JP2021533738A - 機能不全血管の挙動のインビトロシミュレーションのためのモデル - Google Patents

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Abstract

本発明は、医療デバイス及び薬物を、それらを人間に対して使用する前に、それらの有効性及び安全性を検証する目的で試験するための器具としての、例えば、動脈瘤、狭窄症又は硬化症プラークの影響を受けた血管などの、機能不全ヒト血管の挙動のインビトロシミュレーションのためのモデルについて言及する。具体的には、本発明は、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態を含む群の中、又は、代替的に、これらからなる群から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の同じ血管構造をシミュレーションする、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の血管構造のインビトロモデルについて言及する。さらに、本発明は、人体使用のための医薬品及び動物使用のための獣医製品のインビトロ試験用に、人工血管組織を製造するために気泡を除去するための、信頼できる再現可能な産業化プロセスにも言及する。

Description

本発明は、医療デバイス及び薬物を、それらを人間に対して使用する前に、それらの有効性及び安全性を検証する目的で試験するための器具としての、例えば、動脈瘤、狭窄症又は硬化症プラークの影響を受けた血管などの、機能不全ヒト血管の挙動のインビトロシミュレーションのためのモデルについて言及する。具体的には、本発明は、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態を含む群の中、又は、代替的に、これらからなる群から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の血管構造をシミュレーションする、血管構造、好ましくは、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の合成血管構造のインビトロモデルについて言及する。さらに、本発明は、人体使用のための医薬品及び動物使用のための獣医製品のインビトロ試験用に、人工血管組織を製造するために気泡を除去するための、信頼できる再現可能な産業化プロセスにも言及する。
医薬品の開発には、長期の繊細なプロセスを伴うことが知られている。基本的に、医薬品又は獣医製品の開発プロセスにおいては、薬物であれ、医療デバイスであれ、その製品を人間又は動物に使用する前に、生物学的な安全性と医薬品の効率との両方に関連する観点を評価し、その使用に関連する潜在的な問題を予告するように、その製品が接触する組織に対する影響のタイプを決定することができることが重要である。
この文脈において、医薬品の生物学的な安全性及び効率の評価は、広範囲で複雑であり、一方で、1つのみの構成材料の組織との相互作用の評価は、全体として、かつ、使用条件をできる限り誠実に再現することができる文脈において評価されなければならない医薬品又は獣医製品の全体的な計画から分離されたものとして考慮することはできない。
今日、生物学的な安全性、及び医薬品又は獣医製品の効率の評価は、インビトロ試験、エクスビボ試験、及び最終的な使用条件に関して著しい相違を有する動物モデルに基づいている。特に、動物モデルは、人間に対する結果の妥当性の転移を複雑にする著しい生理学的な相違を有する。そのような相違は、心臓血管及び末梢血管領域、例えば、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯及びネットなどにおいてその使用を提供する、人間に使用する医薬品又は動物に使用する獣医製品を評価する場合に、より一層観察可能である。
残念ながら、生物学的な安全性及び効率を確立することができるように、人間に使用する医薬品又は動物に使用する獣医製品の、血管組織との、及び血液との相互作用の評価は極めて重要であり、現在使用されているモデルは、解剖学的/構造的双方において、及び血液組成に関して、主要な限界及び欠点を明らかにしている。
さらに、動物に対する試験は、生物医学的試験に動物を使用することが道義的に容認されると考え得るのかどうかという問題をめぐる激しく物議を醸す議論の中心となってきた。この問題は、遡ること1959年における3R原理につながっており、また、この問題は、議論において、及び国際的な研究プログラムにおいて、依然として熱心に議論される時事問題のままである。3R原理は、3つの重要な概念:代替、削減及び改善を指す。3R原理は、生物医学的産業における研究が、動物モデルを代替的モデルに代替すること又は置換すること、所与の実験プロトコールにおいて使用される動物の数をできる限り減少させること、動物がさらされる実験条件を改善すること、すなわち改良することを、最大限の努力を払って目指すべきであると論じるものである。
血管組織エンジニアリング産業は、内皮細胞（EC）から主になる連続的（すなわち、コンフルエント細胞の単層を有する）で機能的な内皮を製造することが可能であることが極めて重要であると示している。
連続的で機能的な内皮の製造は、（スキャフォールドと細胞とからなる）組織工学的構造物が、移植された際に血栓症及び狭窄症を防止することを含めて、スキャフォールド内皮化を促進し、当該組織工学的構造物の適切な効率を保証することに向けて、極めて重要な要因である。
血管内皮又は人工血管構造物/組織のインビトロ生成は、要約すれば、下記のステップを提供する。
（1）スキャフォールドの内腔内に内皮細胞を播種すること、及びその後の内皮細胞の付着、
（2）細胞がさらされる機械的刺激（例えば流体の流れなど）に応じた細胞成長/増殖及び組織化、ならびに
（3）機能的な内皮細胞の1つ又は複数の層の生成すること。
播種ステップは極めて重要であるので、大学レベルにおける多くの研究グループが、スキャフォールドの内腔内に内皮細胞を均一に播種し、播種有効性を増強するための様々な技法を生み出す過去数十年間にわたる研究に投資してきた。しかしながら、達成された結果は、完全に満足のいくものではなかった。
静的播種及び動的播種は現在、主な内皮細胞播種方法を代表するものである。最も単純な静的方法は、スキャフォールドの内腔表面に細胞懸濁液を直接滴下することと、その後のペトリ皿上での短い培養ステップとから構成される。この方法は、操作者に大きく依存し、均一な内皮層を得ることの困難さによって複雑になる。
回転、真空、静電気力又は磁力に大きく基づいて、動的な方法は、細胞播種の有効性、均一性及び付着をむしろ高める。これらの動的原理のうちのいくつかは、灌流バイオリアクターに直接転移し、組み合わせることができ、スキャフォールドの取扱いにおける低減を可能にする。この場合において、スキャフォールドは、バイオリアクターチャンバ内に収容されると、すぐに播種されることが可能である。
他の研究グループは、内皮細胞懸濁液を注入した後に、シリンジポンプを使用した細胞懸濁液の連続注入による、又は蠕動ポンプを使用して成長媒体が播種されたスキャフォールドの内腔の連続的な灌流による、動的播種方法を代わりに使用する。これらの方法は、注射器の体積だけでなく灌流管の体積も満たす必要に起因して、滴下/回転播種方法に対して、より多くの体積の細胞懸濁液の必要とし、コスト低減（成長細胞及び媒体）に関する考え得る限界を見せる。
前述した技法に対して全く異なる技法は、スキャフォールドの内腔内に細胞懸濁液を滴らせることに基づく。この場合において、主な欠点は、細胞の初期付着性が低いこと、及び、方法が操作者に大きく依存するとすれば、方法の再現性が低いことにある。
さらに、主に管状のスキャフォールドの灌流に必要とされる灌流回路（灌流方法）をバイオリアクタースキャフォールドシステムに接続するための方法の選択は、実験セットアップに適合していなければならない。
上述された、播種し、灌流回路（灌流方法）を接続するための方法に関する状況を考慮すると、相当な限界及び欠点が依然として存在している。
したがって、その目的が高度な前臨床試験及び臨床試験に着目することである、GLP（優良試験所規範）認証を受けた組織工学研究所に対する前記処理の適用可能性を特に考慮すると、播種し、灌流回路（灌流方法）を、再現可能であり、信頼でき、効果的なバイオリアクタースキャフォールドシステムに接続するための方法を含むプロセスを提供する必要が明らかに生じる。
単純で、迅速で、効果的で、操作者から独立しており、明確に定義され、高度に再現可能で、信頼できる、連続的で（すなわち、コンフルエント細胞の単層を有する）機能的な内皮を有する人工血管組織/構造物の製造のためのプロセスであって、（1）スキャフォールド内の気泡の除去により、内皮細胞の均質性及び均一な付着を保証する、スキャフォールドの内腔内に細胞、主に内皮細胞を播種する方法と、（2）無菌状態を保証し、灌流回路とバイオリアクタースキャフォールドシステムとからなる組み立てられたシステム内の気泡の欠如を維持することができる、灌流回路をバイオリアクタースキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法とを含む、プロセスを開発する必要がある。
臨床前試験及び臨床試験を行うために実験用モルモットを使用しないように、高度な臨床前試験及び臨床試験を行うための連続的で機能的な内皮を備えるインビトロ人工血管組織/構造物を開発することができる必要も生じる。したがって、前記インビトロ人工血管組織/構造物の産業化のために、信頼でき、効果的で、再現可能な手順の必要が生じる。
上記で観察されたように、例えば、医療デバイス及び薬物などの医薬品を開発し、承認するためのプロセスは、人間に対して臨床試験を行う前に、動物に対して、インビトロ、エクスビボ、及びインビボにおいて行われるべき多数の前臨床試験が行われることを通常は必要とする。動物試験は、医薬品の試験のためのインビボモデルを提示するにもかかわらず、解剖学的構造、生理学及び血液組成物は、人間のものとは大幅に異なり、動物モデル上で達成される結果は、人体試験において達成される結果とは大幅に異なり得る。
さらに、技術的に複雑なことに加えて、動物モデルを使用して疾患（例えば、血管障害、動脈瘤又は狭窄症など）を引き起こすことは、広く倫理的に許されないことである。したがって、動物に対するインビボ試験は、医薬品が所与の疾患の治療において効果的であるかどうかを検証するために行われ得ない。動物に対するインビボ試験を最小限にすることに向けた科学的意思及びポリシーを確認するために、1987年以来、3R（代替、削減、改善）リサーチ財団は、動物モデルの代替となる方法の開発を促進しており、実験動物の数及び動物に与えられる苦痛を最小限に低減する目的で、「技術的な」要件を満たすために代替方法がないときのみの動物試験について公衆及び科学界の中での意識を生み出してきた。動物試験の代替となる方法は、動物をより責任を持って扱うことに関する倫理的な観点からだけでなく、とりわけ、信頼でき、再現可能であり、「人間」環境を極限までシミュレーションすることを可能にするモデルを開発する可能性に関しても、著しい進歩を表す。医薬品のいくつかの特性の予備分析のためのコンピューター化されたシミュレーション及びインビトロ細胞培養は、この目的のために近年生み出されてきた。
3R原理に従って、及び動物モデルの解剖学的/生理学的制限を克服する目的で、疾患（例えば、狭窄症、動脈瘤）及び「特別な」血管構造を、人間におけるその使用に先立って、医療デバイス及び薬物のための試験プラットフォームとして再現することができる、機能不全人工血管モデルを有することは有益であろう。人間の解剖学的構造及びインビボ環境を標準化された手法で複製することができるインビトロシステムの使用は、新しい医薬品の研究開発を加速することだけではなく、動物モデルに対する試験製品の安全性に関して、及び有効性に関して、より信頼できる応答を得ることも可能にするであろう。
本出願人は、前述のニーズを満たした。
本発明の一目的を形成するものは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍若しくは心筋症の形態を含む群の中から、又は、代替的に、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍若しくは心筋症の形態からなる群の中から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の血管構造をシミュレーションする、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の血管構造のインビトロモデルである。
