亲水共聚物和疏水聚合物。在另一种具体实施方式中，该膜包括亲水均聚物。在更进一步的具体实施方式中，该膜包括亲水均聚物和疏水聚合物。
在本发明的一种具体实施方式中，用于制备该膜的聚合物溶液中包括的疏水和亲水聚合物在数量上如下：疏水聚合物在聚合物溶液中的份额在5到20％重量百分比，而亲水聚合物的份额在2到13％重量百分比。
在一种特定的具体实施方式中，该膜包括一种第一疏水聚合物组分，第二亲水聚合物组分，和可选地，一种第三疏水聚合物组分。
所述的第一疏水聚合物优选地选自聚酰胺(PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜(PAES)，聚醚砜(PES)，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物。所述的第二亲水聚合物优选地选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PEG)，聚乙二醇单酯，水溶性纤维素衍生物，聚山梨醇酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。所述的第三疏水聚合物优选地选自聚酰胺(PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜(PAES)，聚醚砜(PES)，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物。该膜可以制备成平板膜或中空纤维膜的形式。
在本发明的一个方面，该膜可以用于细胞的附着或粘附，细胞的生长和细胞的扩增或储存，而不需要预处理或用EMC预涂覆该膜。使用不带有任何类似EMC的膜用于细胞培养的优点在于，例如，因节省时间和工艺步骤带来的成本降低，显著降低的伴随EMC带来污染或涂覆膜所需的更多的方法步骤带来的风险(GMP符合性)以及值得关注的用于细胞生产的更好的限定材料和记录。
当然也可以使用现有技术中已知的一种或更多的EMC来额外预处理或预涂覆本发明的膜。尤其对于不打算将扩增或生长的细胞或组织再植回宿主体内的用途时，这些预处理可能会进一步改善膜在粘附或增殖方面的性能。但是，总是优选使用本发明的不带有任何EMC涂层的膜。
在本发明的进一步的方面，可以通过制备本发明的中空纤维膜并在连续的培养方法中使用所述中空纤维膜或其膜束作为盘式培养技术的替代来显著地改善细胞培养的性能。除了连续的方法外，该中空纤维膜可以用于静态或半连续方法中。
本发明的膜能够以将特定的粘附性能赋予到膜的整体的方式制备，即，在用于连续应用的中空纤维膜时，赋予到该中空纤维膜的外部和内部。
在本发明的进一步的方面，该膜还提供了一个用于两种或多种不同细胞类型的细胞共培养系统。
本发明的进一步的方面在于，该膜极好地促进了在分化和完整性方面的最优细胞单层的形成，而无需使用任何EMC预涂覆该膜的表面。本发明的膜提供了典型细胞形态的保留，易于形成单层，并且能够产生紧密的连接。在本发明中，单层是指在一个细胞层中，没有细胞在另一个细胞顶部生长，而是全部的细胞并肩生长并且在很多时候在同一个生长表面上互相接触，即便这并非该膜的全部潜在用途所必需的。
由此本发明的膜可以有利地用于，例如，
(a)组织培养技术，即，用于生物人工植入体的建立，例如生物人工肾脏或肝脏(也参见Atala(2006))；
(b)用于培养贴壁细胞，例如，通常的MSC，平滑肌细胞，皮肤细胞，神经细胞，神经胶质细胞或内皮细胞，或悬浮细胞，例如造血干细胞，脐带血细胞，神经干细胞等，通过细胞注射用于医学治疗，这需要在再植入回宿主体内之前进行体外增殖；
(c)用于扩增和提供细胞用作生物产品例如生长因子，蛋白重组体，细胞因子或例如单克隆抗体的抗体的生产者；
(d)用于准备贴壁细胞的培养，优选是细胞单层的培养，用于研究特定的细胞类型或用于研究任何药物对细胞的影响(筛选程序)，例如抗癌剂，抗真菌，抗生素，抗病毒(包括抗体-HIV)和抗寄生虫药物；
(e)或其它任何基于或需要在活体外系统中扩增培养或存储贴壁细胞或悬浮细胞的应用。
本发明的膜能够根据任何潜在的用途需要而具有适用的几何形状，即，其可以是平板，中空纤维或中空纤维束，或是制成能够形成腔室的形状或所需的其它形状。用于细胞扩增的核心单元优选地是一个中空纤维基的膜系统，其允许充分的O2和CO2的交换，营养物的供应和废物的去除。膜的表面设计成通过特定的表面特性能够使得具有所需性质的细胞的粘附和增殖。在中空纤维内部进行细胞培养的优点是基于优越的表面积与体积比，其与传统的烧瓶或多层细胞培养器培养方法相比，能够得到在培养过程中介质消耗的最小化，需要空间的最小化和劳力的最小化。中空纤维结构的另一个优点是统一控制的流路。
本发明的膜可以用于各种不同的细胞扩增或细胞培养装置或系统，例如在US2003/0203478A1，US6,150,164或US6,942879中所描述的那样。
通常而言，本发明的膜可以有利地用于培养贴壁细胞。在本发明中，贴壁细胞被定义为附着到基质上进行维持、扩增、分化和储存等的细胞。本发明的膜将被用于培养例如干细胞，包括胚胎和成人干细胞，尤其是间充质干细胞(MSC)，成纤维细胞，上皮细胞，肝细胞，内皮细胞，肌细胞，软骨细胞等。
在本发明的第一个方面，本发明的膜由包括疏水和亲水聚合物的聚合物的混合物制成，用于制备该膜的聚合物溶液中的疏水聚合物的份额为从5-20％重量百分比，并且亲水聚合物的份额为从2-13％重量百分比。所述至少一种疏水聚合物优选地选自聚酰胺(PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜(PAES)，聚醚砜(PES)，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物，优选聚醚砚或聚(芳基)醚砜与聚酰胺组成的混合物。所述至少一种亲水聚合物优选地选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PEG)，聚乙二醇单酯，水溶性纤维素衍生物，聚山梨醇酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明中优选使用的膜包括，在制备该膜的聚合物溶液中，从11到19wt.％的第一聚合物，其选自聚砜(PS)，聚醚砜(PES)和聚(芳基)醚砜(PAES)，从0.5到13wt.％的第二聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，从0wt.％到5wt.％的，优选从0.001wt.％到5wt.％的一种聚酰胺(PA)，从0wt.％到7wt.％的水和补足100％wt.余量的一种溶剂，其选自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，这是作为优选地，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)和伽马-丁内酯(GBL)。
优选地，该聚合物溶液中的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是由至少两种聚乙烯吡咯烷酮的均聚物混合而成，其中一种聚乙烯吡咯烷酮均聚物(＝低分子量PVP)具有的平均相对分子量从约10,000g/mol到100,000g/mol，优选约30,000g/mol到70,000g/mol，而另一种聚乙烯吡咯烷酮均聚物(＝高分子量PVP)具有的平均相对分子量从约500,000g/mol到2,000,000g/mol，优选约800,000g/mol到2,000,000g/mol。类似这样的PVP均聚物的例子是PVP K85，一种分子量为约825,000Da的高分子量PVP，和PVP K30，一种分子量为约66,800Da的低分子量PVP。在本发明的一种优选的具体实施方式中，用于制备膜的聚合物溶液包括从0.5到5wt.％的高分子量PVP和从1到8wt.％的低分子量PVP。
