JP6710000B2 - マイクロファイバ - Google Patents
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Description
[1]
(1)細胞接着性ハイドロゲルを含む少なくとも1つの細胞接着性層、
(2)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性層の外周を覆う高強度ハイドロゲルを含む外殻層、及び
(3)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最近位部に位置する細胞接着性層の内周を覆う管状の細胞層
を含む、マイクロファイバ。
[2]
前記細胞接着性ハイドロゲルが、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、[1]に記載のマイクロファイバ。
[3]
前記高強度ハイドロゲルが、アルギン酸ゲル又はアガロースゲルである、[1]又は[2]に記載のマイクロファイバ。
[4]
外殻層の外径が20μm〜500μmである、[1]〜[3]のいずれか1つに記載のマイクロファイバ。
[5]
前記細胞層を構成する細胞が、血管内皮細胞、リンパ管細胞及び尿細管細胞からなる群から選択される、[1]〜[4]のいずれか1つに記載のマイクロファイバ。
[6]
前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、少なくとも1つは、前記細胞層の細胞とは異なる細胞を含む、[1]〜[5]のいずれか1つに記載のマイクロファイバ。
[7]
前記少なくとも1つの細胞接着性層の数が1層である、[1]〜[6]のいずれか1つに記載のマイクロファイバ。
[8]
[1]〜[7]のいずれか1つに記載のマイクロファイバから外殻層を除去することにより得ることができる、マイクロファイバ。
[9]
[1]〜[7]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの中空部が、前記細胞層を構成する細胞の懸濁液で満たされた、マイクロファイバ。
[10]
前記細胞の懸濁液が、ポリエチレングリコール、グリセロール、アルギン酸エステル及びデキストラン、並びにそれらの混合物からなる群から選択される液体に細胞を懸濁させて調製される、[9]に記載のマイクロファイバ。
[11]
[9]又は[10]に記載のマイクロファイバから外殻層を除去することにより得ることができる、マイクロファイバ。
[12]
(1)細胞接着性ハイドロゲルを含む少なくとも1つの細胞接着性層、
(2)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性層の外周を覆う高強度ハイドロゲルを含む外殻層、
(3)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最近位部に位置する細胞接着性層の内周を覆う細胞層、及び
(4)中空部を満たす細胞懸濁液
を含む、マイクロファイバを製造する方法であって、以下のステップ:
(i)細胞懸濁液の層流を形成し;
(ii)前記細胞懸濁液の層流の外周を覆う少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iii)前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流の外周を覆う高強度ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iv)高強度ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、高強度ハイドロゲルを含む外殻層を形成する;
(v)細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、細胞接着性ハイドロゲルを含む細胞接着性層を形成する;そして
(vi)前記細胞懸濁液中で細胞を培養して、前記細胞層を形成すること
を含む、前記マイクロファイバの製造方法。
[13]
細胞懸濁液導入管、
前記細胞懸濁液導入管と同軸にある、少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管、
前記細胞懸濁液導入管及び前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管と同軸にある、高強度ハイドロゲル調製用溶液導入管、
高強度ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域、及び
細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域
を備えるマイクロ流体装置を用いて、
(1)細胞接着性ハイドロゲルを含む少なくとも1つの細胞接着性層、
(2)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性層の外周を覆う高強度ハイドロゲルを含む外殻層、
(3)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最近位部に位置する細胞接着性層の内周を覆う細胞層、及び
(4)中空部を満たす細胞懸濁液
を含む、マイクロファイバを製造する方法であって、以下のステップ:
(i)細胞懸濁液導入管から細胞懸濁液を射出して、細胞懸濁液の層流を形成し;
(ii)少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管から、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液を射出して、前記細胞懸濁液の層流の外周を覆う少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iii)前記高強度ハイドロゲル調製用溶液導入管から、高強度ハイドロゲル調製用溶液を射出して、前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流の外周を覆う高強度ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iv)(i)〜(iii)で形成された層流の集合体を、高強度ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域に通過させて、高強度ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、高強度ハイドロゲルを含む外殻層を形成する;