さらに、本発明の一目的を形成するものは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態を含む群の中、又は、代替的に、これらからなる群から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の同じ血管構造をシミュレーションする、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の血管構造のインビトロモデルであって、細胞付着及び成長を促進することができる1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体（「スキャフォールド」）を含み、又は、代替的に、この1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体からなり、前記スキャフォールドには、スキャフォールドの内腔を覆い、コンフルエント細胞の単層を有する内皮を構成する内皮細胞が播種され、その管状構造に変形又は欠陥が設けられている、インビトロモデルである。
好ましくは、前記インビトロモデルは、中心循環系又は末梢循環系の血管又は弁の中から選択された血管構造、好ましくは、動脈、静脈、毛細管、大動脈弁又は僧帽弁を有する。好ましくは、前記インビトロモデルは、機能不全血管モデルである。好ましくは、前記血管構造は、合成血管構造である。好ましくは、前記スキャフォールドは、電界紡糸絹フィブロイン、ポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）のコポリマー、又はポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーからなる。好ましくは、前記インビトロモデルは、内皮細胞、及び任意選択で筋細胞が播種された1つもしくは複数のスキャフォールドを備え、又は、代替的に、この1つ又は複数のスキャフォールドからなる。好ましくは、管状構造の前記変形又は前記欠陥は、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、膨脹、又はそれらの組合せを含む。
本発明の一目的を形成するものは、医療デバイス又は薬物を、人間又は動物に対するそのインビボ使用に先立って、その有効性及び安全性を検証する目的で、試験する方法であって、以下:
- 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態に起因した、損傷又は変形又は劣化をシミュレーションするのに適した、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状のスキャフォールドを準備するステップ、
- 播種された内皮細胞（播種方法）の連続的で均質な層を取得するために、前記スキャフォールドの内部内腔の少なくとも一部に内皮細胞株を播種するステップであって、任意選択で、前記スキャフォールドの外面の少なくとも一部に筋細胞株を播種する、ステップ、
- 前記インビトロモデルを取得するために、内皮細胞の連続的で均一な層を取得するまで、前記内皮細胞、及び任意選択で前記筋細胞の成長を促進するステップ、
- 試験対象の医療デバイス又は薬物を前記インビトロモデル内に導入するステップ、ならびに
- 前記医療デバイス又は薬物とヒト全血サンプル、人工血液又はそれらの派生物との挙動及び相互作用を評価するために、前記医療デバイス又は薬物を備える前記インビトロモデル内における、前記ヒト全血サンプル、人工血液又はそれらの派生物の循環（灌流モデル）を可能にするステップとを含む、方法である。
本発明の一目的を形成するものは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、医療デバイス及び薬物を、それらを人間に対して使用する前に、それらの有効性及び安全性を検証する目的で試験するための器具としての、動脈瘤の影響を受けた血管、狭窄症又は硬化症プラークを含む、又は、代替的に、これらからなる、機能不全ヒト血管の挙動のインビトロシミュレーションのためのモデルである。
また、本発明の一目的を形成することは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、非限定的な例として、動脈瘤、狭窄症、硬化症プラークなどの、健康な人間の血管構造に関する解剖学的及び生理学的な機能不全特性を必要に応じて有する、主に実質的に管状の、インビトロ血管構造モデルを提供することである。
本発明の別の目的を形成するものは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、適切な選択された細胞が播種された1つ又は複数のスキャフォールドを備える、又は、代替的に、この1つ又は複数のスキャフォールドからなる、機能不全血管モデルである。
本発明の別の目的を形成するものは、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、適切な選択された細胞が播種されたスキャフォールドを使用して、前記機能不全血管モデルを提供する方法である。
そのような機能不全血管構造は、（i）例えば、絹フィブロインなどの、電気紡糸されること、又は型において鋳造されること、又は例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトンなどの、バイオプリンターを使用して印刷されることに適した生体適合性材料からなるスキャフォールドを含む。スキャフォールドの構造は、スキャフォールドにおける内皮血管細胞の播種を可能にすること、及び細胞、血液（人工又はヒト全血）を持続するための成長媒体などの流体の貫流を可能にすることに適している。
前述のポイントにおいて記載されるスキャフォールドの構造の異なる実施形態は、試験対象の医薬品、筋細胞又は神経細胞における試験されるべき特徴に応じて、スキャフォールドの外面上に播種し、モデルが受ける機械的、薬理学的又は化学的な刺激に依存した血管収縮又は血管拡張をシミュレーションすることができるように、前記細胞の配向を促進する横糸を提供することを提供する。
スキャフォールドにおいて、例えば、凝塊、硬化症プラーク、血栓症又は狭窄症、血液成分（例えば、血小板、コレステロール、赤血球など）をシミュレートするために。
さらに、血管構造の機能不全をシミュレーションする目的で、スキャフォールドは、その管状構造上に、例えば、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、膨脹などの、変形又は欠陥を有して作製されることが可能である。
油圧回路、及びスキャフォールドが挿入されるバイオリアクターは、添付の図面の助けを借りて参照されるべき本明細書において、以下に概説される。既に提供されているような回路は、成長媒体を（全血、又は成長媒体により、もしくは試験されるべき製品の溶出液により希釈された）血液と、又は人工血液と、又は試験されるべき製品の溶出液により希釈された成長媒体と置換する際に脈動レジメンを通過させる可能性と共に、播種された細胞の存続と成長を可能にするように、成長媒体と共にスキャフォールド上の播種された細胞の灌流を可能にする。回路は、バイオリアクターの上流の適切な弁によって、医薬品（薬物、医療デバイス）をスキャフォールド内へ導入することを可能にする。
本発明の主題であり、本明細書において記載される方法によって取得される機能不全スキャフォールドは、以下を使用して試験された。
- 血液分析（容器の機能不全によって、及び/又は容器の機能不全を処理するために使用される製品によって引き起こされた血液変化）又は医薬品の血液適合性。
- 血管障害を処置するために使用される医薬品、例えば、ステント、動脈瘤の塞栓術用のデバイス、カテーテル、心臓弁、薬物など、の生体適合性。
- 血管障害の矯正における医薬品の設計の機能性、実現可能性又は適切さを検証すること。
さらに、長期の熱心な研究開発活動の後、本出願人は、添付の特許請求の範囲において特許請求されるような特徴を有する、播種方法と、灌流回路をバイオリアクタースキャフォールドシステムに接続するための方法とを含むプロセスを生み出した。
スキャフォールドホルダを表わす。 機能的かつ連続的な内皮により覆われた内腔を有する、人工血管組織又は構造物、好ましくはスキャフォールドを表わす。 バイオリアクターを表わす。 バイオリアクターの両端（上流及び下流）には、回転コネクタ及びT字形コネクタが適用された状態を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 T字形コネクタによってバイオリアクターの2つの端部のうちの1つに係合されるルアーロックコネクタを有する注射器を使用して、バイオリアクターに収容されるスキャフォールドの内腔に注入された新鮮な成長媒体を使用して、事前調整されたスキャフォールドを表わす。 回転コネクタによってバイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタに搭載された容器（図10、91）内に、新鮮な成長媒体及び内皮細胞を備える細胞懸濁液の形態で、前記内皮細胞培養物を放出するステップを表わす。 バイオリアクターを表わす。 細胞懸濁液残留物を有する注射器は、平面に対して約90°だけ回転され、注射器はこの平面上に横たわり、この位置において、注射器のプランジャは、スキャフォールド内部に圧力を生み出さないように絶縁黒部のみを挿入することによって、注射器の開口端部において再挿入された状態を表わす。 スキャフォールドホルダを表わす。 キャップを使用して閉じられたコネクタの端部を表わす。 3つの異なる実験（DYN1、DYN2及びDYN3と命名された）において、内皮細胞が播種され、24時間インキュベートされたスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を表すサンプルに対して、レサズリンを用いるアッセイを使用して取得された値を示す。 3つの異なる実験（DYN1、DYN2及びDYN3と命名された）において、内皮細胞が播種され、24時間インキュベートされたスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を表すサンプルに対して、レサズリンを用いるアッセイを使用して取得された値を示す。 内皮細胞のゲノムDNA含量が約7pgであることを考慮して計算されたゲノムDNAを表わす。 内皮細胞のゲノムDNA含量が約7pgであることを考慮して計算されたゲノムDNAを表わす。 バイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタT2の上端部及び側端部からキャップを除去した際に、気泡の生成可能性は、熱い新鮮な成長媒体と同じ体積を有するを（好ましくは、パスツールピペットを使用して）手動で加えることによって補償されることを表わす。 灌流回路の管と管との間のコネクタに近位の位置において、好ましくはクランプを使用して、閉じた灌流回路の管を閉塞した状態を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。 第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法を表わす。
本発明の好ましい実施形態は、以下に続く詳細な説明から明らかになるであろう。
図1〜図27は、本明細書において以下に概説される。
本発明の文脈において、連続的かつ機能的な内皮という表現は、生理的な挙動を有する内皮を示すために使用され、内皮細胞は互いに隣接し、スキャフォールドに付着し、内皮細胞に典型的なマーカー、例えば、フォン・ウィルブランド因子（VWF）、分化抗原群31（CD31）、血管細胞付着分子1（VCAM-1）などを表現する。特に、連続的な内皮という表現は、コンフルエント細胞の単層を有する内皮を示すために使用される。
本発明の文脈において、スキャフォールドという表現は、細胞付着及び成長を促進することができる生体適合性材多孔質ポリマー媒体、この場合には内皮細胞を示すために使用される。ポリマースキャフォールドは、合成由来又は天然由来とすることができ、例えば、電界紡糸絹フィブロイン、又はPGA/PLA（ポリグリコール酸/ポリ乳酸）もしくはPGA/PCL（ポリグリコール酸/ポリカプロラクトン）のコポリマーなど、1つのみのポリマー又はコポリマー（ポリマー全体）からなることができる。
本発明の文脈において、「コンフルエンス」という表現は、付着細胞によって覆われるスキャフォールドの表面（特に、内面又はそのようなスキャフォールドの内腔）を指す。特に、いわゆる「コンフルエント細胞」は、コンフルエンスを90%以上有し、好ましくは90%から100%の間で構成され、より一層好ましくは95%から100%の間で構成され、したがって、スキャフォールドの実質的に全表面が付着細胞によって覆われ、スキャフォールド上に利用可能な余った表面はなく、その結果、細胞は単層として成長することができる
