CN116710110A - 新型的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维 - Google Patents
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Abstract
需要进一步的抗体的生产方法。本文中提供将芯层用阳离子性聚合物被覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法，所述芯层包含产生抗体的细胞(例如，产生抗体的CHO细胞)或产生生理活性物质的细胞(例如，来自胰腺β细胞的MIN6细胞)与交联海藻酸凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及用于生产抗体、生理活性物质等的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法。此外，本发明还涉及用于生产抗体、生理活性物质等的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法。
背景技术
迄今为止，已知通过使用动物细胞的培养来生产抗体、生理活性物质(例如，干扰素、促红细胞生成素、IL-2(白介素-2)、CSF(集落刺激因子)、TNF(肿瘤坏死因子)等)等的各种方法。
生产抗体时，作为产生抗体的细胞，CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)、Sp2/0细胞、NS0细胞等被用作宿主细胞，特别时CHO细胞是能够悬浮培养的细胞，而且细胞的增殖速度快，通过CHO细胞的大量培养，容易大量生产目标蛋白，因此在抗体的制造中被广泛应用。
近年来，在抗体药品的开发·制造中，要求向抗体药品的稳定生产、低成本化努力，为了实现这些，生产率更高效的生产系统(例如，连续生产方法、利用小规模生产设备用于产生必要量的抗体的新型培养技术等)的开发受到关注。
产生抗体的细胞的培养是在转瓶等中使产生抗体的细胞株产生细胞，然后一边控制培养基组成·温度·搅拌条件·气体交换·pH等培养条件，一边进行扩大培养，最终在数千至1万L规模的大规模生产培养罐中进行培养。
在以高密度连续培养产生抗体的细胞时，(1)细胞与培养液的分离方法、(2)有效的氧供给方法等有时成为问题。虽然对(1)和(2)谋求了各种改善，但为了有效地生产抗体，需要解决其它各种问题。
已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含各种细胞，壳层由海藻酸凝胶组成(专利文献1：国际公开第2011/046105号小册子、专利文献2：日本特开2016-77229号公报)。
已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含产生抗体的细胞，壳层由海藻酸凝胶组成(专利文献3：国际公开第2020/032221号小册子)。
已知海藻酸凝胶中空纤维，其中中空部包含各种细胞，外壳层为海藻酸凝胶(专利文献4：国际公开第2015/178427号小册子、专利文献5：专利第6601931号公报、专利文献6：日本特开2014-236698号公报)。
已知将包含细胞(具体地，人皮肤成纤维细胞、HEK293T细胞)的海藻酸水凝胶纤维用包含纳米颗粒的粘接剂粘接而成的束，所述纳米颗粒是表面用阳离子性水溶性聚合物被覆的纳米颗粒(专利文献7：国际公开第2019/078251号小册子、专利文献8：国际公开第2019/123886号小册子)。
已知有使用壳聚糖将神经干细胞或含神经干细胞的海藻酸水凝胶纤维集束化而成的移植用神经束(专利文献9：日本特开2014-136128号公报)。
已知将包含粘附性细胞(具体地，C2C12细胞)、微载体和凝胶状多糖类(具体地，海藻酸凝胶)的混合物用聚氨基酸被覆的细胞结构体(可举出例如片材状(板状)、纤维状(纤维状)、球状等)(专利文献10：日本特开2019-075993号公报)。
已知将包含细胞(293/GFP细胞)的海藻酸钙微纤维用聚-L-赖氨酸被覆，并用柠檬酸钠溶液溶解而得的管状凝胶(非专利文献1：PA-Lab Chip，2008，8，p1255-1257)。
已知在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基团而导入了环状烷基或叠氮基的化学修饰海藻酸衍生物(专利文献11：国际公开第2019/240219号小册子、专利文献12：国际公开第2021/125255号小册子)。
已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含产生抗体的细胞，壳层包含由化学修饰海藻酸衍生物形成的交联海藻酸凝胶(专利文献13：国际公开第2021/125279号小册子)。
专利文献1～13和非专利文献1中既没有公开也没有暗示本发明的抗体、生理活性物质等的生产用的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、各凝胶纤维的制造方法、和使用各凝胶纤维的抗体等的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2011/046105号小册子
专利文献2：日本特开2016-77229号公报
专利文献3：国际公开第2020/032221号小册子
专利文献4：国际公开第2015/178427号小册子
专利文献5：日本专利第6601931号公报
专利文献6：日本特开2014-236698号公报
专利文献7：国际公开第2019/078251号小册子
专利文献8：国际公开第2019/123886号小册子
专利文献9：日本特开2014-136128号公报
专利文献10：日本特开2019-075993号公报
专利文献11：国际公开第2019/240219号小册子
专利文献12：国际公开第2021/125255号小册子
专利文献13：国际公开第2021/125279号小册子
非专利文献
非专利文献1：PA-Lab Chip，2008，8，p1255-1257
发明内容
发明要解决的课题
要求含有能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的海藻酸凝胶纤维，特别是纤维不分解、可长期(例如，7天以上、14天以上、28天以上等)进行细胞培养的更为实用的海藻酸凝胶纤维。
用于解决课题的手段
本发明人等反复深入研究，结果发现将交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的新型聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和其制造方法，所述交联海藻酸凝胶包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞，且通过使用后述的方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得到。另外，还发现使用该聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进行产生抗体、生理活性物质等的细胞的培养时，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维不分解，能够长期连续产生抗体、生理活性物质等，从而完成了本发明。进一步，还发现将聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维用阴离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的新型多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和其制造方法，所述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是将交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述交联海藻酸凝胶是通过使用后述的方式[1B]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的。另外，还发现使用该多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进行产生抗体的细胞的培养时，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维不分解，能够长期连续产生抗体等。