(v)(i)〜(iii)で形成された層流の集合体を、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域に通過させて、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、細胞接着性ハイドロゲルを含む細胞接着性層を形成し、ここで本ステップは、ステップ(iv)の前若しくは後に行われるか、又はステップ(iv)と同時に行われ;そして
(vi)前記細胞懸濁液中で細胞を培養して、前記細胞層を形成すること
を含む、前記マイクロファイバの製造方法。
[14]
前記細胞懸濁液が、ポリエチレングリコール、グリセロール、アルギン酸エステル及びデキストラン、並びにそれらの混合物からなる群から選択される液体に細胞を懸濁させて調製される、[12]又は[13]に記載のマイクロファイバの製造方法。
[15]
前記細胞懸濁液中の細胞密度が、1.0 x 106 cells/mL〜1.0 x 108 cells/mLである、[12]〜[14]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法。
[16]
前記細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液及び前記高強度ハイドロゲル調製用溶液が異なる条件でゲル化される、[12]〜[15]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法。
[17]
前記細胞接着性ハイドロゲルが、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル又はフィブリンゲル、あるいはそれらの混合物からなる群から選択される、[12]〜[16]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法。
[18]
前記高強度ハイドロゲルが、アルギン酸ゲル又はアガロースゲルである、[12]〜[17]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法。
[19]
前記細胞接着性ハイドロゲルがコラーゲンゲルであり、前記高強度ハイドロゲルがアルギン酸ゲルである、[12]〜[18]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法。
[20]
[12]〜[19]のいずれか1つに記載の方法で製造された、マイクロファイバ。
[21]
[20]に記載のマイクロファイバから外殻層を除去することにより得ることができる、マイクロファイバ。
[22]
(1)細胞接着性ハイドロゲルを含む少なくとも1つの細胞接着性層、
(2)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性層の外周を覆う高強度ハイドロゲルを含む外殻層、及び
(3)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最近位部に位置する細胞接着性層の内周を覆う細胞層
を含む、マイクロファイバを製造する方法であって、[12]〜[19]のいずれか一つに記載の方法で製造されたマイクロファイバから細胞懸濁液を除去するステップを含む、前記方法。
[23]
[22]に記載の方法で製造された、マイクロファイバ。
[24]
[23]に記載のマイクロファイバから外殻層を除去することにより得ることができる、マイクロファイバ。
[25]
[12]〜[19]のいずれか1つに記載のマイクロファイバの製造方法を行うためのキットであって、
(i)ゲル化されて細胞接着性ハイドロゲルが形成される、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液;
(ii)ゲル化されて高強度ハイドロゲルが形成される、高強度ハイドロゲル調製用溶液;
(iii)細胞懸濁液;及び
(iv)前記マイクロファイバを製造するための説明書
を含む、前記キット。
(i)細胞懸濁液の層流を形成し;
(ii)前記細胞懸濁液の層流の外周を覆う少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iii)前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流の外周を覆う高強度ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iv)高強度ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、高強度ハイドロゲルを含む外殻層を形成する;
(v)細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、細胞接着性ハイドロゲルを含む細胞接着性層を形成する;そして
(vi)前記細胞懸濁液中で細胞を培養して、前記細胞層を形成すること
を含む、前記マイクロファイバの製造方法である。
で表される。
(i)ゲル化されて細胞接着性ハイドロゲルが形成される、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液;(ii)ゲル化されて高強度ハイドロゲルが形成される、高強度ハイドロゲル調製用溶液;(iii)細胞懸濁液;及び(iv)前記マイクロファイバを製造するための説明書を含む、前記キットである。
コラーゲンゲル及び血管内皮細胞を含むコア部、並びに当該コア部を覆うアルギン酸ゲルを含むシェル部からなるマイクロファイバの製造
非特許文献1に記載された方法で、二重の同軸の層流装置を用いて製造した。当該マイクロファイバを培養すると、血管内皮細胞からなる細胞層が自発的に形成されたが、細胞層がランダムに形成され、連続的な管腔構造を形成することはできなかった。