本発明の文脈において、血管組織の内皮を構成する細胞は、内皮細胞として定義される。内皮細胞の例は、HAOEC（human aortic endothelial cells（ヒト大動脈内皮細胞））、HCAEC（human coronary artery endothelial cells（ヒト冠状動脈内皮細胞））、HMEVEC（human dermal microvascular endothelial cells（ヒト真皮微小血管内皮細胞））、又はHUVEC（human umbilical vein endothelial cells（ヒト臍帯静脈内皮細胞））である。
本発明の文脈において、インビトロ内皮化プロセスの後に、機能的な内皮細胞によって主に覆われた内腔を有するスキャフォールドは、人工血管構造物として定義される。スキャフォールドの内腔を覆う前記内皮細胞は、連続的な内皮、すなわち、コンフルエント細胞の単層を有する内皮を構成する。
本発明の文脈において、各タイプの細胞に固有の細胞成長及び維持液は、成長媒体として定義される。特に、この特定の場合において使用される内皮細胞（HUVECs-Sigma Aldrichから購入されたヒト臍帯静脈内皮細胞、コード200-05n）に関して、成長媒体は、内皮成長媒体（EGM、Sigma Aldrich、211-500）である。EGMは、ウシ胎児血清（2%）、アデニン（0.2μg/ml）、メタバナジン酸アンモニウム（0.0006μg/ml）、アンフォテリシンB（0.3μg/ml）、塩化カルシウム2H2O（300μg/ml）、塩化コリン（20μg/ml）、硫酸銅5H2O（0.002μg/ml）、チオクト酸DL-6,8（0.003μg/ml）、フォリニン酸（カルシウム）（0.6μg/ml）、ヘパリン（4μg/ml）、ヒドロコルチゾン（2μg/ml）、L-アスパラギン酸（15μg/ml）、L-システイン（30μg/ml）、L-チロシン（20μg/ml）、硫酸マンガン一水和物（0.0002μg/ml）、モリブデン酸アンモニウム4H2O（0.004μg/ml）、ニコチンアミド（8μg/ml）、塩化ニッケル6H2O（0.0001μg/ml）、ペニシリン（60μg/ml）、フェノールレッドナトリウム塩（15μg/ml）、塩化カリウム（300μg/ml）、プトレシン二塩酸塩（0.0002μg/ml）、ピリドキシン塩酸塩（3μg/ml）、メタケイ酸ナトリウム9H2O（3μg/ml）、硫酸ナトリウム7H2O（200μg/ml）、亜セレン酸ナトリウム（0.01μg/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（100μg/ml）、チアミン塩酸塩（4μg/ml）、及び硫酸亜鉛7H2O（0.0003μg/ml）を含有する。新鮮な成長媒体は、製造業者によって直接供給される、過去に使用されていない無菌媒体である。熱い成長媒体という表現は、30℃から45℃の間の範囲で、好ましくは37℃の温度で、成長媒体が過去に加熱されたことを示すために使用される。
本発明の主題であるプロセスは、血管組織を工学的に作製し、その後に医薬品の試験のために工学的作製された血管移植片（血管構造物/組織）を製造するための、播種方法と、バイオリアクターとスキャフォールド灌流回路（灌流方法）、好ましくは管状スキャフォールドとの間の接続のための方法とを含む。播種方法と、バイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）のための灌流回路を接続するための方法とを含む前記プロセスは、以下に記載されるシステムからの気泡の正確な除去を有利に保証し、したがって、プロセスの最大限の再現性を保証する。さらに、気泡が内皮細胞と接触するリスクを低減することは、内皮細胞を損傷することを防止することを可能にし、スキャフォールド（連続的かつ機能的な内皮）の内腔上に付着した内皮細胞のコンフルエント単層を取得することを可能にする。この特定の場合において、そのような播種方法、及びスキャフォールド灌流回路（灌流方法）を接続するための方法は、灌流のためのバイオリアクター内のスキャフォールド、好ましくは管状の電界紡糸絹フィブロインに適用される。
本発明のプロセスは、動物モデルの使用に対する有効な代替案を提示するという点において、現在使用可能であり、3R要件を満たすモデルの制限を克服することを可能にする。
本発明の一目的を形成するものは、好ましくは、医薬品又は獣医製品の試験に使用可能な、コンフルエント細胞単層を有する、機能的かつ連続的な内皮により覆われた内腔を有する、人工血管組織又は構造物、好ましくはスキャフォールド（図2、21）を製造するプロセスであって、
- バイオリアクター（図3、11）・播種済みスキャフォールド（21）システムを取得するためにバイオリアクター（11）内に存在する、播種済みスキャフォールド（21）を取得するために、スキャフォールド（21）の内腔内に内皮細胞培養物を播種するための方法であって、以下：
- 回転コネクタ（図10、CR1）によってバイオリアクター（11）の上流に配置されたT字形コネクタ（図10、T2）に搭載された容器（図10、91）内に、新鮮な成長媒体及び内皮細胞を備える細胞懸濁液の形態で、前記内皮細胞培養物を放出するステップと、その後に、
- バイオリアクターチャンバ（11）内に存在するスキャフォールド（21）の内腔内へ前記内皮細胞培養物を連続的な流れで放出し、それにより、流れ速度が、前記細胞懸濁液が気泡を生成せずにT字形コネクタ（T2）内へ滴ることを可能にし、スキャフォールド（21）の内腔内に存在する気泡を、バイオリアクター（11）の下流に配置されたT字形コネクタ（図10、T3）の開口へ押して、その流出を可能にするステップと
を含む方法と、その後に、
- 灌流回路（図6;51、52、53、54、55及び51〜56又は51〜57及びBT）を前記バイオリアクター（11）・播種済みスキャフォールド（21）システムに接続することによって取得される、前記播種済みスキャフォールド（21）の内腔内に存在する内皮細胞の、30℃から45℃の間の範囲で構成される、好ましくは37℃の温度を有する新鮮な成長媒体を用いた、灌流のための方法であって、以下:
- 灌流回路内に存在する気泡を除去するための要素（71又はBT）を前記新鮮な成長媒体により部分的に満たすステップであって、気泡を除去するための前記要素（71又はBT）は、チャンバと、前記チャンバを閉じるキャップと、流入機能を有するアクセス部（211）と、流出機能を有するアクセス部（212）とを備え、気泡を除去するための要素（71又はBT）の前記のチャンバは、ある体積を有しており、前記体積の第1の部分は、前記新鮮な成長媒体により満たされ、前記体積の第2の部分は、空気で満たされ、前記体積の前記第2の部分は、流入機能を有する前記アクセス部（211）及び流出機能を有する前記アクセス部（212）を通って流れる前記新鮮な成長媒体内に存在する気泡をトラップする機能を有する、ステップ
を含む方法と
を適用することを含む、プロセスである。
好ましい実施形態を例示する目的で、本発明のプロセス対象によって表される、提案される技術的解決策は、理解の容易さのために、以下に別々に詳細に記載される2つの方法:（1）スキャフォールド、好ましくは管状スキャフォールドの内腔内の細胞培養物を播種するための方法、（2）灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法に分けられる。
（1）好ましい実施形態によるスキャフォールドの内腔内の細胞培養物を播種するための方法。
バイオリアクター・スキャフォールドシステムのための内皮細胞の均一な播種のための方法は、無菌状態下で連続して実行される複数のステップを含む。
1.1 スキャフォールドホルダ（図1;13、13a、13b）のグリップに搭載される、スキャフォールド（図2;21）、好ましくは管状スキャフォールド、例えば電界紡糸絹フィブロインの管状スキャフォールドは、バイオリアクターチャンバ内に収容されて、バイオリアクター・スキャフォールドシステムが取得される。バイオリアクターの両端（上流及び下流）には、回転コネクタ（図4;CR1、CR2）及びT字形コネクタ（図4;T2、T3）が適用される。
本発明の文脈において、バイオリアクター・スキャフォールドシステムという表現は、バイオリアクターと、スキャフォールド（図3;11、21）、好ましくは管状スキャフォールド、例えば、電界紡糸絹フィブロイン管状スキャフォールドとのアセンブリを示すために使用され、スキャフォールドは、バイオリアクターに配置されるスキャフォールドホルダ（図1;13、13a、13b）のグリップによって収容され、固定される。好ましくは管状のスキャフォールドは、この場合には電界紡糸絹フィブロインであるスキャフォールドを、殺菌済みのテフロン（登録商標）テープ保護した後に、自己固定ストリップによりスキャフォールドホルダ（スキャフォールドの灌流を可能にするように内部が中空である）のグリップに固定される。
バイオリアクター11内へのスキャフォールドホルダ13の挿入は、バイオリアクターの上流の入口（図4;13a）がスキャフォールドの一端部（図4;CR1、41）に一致し、バイオリアクターチャンバの下流の開口（図4;CR2、42）がスキャフォールドの他端部（図4;13b）に一致するように生じる。このように、スキャフォールド21は、内部が中空のスキャフォールドホルダによって生成される灌流経路に対して完全に同軸である。バイオリアクターに搭載されるスキャフォールドが向き付けられるより大きな軸は、長手方向軸として定義される。
1.2 スキャフォールドは、T字形コネクタ（図9;T2）によってバイオリアクターの2つの端部のうちの1つに係合されるルアーロックコネクタを有する注射器を使用して、バイオリアクターに収容されるスキャフォールドの内腔に注入された新鮮な成長媒体を使用して、事前調整される。続いて、バイオリアクターの上流及び下流に配置されるコネクタの開口端部は、スキャフォールドの内腔を空にしないように、キャップを使用して閉じられる。さらに、新鮮な成長媒体は、バイオリアクターチャンバに収容されたスキャフォールドが完全に覆われるまで、バイオリアクターチャンバ内へ挿入される。このように、バイオリアクターチャンバ内に収容されたスキャフォールドは、内部（内腔内）と外部との両方が、新鮮な成長媒体を使用して、好ましくは1時間、25℃まで事前調整される。
1.3 事前調整の後、内腔に注入された成長媒体により事前調整されたバイオリアクター内部のスキャフォールドは、好ましくは無菌ピペットを使用して空にされ、チャンバ内へ前もって導入された成長媒体は、好ましくは無菌ピペットを使用して除去される。バイオリアクターの下流及び上流に配置されたコネクタ（回転され、T字形である）内に存在する成長媒体残留物は、スキャフォールドを崩さずに、ピペットを使用して真空で除去される。
1.4 バイオリアクターの端部の上流（図9、T2）及び下流（図9;T3）に配置されたT字形コネクタは、その中のスキャフォールドがグリップ上に搭載された状態で、上部開口が上向き（バイオリアクター・スキャフォールドシステムが位置する平面に対して90°）の状態に向き付けられる。続いて、バイオリアクターの下流（T3）及び上流（T2）に配置されたT字形コネクタの側面開口に栓がされる。バイオリアクターの上流に配置されるT字形コネクタ（図9;T2）の上方に面した開口に搭載されるものは、容器、好ましくは、そのプランジャなしで、例えば5mlの容量を有するルアーロックコネクタを備えた注射器（図9;91）である。バイオリアクターの上流に配置されるT字形コネクタ（図9;T3）の開口は、代わりに開いたままである（図9）。
1.5 ピペット、好ましくは、例えば25mlの容量を有する無菌プラスチックピペットを使用して、新鮮な成長媒体及び内皮細胞（例えばHUVEC）からなる細胞懸濁液が準備された容器から引き込まれる。続いて、引き込まれた細胞懸濁液は、要素（図10;CR1）を通じて容器内へ、又はバイオリアクターの上流のT字形コネクタ要素（図10;T2）に搭載された注射器（図10;91）内へ放出される。細胞懸濁液は、例えば25mlの容量を有するピペット（図10;101）を使用して、連続的な流れで放出されなければならず、その結果、流れ速度が、細胞懸濁液が気泡を生成せずにT字形コネクタ（図10;T2）内へ滴ることを可能にし、スキャフォールド内に存在するあり得る気泡を、バイオリアクター11の下流に配置されたT字形コネクタT3（図10;T3）の開口の方へ押し、したがって、流出する（図10）。
1.6 注射器を使用して装填された細胞懸濁液が、バイオリアクターの下流に配置されたT字形コネクタT3の開口端部に、あり得る気泡なしに到達した場合、バイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタT2は、キャップを使用して閉じられる（図11）。
1.7 続いて、細胞懸濁液残留物を有する注射器（91）は、平面に対して約90°だけ回転され、注射器はこの平面上に横たわり（図12）、この位置において、注射器のプランジャ（102）は、スキャフォールド内部に圧力を生み出さないように絶縁黒部のみを挿入することによって、注射器の開口端部において再挿入される（図12）。続いて、注射器（91）は、気泡を形成せずにバイオリアクターの上流のT字形コネクタT2からねじを緩めることができ（図13）、コネクタの端部は、キャップを使用して閉じられる（図14）。