用于制备这样的膜的方法详细地记载在例如，US-A 4,935,141，US-A5,891,338和EP 1 578 521 A1中，其全文在此引作参考。能够按照本发明的方法有效处理的类似的膜的例子是目前已被用于商业产品的Gambro Polyflux膜(聚芳基醚砜/PVP/聚酰胺)，例如Polyflux L和H系列；Arylane膜(聚(芳基)醚砜/PVP)；或DIAPES或PUREMA膜(聚(芳基)醚砜/PVP)或其它的基于亲水和疏水聚合物的共混物，例如包括PVP与PES或聚砜的商业渗析膜。
在本发明的第二个方面，用于制备本发明的膜的聚合物溶液包括从12到15wt.％的作为疏水聚合物的聚醚砜或聚砜和从5到10wt.％的PVP，其中所述的PVP由低分子量和高分子量的PVP组分组成。在纺丝溶液中含有的PVP总量由从22到34wt.％的，优选从25到30wt.％的高分子量(＞100kDa)组分和从66到78wt.％的，优选从70到75wt.％的低分子量(≤100kDa)组分组成。高分子量和低分子量的PVP的例子分别是PVP K85/K90和PVP K30。用于本发明的方法中的聚合物溶液优选地还进一步包括从66到86wt.％的溶剂和从1到5wt.％的适当的添加剂。适当的添加剂例如水，甘油，和/或其它的醇类。尤其优选水，而且在使用时，纺丝溶液中的含水量为从1到8wt.％，优选从2到5wt.％。在本发明的方法中使用的溶剂优选选自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，二甲基乙酰胺(DMAC)，二甲亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，丁内酯和所述溶剂的混合物。NMP是尤其优选的。用于制备膜的中心流体或钻孔流体(bore liquid)包括至少一种上面提到的溶剂和一种选自水，甘油和其它醇类的沉淀介质。最优选地，该中心流体由从45到70wt.％的沉淀介质和从30到55wt.％的溶剂组成。优选地，该中心流体由从51到57wt.％的水和从43到49wt.％的NMP组成。
制备这样的膜的方法已经在欧洲专利申请号NO.08008229中被详细地公开，在此全文引作参考。能够按照本发明的方法有效处理的此类膜的例子是例如Gambro Revaclear膜及其衍生物。还可能用于本发明的膜通常是已被用于商业产品的，例如Fresenius FX-类的膜(Helixone膜)或Optiflux类型的膜或其它的基于亲水和疏水聚合物的共混物，例如包括PVP与PES或聚砜的商业渗析膜。
在本发明的第三个方面，用于制备本发明的膜的聚合物溶液包括从11到19wt.％的第一聚合物，其选自聚砜(PS)，聚醚砜(PES)和聚(芳基)醚砜(PAES)，从0.5到13wt.％的第二聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，从0.001wt.％到20wt.％的聚氨酯(PU)，从0wt.％到7wt.％的水，和一种选自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)和伽马-丁内酯(GBL)的溶剂补足100％wt.。所述的第一聚合物在聚合物溶液中的含量优选从13到14％wt.，尤其优选从13.6到14％wt.。聚醚砜(PES)和聚(芳基)醚砜(PAES)优选用于制备本发明的膜。优选地，在聚合物溶液中的PVP由至少两种聚乙烯吡咯烷酮均聚物的共混物组成，其中一种聚乙烯吡咯烷酮均聚物(＝低分子量PVP)具有的平均分子量从约10,000g/mol到100,000g/mol，优选约30,000g/mol到70,000g/mol，而另一种聚乙烯吡咯烷酮均聚物(＝高分子量PVP)具有的平均分子量从约500,000g/mol到2,000,000g/mol，优选约800,000g/mol到2,000,000g/mol。类似这样的PVP均聚物的例子是PVP K85，一种分子量为约825,000Da的高分子量PVP，和PVP K30，一种分子量为约66,800Da的低分子量PVP。在本发明的一种优选的具体实施方式中，用于制备膜的聚合物溶液包括从0.5到5wt.％的高分子量PVP和从1到8wt.％的低分子量PVP。纺丝溶液中的含水量优选从1到5wt.％，更优选约3wt.％。各种的溶剂可以用于制备本发明的膜，例如N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)或伽马-丁内酯(GBL)及其混合物。溶剂的量是用来补足聚合物溶液到100wt.％。聚合物溶液中的溶剂的含量优选从60到80wt.％，更优选从67到76.4wt.％。
本发明的膜可以制备成，例如平板或中空纤维的形状。
在一种具体实施方式中，本发明的膜具有非对称结构。当呈现中空纤维的情况下，纤维的内侧是一个薄的分离层。本发明的膜的结构或形态也可以变化而不会对其在细胞粘附和增殖方面产生显著影响。该膜可以具有，例如3层结构或类似海绵结构或类似泡沫结构。在一种具体实施方式中，本发明的膜的进一步的特征在于细胞粘附侧的光滑性或低粗糙度。
在一种具体实施方式中，本发明的膜的液体透过性可以从约0.1 10-4cm3到200 10-4cm3/(cm2 bar sec)变化，例如从0.1 10-4cm3到10 10-4cm3/(cm2 barsec)，或者甚至从0.1 10-4cm3到5 10-4cm3/(cm2 bar sec)。为了得到这样的液体透过性而不会使膜的结构产生缺陷，聚合物溶液在用于中空纤维制造时的粘度范围通常从2,500厘泊(cP)到200,000cP，或者甚至从10,900cP到25,600cP。对于平板膜生产，粘度范围通常从2,500cP到500,000cP，或者甚至从4,500cP到415,000cP。
为了制备本发明的膜，在恒温恒压下将聚合物溶解在溶剂中。在真空(约100mbar)干燥箱中将该聚合物溶液脱气。聚合物溶液的温度可以在一个相对较宽的范围内变化。较有利地是从室温到60℃的范围内选择该温度。
为了制备平板膜，通过使用特定的刮刀，将最后的聚合物溶液以均匀的膜的形式浇铸在一个光滑表面上，例如玻璃载片(作为支撑区域)上；聚合物膜的浇铸速度可以在一个相对较宽的范围内变化。速度在10和20mm/s之间是适宜的。在一个示范性的试验室规模方法中，该聚合物溶液首先通过一个注射器稳定地施加到玻璃载片上。重要的是该过程没有气泡产生。具有限定间隙高度的刮刀以恒速驱动，制出均匀的聚合物膜。为实现良好的厚度分布，建议刮刀具有均匀的间隙。
在本发明的一种具体实施方式中，沉淀浴中包括的含量从30到100wt.％，优选从56到66wt.％的水，和一种溶剂，例如NMP，其含量从0到70wt.％，优选从34到44wt.％。沉淀浴的温度可以在一个相对较宽的范围内变化。较有利地是使用在0℃和80℃之间，或是30℃和50℃之间的温度。沉淀时间也可以变化。例如，沉淀时间可以是5分钟。该沉淀浴优选由水和一种溶剂组成。该浴优选包括含量从30到100wt.％的水和含量从70到0wt.％的选自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)或伽马-丁内酯(GBL)及其混合物的一种溶剂。在本发明的一种具体实施方式中，沉淀浴包括含量从56到66wt.％的水和含量从34到44wt.％的溶剂。NMP是本发明的一种尤其适用的溶剂。
沉淀后的膜然后在无溶剂的条件下存储直到切割。在切割后，该膜被洗涤，干燥和消毒。
本发明的平板膜的厚度可以在15μm和200μm之间变化。35μm和50μm之间的厚度可能会特别有利于大部分用途。
本发明的膜还可以制备成中空纤维的形态。在制备这样的中空纤维膜时，溶液被泵送通过一个纺丝模具并形成液体的中空纤维。中心的溶剂浓缩导致了膜内侧的开放式结构。最小的孔直接位于膜的内侧。在使用时，内侧的选择层直接接触细胞介质。