(a)コラーゲンゲルを含む細胞接着性層、当該細胞接着性層の外周を覆うアルギン酸ゲルを含む外殻層、及び当該細胞接着性層の内周を覆う血管内皮細胞層を含むマイクロファイバの製造
図5に示す装置を用いて製造した。細胞懸濁液1として、血管内皮細胞のポリエチレングリコール溶液(2.0 x 107cells/mL)を調製し、細胞懸濁液導入管2から流速10 μl/minで射出して、当該溶液の層流を形成した。細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液3として、コラーゲン水溶液(4 mg/ml)を調製し、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管4から流速200 μl/minで射出して、細胞懸濁液の層流の外周を覆うコラーゲン水溶液の層流を形成した。高強度ハイドロゲル調製用溶液5として、アルギン酸ナトリウム水溶液(1.5 mg/ml)を調製し、高強度ハイドロゲル調製用溶液導入管6から流速125 μl/minで射出して、コラーゲン水溶液の層流の外周を覆うアルギン酸ナトリウム水溶液の層流を形成した。得られる層流の集合体を、高強度ハイドロゲル調製用溶液、及び細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域8においてゲル化した。具体的には、ゲル化剤溶液7である塩化カルシウム水溶液(100mM、流速2500 μl/min)に導入し、37℃で15分間加熱し、マイクロファイバ(外殻層の内径:270 μm、外殻層の外径:350 μm、コラーゲン層の厚み:100 μm。いずれも、位相差光学顕微鏡による画像からの計測値の平均値として計算された)を製造した。得られたマイクロファイバ中で細胞培養することにより、コラーゲン層の内周を均一に覆う単層の血管内皮細胞層が形成された。
(b)外殻層の溶解
(a)で得られたマイクロファイバにアルギン酸リアーゼを作用させることで、外殻層のアルギン酸ゲルを溶解した(図2)。
血管平滑筋細胞及びコラーゲンゲルを含む細胞接着性層、当該細胞接着性層の外周を覆うアルギン酸ゲルを含む外殻層、及び当該細胞接着性層の内周を覆う血管内皮細胞層を含むマイクロファイバの製造
細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液3として、血管平滑筋細胞(1.25 x 106 cells/mL)を含むコラーゲン水溶液(4 mg/ml)を調製し、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管4から流速200 μl/minで射出して、細胞懸濁液の層流の外周を覆うコラーゲン水溶液の層流を形成すること以外は、実施例1と同様にして、マイクロファイバを製造した(外殻層の内径:270 μm、外殻層の外径:350 μm、コラーゲン層の厚み:100 μm。いずれも、位相差光学顕微鏡による画像からの計測値の平均値として計算された)。得られたマイクロファイバ中で細胞培養することにより、単層の血管内皮細胞層の外側に血管平滑筋細胞層が積層されたマイクロファイバが得られた(図3)。
実施例1で得られたマイクロファイバを狭窄したガラス管に挟むことにより,マイクロファイバの中空部に送液を行った。シリンジポンプを利用して流速1 μL/minで送液を行ったところ、形成した血管内皮層内の中空部に送液が可能であった。直径5 μmのポリスチレンビーズの分散液を送液したところ、光学顕微鏡でビーズが送液に伴い中空部を移動することを確認した(図4の上部(t=0秒)と下部(t=18秒)を参照。図中、矢印はポリスチレンビーズを示す)。
2 細胞懸濁液導入管
3 細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液
4 細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管
5 高強度ハイドロゲル調製用溶液
6 高強度ハイドロゲル調製用溶液導入管
7 ゲル化剤溶液
8 高強度ハイドロゲル調製用溶液、及び細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域
9 中空部
10 細胞層
11 細胞接着性層
12 外殻層
Claims (23)
- (1)細胞接着性ハイドロゲルを含む少なくとも1つの管状の細胞接着性層、
(2)前記少なくとも1つの管状の細胞接着性層のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性層の外周を覆うハイドロゲルを含む外殻層、及び
(3)前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、中心軸から最近位部に位置する細胞接着性層の内周を覆う管状の細胞層
を含み、
前記細胞接着性層の外周を覆うハイドロゲルが、アルギン酸ゲル又はアガロースゲルである、マイクロファイバ。 - 前記細胞接着性ハイドロゲルが、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載のマイクロファイバ。
- 外殻層の外径が20μm〜500μmである、請求項1又は2に記載のマイクロファイバ。
- 前記細胞層を構成する細胞が、血管内皮細胞、リンパ管細胞及び尿細管細胞からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロファイバ。
- 前記少なくとも1つの細胞接着性層のうち、少なくとも1つは、前記細胞層の細胞とは異なる細胞を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のマイクロファイバ。
- 前記少なくとも1つの細胞接着性層の数が1層である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のマイクロファイバ。
- 前記管状の細胞層の内側が、前記細胞層を構成する細胞の懸濁液で満たされた、請求項1〜6のいずれか1項に記載のマイクロファイバ。
