CN104490489A - 基于3d生物打印技术制备组织工程血管的方法 - Google Patents

基于3d生物打印技术制备组织工程血管的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状，经过融合后，去除上述高分子材料，构造出组织工程血管；向血管中灌注晚期内皮祖细胞，在生物反应器内经过7天的体外动态培养，获得分化的组织工程血管，所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种。本发明的方法获得的血管生物相容性好，有较强的力学性能，较好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，可用于受损或病变血管的修复和替换。

Description

基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术，特别明涉及用于治疗脉管疾病的组织工程血管，即采用3D打印的方式，制备出去支架化的组织工程血管，应用于修复或替换受损或病变的原生血管。
背景技术
血管替换是治疗脉管疾病的有效方法之一。常用的替换血管分为自体血管、异体血管和组织工程血管。人类自体血管来源有限，异体血管又存在免疫排斥，从而组织工程血管构建的研究变得尤为重要。
组织工程血管构建的基本途径是，采用与血管相似的天然或人工合成材料构建支架，在支架上种植种子细胞并培养，最终形成结构、功能与自体血管相似的组织。
目前常使用的组织工程血管有涤纶人造血管，聚氨酯材料人造血管、真丝人造血管等高分子材料人工血管。由于这一系列高分子材料人造血管都存在着生物兼容性差、使用年限短、远期通畅率差，容易造成疾病复发等问题。近年来，随着组织工程的发展，人们开始通过3D生物打印技术探索制造新型人工血管，3D生物打印技术是以高分子生物材料、细胞、细胞外基质等成分作为打印墨汁而进行活体打印的新技术。其优势就在于精确可控的三维打印细胞及生物材料的使用，并且可根据病人病变血管的形状及大小个性化的定制打印人工血管。
目前3D生物打印技术在打印血管时所采用的方式是在培养器皿中层层堆积生物墨汁细胞，然后通过后续的生物培养得到所需要的人工血管。其血管成型的具体方法有两种：第一种是垂直堆积，第二种是平行堆积成型，这两种方法同样受到血管杆的机械性能影响，获得的人工血管细胞分布杂乱，不容易精确控制。同时，这两种血管打印成型方法都存在成型速度慢、效率低，打印出的成品结构不理想，无法形成完整的生物血管等问题。
目前的组织工程血管是以水凝胶为支架材料为支架，在培养器皿中层层堆积生物墨汁细胞，然后通过后续的生物培养得到所需要的人工血管。这种方式存在以下缺点：水凝胶为支架材料存在机械强度不足，细胞密度低，替换血管的细胞相容性和组织相容性低。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，以克服以水凝胶为支架材料的机械强度不足，从而使得到的组织工程血管获得较高的细胞密度，同时提高了替换血管的细胞相容性和组织相容性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状，经过融合后，去除上述高分子材料，构造出组织工程血管；向血管中灌注晚期内皮祖细胞，在生物反应器内经过7天的体外动态培养，获得分化的组织工程血管，所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种。
具体步骤如下：
步骤a、细胞处理：
(a1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞的培养皿，用磷酸盐缓冲液清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
(a2)处理后的细胞重悬于细胞培养液，置于组织培养瓶中；
(a3)培养瓶在旋转振动器上培养，使受损细胞恢复附着能力，离心把细胞分离出来；
(a4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；
步骤b、高分子材料处理：
选择液态的上述高分子材料，当高分子材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入磷酸盐缓冲液中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状高分子材料；
步骤c、3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状高分子材料，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
(c1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体高分子材料的小瓶中，将高分子材料吸入吸液管中；
(c2)挤出：将交联后的高分子材料挤出在一个培养皿中；
(c3)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同高分子材料；
(c4)打印完成后，经过2-4天的融合过程，去除高分子材料，获得血管结构；步骤d、内皮细胞灌注：
(d1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
(d2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，旋转；
(d3)对步骤(d2)得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养。
步骤(a3)中，培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离。
所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素时，在步骤(c1)装载的步骤后还有交联的步骤：将装载有液体高分子材料的吸液管浸入装有磷酸盐缓冲液的小瓶中，使高分子材料快速交联。
步骤(c5)中，采用改变温度的方式去除普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素。
步骤(c5)中，采用螯合的方式去除阮藻酸钠。
采用离子螯合的方式去除阮藻酸钠的步骤为：将质量浓度为2％wt明胶煮沸，加入NaCl使其质量浓度为0.9％wt、加入CaCl2使其摩尔质量浓度为10mmol/L，煮沸2分钟后，放置冰箱中8h后，将上述混合物事先涂覆在装载打印物的培养皿上；在阮藻酸钠中掺入乙二胺四乙酸，挤出在铺有上述混合物的培养皿上；乙二胺四乙酸和Ca2+发生螯合作用，阮藻酸钠降解。
步骤(d2)中，细胞浓度为5x105个/mL。
步骤(d2)中，旋转的条件是：温度37℃，转速10rph，旋转30min。
步骤(d3)中，体外培养的条件是：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
本发明的有益效果是：
本发明的方法获得的血管生物相容性好，有较强的力学性能，较好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，可用于受损或病变血管的修复和替换。
本发明构建的组织工程血管是去支架的，不仅克服了以水凝胶为支架材料的机械强度不足，也获得了较高的细胞密度，同时，一定程度上提高了替换血管的细胞相容性和组织相容性。
采用螯合或改变温度的方式去除基底材料，过程简单易操作，且能够制备并获得分枝状血管。
在替换血管内层涂覆内皮细胞，能够提高血管的通透性。
内皮细胞的选择：从外周血中获取内皮细胞，操作简单，痛苦小；
内皮祖细胞分为早期内皮祖细胞(Early-outgrowth EPCs)和晚期内皮祖细胞(Late-outgrowth EPCs)，本专利选取晚期内皮祖细胞，该种细胞虽数量稀少但增殖能力强(因而仅需少量外周血即可获得大量Late-outgrowth EPCs，减少了供体的痛苦)，粘附能力强，具有典型的内皮细胞功能，能够在注入体内直接整合到血管内皮，参与血管生成，被成为“真正的”内皮祖细胞；
选择的细胞来源于患有脉管疾病的病人，有文献证明，取自于病患体内的内皮细胞能够表现出和取自非病患体内的内皮细胞相同的功能，同时避免了异体细胞导致的免疫原性。
附图说明
图1是本发明的打印方式的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
细胞处理：
1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞(hNDFs)的培养皿，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
2)处理后的细胞重悬于4mL的细胞培养液，置于10mL的组织培养瓶中；
3)培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离；
4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟。
普朗尼克F127(PF127)处理：
