JP2020531049A - 工学的操作された血管組織の作製において気泡を除去するための信頼性が高く再現可能な工業化プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
(1)足場の内腔に内皮細胞を播種して、前記細胞を接着
(2)細胞が受ける機械的刺激(流体の流れなど)に対する成長/増殖および細胞組織化
(3)機能的な内皮細胞の1つまたは複数の層の産生
- 足場(21)の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場(21)を生じさせるための方法であって、前記播種された足場(21)がバイオリアクタ(11)内にあって、播種されたバイオリアクタ(図3、11)-足場(21)システムを生じさせ、
- バイオリアクタ(11)の上流に配置されたTコネクタ(図10、T2)に取り付けられた容器(図10、91)内の新しい培地および内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態の前記内皮細胞培養物を回転コネクタ(図10、CR1)によって放出するステップと、それに続いて、
- 前記細胞懸濁物が気泡を発生しないでTコネクタ(T2)内を下り、足場(21)の内腔内にある気泡をバイオリアクタ(11)の下流に配置されたTコネクタ(図10、T3)の開口に向けて押して出すことができる流速になるように、前記内皮細胞培養物を、バイオリアクタチャンバ(11)内の足場(21)の内腔に連続流で放出するステップとを含む播種方法と、
引き続いて、
- 30℃から45℃の間、好ましくは37℃の温度の新しい培地で、前記播種された足場(21)の内腔にある内皮細胞を灌流する方法であって、前記播種されたバイオリアクタ(11)-足場(21)システムに灌流回路(図6、51、52、53、54、55、ならびに51〜56または51〜57およびBT)を接続することによって実現され、
- 灌流回路にある、気泡の除去のための要素(71またはBT)を前記新しい培地で部分的に満たすステップであって、泡の除去のための前記要素(71またはBT)が、チャンバ、前記チャンバを閉じるキャップ、入口通路(211)、および出口通路(212)を備え、気泡の除去のための前記要素(71またはBT)が容積を有し、前記容積の第1の部分が前記新しい培地で満たされ、前記容積の第2の部分が空気で満たされ、前記容積の前記第2の部分が、前記入口通路(211)および前記出口通路(212)を通って流れる前記新しい培地内にある気泡を捕捉する機能を有する、ステップ
を含む灌流方法とを適用する。
バイオリアクタ-足場システムのために一様に内皮細胞を播種するための方法は、無菌条件下で順次実施される複数のステップを含む。
本発明による播種方法の効率を示すために、以下の分析が実施された。
本接続方法は、播種((1)項において上記した実施形態による、足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法)後、内皮細胞の接着の24時間後の以下の一連のステップに基づく。
a.管53を(灌流回路の管53と管52との間に配置された)TコネクタT1の側方端に接続するコネクタの近くに配置されたクランプで灌流回路の管53を閉じて、それ(図7、52)をねじって外す。
b.灌流回路の管53をキャップで閉じることが好ましい。この操作は、灌流回路の管53が空になるのを防ぐ。
c.(灌流回路の管53と管52との間に配置された)TコネクタT1の側方端の蓋をして、その上端を開ける。
d.泡トラップのチャンバの入口通路を開けて、それをTコネクタT1の鉛直方向の上端の通路に接続する。
e.泡トラップの出口通路を開けて、それを灌流回路の管53に接続する。管をねじらないように注意のこと。
f.泡トラップを鉛直位置に保持する。
g.灌流回路の管53が泡トラップのチャンバに接続されるとすぐに、管53からクランプ171を取り外す。ポンプを作動させて、バイオリアクタの上流のTコネクタT2の上端のキャップを開けて、プロセス中に管53に形成されたかもしれないすべての気泡を除去して、気泡が足場に達することを防ぐ。灌流回路とバイオリアクタ-足場システムよりなる組み立てられたシステムにポンプによって加えられた蠕動が足場の灌流を可能にする。
h.これを確認した後、バイオリアクタの上流のTコネクタT2をそのキャップで閉じる。
本接続方法は、播種((1)項において上記した実施形態による、足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法)後、内皮細胞の接着の24時間後の以下の一連のステップに基づく。