1.8 バイオリアクターチャンバ内に存在する播種済みスキャフォールドが、成長媒体中に半分沈められるまで、（先に定義されたような）熱い新鮮な成長媒体は、バイオリアクターチャンバ内に追加される。
1.9 次いで、連続的な回転が、例えば、24時間、1.5〜2rpmの間で構成される回動速度により、スキャフォールドの長手方向軸に沿って適用される。この回転は、スキャフォールドの内腔上の均一な細胞付着を可能にし、バイオリアクターチャンバ内に存在する成長媒体によってスキャフォールドが連続的に湿らせたままであることを可能にし、チャンバ（スキャフォールドの外部）に存在する媒体とスキャフォールドの内腔内の播種された細胞懸濁液との間での栄養素の貫流を可能にする。
1.10 好ましくは、24時間、37℃で、5%のCO2を用いて、（回転下で）バイオリアクターチャンバ内に収容されたスキャフォールドをインキュベートすること。
有利には、本出願人によって生み出された播種方法は、無菌状態条件の下で運用することを可能にする。さらに、本発明の主題である本播種方法は、迅速であり、再現可能であり、有利には、スキャフォールドの全長（近位部分から、中間部分、遠位部分まで）に沿って均質的かつ一様に付着した内皮細胞を備えた内腔表面（内部）を有するスキャフォールドを準備することを可能にする。本発明の主題である本播種方法は、細胞を播種して、バイオリアクター・スキャフォールドシステム内に存在する気泡と、形成される気泡との両方を除去することを可能にし、したがって、細胞を損傷することを回避する。基本的に、本方法の各ステップは標準化され、再現可能であり、コスト及び動作時間を最適化する。
播種方法の実験証拠
本発明の主題である播種方法の有効性を証明するために、以下の分析が行われた。
スキャフォールドに付着した細胞の生存能力は、試薬としてレサズリン（商標名Alamar Blue、IUPAC名7-ヒドロキシ-10-オキシドフェノキサジン-10-イウム-3-オン、CAS 550-82-3）を使用するアッセイを使用して評価された。そのようなアッセイは、生細胞の還元雰囲気の存在下で、ピンク色の蛍光化合物である、レゾフルオリン（resofluorine）に還元されるインジケータ（レサズリン）の酸化還元に起因して、細胞生存能力を定量化することを可能にする代謝反応に存する。24時間の付着の後、播種済みスキャフォールドは、グリップから除去される。続いて、スキャフォールドは、細胞懸濁液の注入の部位からの距離、近位、中間及び遠位に応じて、各々が約2cmである3つのエリアに区分される（切断する）。続いて、各セクションは、約1cm2である4つの部分に分けられる。付着した内皮細胞を有するスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を各々が表す3つのサンプルが、レサズリンを用いるアッセイのために選択された。各サンプルは、24ウェルディッシュのウェルに配置され、好ましくは、3時間、37℃で、5%のCO2を用いて、新鮮な成長媒体を有する0.02mg/mlのレサズリンナトリウム塩（Sigma Aldrich、R7017）溶液1mlを用いてインキュベートされた。新鮮な成長媒体を有する0.02mg/mlのレサズリンナトリウム食塩水と（付着した内皮細胞を有する）スキャフォールドサンプルとの間で展開される反応は、分光蛍光光度計を使用することによって、590nmにおけるA.U.（任意の蛍光単位）検出を使用して分析される。
実行されたさらなる分析は、レサズリンを用いるアッセイのために過去に使用されたスキャフォールドのサンプル上に付着した細胞内に存在するゲノムDNAの量のアセスメントである。ゲノムDNAは、溶解を通じてスキャフォールドによって付着した細胞から抽出され、それは、続いて、核酸（PicoGreen）の蛍光染色が標準参照曲線を通じて溶液中のゲノムDNAの濃度を決定することを可能にする、Quant-iT（商標）PicoGreen（商標）dsDNAアッセイ（P7589、Invitrogen、Molecular Probes）を使用して定量化される。
図15A及び図15Bにおいてチャートに表されているものは、3つの異なる実験（DYN1、DYN2及びDYN3と命名された）において、内皮細胞が播種され、24時間インキュベートされたスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を表すサンプルに対して、レサズリンを用いるアッセイを使用して取得された値である。図15A及び図15Bのチャートは、内皮細胞の良好な付着及び生存能力を示す。
このデータは、内皮細胞のゲノムDNA含量が約7pgであることを考慮して計算されたゲノムDNA（図15C及び図15D）の定量化によって確認された。
内皮細胞が播種されたスキャフォールドの様々な近位セクション、中間セクション及び遠位セクション間で、著しい細胞生存能力の差異は、観察されなかった。特に、細胞生存能力及びその数は、その近位部分、中間部分及び遠位部分における長さ（スキャフォールドの主軸）に沿って比較され得る。この証拠を裏付ける目的で、内皮細胞が播種され、24時間インキュベートされたスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を代表するサンプルに対して、DAPI（4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩、D1306、ThermoFisher scientific）及びローダミンファロイジン（R415、ThermoFisher scientific）を使用して共染色が行われた。この2つのDAPI試薬及びローダミンファロイジン試薬は、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡を使用した染色の後に可視となる、核検出と、生細胞の形態素であるアクチンフィラメント（F-アクチン）とのそれぞれに特異的である。24時間の培養の後、これらの結果は、内皮細胞が生きており、スキャフォールドの内腔上に均一に分布していることを示す。特に、これらの結果は、90%の細胞コンフルエンスを示す。さらに、内皮細胞が播種され、24時間インキュベートされたスキャフォールドの各領域（近位、中間、遠位）を代表するサンプルに対して、内皮細胞に典型的なマーカーの遺伝子発現解析、例えば、フォン・ウィルブランド因子（VWF）、分化抗原群31（CD31）、血管細胞付着分子1（VCAM-1）が行われる。遺伝子発現評価を行うために、総RNAが細胞（この場合には内皮）から抽出され、cDNAにおける逆転写の後に、リアルタイムPCR技法を使用して、特異的Taqman遺伝子発現アッセイ（ThermoFisher Scientific）を使用して定量化される。先に列挙したマーカーの遺伝子発現の機能レベルは、スキャフォールドの内腔上に付着した細胞の良好な機能性及び生存能力のインジケータである。
最後に、細胞の分布及びその形態、ならびに特異的な内皮機能性マーカーの免疫蛍光アッセイを評価する目的で、本発明による内皮細胞が播種されたスキャフォールドのサンプルに対して、H&E「ヘマトキシリン及びエオシン」染色分析が行われる。
結論として、本発明の主題である本播種方法は、全内腔に沿って生内皮細胞の均質で、均一で、再現可能な播種を保証するという点で効率的であることが明らかになった。
（2）第1の実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法（図5〜図8、18〜21）。
接続方法は、播種（ポイント（1）の下で上述した実施形態による、スキャフォールドの内腔内の細胞培養物を播種するための方法）に続いて、内皮細胞の付着から24時間に、以下の連続するステップに基づく。
2.1 閉じた灌流回路の管又はアンダーポンプ（図5;52）を蠕動ポンプ（図5;55）のヘッドの下に配置し、蠕動ポンプは、起動時に、流体、この場合には熱い新鮮な成長媒体を吸引することができる蠕動力を生成する。閉じた灌流回路は、レザーバが閉じられてから、前もってレザーバへ注がれた熱い新鮮な成長媒体を、レザーバ（図5;56）に接続された灌流回路の管（図5;51）によって吸引することに起因して、満たされる。新鮮な成長媒体が、閉じた灌流回路の管54（図5;54）を通ってレザーバに戻るまで、灌流回路の管を熱い新鮮な成長媒体で満たす。バイオリアクター・スキャフォールドシステムを、灌流回路と同じ無菌状態条件下に配置する。
2.2 バイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタT2の上端部及び側端部を開く。
2.3 バイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタT2の上端部及び側端部からキャップを除去した際に、気泡の生成可能性は、熱い新鮮な成長媒体と同じ体積を有するを（好ましくは、パスツールピペットを使用して）手動で加えることによって補償される（図16）。
2.4 灌流回路の管54と管53との間のコネクタに近位の位置において、好ましくはクランプ（図17;171）を使用して、閉じた灌流回路の管54を閉塞する（図17）。閉じた灌流回路の管53を空にすることを防止するように、ポンプのヘッドが閉じられたままにするように注意する。
2.5 閉じた灌流回路の管53を垂直位置に維持し、管53と灌流回路の管54との間に配置されたコネクタのねじを緩め、好ましくは、灌流回路の管54をキャップを使用して栓をする。
2.6 灌流回路の管53を、バイオリアクターの上流のT字形コネクタT2の開いた側端部に、その側面アクセス部においてねじ留めする。バイオリアクターの上流のコネクタは、常に垂直位置に維持されなければならない（図18）。
2.7 バイオリアクターの下流のT字形コネクタT3を、側面開口のキャップのねじを緩めることによって開く。
2.8 灌流回路（図19A）の管54のコネクタからキャップを除去し、それをバイオリアクターの下流のT字形コネクタの側面開口にねじ留めする（図19B）。
2.9 灌流回路の管54を閉塞するクランプ171を除去する（図20）。
2.10 本発明の文脈においてバブルトラップという技術的表現で定義される、気泡の除去のために要素（図21、71）を満たす。バブルトラップは、キャップを使用して閉じられるチャンバによって表される要素からなり、流出口と流入口として役割を果たす2つのアクセス部を有する。バブルトラップチャンバは、ある体積の液体（この特定の場合には、熱い新鮮な成長媒体）と、バブルトラップチャンバの2つのアクセス部を通って流れる灌流液体中に存在するあり得る気泡をトラップする、ある体積の空気とを含む。
所与の空気量を残し、チャンバ及びそのアクセス部をそれぞれのキャップを使用して閉じるように、バブルトラップを熱い新鮮な成長媒体で満たす。
2.11 前もってバイオリアクター・スキャフォールドシステムに接続された灌流回路に、バブルトラップを以下のように接続する（図7）。
a.管53を（管53と灌流回路の管52との間に配置された）T字形コネクタT1の側端部に接続するコネクタの近位に配置されたクランプを使用して、灌流回路の管53を閉じ、それのねじを緩める（図7;52）。
b.好ましくは、キャップを使用して、灌流回路の管53を閉じる。そのような動作は、灌流回路の管53を空にすることを防止する。
c.（管53と灌流回路の管52との間に配置された）T字形コネクタT1の側端部に栓をし、その上端部を開く。
d.バブルトラップチャンバの流入アクセス部を開き、それを上端部のアクセス部に接続し、T字形コネクタT1に対して垂直に配置する。
e.バブルトラップの流出アクセス部を開き、それを灌流回路の管53に、管を全くねじらないように注意して接続する。
f.バブルトラップを垂直位置に維持する。
g.バブルトラップチャンバに接続されたばかりの灌流回路の管53から、クランプ171を除去する。ポンプを起動し、バイオリアクターの上流のT字形コネクタT2の上端部のキャップを開いて、プロセス期間中に管53内に形成されたあり得る気泡を除去し、気泡がスキャフォールドに到着するのを防止する。灌流回路とバイオリアクター・スキャフォールドシステムとからなる、組み立てられたシステムに対して、ポンプによって加えられる蠕動力は、スキャフォールドの灌流を可能にすることとなる。
h.そのような検証の後、バイオリアクターの上流のT字形コネクタT2を、そのキャップを使用して閉じる。
（3）第2の好適な実施形態による、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステム（灌流方法）に接続するための方法（図22〜図27）。