在一种具体实施方式中，沉淀浴由水组成。沉淀浴的温度可以在较宽的范围内变化，但是在该方法中有利地使用了高达约40℃的环境温度。模具和沉淀浴之间的距离范围从0到100cm，例如从50到100cm。该模具(纺丝头)的温度也可以变化。可以使用20和80℃之间的温度。有利地是使用在40和55℃之间的温度。纺丝速度可以选自从5到80m/min，例如从11到40m/min的范围。
本发明的中空纤维膜的尺寸变化取决于膜的潜在应用。内径通常在从50到2,000μm的范围。在许多应用中，内径从100到950μm是有利的。壁厚通常从25到55μm的范围内。
本发明的膜得到的Lp在从0.1 10-4cm3到200 10-4cm3/(cm2 bar s)的范围内，例如从0.1 10-4cm3到10 10-4cm3/(cm2 bar s)，或者甚至从0.1 10-4cm3到5 10-4cm3/(cm2 bar s)。在本发明的另一种具体实施方式中，膜的Lp在从2 10-4cm3到18 10-4cm3/(cm2 bar s)的范围内。在本发明的另一种具体实施方式中，膜的Lp在从5 10-4cm3到15 10-4cm3/(cm2 bar s)的范围内，也就是说，用于细胞培养的膜也可以是所谓的低流通膜。
可以通过两种方式来制备本发明的膜，被称为“湿”和“干”的膜。当制备“湿”膜时，膜在制备后必须在管或炉中分别干燥。为此，纤维束(例如30-15,000根纤维)被放置在塑料或金属容器中。热空气通过该容器并干燥该膜。第二种方法是所谓的“在线干燥”，其是一种在纺丝机上直接制备干燥的中空纤维的有效方法。这两种程序都可以获得能够按照本发明加以处理和使用的膜。
按照本发明，通过用空气或水或含有适宜的添加剂的水溶液覆盖前述的膜来对其加以处理，这样的添加剂例如丙烯酸，烯丙胺或丙烯酰胺，其浓度从0.00001到5wt.％，例如从0.0001到0.01wt.％，并且在氧的存在下经受伽马，贝塔或电子束的辐照。
为使膜达到能够用作细胞培养的目的，可以将膜放置在辐照室内经受伽马，贝塔或电子束的辐照，尤其是伽马-射线的辐照，使用的辐照剂量从12.5到175kGy，优选剂量从70到175kGy。在本发明的另一个方面，使用的剂量从25到125kGy。在本发明的另一个方面，使用的剂量从50到175kGy。在本发明的另一个方面，使用的剂量从50到125kGy。在本发明的另一个方面，使用的剂量从70到100kGy。
伽马-射线辐照可以使用例如一个Co-60源进行。电子束辐照可以使用一个电子束加速器进行。贝塔-射线辐照可以使用一个贝塔辐照源，例如Sr-90或Ru-106进行。
在本发明的一种具体实施方式中，膜在干的条件下经受辐照，即膜被空气覆盖或包围。本发明中的“干”的表达形式并不排除膜多孔结构中的水的存在，即其意欲包括的范围从完全没有水到膜壁的整个多孔结构中充满了水的情况。
与已知的用伽马-射线辐照膜以使膜消毒或使膜中的特定的组分例如PVP产生交联相对照，辐照过程中氧的存在对于获得适用于细胞培养目的的膜来说是很关键的。在本发明的一个方面，辐照过程中环绕的空气可以是未修饰的空气，大致含有(按摩尔含量/体积)78.08％的氮气，20.95％的氧气，0.93％的氩，0.038％的二氧化碳，痕量的其它气体，和可变量的水蒸气。在本发明的另一个方面，环绕的空气中的含氧量可以增加，例如通过将附加的氧气导入系统。氧浓度可以增加达到约100％的限值，例如高达30％。在本发明的另一个方面，氧浓度可以降低到约4％的限值。从4％到100％的氧浓度，例如从4％到30％(按摩尔含量/体积)，可通常用于获得所需的结果。使用从5％到25％，或者甚至从15％到22％的氧浓度是有利的。
在本发明的另一种具体实施方式中，膜在湿的状态下，或者，换句话说，在含水条件下经受辐照。本发明中的“湿”和“含水条件”的表达形式是指在辐照过程中水的存在，即膜可以被水覆盖或浸没在水中。在本发明的一种具体实施方式中，使用的是RO水。
在本发明的另一种具体实施方式中，添加剂可以与少量的水混合。这样的添加剂通过将官能团导入膜的表面来用于改善普通或特定类型细胞培养的辐照膜的性能。这样的添加剂的例子是含有具有氨基酸，羧基或羧胺官能团的单体的乙烯基基团，例如丙烯酸，烯丙胺或丙烯酰胺。在一种特定的具体实施方式中，使用丙烯酸。在另一种特定的具体实施方式中，使用烯丙胺。添加剂在水溶液中的浓度可以从0.00001到5wt.％。使用从0.0001到1wt.％，或从0.0001到0.1wt.％的浓度是有利的。低浓度的添加剂，例如从0.0001到0.01wt.％被证明是尤其有效的。
在湿的状态下使用更高的辐照剂量对于膜的辐照来说是有利的，例如从70到175kGy的剂量。
到达选定剂量所需的时间可以在相对较宽的范围内变化。例如，使用Co-60源时，对于25kGy的剂量需要约6到7小时，对于75kGy的剂量需要约17到20小时，即辐照时间为3倍。需要的时间取决于源及其在辐照时的强度和根据需求调整。
温度也可以在更宽的范围内变化并且也取决于膜的壳体的材料，即，该壳体是否由金属或合成材料制成。一般来说，该温度在从0℃到41℃的范围内。在多数情况下，使用室温是较方便的。
在本发明的另一种具体实施方式中，在被辐照之前，膜要经过干燥，优选在线干燥，随后蒸汽消毒，以保持所需的低流量特性。如果在制备过程中需要或是有必要，会增加一个进一步的EtO(环氧乙烷)消毒而不会对本发明的膜在细胞培养方面应用的效力产生任何负面的影响。蒸汽消毒或EtO消毒膜的方法是本领域所熟知的。
被辐照后的膜直接用于各种不同类型细胞，尤其是贴壁细胞的培养。本发明的膜表现出的生长特性基本相似于或优于组织培养聚苯乙烯(TCPS)板，后者代表了当今使用培养瓶或多层细胞培养器进行细胞扩增的金标准。
本发明的膜细胞显示了扩增率，细胞在膜上的再贴附效率，和包括形态控制在内的扩增后细胞的特性方面类似于或更优于组织培养聚苯乙烯(TCPS)，正如使用间充质干细胞(MSC)，成纤维细胞，上皮细胞和肝细胞进行的测试所表现出的那样。
本发明的更进一步的方面是包括本发明的膜的细胞培养装置。可以通过改进用来包含本发明的膜的细胞扩增或细胞培养的装置或系统的例子已被US2003/0203478 A1，US-A 6,150,164，或US-A 6,942,879公开，在此全文引作参考。该装置可以包括本发明的平板膜的叠层或本发明的中空纤维膜的膜束。
在该装置的一种具体实施方式中，膜在装置的两个流体室之间形成一个界面。该装置在结构上类似于商业上可以得到的用于例如血液透析或血滤的过滤装置。
示范性的装置包括被安装在封套中的一个半透膜分隔开的两个室，第一内室设置有两个接口，而第二外室包括一个或两个接口，这两个室都还被一个封装(potting)部件分隔，该封装部件是基于适当的粘结化合物，意欲形成，(i)一个圆柱形分隔将包括如上文中定义的中空纤维膜束类型的半透膜的所述装置分成两个室或是(ii)在包括如上文中定义的平板膜束类型的半透膜的所述装置中的一个紧密的密封。
另一个示范性的装置，具有包含在一个外壳中的多个中空纤维膜，并且配置成将中空纤维膜外部空间(即，外毛细管室)的流体与穿透到中空纤维膜中的流体及其对应的开孔分离开来。此外，该装置包括在外壳内位于装置相对的端部的两个集管端室。中空纤维两端开口的每一个都连接到不同的端室。端室和毛细管外室被中空纤维的半透膜分隔开来。外毛细管室内的组成在一定程度上是可以通过中空纤维膜的分子量截止，或孔径加以控制的。
在该装置的一种操作方式中，细胞在外毛细管室内生长而营养介质穿透中空纤维膜。介质可以穿透外毛细管或内毛细管室。在该装置的另一种操作方式中，细胞在中空纤维的内毛细管空间(即，管腔)内生长，而营养介质穿透外毛细管和/或内毛细管室。中空纤维的半透过特性使得营养，气体和细胞废物穿透中空纤维壁而阻止细胞透过。
管-壳型生物反应器提供了数个优点。对于贴壁细胞而言，数个中空纤维的使用在一个相对较小的体积内提供了细胞能够生长的大量表面。该大量表面区域也为营养介质局部分配到生长的细胞上提供了便利并且易于收集细胞废物。管-壳型生物反应器使得细胞的生长与其它细胞培养装置相比能够具有尽可能更高的密度。其可以支撑的细胞密度大于每毫升108个细胞，而其它细胞培养装置通常限制在每毫升约106个细胞的密度。