发明效果
根据本发明，提供新型聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和使用该凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的生产方法。在一些方式中，通过将使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、后述方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液制作的交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆，由此提供能够长期连续产生抗体、生理活性物质等的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。另外，根据本发明，提供新型多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和使用该凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的生产方法。在一些方式中，通过将使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、后述方式[1B]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液制作的交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，并将其用阴离子性聚合物被覆，由此提供能够长期连续产生抗体、生理活性物质等的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
由后述实施例可知，通过将使用包含产生抗体的细胞(产生抗GPVI抗体的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞)或产生生理活性物质的细胞(来自胰腺β细胞的MIN6细胞)、式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液形成的交联海藻酸凝胶(也称为芯层)用聚-L-鸟氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)的阳离子性聚合物(也称为阳离子性聚合物层)被覆，可以制作聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，使用该纤维进行培养时，可以长期(后述实施例中，最大47天)连续产生抗体或胰岛素。本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维具有下述特征：提供适于能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的环境，在该纤维的芯层中产生的抗体、生理活性物质等连续透过芯层、阳离子性聚合物层而释放至该纤维外。
进一步，由后述实施例可知，通过将芯层包含产生托珠单抗的CHO细胞的前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的外侧使用作为阴离子性聚合物(也称为阴离子性聚合物层)的海藻酸、式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行被覆，可以制作多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，或者通过使用该纤维进行培养，可以长期(后述实施例中，最大35天)连续产生抗体。本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维具有下述特征：与前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维相同地提供适于能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的环境，在该纤维的芯层中产生的抗体、生理活性物质等连续透过芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层而释放至该纤维外。
本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维提供适于抗体、生理活性物质等的生产的环境。对封入芯层的抗体、生理活性物质等的产生细胞的物理压力少，可期待封入的该细胞长期持续产生抗体、生理活性物质等。因此，使用这种纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法可以期待飞跃性地提高抗体、生理活性物质等的生产效率。例如，抗体生产的情况中，与需要大规模的培养罐的抗体的悬浮培养不同，还可期待以小规模的生产设备来制造抗体。也可期待作为适于少量·多种品种的抗体药品制造的下一代型抗体药品的连续生产技术。
附图说明
图1：是聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的截面图。
图2：是聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层与阳离子性聚合物层的示意图。
图3：是说明聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造过程的1个方式的示意图。
图4：是聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的横截面。是说明芯层中产生的抗体、生理活性物质等代谢物和废物、以及培养液(营养源)和氧透过阳离子性聚合物层的示意图。
图5：是(实施例F2-C)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB2-A-5-c1)的培养前的照片。
图6：是(实施例F2-C)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB2-A-5-c1)的培养后的照片。
图7：是(实施例F3)中制作的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的荧光显微镜的照片。
图8：是多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的截面图。
图9：是多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的示意图。
图10：是说明多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造过程的1个方式的示意图。
图11：是多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的横截面。是说明芯层中产生的抗体、生理活性物质等代谢物和废物、以及培养液(营养源)和氧透过阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的示意图。
图12：是(实施例F9)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-3-c3)的培养前的照片。
图13：是(实施例F9)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-3-c3)的培养后的照片。
图14：是(实施例F9)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-2-c2)的培养前的照片。