采用20％-30％W/W的PF127，其中，W/W为：溶质质量百分浓度(w/w)＝溶质质量/溶液质量
选择温度在4-5℃的液态普朗尼克F127，当材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入常温下的PBS中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状的普朗尼克F127。
3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状的普朗尼克F127，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体普朗尼克F127的小瓶中，将普朗尼克F127吸入吸液管中；
2)交联：将装载有液体普朗尼克F127的吸液管浸入装有常温磷酸盐缓冲液的小瓶中，使普朗尼克F127快速交联；
3)挤出：将交联后的普朗尼克F127挤出在一个培养皿中；
4)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同普朗尼克F127；
5)打印完成后，经过2-4天的融合过程，通过改变温度去除普朗尼克F127，获得血管结构。
打印过程如图1所示，x代表细胞柱，其他代表普朗尼克F127柱。
内皮细胞灌注：
1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，细胞浓度为5x105个/mL，37℃下10rph旋转30min；
3)对上一步得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
本实施例得到的组织工程血管(TEBVs)内径0.81mm，壁厚0.35mm，平均爆破压力1770±420mmHg，CAD EPCs的附着率大于90％。
实施例2
细胞处理：
1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞(hNDFs)的培养皿，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
2)处理后的细胞重悬于4mL的细胞培养液，置于10mL的组织培养瓶中；
3)培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离；
4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；
聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)处理：
选择液态聚N-异丙基丙烯酰胺，当材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入PBS中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状聚N-异丙基丙烯酰胺；
3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状聚N-异丙基丙烯酰胺，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体聚N-异丙基丙烯酰胺的小瓶中，将聚N-异丙基丙烯酰胺吸入吸液管中；
2)交联：将装载有液体聚N-异丙基丙烯酰胺的吸液管浸入装有33℃的磷酸盐缓冲液的小瓶中，使聚N-异丙基丙烯酰胺发生细微形变，利于后续挤出步骤；
3)挤出：将交联后的聚N-异丙基丙烯酰胺柱挤出在一个培养皿中；
4)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同聚N-异丙基丙烯酰胺；
5)打印完成后，经过2-4天的融合过程，通过改变温度去除聚N-异丙基丙烯酰胺，获得血管结构；
内皮细胞灌注：
1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，细胞浓度为5x105个/mL，37℃下10rph旋转30min；
3)对上一步得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
本实施例得到的组织工程血管(TEBVs)内径1.5mm，壁厚0.25mm，平均爆破压力3680±750mmHg，CAD EPCs的附着率大于85％。
实施例3
细胞处理：
1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞(hNDFs)的培养皿，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
2)处理后的细胞重悬于4mL的细胞培养液，置于10mL的组织培养瓶中；
3)培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离；
4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；
甲基纤维素(MC)处理：
甲基纤维素(MC)的含量为12％-16％，加入PBS，构成MC-water-salt系统。
选择上述的液态甲基纤维素，当材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入32℃以上的PBS中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状甲基纤维素；
3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状甲基纤维素，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体甲基纤维素的小瓶中，将甲基纤维素吸入吸液管中；
2)交联：将装载有液体甲基纤维素的吸液管浸入装有32℃以上的磷酸盐缓冲液的小瓶中，使甲基纤维素快速交联；
3)挤出：将交联后的甲基纤维素挤出在一个培养皿中；
4)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同甲基纤维素；
5)打印完成后，经过2-4天的融合过程，通过改变温度去除甲基纤维素，获得血管结构；
内皮细胞灌注：
1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，细胞浓度为5x105个/mL，37℃下10rph旋转30min；
3)对上一步得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
本实施例得到的组织工程血管(TEBVs)内径4.5mm，壁厚0.42mm，平均爆破压力3468±525mmHg，CAD EPCs的附着率大于85％。
实施例4
细胞处理：
1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞(hNDFs)的培养皿，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
2)处理后的细胞重悬于4mL的细胞培养液，置于10mL的组织培养瓶中；
3)培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离；
4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；
阮藻酸钠处理：
选择液态阮藻酸钠，向其中掺入乙二胺四乙酸(EDTA)，将材料吸入打印头上的微量吸液管，连续挤出条状阮藻酸钠；
3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状阮藻酸钠，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
1)培养皿预处理：将质量浓度为2％wt明胶煮沸，加入NaCl使其质量浓度为0.9％wt、加入CaCl2使其摩尔质量浓度为10mmol/L，煮沸2分钟后，放置冰箱中8h后，将上述混合物涂覆在装载打印物的培养皿上；
2)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体阮藻酸钠的小瓶中，将阮藻酸钠吸入吸液管中，其中，阮藻酸钠中掺入了乙二胺四乙酸(EDTA)；
3)挤出：将交联后的阮藻酸钠挤出在一个培养皿中；
4)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同阮藻酸钠；
5)打印完成后，经过2-4天的融合过程，乙二胺四乙酸(EDTA)和Ca2+发生螯合作用，阮藻酸钠溶解，获得血管结构；
内皮细胞灌注：
1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，细胞浓度为5x105个/mL，37℃下10rph旋转30min；
3)对上一步得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
本实施例得到的组织工程血管(TEBVs)内径3.0mm，壁厚0.35mm，平均爆破压力3020±600mmHg，CAD EPCs的附着率大于86％。