灌流回路をバイオリアクタ-足場システムに接続するための方法の評価に対する実験的分析は、足場、好ましくは管状足場における細胞培養物のための播種方法の評価に適用されたものと同じである。
- 足場(図2、21)の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場を生じさせるための方法であって、前記播種された足場がバイオリアクタ(図4、11)内にあって、播種されたバイオリアクタ-足場システムを生じさせる、方法と、その後に、
- 前記播種された足場の内腔にある内皮細胞を灌流するための方法であって、灌流回路(図6、51、52、53、54、55、および56)を前記播種されたバイオリアクタ-足場システムに接続することにある、灌流方法と
を含むプロセス。
- 足場(21)、好ましくは電界紡糸絹フィブロインの管状足場を足場支持部(図1、13、13a、13b)の取付部に取り付けて、足場(21)を有する前記足場支持部(13)をバイオリアクタのチャンバ(11)内に固定してバイオリアクタ(図4、11)-足場(図4、21)システムを生じさせるステップと、
- バイオリアクタチャンバ(11)内の前記足場支持部(13)に取り付けられた前記足場(21)の内腔に新しい培地を注入するステップと、
- すでに前記培地を注入された、足場(21)を有する前記足場支持部(13)があるバイオリアクタチャンバ(11)内に前記新しい培地を加えるステップと、
- 20℃から30℃の間、好ましくは25℃の温度で、好ましくは1時間から18時間の間の時間、すでに前記培地を注入された、足場(21)の内腔内、および足場(21)を有する前記足場支持部(13)があるバイオリアクタチャンバ(11)内に前記培地を入れたままにするステップと、
- 足場(21)の内腔の内部、およびバイオリアクタチャンバの内部から培地を取り除くステップと、
- バイオリアクタ(11)の上流に配置されたコネクタ要素(T2)に取り付けられたシリンジタイプの容器(図10、91)内の前記新しい培地、およびHUVECタイプの内皮細胞よりなる細胞懸濁物を要素(CR1)によって放出するステップであって、前記細胞懸濁物が気泡を発生しないでコネクタ(T2)内を下り、足場(21)の内腔内にあるいかなる気泡もバイオリアクタ(11)の下流に配置されたコネクタ(T3)の開口に向けて押してシステムから出すことができる流速になるように、前記細胞懸濁物が、バイオリアクタ(11)のチャンバ内にある足場(21)の内腔に連続流で放出される、ステップと、
- 前記細胞懸濁物が入っている、足場(21)を有する前記足場支持部(13)があるバイオリアクタチャンバ(11)内に前記新しい培地を加えるステップと、
- 好ましくは、5%CO2の存在下、37℃で24時間の間、バイオリアクタチャンバ(11)内に固定された足場(21)をインキュベートするステップと
を含むプロセス。
- 管(図5、51、52、53、54、55、および56)を備える灌流閉回路(図5)を用意するステップと、
- コネクタ(C)に近い位置にあるクランプタイプの閉止要素(図17、171)で灌流回路の管(54)を塞ぐステップと、
- 灌流回路の管53と管54(図5、図17)との間に配置されたコネクタ(C)をねじって外すステップと、
- バイオリアクタの上流のコネクタ(T2)の側方通路のその開いた側方端に灌流回路の管(53)をねじって取り付けるステップ(図18)と、
- バイオリアクタの下流のコネクタ(T3)を開けて、側方開口のキャップをねじって外すステップ(図19a)と、
- 無菌状態を維持しながら、灌流回路の管(54)をバイオリアクタの下流のコネクタ(T3)の側方開口に接続して(図19b)、クランプタイプの閉止要素(図20、171)を取り外すステップと
を含むプロセス。
13 足場支持部
13a 足場支持部
13b 足場支持部
14a 足場支持部
21 足場
41 バイオリアクタチャンバの上流の入口
42 バイオリアクタチャンバの下流開口
51 管
52 管
53 管
54 管
55 蠕動ポンプ
56 貯槽
57 蠕動ポンプ
71 気泡除去要素
72 キャップ
91 容器
101 ピペット
102 プランジャ
171 閉止要素、クランプ
172 クランプ
211 入口通路
212 出口通路
BT 気泡除去要素
C コネクタ
CR1 回転コネクタ
CR2 回転コネクタ
T1 Tコネクタ
T2 Tコネクタ
T3 Tコネクタ
Claims (9)