接続方法は、播種（ポイント（1）の下で上述した実施形態による、スキャフォールドの内腔内の細胞培養物を播種するための方法）に続いて、内皮細胞の付着から24時間に、以下の連続するステップに基づく。
3.1）無菌状態条件下で、灌流回路の管（図22;51;52;53;54;55）と、バブルトラップという技術的表現を用いて本発明の文脈において定義される、気泡を除去するための要素（図22;BT）と、レザーバ（図22;56）とを接続する。気泡を除去するための要素、すなわち、バブルトラップ（BT）は、キャップを使用し、2つの非対称なアクセス部を有する、好ましくはガラス製の、閉じたチャンバによって表される要素からなる。タップと接続ノズルとを有するアクセス部は、流入口（図27、211）としての役割を果たし、一方で、接続ノズルを有するアクセス部は、流出口（図27、212）としての役割のみを果たす。バブルトラップチャンバは、ある体積の液体（この特定の場合には、熱い新鮮な成長媒体）と、バブルトラップチャンバの2つのアクセス部を通って流れる灌流液体中に存在する、あり得る気泡をトラップする、ある体積の空気とを含有する。
3.2）閉じた灌流回路のアンダーポンプ（図22;52）を蠕動ポンプ（図22;57）のヘッドの下に配置し、蠕動ポンプは、起動時に、流体、この場合には熱い新鮮な成長媒体を吸引することができる蠕動力を生成する。閉じた灌流回路は、前もってレザーバ（図22;56）へ注がれ、次いで閉じられた熱い新鮮な成長媒体を、レザーバ（図22;56）に接続された灌流回路の管（図22;51）によって吸引することに起因して、満たされる。熱い新鮮な成長媒体が、閉じた灌流回路の管55（図22;55）を通ってレザーバに戻るまで、灌流回路、バブルトラップ（図22、BT）及びレザーバ（図22;56）のすべての管を、（上記で定義されたような）熱い新鮮な成長媒体などの液体灌流で満たす。BT及びレザーバは、所与の空気量を残すように満たされる。特に、バブルトラップ（図22、BT）が満たされ、その結果、前記バブルトラップチャンバは、前記新鮮な成長媒体により満たされたその体積の第1の部分と、空気により満たされたその体積の第2の部分とを有し、前記体積の前記第2の部分は、バブルトラップ（BT）（図22）の、流入口（211）としての役割を果たす前記アクセス部と、流出口（212）としての役割を果たす前記アクセス部とを通って流れる灌流液体（熱い新鮮な成長媒体）中に存在する気泡をトラップする機能を有する。
3.3）BTに近位の位置において、好ましくはクランプ（図23;172）を使用して、管54（図23）を閉塞し、BTのタップを（灌流回路の管に対して垂直な位置にある）閉鎖位置に移動させる。
3.4）バイオリアクター・スキャフォールドシステムを、灌流回路と同じ無菌状態条件下に配置する。
3.5）管54（図23;C）を有する接続Cに近位の位置において、好ましくはクランプ（図23;171;図17;171）を使用して、管55（図23）を閉塞する。バイオリアクター（図4;T2）の上流に配置されたT字形コネクタT2の上端部及び側端部を開く。
3.6）バイオリアクターの上流に配置されたT字形コネクタT2（図4）の上端部及び側端部からキャップを除去した際に、気泡の生成可能性は、熱い新鮮な成長媒体と同じ体積を有するを（好ましくは、パスツールピペットを使用して）手動で加えることによって補償される（図16）。
3.7）閉じた灌流回路の管54（図23）を垂直位置に維持し、管54（図23）と灌流回路の管55（図23）との間に配置されたコネクタのねじを緩め、好ましくは、灌流回路の管55をキャップを使用して栓をする（図24）。
3.8）灌流回路の管54（図27）を、バイオリアクターの上流のT字形コネクタT2（図27）の開いた側端部に、その側面アクセス部においてねじ留めする。バイオリアクターの上流のコネクタは、常に垂直位置に維持されなければならない（図18又は図27）。
3.9）バイオリアクターの下流のT字形コネクタT3（図4）を、側面開口のキャップのねじを緩めることによって開く。
3.10）歯車R（図4）を静止した状態に保持する、T字形コネクタT3（図4）と一緒に回転コネクタCR2のねじを緩め、スキャフォールドホルダ14a（図1）（図25）の側面開口に管55（図25）のコネクタをねじ留めする。
3.11）灌流回路（図26）の管55を閉塞するクランプ171を除去する。
3.12）灌流回路に接続されたバイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムを約37℃で約5%のCO2において配置し、アンダーポンプ52（図27）を自由位置に配置し、バブルトラップBT（図27）のタップを灌流回路の管に平行に配置することによって開き、クランプ172（図27）を除去し、次いで、ポンプ（図27、57）を起動する。灌流回路とバイオリアクター・スキャフォールドシステムとからなる、組み立てられたシステムに対して、ポンプによって加えられる蠕動力は、スキャフォールドの灌流を可能にすることとなる。
有利には、上述した第1の実施形態と第2の実施形態との両方において、本明細書において記載される接続方法（灌流方法）は、好ましくは管状のスキャフォールドの灌流回路を、バイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムに接続することを可能にする。この手順は、気泡の形成を防止し、万一気泡が形成された場合には、バイオリアクター・スキャフォールドシステムの、内皮細胞が播種されたスキャフォールドに気泡が到達することを防止することを可能にする。さらに、灌流回路内に既に存在する可能性がある気泡は、回路におけるバブルトラップ（図21、71;図27、BT）の存在に起因して、スキャフォールドに到達しない。このように、本出願人によって生み出された方法は、スキャフォールドの内腔内の気泡の完全な不在を保証することができる。このシステムは、バイオリアクターの構成によって述べられた要件を満たす。示され、記載されたあらゆる詳細は、方法を操作者から独立したものとするために、したがって、産業レベルで機能的な内皮を有する構造物のインビトロ生成中の結果の再現性を保証するために、必要とされる。さらに、この方法は、単純なアクションに基づいて、無菌状態条件下で運用することができることを可能にする。さらに、迅速で追跡可能な手順は、気泡が細胞と接触するリスクを低減することを可能にし、したがって、好ましくは管状のスキャフォールドの内腔上に付着した内皮細胞を損傷することを回避する。前記灌流方法は、連続的（すなわち、コンフルエント細胞の単層を有する）かつ機能的な内皮により覆われた内腔を有するスキャフォールドを有する人工血管構造物/組織を取得することを可能にする。
接続方法の実験証拠
灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステムに接続するための方法の評価に関する実験分析は、好ましくは管状のスキャフォールド内の細胞培養物の播種方法の評価のために適用されたものと同じである。
本発明の文脈において、灌流回路（図5及び図22）は、管（図5;51〜54又は図22;51〜55）、レザーバ（図5又は図22;56）、蠕動ポンプ（図5;55又は図22;57）、及び気泡を除去するための要素（図21、71又は図22、BT）のアセンブリとして定義される。前記気泡を除去するための要素は、灌流回路をバイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムに接続することに先立って、灌流回路内に存在することができ（灌流方法の第2の実施形態）、又は、代替的に、灌流回路をバイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムに接続した後に、灌流回路内へ挿入されてもよい（灌流方法の第1の実施形態）。前記管は、生体適合性材料で作製されており、バイオリアクター11に収容されている、好ましくは管状の、スキャフォールド（図21及び図27）の灌流を、Easy-Load II 77200-62（Masterflex、Cole-Parmer）ヘッドを備えた蠕動ポンプ（図5;55、図22;57）（そのような場合には、Masterflex（登録商標）、L/S Digital Dispensing Pump Drives 07551-20、Cole-Parmer）によって可能にするように互いに接続される。次いで、上に記載され、図27に例示された灌流方法の第2の実施形態を参照すると、灌流回路は、3/16インチの内径を有する5つの管:レザーバから吸引するための第1の管51、第2のアンダーポンプ管52、回路をバブルトラップBTに接続する第3の管53、BTをバイオリアクター・スキャフォールドシステムの上流のT字形コネクタT2に接続する第4の管54、バイオリアクター・スキャフォールドシステムの下流のT字形コネクタT3に接続されたレザーバ56へ戻るための第5の管55から主になる。
上に記載され、図5において表される灌流方法の第1の実施形態を参照すると、管51はアンダーポンプ管52に接続され、アンダーポンプ管52はBTに接続され、BTは管53に接続され、管53は、バイオリアクター・スキャフォールドシステムの上流のT字形コネクタT2に接続され、管54は、バイオリアクター・スキャフォールドシステムの下流のT字形コネクタT3に、及びレザーバ56に接続される。
レザーバ（図5又は図22、56）は、熱い新鮮な成長媒体（例えば、内皮成長媒体EGM、Sigma Aldrich）を含有する要素であり、管51（図5又は図22）はこの要素から吸引し、管54（図5）又は管55（図22）はこの要素に戻り、バイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステム全体をクローズトシステムに維持する。レザーバ（図5又は図22、56）は、空気の無菌状態を保証する、レザーバのキャップ内に存在する0.22μmのフィルタに起因して、大気圧下にある。
本発明の一目的をさらに形成するものは、以下に示されるような、下記の好ましい実施形態RPnである。
RP1.医薬品を試験するために、好ましくはスキャフォールド（図2;21）である血管組織を製造するためのプロセスであって、
- 播種済みスキャフォールドを得るために、スキャフォールド（図2;21）の内腔内に内皮細胞培養物を播種するための方法であって、バイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムを得るために、前記播種済みスキャフォールドは、バイオリアクター（図4;11）内に存在する、方法と、続いて、
- 前記播種済みスキャフォールドの内腔内に存在する内皮細胞の灌流のための方法であって、灌流回路（図6;51、52、53、54、55及び56）を前記バイオリアクター・播種済みスキャフォールドシステムに接続することによって得られる、方法と
を適用することを含む、プロセス。
RP2.スキャフォールドの内腔内に内皮細胞培養物を播種するための前記方法は、
- スキャフォールド（21）、好ましくは、電界紡糸絹フィブロイン管状スキャフォールドを、スキャフォールドホルダ（図1;13、13a、13b）のグリップに搭載し、前記スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）をスキャフォールド（21）と共にバイオリアクターチャンバ（11）に収容して、バイオリアクター・スキャフォールドシステム（図4;11、21）を得るステップ、
- バイオリアクターチャンバ（11）内に配置された前記スキャフォールドホルダ（13）に固定された前記スキャフォールド（21）の内腔内に新鮮な成長媒体を注入するステップ、
- スキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が、前記成長媒体を既に注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップ、
- スキャフォールド（21）の内腔内、及びスキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が、前記成長媒体を既に注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバ（11）内の前記成長媒体を、好ましくは、1時間から18時間の間で構成される時間間隔の間、20℃〜30℃の間で構成される温度、好ましくは25℃で、放置するステップ、
- スキャフォールド（21）の内腔及び培地のバイオリアクターチャンバの内部から、成長媒体を取り除くステップ、
- 要素（CR1）によってバイオリアクター（11）の上流に配置されたコネクタ要素（T2）上に搭載された注射器タイプ（図10;91）の容器内へ、前記新鮮な成長媒体とHUVECタイプの内皮細胞とからなる細胞懸濁液を放出するステップであって、前記細胞懸濁液は、バイオリアクターチャンバ（11）内に存在するスキャフォールド（21）の内腔内へ連続的な流れで放出され、それにより、流れ速度が、前記細胞懸濁液が気泡を生成せずに容器（T2）内へ滴ることを可能にし、スキャフォールド（21）の内腔内に存在するあらゆる気泡を、バイオリアクター（11）の下流に配置されたコネクタ（T3）の開口へ押して、その流出を可能にする、ステップ、