- 前記細胞の懸濁液が、ポリエチレングリコール、グリセロール、アルギン酸エステル及びデキストラン、並びにそれらの混合物からなる群から選択される液体に細胞を懸濁させて調製される、請求項7に記載のマイクロファイバ。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のマイクロファイバから外殻層を除去することにより得ることができる、マイクロファイバ。
- マイクロファイバの製造方法であって、以下のステップ:
(i)細胞懸濁液の層流を形成し;
(ii)前記細胞懸濁液の層流の外周を覆う少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iii)前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流の外周を覆う外殻用ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成し;
(iv)前記外殻用ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、外殻用ハイドロゲルを含む外殻層を形成する;
(v)細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、細胞接着性ハイドロゲルを含む細胞接着性層を形成する;そして
(vi)前記細胞懸濁液中で細胞を培養して、前記細胞接着性層の内周を覆う管状の細胞層を形成すること
を含み、
前記外殻用ハイドロゲルが、アルギン酸ゲル又はアガロースゲルである、マイクロファイバの製造方法。 - ステップ(v)が、ステップ(iv)の前若しくは後に行われるか、又はステップ(iv)と同時に行われる、請求項10に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記細胞懸濁液が、ポリエチレングリコール、グリセロール、アルギン酸エステル及びデキストラン、並びにそれらの混合物からなる群から選択される液体に細胞を懸濁させて調製される、請求項10又は11に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記細胞懸濁液中の細胞密度が、1.0 x 106 cells/mL〜1.0 x 108 cells/mLである、請求項10〜12のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液及び前記外殻用ハイドロゲル調製用溶液が異なる条件でゲル化される、請求項10〜13のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記細胞接着性ハイドロゲルが、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル又はフィブリンゲル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10〜14のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記外殻用ハイドロゲルが、アルギン酸ゲルである、請求項10〜15のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記細胞接着性ハイドロゲルがコラーゲンゲルである、請求項10〜16のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記外殻層を除去することを含む、請求項10〜17のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 前記管状の細胞層の内側の細胞懸濁液を除去するステップを含む、請求項10〜18のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法。
- 請求項10〜19のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法を行うためのキットであって、
(i)ゲル化されて細胞接着性ハイドロゲルが形成される、細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液;
(ii)ゲル化されてアルギン酸ゲル又はアガロースゲルが形成される、外殻用ハイドロゲル調製用溶液;及び
(iii)細胞懸濁液
を含む、前記キット。 - 請求項10〜19のいずれか1項に記載のマイクロファイバの製造方法を行うための装置であって、
(i)細胞懸濁液の層流を形成する細胞懸濁液導入管、
(ii)前記細胞懸濁液の層流の外周を覆う少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成する少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液導入管、及び
(iii)前記少なくとも1つの細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流のうち、中心軸から最遠位部に位置する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液の層流の外周を覆う外殻用ハイドロゲル調製用溶液の層流を形成する外殻用ハイドロゲル調製用溶液導入管、
を含む装置。 - (iv)前記外殻用ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、外殻用ハイドロゲルを含む外殻層を形成する、外殻用ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域、及び
(v)細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液をゲル化し、細胞接着性ハイドロゲルを含む細胞接着性層を形成する細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域、
を含む、請求項21に記載の装置。 - 前記外殻用ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域と前記細胞接着性ハイドロゲル調製用溶液のゲル化領域とが、同一領域又は異なる領域である、請求項22に記載の装置。
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