本发明的更进一步的方面提供了一种用于体液的体外处理的装置，其包括细胞和本发明的膜。在一种具体实施方式中，该细胞是贴壁细胞，其在膜表面，例如在本发明的中空纤维膜的管腔表面或在本发明的中空纤维膜的外表面上形成一个融合的层。在其余的部分，该装置的设计与上文中所述的细胞培养装置的设计相类似。待处理的体液被导入该装置的流体空间，在此穿过细胞层，使得细胞提取体液中的组分，代谢体液中的组分，或分离组分进入体液。
实施例
一般来说，本发明的膜的适用性和效率的评估是基于以下原则特征：细胞扩增率，细胞在膜上的再贴附效率，和包括形态控制的扩增后细胞的特性。使用间充质干细胞(MSC)，成纤维细胞，上皮细胞和肝细胞进行测试以证明本发明的膜适用于培养不同类型的贴壁细胞。选择MSC用来对本发明的膜用作细胞培养的性能的深入分析。
方法
手束(hand bundle)，小型模块，过滤器和平板插件的制备
(A)手束
纺丝工艺后膜束的制备对于以充分的方式为后续的性能测试制备纤维束来说是必要的。第一个方法步骤是将纤维束切割成规定的23cm的长度。接下来的方法步骤包括熔化纤维的末端。一个光学控制确保全部的纤维都被很好地熔化。然后，纤维束的末端被装入一个封装帽中。该封装帽被机械地固定并且一个封装管被套在封装帽上。之后，使用聚氨酯进行封装。在封装后必须确保聚氨酯硬化至少一天。在接下来的方法步骤中，封装的膜束被切割到指定的长度，并且打开了纤维的端部。最后的方法步骤包括纤维管束的光学控制。在这一步骤过程中，需控制以下点：(i)切割质量(切口是否光滑或是否有任何刀伤)，(ii)封装质量(是否在纺丝工艺中开口的纤维数目通过被封装的纤维减少或是否有可见的因缺乏聚氨酯导致的空隙)。在该光学控制后，膜束在用于不同的性能测试之前被干燥储存。
(B)小型模块的制备
小型模块(＝壳体中的纤维束)是通过相关的方法步骤制备的。需要小型模块以确保纤维的保护和非常清洁的生产。小型模块的生产存在以下几点不同：(i)纤维束切割成20cm的规定长度；(ii)纤维束在融化方法之前被传送到壳体中；(iii)小型模块在封装方法之前被放入真空干燥箱中过夜。
(C)过滤器的制备
该过滤器包括约8,000到15,000根纤维，有效表面积为0.9到1.7m2。过滤器的特征在于圆筒状壳体上带有用于供应培养介质流体的两个接头和位于两侧的封帽，每个封帽都带有一个中心接头。制造方法(卷绕后)可以划分成以下主要步骤：(i)通过专用的束卡将切割(约30cm的长度)后的膜束转移到壳体中；(ii)膜束的两端通过封闭步骤被封闭；(iii)使用聚氨酯(PUR)将纤维封装到壳体中；(iv)将端部切下以打开纤维，其中要求光滑的表面；(v)端部通过目视检查封闭的纤维或PUR封堵的缺陷；(vi)将帽盖胶合到接头上；(vii)最终处理：清洗，整体测试，最终干燥；(viii)包装到专用的袋中用于进一步的步骤(例如，辐照)。
(D)平板插件的制备
将平板膜在玻璃板上固定。对插件起到胶水功能的聚氨酯被均匀地分布在板上。将该插件轻柔地浸入到聚氨酯中并立即粘结到各自的膜上。用玻璃和钢板承重该插件并干燥16到18小时。平板膜插件被切割出来并焊到消毒袋内。最后，插件在压力釜中在121℃消毒。
手束和小型模块的液体透过性(Lp)
膜束的液体透过性的测量是通过在压力下挤压具有确定的体积的水通过一端封闭的膜束，并测量所需的时间来进行的。液体透过性可以通过确定的时间，膜的有效表面积，施加的压力和挤压通过膜的水的体积来计算。根据纤维数量，纤维长度以及纤维的内径，能够计算有效的膜的表面积。膜束在进行Lp测试前必须润湿30分钟。为此，将膜束放入含有500ml超纯水的箱内。30分钟后，将膜束转移至测试系统中。该测试系统包括37℃的水浴和一个膜束能够被机械实施的装置。水浴的填充高度必须确保膜束在指定设备中位于水面以下。为避免膜泄漏导致错误的测试结果，事先要进行膜束和即将运行的测试系统的整体性测试。整体性测试的进行是通过挤压空气通过一端封闭的膜束。空气泡表明膜束或测试系统的泄漏。应当检查泄漏是否与膜束在测试系统中的错误实施有关或者是否有真正的膜泄漏存在。如果检测到膜存在泄漏，则弃用该膜束。整体性测试所施加的压力应当至少与液体透过性测试期间施加的压力相同的数值，以确保由于施加的压力过高，在液体透过性测试期间没有泄漏发生。
手束的扩散透过性
使用等渗压氯化物溶液和在渗析液中稀释的磷酸盐(100mg/l)一起进行扩散试验来测定膜的扩散性质。将手束放入测量室内。测量室允许通过在中空纤维内侧的特定的溶液。此外，测量室完全地被水充满，并且使用高的横流蒸馏水来运走特定的离子穿过膜的横截面，从中空纤维的内侧到达外侧。通过正确地调节压力比，来达到零过滤，由此使得测量到的仅仅是膜的扩散性质(通过在中空纤维的内侧和中空纤维的周围之间形成特定离子的最大的浓度梯度)而非扩散和对流的结合。在开始时从库中取得样品并且在过10分钟和20分钟后取得渗余物的样品。然后将该氯化物样品用硝酸银溶液滴定来测定氯化物浓度。磷酸盐样品通过光计量进行分析。根据测得的浓度，有效的膜表面积A和流量条件，氯化物或磷酸盐各自的透过性P能够按照下式(2)来计算：
Px[10-4cm/s]＝[QB/60/A]*ln[(CA-CD)/CR]*104            (2)
其中
P＝扩散透过性[cm/s]
c＝浓度[mmol]
A＝有效的膜面积[cm2]
下标：
x＝物质(在此：分别是氯化物或磷酸盐)
A＝起始浓度(进料)
D＝渗析液
R＝渗余物
QB＝血流量[ml/min]
水溶液中肌红蛋白的筛析系数(手束)
在肌红蛋白和白蛋白的水溶液中进行的筛析系数试验是使用两种带有分开的溶液的不同的试验设定进行的。在第一测试中测定肌红蛋白的筛析系数。
溶解在PBS缓冲溶液中的肌红蛋白的浓度是100mg/l。该水溶液的失效日期在4到8周之间。该溶液必须储存在冰箱中。在进行筛析系数试验之前，使用前面介绍过的方法进行Lp测试。肌红蛋白的筛析系数试验进行一次，其测试条件设定如下：
本征流率(Jv，cm/s)和壁剪切率(γ□in s-1)保持固定，其中对血流(QB)和过滤比(UF)进行计算(参见式(4)+(5))：
QB[ml/min]＝γ*n*π*di3*60/32            (4)
UF[ml/min]＝Jv*A*60                      (5)
其中
n＝纤维数量
di＝纤维内径[cm]
γ＝剪切率[s-1]
A＝有效的膜面积[cm2]
其中A是按照式(1)计算的：
当测试手束或小型模块时，剪切率设定在500s-1，并且本征流率设定在0.3810-4cm/s。
在15分钟后取出第一个样品(库，渗余物，滤液)，在60分钟后取第二个样品。最后，用PBS缓冲液冲洗测试束数分钟然后停止测试。
实施例1
平板膜的制备
聚合物溶液的制备是在60℃下将聚醚砜(Ultrason6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30和K85，BASF)，聚氨酯(Desmopan9665DU，BayerMaterialScience AG)和蒸馏水溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中直到获得澄清的高粘度溶液。
在聚合物纺丝溶液中的不同组分的重量份数，PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665DU/H2O/NMP为14/3/5/2/3/73。得到的聚合物溶液的粘度为21,000mPa s。