- 医療製品または獣医学的製品を試験するための、工学的操作された血管組織または構築物の作製、好ましくは、コンフルエントな細胞の単層を有する機能的で連続した内皮で被覆された内腔を有する足場(21)の作製のためのプロセスであって、
- 足場(21)の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場(21)を生じさせるための方法であって、前記播種された足場(21)がバイオリアクタ(11)内にあって、播種されたバイオリアクタ(11)-足場(21)システムを生じさせ、
- 前記バイオリアクタ(11)の上流に配置されたTコネクタ(T2)に取り付けられた容器(91)内の新しい培地および内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態の前記内皮細胞培養物を回転コネクタ(CR1)によって放出するステップと、それに続いて、
- 前記細胞懸濁物が気泡を発生しないで前記Tコネクタ(T2)内を下り、前記足場(21)の前記内腔内にある気泡を前記バイオリアクタ(11)の下流に配置されたTコネクタ(T3)の開口に向けて押して出すことができる流速になるように、前記内皮細胞培養物を、前記バイオリアクタ(11)のチャンバ内の前記足場(21)の前記内腔に連続流で放出するステップと
を含む播種方法と、
引き続いて、
- 30℃から45℃の間、好ましくは37℃の温度の新しい培地で、前記播種された足場(21)の前記内腔にある前記内皮細胞を灌流する方法であって、前記播種されたバイオリアクタ(11)-足場(21)システムに灌流回路(51〜56)または(51〜57およびBT)を接続することによって実現され、
- 前記灌流回路にある、前記気泡の除去のための要素(71)または(BT)を前記新しい培地で部分的に満たすステップであって、前記気泡の除去のための前記要素(71)または(BT)が、チャンバ、前記チャンバを閉じるキャップ、入口通路(211)、および出口通路(212)を備え、前記気泡の除去のための前記要素(71またはBT)が容積を有し、前記容積の第1の部分が前記新しい培地で満たされ、前記容積の第2の部分が空気で満たされ、前記容積の前記第2の部分が、前記入口通路(211)および前記出口通路(212)を通って流れる前記新しい培地内にある気泡を捕捉する機能を有する、ステップ
を含む灌流方法と
を適用するプロセス。 - 前記足場(21)の前記内腔に前記内皮細胞培養物を播種する前記方法が、
- 前記足場(21)、好ましくは電界紡糸絹フィブロインの管状足場を足場支持部(13、13a、13b)の取付部に取り付けて、前記足場(21)を有する前記足場支持部(13、13a、13b)を前記バイオリアクタチャンバ(11)内に固定してバイオリアクタ(11)-足場(21)システムを生じさせるステップと、
それに続いて、
- 前記バイオリアクタチャンバ(11)内の前記足場支持部(13)に留められた前記足場(21)の前記内腔に前記新しい培地を注入するステップと、それに続いて、
- 前記培地を注入された、前記足場(21)を有する前記足場支持部(13、13a、13b)がある前記バイオリアクタチャンバ(11)内に前記新しい培地を加えるステップと、それに続いて、
- 20℃から30℃の間、好ましくは25℃の温度で、1時間から18時間の間の時間、前記培地を注入された、前記足場(21)の前記内腔内、および前記足場(21)を有する前記足場支持部(13)がある前記バイオリアクタチャンバ(11)内に前記培地を入れたままにするステップと、それに続いて、
- 前記足場(21)の前記内腔の内部、および前記バイオリアクタチャンバ(11)の内部から前記培地を取り除くステップと、それに続いて、
- 請求項1に記載の前記容器(91)、好ましくはシリンジである前記容器(91)内の前記内皮細胞培養物を放出するステップと、それに続いて、
- 前記細胞懸濁物を請求項1に記載の前記足場(21)の前記内腔に放出するステップと、それに続いて、
- 内腔に前記細胞懸濁物が入っている、前記播種された足場(21)を有する前記足場支持部(13)がある前記バイオリアクタチャンバ(11)内に前記新しい培地を加えるステップと、それに続いて、
- 好ましくは、5%CO2の存在下、37℃で24時間の間、前記バイオリアクタチャンバ(11)内に固定された前記足場(21)をインキュベートするステップと
を含む、請求項1に記載のプロセス。 - 前記播種された足場(21)の前記内腔内の前記内皮細胞の前記灌流方法が、
- 管(51)、(52)、(53)、(54)、および任意選択的に管(55)を備える灌流閉回路を用意するステップと、