图15：是(实施例F9)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-2-c2)的培养后的照片。
图16：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac1)的培养前的照片。
图17：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac1)的培养后的照片。
图18：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac3)的培养前的照片。
图19：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac3)的培养后的照片。
图20：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac2)的培养前的照片。
图21：是(实施例F12)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac2)的培养后的照片。
图22：是(实施例F14)中制作的荧光标记海藻酸凝胶纤维(FB14-c2-2)的荧光显微镜的照片。
图23：是(实施例F14)中制作的荧光标记海藻酸凝胶纤维(FB14-c1-1)的荧光显微镜的照片。
具体实施方式
具体方式
这里，对聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法的具体方式进行说明。另外，也对多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法的具体方式进行说明。更具体地，如以下方式[1]～[7C-2]所述。
[1]第1方式如下所述。聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其是将芯层用阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)被覆而得的，所述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、以及使用下述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶。
[式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物]
下述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物，
[化1]
式(I)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；Akn-L1-是选自下述表中记载的部分结构式中的基团，其中Akn表示环状烷基；-L1-为与环状烷基(Akn)键合的2价连接基团；
[表1-1]
[表1-2]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物]
下述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，
[化2]
式(II)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；-L2-表示选自下述表中记载的部分结构式中的连接基团，
[表2]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1A]第1A的方式如下所述。聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其是包含芯层、配置于前述芯层的外侧的阳离子性聚合物层的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞和使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成交联而成的交联海藻酸凝胶，前述阳离子性聚合物层为阳离子性聚合物。式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与前述方式[1]中定义的相同。
[1-1-1]前述方式[1]或[1A]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表3-1]
[表3-2]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[1-1-2]前述方式[1]或[1A]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-更优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表3-3]
[表3-4]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[1-1-3]前述方式[1]或[1A]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-进一步优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化3]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[1-1-4]前述方式[1]或[1A]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-特别优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化4]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[1-1-5]前述方式[1]或[1A]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-是选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表3-5]
各式中，虚线右侧不包括在内；
优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表3-6]
各式中，虚线右侧不包括在内；
更优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表3-7]
各式中，虚线右侧不包括在内；
进一步优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化5]
各式中，虚线右侧不包括在内。
[1-2-1]前述方式[1]或[1A]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表4-1]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-2-2]前述方式[1]或[1A]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-更优选为选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表4-2]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-2-3]前述方式[1]或[1A]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-进一步优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化6]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-2-4]前述方式[1]或[1A]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-特别优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化7]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-2-5]前述方式[1]或[1A]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-是选自下述表中记载的部分结构式中的基团，