将该溶液过滤并脱气。聚合物溶液的脱气是在升高温度(＜100℃)和降低压力(约100mbar)的干燥箱中进行的。最后的聚合物溶液随后使用专门的涂层刮刀在光滑表面(玻璃载片)上浇铸(自动地)成均匀的膜，所述光滑表面用作支撑面。首先，该聚合物溶液在烘箱中被加热到60℃，然后使用注射器直接稳定地施加到玻璃载片上。该具有设定间隙(100μm)高度的涂层刮刀以12.5mm/s的恒速驱动，由此制备均匀的聚合物膜。该带有薄层聚合物膜的玻璃载片迅速浸入到凝固浴中。50℃的水/NMP的混合物被用作凝固浴，其中含有56wt.％的水和44wt.％的NMP。膜的沉淀需要约5分钟。随后，将沉淀的膜取出，在无溶剂的条件下储存直到一个系列的全部膜都已制备完，然后切割成规定的尺寸。在切割后，将膜用70℃的蒸馏水洗涤30分钟。接下来的步骤是置于烘箱中在60℃下干燥过夜并最终包装该膜于专用的袋中用于消毒。膜的厚度为35μm。
实施例2
平板膜的制备
聚合物溶液的制备是在60℃下将聚醚砜(Ultrason6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30和K90，BASF)和蒸馏水溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中直到获得澄清的高粘度溶液。
在聚合物纺丝溶液中的不同组分的重量份数，PES/PVP(K90)/PVP(K30)/H2O/NMP为13.6/2/5/3/76.4。得到的聚合物溶液的粘度为5,900mPa s。
膜的制备如实施例1中所述。膜的厚度为50μm。
实施例3
中空纤维膜的制备
聚合物溶液的制备是将13.5wt.％的聚醚砜，0.5wt.％的聚酰胺，7.5wt.％的PVP K30和78.5％的NMP混合。59wt.％的水和41wt.％的NMP的混合物用作中心流体。聚合物溶液的粘度在22℃的温度下测量为4,230mPa s。
中心流体被加热到55℃后泵送穿过一个双组份中空纤维纺丝头。聚合物溶液通过一个环形狭缝离开纺丝头，该狭缝的外径为0.5mm且内径为0.35mm。中心流体离开位于环形聚合物溶液管中心的纺丝头以从内侧开始聚合物溶液的沉淀并且决定了该中空纤维的内径。
两种组份(聚合物溶液和中心流体)在同一时间进入与室内空气分隔开的空间内。该空间被称为纺丝轴。蒸汽(100℃)和空气(22℃)的混合物被注射入纺丝轴。通过蒸汽和空气之比将纺丝轴内的温度调节到49℃且相对湿度为99.5％，并且相对于水含量，将溶剂含量调节到3.9wt.％.。溶剂是NMP。纺丝轴的长度是890mm。借助于重力和电机驱动辊，中空纤维被由顶部抽到底部，由纺丝头穿过纺丝轴沿垂直方向进入水浴。纺丝速度为50m/min。该中空纤维随后被引导穿过串联多级水浴并且温度由20增加到90℃的级联。离开冲洗水浴的湿的中空纤维膜在连续的在线干燥步骤中被干燥。在一个可选的形成纹理的步骤之后，中空纤维以丝束的形式被收集到一个纺丝轮上。按照本实施例制备的中空纤维的外表面每mm2具有62,500个孔，并且孔径在0.5到3μm的范围内。
实施例4
中空纤维膜的制备
聚合物溶液的制备是将14wt.％的聚醚砜，5wt.％的PVP K30，2wt.％的PVPK85/K90，3wt.％的水和76％wt.的NMP混合。55wt.％的水和45wt.％的NMP的混合物用作中心流体。聚合物溶液的粘度在22℃的温度下测量为5,400mPa s。
中心流体被加热到55℃后泵送穿过一个双组份中空纤维纺丝头。聚合物溶液通过一个环形狭缝离开纺丝头，该狭缝的外径为0.5mm且内径为0.35mm。中心流体离开位于环形聚合物溶液管中心的纺丝头以从内侧开始聚合物溶液的沉淀并且决定了该中空纤维的内径。两种组份(聚合物溶液和中心流体)在同一时间进入与室内空气分隔开的空间内。该空间被称为纺丝轴。蒸汽(100℃)和空气(22℃)的混合物被注射入纺丝轴。通过蒸汽和空气之比将纺丝轴内的温度调节到45℃且相对湿度为99.5％。纺丝轴的长度是890mm。借助于重力和电机驱动辊，中空纤维被由顶部抽到底部，由纺丝头穿过纺丝轴沿垂直方向进入水浴。纺丝速度为50m/min。该中空纤维随后被引导穿过串联多级水浴并且温度由15增加到40℃的级联。离开冲洗水浴的湿的中空纤维膜在连续的在线干燥步骤中被干燥。在一个可选的拉伸步骤之后，中空纤维以丝束的形式被收集到纺丝轮上。或者也可以形成手束。
实施例5
中空纤维膜的制备
聚合物溶液的制备是在50℃下将聚醚砜(Ultrason6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30和K85，BASF)，聚氨酯(DesmopanPU 9665DU，BayerMaterialScience AG)和蒸馏水溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中直到获得澄清的高粘度溶液。
在聚合物纺丝溶液中的不同组分的重量份数，PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665DU/H2O/NMP为14/3/5/2/3/73。得到的聚合物溶液的粘度为22,900mPa s。
将该温暖的溶液冷却到20℃并脱气。膜的形成是通过将溶液加热至50℃后再将溶液通过一个纺丝模具。56wt.％的水和44wt.％的NMP的水/NMP混合物用作钻孔流体。模具的温度为50℃。在40m/min的纺丝速度下形成中空纤维膜。离开模具的液体细丝进入具有环境温度的水浴。模具与沉淀水浴之间的距离长度为100cm。形成的中空纤维膜被引导通过一系列的水浴。然后湿的中空纤维膜被干燥并且具有216μm的内径和318μm的外径。该膜具有完全非对称的膜结构。膜的活性分离层处于内侧。活性分离层被定义为具有最小孔的层。该结构总体上表现出类似海绵的结构。内侧表面呈现非常光滑的孔。该膜被卷绕轮卷绕并按照下述的方法制成具有200纤维的手束。接下来将测量该膜的液体透过性(Lp值)。该膜表现出3.7×10-4cm3/(cm2 bar sec)的液体透过性。此外，还测量了肌红蛋白(在水溶液中)的筛析系数。在15分钟后得到的筛析系数为1.5％，而在60分钟后得到的筛析系数为1.1％。随后，再次测量膜的液体透过性(Lp值)，在37℃时为2.7×10-4cm3/(cm2 bar sec)。而且，使用氯化物，菊粉和维生素B12对膜的扩散透过性进行试验。在37℃时对氯化物，菊粉和维生素B12的扩散透过性分别为10.5×10-4cm/sec，3.7×10-4cm/sec和4.0×10-4cm/sec。
实施例6
辐照插件并准备用于细胞培养
在室温下，将空气覆盖的膜(氧气浓度没有加或减少)在传统的消毒袋中分别经受6.3和18.9小时的伽马辐照(分别为25和75kGy)。水或丙烯酸溶液覆盖的膜插件在含有约70ml溶液的塑料容器中经受伽马辐照。为了洗涤液体覆盖的膜插件，准备用于每种膜的盘，其中含有约300ml的常规的PBS介质(8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4溶于800ml的蒸馏水中，用HCl调节pH至7.4，加水到1升并在高压釜中消毒)。插件被以无菌的方式从容器中移出，在PBS盘中洗涤，并转移至一个6孔板上以便进一步冲洗。全部的插件类型都被转移到6孔板上后，在顶部和底部分别使用3ml和5ml的PBS冲洗5次。在每个冲洗步骤中，插件被温育至少10分钟以去除残留的药剂和在伽马辐照过程中产生的副产物。在完成冲洗工序后，插件被转移到新的孔板上用于细胞培养。3ml的MSC介质和5ml的介质被分别添加到孔中插件的顶部和底部。插件在MSC介质中温育并在孵化器中过夜。
纤连蛋白涂覆的膜(基于按照实施例2的膜)，用作对比，代表了一种例外。插件的洗涤和冲洗都按照上文所述的进行。将其中含有21μg纤连蛋白的1ml的PBS缓冲液添加到插件的顶部并在孵化器中孵化过夜。第二天，移除纤连蛋白溶液并使用PBS洗涤该插件一次，然后在细胞移植前使用细胞基质孵化过夜。使用未处理的膜插件(实施例2)和TCPS培养板分别作为阴性对照和阳性对照。
实施例7
中空纤维膜的辐照