- 前記細胞懸濁液をその内部に含有したスキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が存在するバイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップ、
- バイオリアクターチャンバ（11）に収容されたスキャフォールド（21）を、好ましくは24時間、37℃で、5%のCO2の存在下で、インキュベートするステップ
を含む、RP1に記載のプロセス。
RP3.前記播種済みスキャフォールドの内腔内に存在する内皮細胞の灌流のための前記方法は、
- 管（図5;51、52、53、54、55及び56）を備える、閉じた灌流回路（図5）を準備するステップ、
- コネクタ（C）に近位の位置においてクランプタイプ（図17;171）の閉鎖要素を使用して、灌流回路の管（54）を閉塞するステップと、
- 管53と灌流回路の管54（図5;図17）との間に配置されたコネクタ（C）のねじを緩めるステップ、
- 灌流回路の管（53）を、バイオリアクター（図18）の上流のコネクタ（T2）の開いた側端部に、その側面アクセス部においてねじ留めするステップ、
- バイオリアクターの下流のコネクタ（T3）を開き、側面開口（図19a）のキャップのねじを緩めるステップ、
- 灌流回路の管（54）を、バイオリアクター（図19b）の下流に配置されたコネクタ（T3）の側面開口に接続し、クランプタイプ（図20;171）の閉鎖要素を除去するステップ
を含む、RP1又はRP2に記載のプロセス。
RP4.キャップ（72）を使用して閉じられ、バブルトラップタイプ（図21）の流入口（211）としての、及び流出口（212）としての役割を果たす2つのアクセス部を有するチャンバによって表される要素（71）は、灌流回路（図8;図21）の管（53）へ挿入され、前記チャンバは、ある体積を有し、その第1の部分は、熱い新鮮な成長媒体により満たされ、その第2の部分は、空気により満たされて、前記アクセス部（211及び212）を通って流れる灌流液体中に存在するあり得る気泡をトラップする機能を、後者の体積の第2の部分において、トラップする、RP3に記載のプロセス。
RP5.スキャフォールド、好ましくは管状のスキャフォールドは、1つのみのポリマーによって、又はコポリマーによって形成される合成由来又は天然由来のポリマースキャフォールド、例えば、電界紡糸絹フィブロイン、又は、ポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）もしくはポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーなどの中から選択される、RP1〜4のいずれか1つに記載のプロセス。
RP6.内皮細胞は、血管組織の内皮を形成する細胞、例えば、HAOEC（ヒト大動脈内皮細胞）、HCAEC（ヒト冠状動脈内皮細胞）、HMEVEC（ヒト真皮微小血管内皮細胞）、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）などの中から選択される、RP1〜5のいずれか1つに記載のプロセス。
RP7.使用される成長媒体は、好ましくは37℃に加熱される、内皮成長媒体（EGM、Sigma Aldrich、211-500）である、RP1〜6のいずれか1つに記載のプロセス。
RP8.RP1〜7のいずれか1つに記載のプロセスによって取得された連続的かつ機能的な内皮により覆われた内腔を有するスキャフォールド。
RP9.心臓血管及び末梢血管領域、例えば、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテルなどにおいて使用される医薬品のインビトロ臨床前試験及び臨床試験を行うための、RP8に記載のスキャフォールドの使用。
実行され、かつ最適化されるべき第1のフェーズは、好ましくは内皮細胞の細胞播種フェーズであり、その後に、灌流回路を、バイオリアクターとスキャフォールドとを備えるシステムに接続する第2の重要なフェーズが続いて、連続的かつ機能的な内皮のインビトロ生成の間産業化プロセスに信頼性、有効性及び再現性を保証する。
人工血管組織/構造物、好ましくは、コンフルエント細胞単層を有する機能的かつ連続的な内皮により覆われた内腔を有するスキャフォールドの製造のための、本発明の主題である産業化プロセスの成功は、気泡の除去を信頼できる再現可能な手法で全体的に保証するために、播種し、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステムに接続するフェーズに関連する成功に主にある。播種方法は、細胞源及びその及び密度、化学的特性及び多孔質的特性、ならびに、細胞懸濁液の注入中のスキャフォールドの内腔からの気泡の完全な除去に依存する。他方では、灌流回路とバイオリアクター・スキャフォールドシステムとの間の接続のための方法は、組み立てられたシステムの無菌状態を維持すること、及び播種済みスキャフォールドと接触し得る気泡の不在の保証に基づく。気泡が細胞を損傷する可能性があり、その生存能力を危険にさらして、スキャフォールドの内皮化の欠如が後に続くとすれば、気泡の形成が回避されなければならないことが観察されるべきである。
本発明の記載は、灌流回路をバイオリアクター・スキャフォールドシステムに接続するための方法の選択が、前記接続方法が実験セットアップに、ならびに灌流必要性及び培養器内のこのシステムのために選択される位置に適したものでなければならないという事実に起因して、前もって最適化された内皮細胞を播種するための方法に依存することを示す。
スキャフォールド、好ましくは管状のスキャフォールドを播種するためのプロセスは、本発明の明細書において示されるように、コンフルエントな内皮を使用した、機能的な人工血管構造物のインビトロ生成に向けて、重大な要素のうちの1つである。このプロセスは、内腔内の内皮細胞の均一で均質な分布に関与しており、同じことが、表面への細胞の付着にも当てはまる。本発明の説明は、各バイオリアクター・スキャフォールドシステムに適合される、最も適当な播種方法の選択が、プロセスの再現性を定義し、結果の再現性におけるその利点を示すことを示す。
他の試験だけでなく、前臨床試験においても、機能的な血管構造物の大量生産のための再現可能な方法を生み出す必要が生じている。
したがって、十分に定義され、追跡可能な、本発明の播種方法は、他の分野の試験モデルだけでなく前臨床分野の試験モデルとしてのインビトロ血管構造物の製造にその活動が着目する研究所にとって必要とされる、内皮細胞の付着及び結果の良好な再現性の観点から、均一性が高い分布を保証する。
24時間の付着の後、スキャフォールドの内腔内に付着した、主に管状の細胞は、均質な血管内皮を得るために、それらの形態及び生存能力を維持しなければならない。したがって、成長対象の（形成されつつある）血管層の起こり得る損失と共に、細胞付着の状態を変化させ得る接続プロセス中の、いかなる細胞変化も回避することが重要である。
バイオリアクターと灌流回路との間の接続のための公知の方法は、細胞への苦痛を引き起こし、内腔表面からの内皮細胞の剥離がたとえ部分的であっても後に続き、その結果、機能的な内皮層の形成は遅くなり、又は妨げられる。さらに、バイオリアクターと灌流回路との間の接続のための公知の方法は、灌流中に接続管の（完全な又は部分的な）起こり得るねじれ又は圧縮に起因して形成され得る気泡の不在を保証しない。前記気泡と播種済みスキャフォールドとの間の接触を絶対的に防止することが重要であり、この接触は、要素、例えば、播種済みスキャフォールドに気泡が到達する前に気泡を除去することができるバブルトラップを導入することによって回避される。この欠点は、内皮細胞の均一で機能的な層、特にコンフルエント細胞層により覆われたスキャフォールドの内面を得ることを可能にする、本発明の主題であるプロセスのおかげで、成功裡に克服された。
本発明の好ましい実施形態Enは、下記に説明される。
E1.動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態を含む群の中、又は、代替的に、これらからなる群から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の同じ血管構造をシミュレーションする、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の血管構造のインビトロモデルであって、
前記モデルが、細胞付着及び成長を促進することができる1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体（スキャフォールド）を含み、又は、代替的に、この1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体からなり、前記スキャフォールドには、スキャフォールドの内腔を覆い、コンフルエント細胞の単層を有する内皮を構成する内皮細胞が播種され、前記スキャフォールドは、その管状構造に変形又は欠陥が設けられている、インビトロモデル。
E2.前記血管構造は、血管もしくは血管ダクト又は中心循環系もしくは末梢循環系の弁、好ましくは、動脈、静脈、毛細管、大動脈弁又は僧帽弁の中から選択される、E1に記載のインビトロモデル。
E3.前記血管構造は、合成血管構造であり、前記スキャフォールドは、電界紡糸絹フィブロイン、ポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）のコポリマー、又はポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーからなる、E1又はE2に記載のインビトロモデル。
E4.管状構造の前記変形又は前記欠陥は、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、膨脹、又はそれらの組合せを含む、E1〜E3のいずれか1つに記載のインビトロモデル。
E5.医療デバイス又は薬物を、人間又は動物に対するそのインビボ使用に先立って、その有効性及び安全性を検証するために試験する方法であって、以下:
- 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態に起因した、損傷又は変形又は劣化をシミュレーションするのに適した、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状のスキャフォールドを準備するステップと、
- 播種された内皮細胞（播種方法）の連続的で均質な層を取得するために、前記スキャフォールドの内部内腔の少なくとも一部に内皮細胞株を播種するステップであって、任意選択で、前記スキャフォールドの外面の少なくとも一部に筋細胞株を播種する、ステップと、
- 前記インビトロモデルを取得するために、内皮細胞の連続的で均一な層を取得するまで、前記内皮細胞、及び任意選択で前記筋細胞の成長を促進するステップと、
- 試験対象の医療デバイス又は薬物を前記インビトロモデル内に導入するステップと、
- 前記医療デバイス又は薬物とヒト全血サンプル、人工血液又はそれらの派生物との挙動及び相互作用を評価するために、前記医療デバイス又は薬物を備える前記インビトロモデル内における、前記ヒト全血サンプル、人工血液又はそれらの派生物の循環（灌流モデル）を可能にするステップと
を含む、方法。
E6.医薬品又は獣医製品を試験するための、コンフルエント細胞単層を有する、機能的かつ連続的な内皮により覆われた内腔を有する、人工血管組織又は構造物、好ましくはスキャフォールド（21）を製造するための方法又はプロセスであって、前記プロセスは、以下:
- バイオリアクター（11）・播種済みスキャフォールド（21）システムを取得するためにバイオリアクター（11）内に存在する、播種済みスキャフォールド（21）を取得するために、スキャフォールド（21）の内腔内に内皮細胞培養を播種するための方法であって、以下:
- 回転コネクタ（CR1）によってバイオリアクター（11）の上流に配置されたT字形コネクタ（T2）に搭載された容器（91）内に、新鮮な成長媒体及び内皮細胞を備える細胞懸濁液の形態で、前記内皮細胞培養物を放出するステップと、その後に、
- バイオリアクターチャンバ（11）内に存在するスキャフォールド（21）の内腔内へ前記内皮細胞培養物を連続的な流れで放出し、それにより、流れ速度が、前記細胞懸濁液が気泡を生成せずにT字形コネクタ（T2）内へ滴ることを可能にし、スキャフォールド（21）の内腔内に存在する気泡を、バイオリアクター（11）の下流に配置されたT字形コネクタ（T3）の開口へ押して、その流出を可能にするステップと
を含む方法と、その後に、