[表4-3]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
优选为选自下述部分结构式(各式中，虚线右侧不包括在内)中记载的部分结构式中的基团，
[表4-4]
/>
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
更优选为选自下述部分结构式(各式中，虚线右侧不包括在内)中记载的部分结构式中的基团，
[表4-5]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
进一步优选为选自下述部分结构式中的基团，
[化8]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-2A]通过使用适宜组合前述方式[1]～[1-2-5]中记载的Akn、-L1-、-L2-的定义而得的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，可任意地形成本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的交联海藻酸凝胶的优选方式。
[1-3]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞是选自例如，产生抗体(人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体等各种单克隆抗体)的细胞、产生生理活性物质的细胞和能够产生可用作药品原料、化学原料、食品原料等的各种有用物质的细胞中的细胞。
[1-3-1]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体的细胞(也称为产生抗体的细胞)是杂交瘤或由抗体表达载体转化的培养细胞，用作其宿主的培养细胞(宿主细胞)是例如选自CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、PERC6细胞、YB2/0细胞、YE2/0细胞、1R983F细胞、Namalwa细胞、Wil-2细胞、Jurkat细胞、Vero细胞、Molt-4细胞、HEK293细胞、BHK细胞、KGH6细胞、P3X63Ag8.653细胞、C127细胞、JC细胞、LA7细胞、ZR-45-30细胞、hTERT细胞、NM2C5细胞、UACC-812细胞等中的细胞。
[1-3-2]前述方式[1]或[1A]中，对于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生抗体的细胞，优选其宿主细胞是选自CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、和PERC6细胞中的细胞；更优选是选自CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞和NS0细胞中的细胞；进一步优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
[1-3-3]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生抗体的细胞，例如，其宿主细胞是作为CHO细胞的产生抗体的CHO细胞，例如是选自产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生抗GPVI抗体的CHO细胞等中的CHO细胞；例如是选自产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、和产生抗GPVI抗体的CHO细胞中的CHO细胞；例如是产生托珠单抗的CHO细胞或产生抗GPVI抗体的CHO细胞。
[1-3-4]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生生理活性物质的细胞(也称为产生生理活性物质的细胞)例如是选自胰岛素分泌细胞、胰岛、胰岛细胞、多巴胺分泌细胞、脑垂体细胞、生长激素分泌细胞、甲状旁腺细胞、神经生长因子分泌细胞、凝血因子分泌细胞、肝细胞、甲状旁腺细胞、促红细胞生成素分泌细胞、去甲肾上腺素分泌细胞等中的细胞。
[1-3-5]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生生理活性物质的细胞优选为选自胰岛素分泌细胞、胰岛、和胰岛细胞中的细胞；更优选为来自胰腺β细胞的MIN6细胞。
[1-4]前述方式[1]或[1A]中，作为能够在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的成分，例如是选自海藻酸溶液、海藻酸凝胶、培养基、培养液、胶原溶液、甲基纤维素、蔗糖溶液等中的成分。
[1-4-1]前述方式[1]或[1A]中，作为能够在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的成分，优选为选自海藻酸溶液、海藻酸凝胶、培养基、和培养液中的成分。
[1-5]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为例如约100,000Da～约3,000,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围，更优选为约500,000Da～约2,000,000Da的范围。
[1-6]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为例如约100,000Da～约3,000,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围，更优选为约500,000Da～约2,000,000Da的范围。
[1-7]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团(Akn-L1-NH2基：Akn-L1-与前述方式[1]中的定义相同)的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约10mol％的范围。
[1-8]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团(N3-L2-NH2基：-L2-与前述方式[1]中的定义相同)的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约15mol％的范围。
[1-9]前述方式[1]或[1A]中，可在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的制备中所用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围；
优选为约300,000Da～约2,000,000Da的范围，
更优选为约700,000Da～约2,000,000Da的范围。
[1-9-1]前述方式[1]或[1A]中，可在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的制备中所用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围；更优选为选自约700,000Da～约1,400,000Da、约800,000Da～约1,500,000Da、约1,400,000～约2,000,000Da、或约1,500,000～约2,500,000中的范围。