待接受伽马-射线辐照的生物反应器(壳体内装中空纤维)由本发明的中空纤维形状的膜(参见实施例4到6)构成。用于壳体，集管，和封装件的材料是伽马稳定的并且由带有Fibasol blue的MakrolonDP1-1262(Bayer MaterialScience AG)(壳体/集管)和伽马稳定的聚氨酯(封装件)构成。生物反应器包含填充有环境空气，水(RO水)，0.001％的丙烯酸水溶液(0.01g的AA在11RO水中)或0.01％的丙烯酸水溶液(0.1g的AA在11RO水中)的PES/PVP/PA基的膜，并且经受25或75kGy的伽马辐照。使用水溶液或水填充反应器是通过从内毛细管(IC)侧以100ml/min进行冲洗并去除空气完成的。夹住IC外线，外毛细管(EC)侧被超滤液填充。重复该步骤直到没有空气残留在该生物反应器中。使用一Co-60源进行施加25或75kGy的伽马辐照，在室温下进行6.3和18.9小时。
实施例8
未处理的骨髓在平板膜上的培养
MSC介质(900ml的阿尔法-MEM介质(Lonza，Cat.No.BE12-169F)，100ml的FBS，10ml的青霉素/链霉素，和10ml的超谷氨酰胺(ultraglutamine)I；在用于细胞培养之前，将MSC介质加温至37℃)在插件膜上孵化过夜后被用插件顶部(2ml)和底部(4ml)的新鲜MSC介质替代。那些介质体积被用于全部的更进一步的步骤。未处理的骨髓体积如表I所示分别添加到每一个插件。通过摇振该盘使得骨髓均匀地分布在膜上。将插件置于孵化器中3天以使得MSC粘附。到第3天，将介质从培养插件的顶侧和底侧取出。用2ml的PBS冲洗膜两次，每次冲洗都在顶侧。将新鲜的MSC介质添加到顶侧和底侧。在第一生长阶段(即，从骨髓种植到第一次MSC分离的培养阶段)，插件顶侧和底侧的介质每2到3天进行更换直到第12或14天。在第12或14天，从4个插件的3个中，通过在每个插件使用500μl的胰蛋白酶(10分钟，37℃)将MSC分离。在每个插件使用1.5ml的MSC介质将胰蛋白酶灭活，MSC悬浮液被收集到无菌管中并收集样本，通过CASY计数器进行MSC计数。4个插件中的一个被固定并制备用于SEM。因此，使用添加了1ml的2％戊二醛溶液的PBS洗涤插件的顶侧并在4℃下存放过夜。随后，插件被使用蒸馏水洗涤三次，风干并接受SEM。在第二个试验中，不执行SEM。新鲜的介质在被孵化器中的气体预热并调节后，添加到同一插件的顶侧和底侧直到MSC被再植入。允许10,500MSCs/cm2再附着到同一个插件上过夜。在第二生长阶段，再附着的MSCs在膜上扩增额外的7天。MSC介质每2到3天进行更换。在第19或第21天，通过在10分钟，37℃的条件下使用胰蛋白酶将MSC从4个插件中的3个上收获。将MSCs再种植到TCPS上用作MSC形态和增殖潜力对照试验。因此，将收获的MSCs按5,000MSCs/cm2再种植到TCPS上用作形态对照试验并按500MSCs/cm2培养4或5天用作增殖对照试验。通过获取微观图片来记录形态和增殖潜力，第1天或第2天用于形态评价，第4天或第5天用于增殖潜力评价。
未处理的骨髓被种植到不同的基质上(表I)。TCPS或VTK-FN(纤连蛋白涂覆)和VTK(蒸汽消毒，未涂覆)分别被用作阴性和阳性对照试验。在12到14天的第一生长阶段之后，细胞被胰蛋白酶化并计数。相对于TCPS的各自的MSC数目在图1和2中以浅色条带表示。在第二生长阶段，MSC被按500MSCs/cm2的密度再植入到同样的插件上并在第二生长阶段扩增额外的10天。在7天的第二生长阶段后，对再植入的用于形态的(图3)和固定的用于SEM的MSC的数目(在图1和2中以黑色条带表示)进行测定。相对于作为标准的TCPS，MSC(n＝3)的数目表示在图1和2中，线条表示标准的TCPS水平。使用未处理的骨髓的试验进行两次。
表I：用于来自未处理骨髓的MSC培养的膜的类型和辐照条件概览
“n”表示对于每一个参数设置进行的测试次数。“AA”代表丙烯酸。“VTK”代表基于实施例2中使用的聚合物溶液的膜。“FN”代表纤连蛋白。AN69ST膜是一种基于聚丙烯腈的商业膜。
正如从图1到3中可以看出的那样，在第一生长阶段，MSC表现出在纤连蛋白涂覆的VTK膜上在第一生长期时的可比性，即，纤连蛋白涂覆的VTK膜不适用于再种植培养。在胰蛋白酶化后的纤连蛋白涂覆的VTK膜性能缺乏的原因被假设是由于胰蛋白酶导致的纤连蛋白的降解。在试验2(图2)中，纤连蛋白涂覆的VTK膜无论在第一生长还是在第二生长方面都不能发挥作用。在两个试验中，未涂覆的VTK膜均表现出非常弱的MSC生长。经过25kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件与试验1和2相比表现出有争议的结果；在图1中这种类型的膜在第一生长阶段的表现可与TCPS相媲美，然而在第二生长阶段则表现出MSC的显著下降，而该类型的膜在试验2中的表现则正相反。经过75kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件在两个生长阶段表现出的MSC的生长均可以与TCPS相媲美甚至更优。在伽马辐照过程中被水或具有不同浓度的丙烯酸水溶液覆盖的VTK膜得到了与被75kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件相似的结果。AN69ST被包括在试验1中并被证明是不适于MSC的培养。在第二生长阶段后再种植的MSC主要表现出纺锤形的形态和正常的增殖(参见图3)。
实施例9
预处理后的MSC在平板膜上的培养
插件顶侧和底侧的MSC介质在孵化过夜后被新鲜的介质从插件上替换下来。从对MSC施加标准烧瓶条件的烧瓶中胰蛋白酶化MSC(0.25％的胰蛋白酶，5分钟，37℃，振荡直到所有的细胞脱附并且通过加入介质使胰蛋白酶灭活)。使用CASY计数器对MSC计数。制备MSC悬浮液使其能够按500MSC/cm2种植在TCPS孔或插件中。将孔板和插件放入孵化器中使得MSC粘附。顶侧和底侧的介质每2到3天进行更换直到第7或9天(旨在在TCPS上达到～80％的融合)。在第7和/或9天，使用500μl的胰蛋白酶(10分钟，37℃)将MSC分离。然后使用1.5ml的MSC介质将胰蛋白酶灭活，MSC以细胞悬浮液的形式被收集到无菌管中。采集样品通过CASY计数器进行细胞计数。一个插件被固定并制备用于SEM。因此，使用PBS洗涤插件的顶侧一次然后添加1ml的2％戊二醛溶液并将全部东西在4℃下存放过夜。随后，插件被使用蒸馏水洗涤，风干并接受SEM。新鲜的MSC介质被添加到插件的顶侧(2ml)和底侧(4ml)。介质被孵化器中的气体预热并调节直到细胞的再植入。按500MSCs/cm2的再附着到同一个插件上在孵化器中过夜。再附着的MSC在膜上扩增额外的10或11天。MSC介质每2到3天进行更换。在第16或第21天，将MSC从三个插件上收获。将MSC再种植到TCPS上用作MSC形态和增殖潜力对照试验。因此，将收获的MSC按5,000MSCs/cm2再种植到TCPS上用作形态对照试验并按500MSCs/cm2再种植培养4或5天用作增殖对照试验。通过获取微观图片来记录形态和增殖潜力，第1天或第2天用于形态评价，第4天或第5天用于增殖潜力评价。表II给出了在这些试验中使用的全部类型的膜及改进与辐照条件的概览。
表II：用于预先选择的MSC培养的膜的类型和辐照条件概览
“n”表示对于每一个参数设置进行的测试次数。“AA”代表丙烯酸。“VTK”代表基于实施例2中使用的聚合物溶液的膜。“FN”代表纤连蛋白。
使用预先选择的MSC的试验进行两次，结果如图4(试验1)和图5(试验2)所示。在试验1和试验2的第一生长阶段，MSC表现出在纤连蛋白涂覆的VTK膜上的生长可与TCPS相媲美，然而在第二生长阶段则表现出显著下降，即，纤连蛋白涂覆的VTK膜不适用于试验1的再种植培养。在胰蛋白酶化后的纤连蛋白涂覆的VTK膜性能缺乏的原因被假设是由于胰蛋白酶导致的纤连蛋白降解。在两个试验中，未涂覆的VTK膜均表现出非常弱的MSC生长。经过25kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件仅在试验2中进行了测试并且其表现可与TCPS和被75kGy辐照后的全部的VTK膜相媲美。经过75kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件在两个生长阶段表现出的MSC的生长均可以与TCPS相媲美甚至在大多数情况下更优。在伽马辐照过程中被水或具有不同浓度的丙烯酸水溶液覆盖的VTK膜得到了与被75kGy辐照后的空气覆盖的VTK插件相似的结果。AN69ST插件被包括在试验2中并被证明是不适用于MSC的培养。在第二生长阶段后在常规的TCPS盘上再种植的MSC主要表现出纺锤形的形态和正常的增殖。