- コネクタ(C)の近くに配置された閉止要素(171)で前記灌流回路の前記管(54)または(55)を塞ぐステップであって、好ましくは、前記閉止要素がクランプまたは類似の装置である、ステップと、それに続いて、
- 前記灌流回路の前記管(53)または前記管(54)と前記管(54)または前記管(55)との間に配置された前記コネクタ(C)をねじって外すステップと、
- 前記バイオリアクタ(11)の上流の前記Tコネクタ(T2)の側方通路のその開いた側方端に前記灌流回路の前記管(53)または(54)をねじって取り付けるステップと、それに続いて、
- 前記バイオリアクタ(11)の下流の前記Tコネクタ(T3)を開けて、前記Tコネクタ(T3)の側方開口のキャップをねじって外すステップと、それに続いて、
- 前記灌流回路の前記管(54)または(55)を前記バイオリアクタ(11)の下流に配置された前記Tコネクタ(T3)の前記側方開口に接続して、前記閉止要素(171)を取り外すステップと、
- 前記灌流回路の前記管(53)とポンプループ配管の前記管(52)との間に前記気泡の除去のための前記要素(71)を挿入するステップと
を含む、請求項1または2に記載のプロセス。 - 前記気泡の除去のための前記要素(71)または(BT)が泡トラップまたは類似の装置である、請求項1から3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記足場(21)、好ましくは管状足場が、合成または天然由来のポリマーの足場から選ばれ、前記ポリマーの足場が、単一ポリマーまたはコポリマー、好ましくは、電界紡糸絹フィブロインあるいはポリグリコール酸/ポリ乳酸(PGA/PLA)またはポリグリコール酸/ポリカプロラクトン二酸(PGA/PCL)のコポリマーから形成された、請求項1から4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記内皮細胞が、血管組織の内皮を構成する細胞、好ましくは、HAOEC(ヒト大動脈内皮細胞)、HCAEC(ヒト冠状動脈内皮細胞)、HMEVEC(ヒト皮膚微小血管内皮細胞)、またはHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)の中から選択された、請求項1から5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記培地が、ウシ胎仔血清(2%)、アデニン(0.2μg/ml)、メタバナジン酸アンモニウム(0.0006μg/ml)、アムホテリシンB(0.3μg/ml)、塩化カルシウム2H2O(300μg/ml)、塩酸コリン(20μg/ml)、硫酸銅5H2O(0.002μg/ml)、チオクト酸DL-6,8(0.003μg/ml)、ホリン酸(カルシウム)(0.6μg/ml)、ヘパリン(4μg/ml)、ヒドロコルチゾン(2μg/ml)、L-アスパラギン酸(15μg/ml)、L-システイン(30μg/ml)、L-チロシン(20μg/ml)、硫酸第一マンガン一水和物(0.0002μg/ml)、モリブデン酸アンモニウム4H2O(0.004μg/ml)、ニコチンアミド(8μg/ml)、塩化ニッケル6H2O(0.0001μg/ml)、ペニシリン(60μg/ml)、フェノールレッドナトリウム塩(15μg/ml)、塩化カリウム(300μg/ml)、プトレシン二塩酸塩(0.0002μg/ml)、ピリドキシン塩酸塩(3μg/ml)、メタケイ酸ナトリウム9H2O(3μg/ml)、硫酸ナトリウム7H2O(200μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(0.01μg/ml)、ストレプトマイシン硫酸塩(100μg/ml)、塩酸チアミン(4μg/ml)、および硫酸亜鉛7H2O(0.0003μg/ml)を含む、好ましくは37℃に加熱されたEndothelial Growth Mediumである、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた、コンフルエントな細胞の単層を有する連続した機能的な内皮で被覆された内腔を有する足場(21)。
- 心血管および末梢血管領域、好ましくは、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、メッシュ、またはフィルタに使用される、ヒトに使用するための医療製品、および動物に使用するための獣医学的製品のインビトロ前臨床試験または臨床試験を実施する際の、請求項8に記載の足場(21)の使用。
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