[1-10-1]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度为例如约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。
[1-10-2]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物])所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度为例如约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。
[1-10-3]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度为例如约0.02～约2.0重量％的范围；优选为约0.1～约2.0重量％的范围；更优选为约0.15～约1.5重量％的范围。
[1-10-4]前述方式[1]或[1A]中，可在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的浓度为例如0～约1.98重量％的范围；优选为0～约1.8重量％的范围；更优选为0～约1.7重量％的范围。
[1-11-1]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与海藻酸溶液的浓度的总浓度优选为约0.5～约2.0重量％；更优选为选自约1.0重量％、约1.5重量％和约2.0重量％中的浓度。
[1-11-2]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1∶C2)＝(约0.2∶约1.3)、(约0.5∶约1.0)、(约1.0∶约0.5)、(约1.5∶0)、(约0.66∶约1.34)、和(约0.34∶约0.66)中的组合。
[1-11-3]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1A∶C1N∶C2)＝(约0.1∶约0.1∶约1.3)、(约0.25∶约0.25∶约1.0)、(约0.5∶约0.5∶约0.5)、(约0.75∶约0.75∶0)、(约0.33∶约0.33∶约1.34)、和(约0.17∶约0.17∶约0.66)中的组合。
[1-11-4]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的混合溶液中的各衍生物的溶液的容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如为(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
[1-11-5]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、和海藻酸溶液的混合溶液中的各溶液的容量(v1、v2、v3)的容量比为例如v1+v2+v3＝15的比率，例如为(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等的组合。
[1-12]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由下述式(III-L)所示的基团得到的化学交联，
[化9]
式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；
-X-是选自下述表中记载的部分结构式的组中的环状基，
[表5-1]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
-L1-在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表5-2]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
-L1-在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表5-3]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
-L2-与前述方式[1]中的式(II)的定义相同。
[1-12-1]前述方式[1-12]中记载的式(III-L)中，-L1-为前述方式[1-12]，且优选地，在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表6-1]
/>
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表6-2]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
更优选地，在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表6-3]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下为选自下述表中记载的部分结构式中的2价连接基团，
[表6-4]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
更优选地，在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下为选自下述部分结构式中的2价连接基团，
[化10]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下为选自下述部分结构式中的2价连接基团，
[化11]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
特别优选地，在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下为下述部分结构式的2价连接基团，
[化12]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下为下述部分结构式的2价连接基团，
[化13]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1-12-2]前述方式[1-12]中记载的式(III-L)中，优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的-L2-分别与前述方式[1-2-1]～[1-2-4]中记载的定义相同。
[1-12-3]前述方式[1-12]中，式(III-L)所示的基团的-L2-X-L1-的优选组合如选自下述表的式中的部分结构所示，
[表7-1]
表中的-L1-与前述方式[1-12-1]中记载的优选的-L1-的定义相同；-L2-与前述方式[1-2-1]中记载的优选的-L2-的定义相同；-X-如前述方式[1-12]中记载所述；
更优选-L2-X-L1-的组合如选自下述表的式中的部分结构所示：
[表7-2]
表中的-L1-与前述方式[1-12-1]中记载的更优选的-L1-的定义相同；-L2-与前述方式[1-2-2]中记载的更优选的-L2-的定义相同；-X-如前述方式[1-12]中记载所述；
更优选-L2-X-L1-的组合如选自下述表的式中的部分结构所示：
[表7-3]
表中的-L1-与前述方式[1-12-1]中记载的进一步优选的-L1-的定义相同；-L2-与前述方式[1-2-3]中记载的进一步优选的-L2-的定义相同；-X-如前述方式[1-12]中记载所述；
特别优选-L2-X-L1-的组合如选自下述表的式中的部分结构所示：
[表7-4]
表中的-L1-与前述方式[1-12-1]中记载的特别优选的-L1-的定义相同；-L2-与前述方式[1-2-4]中记载的特别优选的-L2-的定义相同；-X-如前述方式[1-12]中记载所述。