- 灌流回路（51〜56）又は（51〜57及びBT）を前記バイオリアクター（11）・播種済みスキャフォールド（21）システムに接続することによって取得される、前記播種済みスキャフォールド（21）の内腔内に存在する内皮細胞の、30℃から45℃の間の範囲で構成される、好ましくは37℃の温度を有する新鮮な成長媒体を用いた、灌流のための方法であって、以下:
- 灌流回路内に存在する気泡を除去するための要素（71）又は（BT）を前記新鮮な成長媒体により部分的に満たすステップであって、気泡を除去するための前記要素（71）又は（BT）は、チャンバと、前記チャンバを閉じるキャップと、流入機能を有するアクセス部（211）と、流出機能を有するアクセス部（212）とを備え、気泡を除去するための要素（71又はBT）の前記チャンバは、ある体積を有しており、前記体積の第1の部分は、前記新鮮な成長媒体により満たされ、前記体積の第2の部分は、空気で満たされ、前記体積の前記第2の部分は、流入機能を有する前記アクセス部（211）及び流出機能を有する前記アクセス部（212）を通って流れる前記新鮮な成長媒体内に存在する気泡をトラップする機能を有する、ステップ
を含む、方法と
を適用することを含む、方法又はプロセス。
E7.前記スキャフォールド（21）の内腔内に前記内皮細胞培養物を播種するための前記方法は、
- スキャフォールド（21）、好ましくは、電界紡糸絹フィブロイン管状スキャフォールドを、スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）のグリップに搭載し、前記スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）をスキャフォールド（21）と共にバイオリアクターチャンバ（11）に収容して、バイオリアクター（11）・スキャフォールド（21）システムを得るステップと、
その後に、
- バイオリアクターチャンバ（11）内に配置された前記スキャフォールドホルダ（13）に固定された前記スキャフォールド（21）の内腔内に新鮮な成長媒体を注入するステップと、その後に、
- スキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）が、前記成長媒体を注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップと、その後に、
- スキャフォールド（21）の内腔内、及びスキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が、前記成長媒体を注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバ（11）内の前記成長媒体を、1時間から18時間の間で構成される時間間隔の間、20℃〜30℃の間で構成される温度、好ましくは25℃で、放置するステップと、その後に、
- スキャフォールド（21）の内腔及びバイオリアクターチャンバ（11）の内部から、成長媒体を取り除くステップと、その後に、
- 請求項1に記載の前記容器（91）内の前記内皮細胞培養物を放出するステップであって、好ましくは、前記容器（91）は、注射器である、ステップと、その後に、
- 請求項1に記載のスキャフォールド（21）の内腔内の前記細胞懸濁液を放出するステップと、その後に、
- 前記細胞懸濁液を内腔に含有し、播種済みスキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が存在するバイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップと、その後に、
- バイオリアクターチャンバ（11）に収容されたスキャフォールド（21）を、好ましくは24時間、37℃で、5%のCO2の存在下で、インキュベートするステップと
を含む、E5又はE6に記載のプロセス。
E8.前記播種済みスキャフォールド（21）の内腔内に存在する内皮細胞の灌流のための前記方法は、
- 管（51）、管（52）、管（53）、管（54）、及び、任意選択で管（55）を備える、前記閉じた灌流回路を準備するステップと、
- コネクタ（C）に近位の位置において閉鎖要素（171）を使用して、灌流回路の管（54）又は（55）を閉塞するステップであって、好ましくは、前記閉鎖要素は、クランプなどである、ステップと、その後に、
- 灌流回路において管（53）又は管（54）と管（54）又は管（55）とのそれぞれの間に配置されたコネクタ（C）のねじを緩めるステップと、
- 灌流回路の管（53）又は管（54）を、バイオリアクター（11）の上流のT字形コネクタ（T2）の開いた側端部に、その側面アクセス部においてねじ留めするステップと、その後に、
- バイオリアクター（11）の下流のT字形コネクタ（T3）を開き、T字形コネクタ（T3）の側面開口のキャップのねじを緩めるステップと、その後に、
- 灌流回路の管（54）又は管（55）を、バイオリアクター（11）の下流に配置されたT字形コネクタ（T3）の側面開口に接続し、閉鎖要素（171）を除去するステップと、
必要に応じて、その後に、
- 灌流回路の管（53）とアンダーポンプ管（52）との間に、気泡を除去するための要素（71）を挿入するステップと
を含む、E5〜E7のいずれか1つに記載のプロセス。
E9.気泡を除去するための要素（71）又は（BT）は、バブルトラップなどである、E6〜E8のいずれか1つに記載のプロセス。
E10.スキャフォールド（21）、好ましくは管状のスキャフォールドは、合成由来又は天然由来のポリマースキャフォールドの中から選択され、前記ポリマースキャフォールドは、1つのみのポリマーによって、又はコポリマー、好ましくは、電界紡糸絹フィブロイン、又はポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）のコポリマー、もしくはポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーによって形成される、E5〜E9のいずれか1つに記載のプロセス。
E11.内皮細胞は、血管組織の内皮を形成する細胞、好ましくは、HAOEC（ヒト大動脈内皮細胞）、HCAEC（ヒト冠状動脈内皮細胞）、HMEVEC（ヒト真皮微小血管内皮細胞）、又はHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の中から選択される、E5〜E10のいずれかに記載のプロセス。
E12.使用される成長媒体は、ウシ胎児血清（2%）、アデニン（0.2μg/ml）、メタバナジン酸アンモニウム（0.0006μg/ml）、アンフォテリシンB（0.3μg/ml）、塩化カルシウム2H2O（300μg/ml）、塩化コリン（20μg/ml）、硫酸銅5H2O（0.002μg/ml）、チオクト酸DL-6,8（0.003μg/ml）、フォリニン酸（カルシウム）（0.6μg/ml）、ヘパリン（4μg/ml）、ヒドロコルチゾン（2μg/ml）、L-アスパラギン酸（15μg/ml）、L-システイン（30μg/ml）、L-チロシン（20μg/ml）、硫酸マンガン一水和物（0.0002μg/ml）、モリブデン酸アンモニウム4H2O（0.004μg/ml）、ニコチンアミド（8μg/ml）、塩化ニッケル6H2O（0.0001μg/ml）、ペニシリン（60μg/ml）、フェノールレッドナトリウム塩（15μg/ml）、塩化カリウム（300μg/ml）、プトレシン二塩酸塩（0.0002μg/ml）、ピリドキシン塩酸塩（3μg/ml）、メタケイ酸ナトリウム9H2O（3μg/ml）、硫酸ナトリウム7H2O（200μg/ml）、亜セレン酸ナトリウム（0.01μg/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（100μg/ml）、チアミン塩酸塩（4μg/ml）、及び硫酸亜鉛7H2O（0.0003μg/ml）を含む内皮成長媒体であり、好ましくは、37℃に加熱される、E6〜E11のいずれか1つに記載のプロセス。
E13.- 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態に起因した、損傷又は変形又は劣化をシミュレーションするのに適した、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状のスキャフォールドを準備するステップ、
- 播種された内皮細胞（播種方法）の連続的で均質な層を取得するために、前記スキャフォールドの内部内腔の少なくとも一部に内皮細胞株を播種するステップであって、任意選択で、前記スキャフォールドの外面の少なくとも一部に筋細胞株を播種する、ステップ、
- 前記インビトロモデルを取得するために、内皮細胞の連続的で均一な層を取得するまで、前記内皮細胞、及び任意選択で前記筋細胞の成長を促進するステップ
を含むプロセスによって取得されるコンフルエント細胞単層を有する、機能的で連続的な内皮（21）により覆われた内腔を有するスキャフォールド（21）であって、
好ましくは、前記スキャフォールド（21）は、E1〜E4からの1つに記載のインビトロモデルにおいて使用されることが可能であり、より好ましくは、前記プロセスは、E6〜E12からのいずれか1つの特性を含む、スキャフォールド（21）。
E14.心臓血管及び末梢血管領域、好ましくは、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯又はネットにおいて使用されるべき、人体使用のための医薬品又は動物使用のための獣医製品のインビトロ臨床前試験又は臨床試験を行うための、E1〜E4又はE13のいずれか1つに記載のスキャフォールド（21）の使用。
11 バイオリアクター
13 スキャフォールドホルダ
13a スキャフォールドホルダグリップ
13b スキャフォールドホルダグリップ
14a スキャフォールドホルダの側面開口
21 スキャフォールド
41 バイオリアクターチャンバの流入口
42 バイオリアクターチャンバの流出口
51 管
52 管又はアンダーポンプ
53 管
54 管
55 蠕動ポンプのヘッド
56 レザーバ
57 ポンプ
71 気泡を除去するための要素（又はバブルトラップ）
72 キャップ
91 容器、好ましくは注射器
101 ピペット
102 注射器プランジャ
171 クランプ
172 クランプ
211 流入機能を有するアクセス部
212 流出機能を有するアクセス部
BT バブルトラップ
CR1 回転コネクタ
CR2 回転コネクタ
T1 T字形コネクタ
T2 T字形コネクタ
T3 T字形コネクタ

Claims (14)

  1. 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態を含む群の中、又は、代替的に、これらからなる群から選択された損傷に起因して、その血管構造が損傷され、又は変形され、又は劣化している、健康な対象の同じ血管構造をシミュレーションする、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状の血管構造のインビトロモデルであって、
    前記インビトロモデルが、細胞付着及び成長を促進することができる1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体（「スキャフォールド」）を含み、又は、代替的に、この1つ又は複数の生体適合性多孔質ポリマー支持体からなり、前記スキャフォールドには、スキャフォールドの内腔を覆い、コンフルエント細胞の単層を有する内皮を構成する内皮細胞が播種され、前記スキャフォールドは、その管状構造に変形又は欠陥を有して作られており、
    前記変形又は前記欠陥は、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、又は膨脹を含み、
    前記血管構造は、合成血管構造であり、前記スキャフォールドは、電界紡糸絹フィブロイン、ポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）のコポリマー、又はポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーからなる、インビトロモデル。
  2. 前記血管構造は、血管もしくは血管ダクト又は中心循環系もしくは末梢循環系の弁の中から選択される、請求項1に記載のインビトロモデル。
  3. 前記血管構造は、動脈、静脈、毛細管、大動脈弁又は僧帽弁の中から選択される、請求項２に記載のインビトロモデル。
  4. 前記管状構造の前記変形又は前記欠陥は、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、及び膨脹の組合せを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のインビトロモデル。