实施例11
伽马辐照之前蒸汽灭菌的影响
按照实施例10进行试验，其中相对于TCPS，测定粘附在膜表面的MSC的数目(％)。测定的细胞数目是针对TCPS和纤连蛋白涂覆的VTK膜以及在空气填充或水覆盖下使用25或75kGy辐照过的VTK膜进行的。进行三种设定条件的试验。在第一种设定条件的试验中，膜在制备出来后直接用伽马-射线辐照。在第二种设定条件的试验中，膜在分别经受伽马-射线处理之前使用蒸汽灭菌。正如从图6能够看出的那样，在伽马-射线辐照之前使用蒸汽灭菌的膜与没有进行蒸汽灭菌的膜相比较，其在MSC的附着方面表现更好。
在第三种设定条件的试验中，对附加的EtO灭菌步骤的影响进行研究。相对于在第一(11天)和第二(7天)生长阶段后的标准TCPS上生长的MSC的数目，对来自未处理的骨髓在75kGy辐照过并且使用W/O蒸汽和EtO灭菌过的膜上生长的MSC数目进行测定。正如从图7能够看出的那样，EtO灭菌并不会对膜的性能产生显著的不良影响。
实施例12
细胞的分化
为了评价在本发明的膜上培养的细胞的分化能力，进行脂肪形成和骨生成的分化测试以测定MSC的分化能力。
(A)脂肪形成
将MSC按大约10,000MSC/cm2的密度种植到一个24孔板中。在使用的三个孔中，一个如下文所述的用于将MSC分化成脂肪细胞，一个用于在标准MSC扩增介质(不诱导脂肪形成)中生长MSC并且另一个用作染色对照。使用标准的MSC扩增介质(900ml的阿尔法-MEM介质，100ml的FBS，10ml的青霉素/链霉素，和10ml的超谷酰胺I；在用于细胞培养之前，将MSC介质加温至37℃)使MSC生长到融合或满十天过度融合。使用脂肪形成诱导介质(在1ml的标准MSC介质中加入20μl的IBMX原液(55.55mg的IBMX溶解在10ml蒸馏水中，然后向溶液中加入20到40mg的碳酸钠)，1μl的地塞米松原液(19.62mg的地塞米松溶解在50ml的纯乙醇中)，1μl的胰岛素原液(10mg/ml)，和2μl的吲哚美辛(178.9的吲哚美辛溶解在10ml的纯乙醇中))诱导脂肪形成11天(第0天到第11天)。该介质每2到3天进行更换。使用3或5天(第12-14天或第12-16天)的脂肪形成维持介质(在1ml的标准MSC介质中加入1μl的胰岛素原液)并且每2-3天更换。使用标准PBS缓冲液冲洗细胞。在室温下使用甲醛溶液(～10％)至少4小时将细胞固定。然后，向每个孔中加入约0.5ml的油红O溶液(新鲜过滤-消毒的)，接着在室温下温育30分钟到2小时，用PBS冲洗细胞两次，接着用50％的乙醇冲洗。在室温下用Mayer’s苏木精溶液复染色5分钟，用自来水冲洗1分钟，反复三次，用甲醛溶液固定。图8显示了在伽马-射线辐照(75或25kGy，在丙烯酸或烯丙胺的存在下)的VTK膜上培养的细胞上成功的MSC脂肪形成。
(B)骨生成
将MSC按大约10,000MSC/cm2的密度种植到24孔板中。在使用的三个孔中，一个用于将MSC如下文所述分化成成骨细胞，一个用于在标准MSC扩增介质(不诱导骨生成)中生长MSC，另一个用作染色对照。使用标准的MSC介质使MSC生长到融合或满十天过度融合。该MSC介质被成骨分化介质(在1ml的标准MSC介质中加入100μl的甘油膦酸酯原液(2.16g的甘油膦酸酯溶解在100ml标准MSC介质中)，1μl的地塞米松原液，和1μl的抗坏血酸原液(0.145g的抗坏血酸溶解在10ml的基础培养基，阿尔法-MEM中))代替并且每3到4天更换。在2-3周后，在细胞内部和周围出现钙化沉着。在PBS中洗涤细胞。移除PBS并用10％的甲醛固定10分钟，然后用PBS洗涤一次，用去离子水洗涤两次。将细胞风干并在UV光下用硝酸银染色10分钟。在用去离子水洗涤2-3次后，用Mayer苏木精溶液将细胞复染色，然后用自来水洗涤1分钟，然后用去离子水洗涤两次。将细胞用10％的甲醛包埋。图9显示了在本发明的膜上生长的细胞的成功的骨生成。
实施例13
用于不同类型细胞扩增的适用性
为了评价本发明的伽马辐照膜对于培养不同类型细胞的适用性，对平板膜进行了示范性的测试。使用的膜如实施例10和11中所述并且被称为“VTK”膜。该膜分别在25kGy(空气覆盖)和75kGy(水覆盖)下进行辐照。该膜以短期培养的形式进行测试，由此与标准TCPS相比较来评价细胞的粘附(种植1天后)和细胞的增殖(再植入5天后)。使用的细胞是(a)NHDF，普通人真皮纤维细胞，(b)HepG2，人肝癌细胞系，(c)HK-2，人肾脏肾近端小管上皮细胞系，和(d)MDCK，MadinDarby犬肾上皮细胞系。在本发明的膜和TCPS上对细胞(a)到(d)进行测试。细胞按如下种植：(a)NHDF：5·103细胞/cm2于介质(DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素)中；(b)HepG2：5.6·104细胞/cm2于介质(RPMI+10％FBS+0.5％庆大霉素)中；(c)HK-2：104细胞/cm2于介质中(角化细胞SFM(Gibco，Cat#17005)+角化细胞SFM添加成分(Gibco，Cat#37000-015)+10μg/ml的Meronem+1％FBS+1％CaCl2)中；(d)MDCK：104细胞/cm2于介质(M199+10μg/ml的Meronem+10％FBS(加热灭活))中。在细胞种植后的1天(粘附)和5天(增殖)使用CASY计数器测定细胞的数目。图10到13表明了全部的细胞类型均能够在75kGy辐照过的膜上有效地扩增。该结果证明该膜至少与标准TCPS同样有效，尤其对于细胞的扩增。该结果表明使用更高剂量处理过的膜比更低剂量处理过的膜能够略好地适用于细胞培养。VTK25kGy膜对于HK-2细胞的表现不够有效(图12)，可能是由于在第一天后第一次移除细胞中的问题。
实施例14
来自于未处理的骨髓的MSC在伽马-射线辐照的中空纤维膜(生物反应器)上的扩增
在细胞扩增系统(CES)中的不同中空纤维生物反应器上对来自未处理的骨髓的MSC和预先选择的MSC进行扩增。被证明适用于预先选择的MSC的生物反应器被进一步地用未处理的骨髓的MSC进行测试。在始于同样的细胞种植密度的条件下，按照本发明的生物反应器的倍增时间与对照烧瓶(TCPS)的倍增时间进行比较。该倍增时间用作评价不同的膜/TCPS性能的方法。
预先选择的MSC：使用的MSC是预先选择的，冷藏的来自骨髓的MSC最多传代四次。MSC的预先选择是通过将骨髓衍生的MSC在传统的TCPS烧瓶中扩增至少两代来进行的。将大约2.8Mio的MSC装载到一个1.7m2的生物反应器中，相当于164MSC/cm2。当表面积小于1.7m2时，装载的MSC的数量成比例减少。培养周期为7天。
未处理的骨髓：将大约10-12ml的骨髓装载到一个1.7m2的生物反应器中。当表面积小于1.7m2时，装载的骨髓的体积成比例减少。培养周期为13天。
T75 TCPS烧瓶用作对照烧瓶。预先选择的MSC按照与生物反应器(164MSC/cm2)中同样的密度种植在烧瓶中。当使用未处理的骨髓启动时，是将234μl的骨髓种植到烧瓶中(3.12μl/cm2)并将12ml的骨髓装载到1.7m2的生物反应器中(0.71μl/cm2)。
用于本试验中的膜的类型如表III所汇总。该基于PES/PVP/PA的膜是按照实施例3中所述制备的。基于PES/PVP/PU的膜是按照实施例5中所述制备的。PAN的表达形式是指聚丙烯腈。
  序号   类型   处理   膜材料