[1-12A]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由前述方式[1-12]中记载的式(III-L)所示的基团得到的化学交联，式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-、-X-与前述方式[1-12]中的定义相同；-L1-在-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下与前述方式[1-12]中记载的部分结构式(LK-1a)所示的基团相同；在-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下与前述方式[1-12]中记载的部分结构式(LK-2-1)所示的基团相同；-L2-与选自前述方式[1]中记载的部分结构式(LN-1)、(LN-3)和(LN-5)中的基团相同。
[1-12A-1]前述方式[1-12A]中，-X-为(CL-1)或(CL-1-r)的情况下，优选的、更优选的、进一步优选的-L1-分别与前述方式[1-12]中记载的部分结构式(LK-1a-1)、(LK-1a-2)、(LK-1a-3)所示的基团相同；-X-为(CL-2)或(CL-2-r)的情况下，优选的、更优选的、进一步优选的-L1-分别与前述方式[1-12]中记载的部分结构式(LK-2-1)、(LK-2-2)、(LK-2-3)所示的基团相同；-L2-优选与前述方式[1-2-1]中记载的部分结构式(LN-1-1)、(LN-3-1)、(LN-5-1)所示的基团相同，更优选与前述方式[1-2-2]中记载的部分结构式(LN-1-2)、(LN-3-2)、(LN-5-2)所示的基团相同，进一步优选与前述方式[1-2-3]中记载的部分结构式(LN-1-3)、(LN-3-3a)、(LN-5-3a)所示的基团相同。
[1-12A-2]前述方式[1-12A]中，式(III-L)所示的基团的-L2-X-L1-的优选的、更优选的、进一步优选的组合如选自下述表的式中的部分结构所示：
[表7-5]
表中的-L1-、-L2-与前述方式[1-12A-1]中记载的定义相同；-X-如前述方式[1-12]中记载所述。
[1-13]前述方式[1]或[1A]中，芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由前述方式[1-12]的式(III-L)[式(III-L)中，各定义与方式[1-12]的定义相同]或前述方式[1-12A]的式(III-L)[式(III-L)中，各定义与方式[1-12A]的定义相同]所示的基团得到的化学交联和介由2价金属离子得到的离子交联。
[1-13A]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的离子交联形成中所用的2价金属离子优选为选自钙离子、镁离子、钡离子、锶离子和锌离子中的2价金属离子；更优选为钙离子、钡离子或锶离子；进一步优选为钙离子或钡离子。
[1-14]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的离子交联形成中所用的包含2价金属离子的水溶液可以以选自氯化钙水溶液、碳酸钙水溶液、葡萄糖酸钙水溶液、氯化钡水溶液、氯化锶水溶液等中的包含2价金属离子的水溶液作为供给源；优选为氯化钙水溶液或氯化钡水溶液。
[1-15-1]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物是选自聚氨基酸、碱性多糖类和碱性聚合物等中的阳离子性聚合物。
[1-15-2]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物优选为选自作为聚氨基酸的聚-L-鸟氨酸(PLO)、聚-D-鸟氨酸(PDO)、聚-DL-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸(PDL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-DL-赖氨酸、聚-L-精氨酸(PLA)、聚-D-精氨酸(PDA)、聚-DL-精氨酸、聚-L-高精氨酸(PLHA)、聚-D-高精氨酸(PDHA)、聚-DL-高精氨酸、聚-L-组氨酸(PLH)、聚-D-组氨酸(PDH)和聚-DL-组氨酸中的阳离子性聚合物；更优选为聚-L-鸟氨酸或聚-L-赖氨酸；进一步优选为聚-L-鸟氨酸。
[1-15-3]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物为壳聚糖。
[1-15-4]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物是选自聚亚甲基-CO-胍(PMCG)、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯基胺(PVA)、聚乙烯亚胺、烯丙基胺-二烯丙基胺共聚物、和烯丙基胺-马来酸共聚物中的阳离子性聚合物；优选为聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺、或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)。
[1-16]前述方式[1]或[1A]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径为例如约0.1～约2000μm的范围。
通过使用将前述方式中记载的Akn、-L1-、-L2-、X的定义适宜组合得到的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，可任意地形成前述方式的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的交联海藻酸凝胶的优选方式。
[1-17-1]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1-3-1]～[1-3-3]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-1]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-1B]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自方式[1B-3-1]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-1]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-2]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维更优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的更优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的更优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1-3-2]～[1-3-3]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]～[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-2B]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维更优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的更优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的更优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自方式[1B-3-2]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]～[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-3]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进一步优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