Claims (10)

1.一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状，经过融合后，去除上述高分子材料，构造出组织工程血管；向血管中灌注晚期内皮祖细胞，在生物反应器内经过7天的体外动态培养，获得分化的组织工程血管，所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种。
2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤a、细胞处理：
(a1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞的培养皿，用磷酸盐缓冲液清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；
(a2)处理后的细胞重悬于细胞培养液，置于组织培养瓶中；
(a3)培养瓶在旋转振动器上培养，使受损细胞恢复附着能力，离心把细胞分离出来；
(a4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；
步骤b、高分子材料处理：
选择液态的上述高分子材料，当高分子材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入磷酸盐缓冲液中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状高分子材料；
步骤c、3D血管打印：
3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状高分子材料，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；
(c1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体高分子材料的小瓶中，将高分子材料吸入吸液管中；
(c2)挤出：将交联后的高分子材料挤出在一个培养皿中；
(c3)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同高分子材料；
(c4)打印完成后，经过2-4天的融合过程，去除高分子材料，获得血管结构；步骤d、内皮细胞灌注：
(d1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；
(d2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，旋转；
(d3)对步骤(d2)得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养。
3.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(a3)中，培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO2环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离。
4.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素时，在步骤(c1)装载的步骤后还有交联的步骤：将装载有液体高分子材料的吸液管浸入装有磷酸盐缓冲液的小瓶中，使高分子材料快速交联。
5.如权利要求1或2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(c5)中，采用改变温度的方式去除普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素。
6.如权利要求1或2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(c5)中，采用螯合的方式去除阮藻酸钠。
7.如权利要求6所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：采用离子螯合的方式去除阮藻酸钠的步骤为：将质量浓度为2％wt明胶煮沸，加入NaCl使其质量浓度为0.9％wt、加入CaCl2使其摩尔质量浓度为10mmol/L，煮沸2分钟后，放置冰箱中8h后，将上述混合物事先涂覆在装载打印物的培养皿上；在阮藻酸钠中掺入乙二胺四乙酸，挤出在铺有上述混合物的培养皿上；乙二胺四乙酸和Ca2+发生螯合作用，阮藻酸钠降解。
8.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d2)中，细胞浓度为5x105个/mL。
9.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d2)中，旋转的条件是：温度37℃，转速10rph，旋转30min。
10.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d3)中，体外培养的条件是：施以6.8dynes/cm2的壁面剪切应力，37℃恒温。
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