  5. 医療デバイス又は薬物を、人間又は動物に対するそのインビボ使用に先立って、その有効性及び安全性を検証するために試験する方法であって、以下:
    - 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態に起因した、損傷又は変形又は劣化をシミュレーションするのに適した、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状のスキャフォールドを準備するステップであって、前記スキャフォールドが、分岐、湾曲、屈曲、狭窄、若しくは膨脹である前記変形又は前記欠陥を前記管状構造に有している、前記ステップと、
    - 播種された内皮細胞（播種方法）の連続的で均質な層を取得するために、前記スキャフォールドの内部内腔の少なくとも一部に内皮細胞株を播種するステップであって、任意選択で、前記スキャフォールドの外面の少なくとも一部に筋細胞株を播種する、ステップと、
    - インビトロモデルを取得するために、内皮細胞の連続的で均一な層を取得するまで、前記内皮細胞、及び任意選択で筋細胞の成長を促進するステップと、
    - 試験対象の医療デバイス又は薬物を前記インビトロモデル内に導入するステップと、
    - 前記医療デバイス又は前記薬物とヒト全血サンプル、人工血液又はそれらの派生物との挙動及び相互作用を評価するために、前記医療デバイス又は前記薬物を備える前記インビトロモデル内における、前記ヒト全血サンプル、前記人工血液又はそれらの前記派生物の循環（灌流モデル）を可能にするステップと
    を含む、方法。
  6. 医薬品又は獣医製品を試験するための、コンフルエント細胞単層を有する、機能的かつ連続的な内皮により覆われた内腔を有する、人工血管組織又は構造物、好ましくはスキャフォールド（21）を製造するための方法又はプロセスであって、前記プロセスは、以下:
    - バイオリアクター（11）・播種済みスキャフォールド（21）システムを取得するためにバイオリアクター（11）内に存在する、前記播種済みスキャフォールド（21）を取得するために、スキャフォールド（21）の内腔内に内皮細胞培養を播種するための方法であって、以下:
    - 回転コネクタ（CR1）によって前記バイオリアクター（11）の上流に配置されたT字形コネクタ（T2）に搭載された容器（91）内に、新鮮な成長媒体及び内皮細胞を備える細胞懸濁液の形態で、内皮細胞培養物を放出するステップと、その後に、
    - バイオリアクターチャンバ（11）内に存在する前記スキャフォールド（21）の前記内腔内へ前記内皮細胞培養物を連続的な流れで放出し、それにより、流れ速度が、前記細胞懸濁液が気泡を生成せずに前記T字形コネクタ（T2）内へ滴ることを可能にし、前記スキャフォールド（21）の前記内腔内に存在する前記気泡を、前記バイオリアクター（11）の下流に配置されたT字形コネクタ（T3）の開口へ押して、その流出を可能にするステップと
    を含む方法と、その後に、
    - 灌流回路（51〜56）又は（51〜57及びBT）を前記バイオリアクター（11）・播種済みスキャフォールド（21）システムに接続することによって取得される、前記播種済みスキャフォールド（21）の前記内腔内に存在する前記内皮細胞の、30℃から45℃の間の範囲で構成される、好ましくは37℃の温度を有する新鮮な成長媒体を用いた、灌流のための方法であって、以下:
    - 前記灌流回路内に存在する前記気泡を除去するための要素（71）又は（BT）を前記新鮮な成長媒体により部分的に満たすステップであって、前記気泡を除去するための前記要素（71）又は（BT）は、チャンバと、前記チャンバを閉じるキャップと、流入機能を有するアクセス部（211）と、流出機能を有するアクセス部（212）とを備え、前記気泡を除去するための前記要素（71又はBT）の前記チャンバは、ある体積を有しており、前記体積の第1の部分は、前記新鮮な成長媒体により満たされ、前記体積の第2の部分は、空気で満たされ、前記体積の前記第2の部分は、流入機能を有する前記アクセス部（211）及び流出機能を有する前記アクセス部（212）を通って流れる前記新鮮な成長媒体内に存在する前記気泡をトラップする機能を有する、ステップ
    を含む、方法と
    を適用することを含む、方法又はプロセス。
  7. 前記スキャフォールド（21）の前記内腔内に内皮細胞培養物を播種するための前記方法は、
    - 前記スキャフォールド（21）、好ましくは、電界紡糸絹フィブロイン管状スキャフォールドを、スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）のグリップに搭載し、前記スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）を前記スキャフォールド（21）と共にバイオリアクターチャンバ（11）に収容して、バイオリアクター（11）・スキャフォールド（21）システムを得るステップと、
    その後に、
    - 前記バイオリアクターチャンバ（11）内に配置された前記スキャフォールドホルダ（13）に固定された前記スキャフォールド（21）の前記内腔内に新鮮な成長媒体を注入するステップと、その後に、
    - 前記スキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13、13a、13b）が、前記成長媒体を注入された状態で存在する前記バイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップと、その後に、
    - 前記スキャフォールド（21）の前記内腔内、及び前記スキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が、前記成長媒体を注入された状態で存在する前記バイオリアクターチャンバ（11）内の前記成長媒体を、1時間から18時間の間で構成される時間間隔の間、20℃〜30℃の間で構成される温度、好ましくは25℃で、放置するステップと、その後に、
    - 前記スキャフォールド（21）の前記内腔及び前記バイオリアクターチャンバ（11）の内部から、前記成長媒体を取り除くステップと、その後に、
    - 請求項1に記載の容器（91）内の前記内皮細胞培養物を放出するステップであって、好ましくは、前記容器（91）は、注射器である、ステップと、その後に、
    - 請求項1に記載の前記スキャフォールド（21）の前記内腔内の細胞懸濁液を放出するステップと、その後に、
    - 前記細胞懸濁液を前記内腔に含有し、播種済みスキャフォールド（21）を有する前記スキャフォールドホルダ（13）が存在する前記バイオリアクターチャンバ（11）内に、前記新鮮な成長媒体を加えるステップと、その後に、
    - 前記バイオリアクターチャンバ（11）に収容された前記スキャフォールド（21）を、好ましくは24時間、37℃で、5%のCO2の存在下で、インキュベートするステップと
    を含む、請求項5又は6に記載のプロセス。
  8. 播種済みスキャフォールド（21）の前記内腔内に存在する前記内皮細胞の灌流のための前記方法は、
    - 管（51）、管（52）、管（53）、管（54）、及び、任意選択で管（55）を備える、閉じた灌流回路を準備するステップと、
    - コネクタ（C）に近位の位置において閉鎖要素（171）を使用して、前記灌流回路の前記管（54）又は前記管（55）を閉塞するステップであって、好ましくは、前記閉鎖要素は、クランプなどである、ステップと、その後に、
    - 前記灌流回路において前記管（53）又は前記管（54）と前記管（54）又は前記管（55）とのそれぞれの間に配置された前記コネクタ（C）のねじを緩めるステップと、
    - 前記灌流回路の前記管（53）又は前記管（54）を、バイオリアクター（11）の上流のT字形コネクタ（T2）の開いた側端部に、その側面アクセス部においてねじ留めするステップと、その後に、
    - 前記バイオリアクター（11）の下流のT字形コネクタ（T3）を開き、前記T字形コネクタ（T3）の側面開口のキャップのねじを緩めるステップと、その後に、
    - 前記灌流回路の前記管（54）又は前記管（55）を、前記バイオリアクター（11）の下流に配置された前記T字形コネクタ（T3）の前記側面開口に接続し、前記閉鎖要素（171）を除去するステップと、
    必要に応じて、その後に、
    - 前記灌流回路の前記管（53）とアンダーポンプ管（52）との間に、気泡を除去するための要素（71）を挿入するステップと
    を含む、請求項5から7のいずれか一項に記載のプロセス。
  9. 気泡を除去するための要素（71）又は（BT）は、バブルトラップなどである、請求項6から8のいずれか一項に記載のプロセス。
  10. 前記スキャフォールド（21）、好ましくは管状のスキャフォールドは、合成由来又は天然由来のポリマースキャフォールドの中から選択され、前記ポリマースキャフォールドは、1つのみのポリマーによって、又はコポリマー、好ましくは、電界紡糸絹フィブロイン、又はポリグリコール酸/ポリ乳酸（PGA/PLA）のコポリマー、もしくはポリグリコール酸/ポリカプロラクトン（PGA/PCL）のコポリマーによって形成される、請求項5から9のいずれか一項に記載のプロセス。
  11. 前記内皮細胞は、血管組織の内皮を形成する細胞、好ましくは、HAOEC（ヒト大動脈内皮細胞）、HCAEC（ヒト冠状動脈内皮細胞）、HMEVEC（ヒト真皮微小血管内皮細胞）、又はHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の中から選択される、請求項5から10のいずれか一項に記載のプロセス。
  12. 使用される成長媒体は、ウシ胎児血清（2%）、アデニン（0.2μg/ml）、メタバナジン酸アンモニウム（0.0006μg/ml）、アンフォテリシンB（0.3μg/ml）、塩化カルシウム2H2O（300μg/ml）、塩化コリン（20μg/ml）、硫酸銅5H2O（0.002μg/ml）、チオクト酸DL-6,8（0.003μg/ml）、フォリニン酸（カルシウム）（0.6μg/ml）、ヘパリン（4μg/ml）、ヒドロコルチゾン（2μg/ml）、L-アスパラギン酸（15μg/ml）、L-システイン（30μg/ml）、L-チロシン（20μg/ml）、硫酸マンガン一水和物（0.0002μg/ml）、モリブデン酸アンモニウム4H2O（0.004μg/ml）、ニコチンアミド（8μg/ml）、塩化ニッケル6H2O（0.0001μg/ml）、ペニシリン（60μg/ml）、フェノールレッドナトリウム塩（15μg/ml）、塩化カリウム（300μg/ml）、プトレシン二塩酸塩（0.0002μg/ml）、ピリドキシン塩酸塩（3μg/ml）、メタケイ酸ナトリウム9H2O（3μg/ml）、硫酸ナトリウム7H2O（200μg/ml）、亜セレン酸ナトリウム（0.01μg/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（100μg/ml）、チアミン塩酸塩（4μg/ml）、及び硫酸亜鉛7H2O（0.0003μg/ml）を含む内皮成長媒体であり、好ましくは、37℃に加熱される、請求項6から11のいずれか一項に記載のプロセス。
  13. - 動脈瘤、狭窄症、硬化症プラーク、腫瘍又は心筋症の形態に起因した、損傷又は変形又は劣化をシミュレーションするのに適した、解剖学的及び生理学的な機能不全特性を有する実質的に管状のスキャフォールドを準備するステップ、
    - 播種された内皮細胞（播種方法）の連続的で均質な層を取得するために、前記スキャフォールドの内部内腔の少なくとも一部に内皮細胞株を播種するステップであって、任意選択で、前記スキャフォールドの外面の少なくとも一部に筋細胞株を播種する、ステップ、
    - インビトロモデルを取得するために、内皮細胞の連続的で均一な層を取得するまで、前記内皮細胞、及び任意選択で筋細胞の成長を促進するステップ
    を含むプロセスによって取得されるコンフルエント細胞単層を有する、機能的で連続的な内皮（21）により覆われた内腔を有するスキャフォールド（21）であって、
    前記スキャフォールド（21）は、請求項1から4のいずれか一項に記載のインビトロモデルにおいて使用され、
    好ましくは、前記プロセスは、請求項6から12のいずれか一項の特徴を含む、
    スキャフォールド（21）。
  14. 心臓血管及び末梢血管領域、好ましくは、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯又はネットにおいて使用されるべき、人体使用のための医薬品又は動物使用のための獣医製品のインビトロ臨床前試験又は臨床試験を行うための、請求項1から4又は請求項13のいずれか一項に記載のスキャフォールド（21）の使用。
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