  1   纤连蛋白涂覆的VTK   蒸汽   PES/PVP/PA
  2   AN69ST(表面处理过)   伽马-辐照   PAN/PEI
  3   AN69XS(表面未处理)   伽马-辐照   PAN
  4   0.5％的PU(未在线干燥)   伽马-辐照   PES /PVP/PU
  5   VTK空气填充25kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA
  6   VTK空气填充75kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA
  7   VTK水填充25kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA
  8   VTK水填充75kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA
  9   VTK 0.001％的AA 25kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA(AA)
  10   VTK 0.001％的AA 75kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA(AA)
  11   VTK 0.01％的AA 25kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA(AA)
  12   VTK 0.01％的AA 75kGy   伽马-辐照   PES/PVP/PA(AA)
表III：针对预先选择的MSC和未处理的骨髓的扩增进行测试的膜的类型概览。膜的结果与标准TCPS烧瓶进行对比。为便于对比，在本试验中包括了未用伽马-射线辐照过而用纤连蛋白(1)涂覆过的膜。
在第0天将骨髓种植到生物反应器和烧瓶中。在第2天将介质第一次更换并且随后在第4或第5天、第6或第7天、第8到第10天和第10到第12天再次更换。在第13天，收获细胞(胰蛋白酶)并对细胞计数。对细胞的活力及其表型和形态和/或增殖行为进行测试。
使用未处理的骨髓(CFU-F)时对细胞群落计数用于起始细胞数目的计算
78μl的未处理的骨髓种植到含有5ml的MSC介质的T25(TCPS)烧瓶中。在2到3天后使用PBS洗涤两次以去除未粘附的细胞，然后加入新鲜的MSC介质。每2到3天对介质进行更换。在第7天，对群落进行计数(10倍放大/显微镜)。
倍增时间和倍增时间比的计算
倍增时间(DT)是细胞数目翻倍需要的时间周期。MSC的DT和DT比计算如下：
N是在指示的培养周期之后获得的MSC的数目，N0是种植的MSC的数目。
DT(小时)＝培养周期(小时)/倍增数。
DT比＝生物反应器中的细胞DT/对照烧瓶中细胞的DT
所有的选定的伽马-辐照的生物反应器使用未处理的骨髓时均表现出可与TCPS和VTK-FN生物反应器相媲美的性能。从28到34小时的倍增时间仅仅略高于对照烧瓶(23到25小时)。所以，倍增时间比的范围为从1.1到1.5(图14)。与该伽马-辐照的生物反应器和该VTK-FN生物反应器相比较，0.5％的PU生物反应器表现出略慢的细胞生长。
通过使用在每个FACS管中50,000个细胞的FACS分析来对MSC介质中收获的细胞的活力(图15)进行测试。在室温下于暗处用碘化丙啶溶液(最终浓度1μg/ml)将一个样品染色10到15分钟。另一个未染色的样品用作参考。收获细胞的活力为88到99.5％。
在细胞的胰蛋白酶化之后对收获细胞的表型进行测试(图16)。将1百万个细胞再悬浮于5,000μl的封闭缓冲液(细胞洗液+10％的人血清)中并在4℃下孵化30分钟。按每个50μl的量分布到10个管中，并加入抗体(一个未染色的(无抗体)：CD34-PE-2μl，CD45-PE-2μl，CD73-PE-2μl，mIgG1-PE 1μl(CD34、CD45、CD73的同种型对照)，HLA-DR、DP、DQ-FITC-2μl，mIgG2a-FITC-1μl(HLA-DR的同种型对照)，CD90-FITC-1μl，CD105-FITC-1μl，mIgG1-FITC-2μl(CD90、CD105的同种型对照)。该混合物被充分混合后在室温下储存于暗处20分钟。然后加入1ml的FACS缓冲液(细胞洗液+2％的PBS(热灭活的))并涡旋混合，然后在400g下离心3分钟。去除该缓冲液并涡旋该块料。然后加入400μl的固定缓冲液(用水按1∶10稀释)并涡旋混合。将该细胞在4℃下存储并在4天内分析。
在以75kGy伽马-辐照的水填充的生物反应器中扩增的细胞在CD45和HLA-DR表观出比较高的值(分别有18和16.7％的细胞是阳性的)。从所有其它的生物反应器中收获的细胞表现出MSC的预期的表型。
对于扩增后TCPS上的再附着的检查表明了大部分的纺锤形细胞在再植入后表现出正常的生长行为(未展示数据)。
实施例15
辐照剂量的影响
为研究辐照剂量对膜性质的影响，使用预先选择的MSC重复进行实施例14的试验，使用的VTK膜为在空气填充的情况下使用在12.5kGy到125kGy之间的剂量的伽马-射线辐照过的，在第一生长阶段(10天)和第二生长阶段(11天)后相对于标准TCPS上的MSC生长数目，来测定MSC生长的数目。结果如图17所示。

Claims (14)

1.一种用于培养细胞的膜，包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮，在浓度为4到100％体积百分比的氧气存在下其被空气覆盖并使用从70到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束对其进行辐照。
2.如权利要求1中的膜，进一步包括聚氨酯。
3.如权利要求1或2中的膜，进一步包括聚酰胺。
4.如权利要求1中的膜，其中所述膜为中空纤维膜。
5.如权利要求1中的膜，其中所述膜为平板膜。
6.制备如权利要求1到5中任一项的膜的方法，包括
(a)用空气覆盖所述膜；
(b)在浓度为4到100％体积百分比的氧气存在下使用从70到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束对膜进行辐照。
7.细胞培养装置，其包括膜，在浓度为4到100％体积百分比的氧气存在下使用从12.5到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束对膜进行辐照，所述膜包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮，所述膜处于干的状态。
8.用于体液的体外处理的装置，其包括细胞和膜，在所述膜的腔表面或外表面所述细胞形成融合层，其中在浓度为4到100％体积百分比的氧气存在下使用从12.5到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束对膜进行辐照，所述膜包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮，所述膜处于干的状态。
9.一种膜在细胞培养中的应用，所述膜包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮，其中在浓度为4到100％体积百分比的氧气存在下使用从12.5到175kGy剂量的伽马-或贝塔-射线或电子束对膜进行辐照，所述膜处于干的状态。
10.如权利要求9中的应用，其中所述细胞是贴壁细胞。
11.如权利要求10中的应用，其中所述细胞是间充质干细胞。
12.如权利要求10中的应用，其中所述细胞是肝细胞。
13.如权利要求10中的应用，其中所述细胞是肾细胞。
14.如权利要求10中的应用，其中所述细胞是上皮细胞。
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