-3]中记载的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-3]中记载的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1-3-2]～[1-3-3]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]或[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-3B]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进一步优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-3]中记载的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-3]中记载的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自方式[1B-3-3]或[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]或[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-4]前述方式[1]或[1A]的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维特别优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-4]中记载的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-4]中记载的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自产生抗体的CHO细胞；阳离子性聚合物层阳离子性聚合物层选自聚-L-鸟氨酸、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺、或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1-17-5]前述方式[1-17-1]～[1-17-4]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的交联海藻酸凝胶包含前述方式[1-4]～[1-4-1]中记载的任一种可添加的成分。
通过对前述方式中记载的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维中的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)的各要素进行组合，可任意地形成聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法的优选方式。
[1B]第1B方式如下所述。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其包含：含有包埋于交联海藻酸凝胶中的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的芯层、被覆前述芯层的阳离子性聚合物层(阳离子性聚合物)、和被覆前述阳离子性聚合物层的阴离子性聚合物层(阴离子性聚合物)，所述交联海藻酸凝胶通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而获得。式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与前述方式[1]中定义的相同。
[1C]第1C方式如下所述。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其是将芯层用阳离子性聚合物和阴离子性聚合物被覆而得的，所述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、以及使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶。式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与前述方式[1]中定义的相同。
[1D]第1D方式如下所述。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其是包含芯层、以及配置于前述芯层的外侧的阳离子性聚合物层、配置于前述阳离子性聚合物层的外侧的阴离子性聚合物层的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞和使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成交联而成的交联海藻酸凝胶。式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与前述方式[1]中定义的相同。
[1B-1-1]前述方式[1B]～[1D]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-优选与前述方式[1-1-1]中记载的定义相同；更优选与前述方式[1-1-2]中记载的定义相同；进一步优选与前述方式[1-1-3]中记载的定义相同；特别优选与前述方式[1-1-4]中记载的定义相同；最优选为下述部分结构式所示的基团(各式中，虚线右侧不包括在内)：
[化14]
[1B-1-2]前述方式前述方式[1B]～[1D]中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的Akn-L1-与前述方式[1-1-5]中记载的定义相同；优选的、更优选的、进一步优选的Akn-L1-分别与前述方式[1-1-5]中记载的定义相同；特别优选为下述部分结构式所示的基团(各式中，虚线右侧不包括在内)：
[化15]
[1B-2-1]前述方式前述方式[1B]～[1D]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-优选与前述方式[1-2-1]中记载的定义相同；更优选与前述方式[1-2-2]中记载的定义相同；进一步优选与前述方式[1-2-3]中记载的定义相同；特别优选与前述方式[1-2-4]中记载的定义相同；最优选为下述部分结构式所示的基团(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)：
[化16]
[1B-2-2]前述方式前述方式[1B]～[1D]中，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-L2-与前述方式[1-2-5]中记载的定义相同；优选的、更优选的、进一步优选的-L2-分别与前述方式[1-2-5]中记载的定义相同；特别优选为下述部分结构式所示的基团(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)：
[化17]
[1B-2A]通过使用将前述方式[1]、[1B-1-1]～[1B-2-2]中记载的Akn、-L1-、-L2-的定义适宜组合得到的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，可任意地形成本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的交联海藻酸凝胶的优选方式。
[1B-3]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞可举出例如，产生抗体(人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体等各种单克隆抗体或它们的双特异性抗体、低分子化抗体、糖链修饰抗体等各种修饰型抗体)的细胞、产生生理活性物质(酶、细胞因子、激素、凝血因子、疫苗等)的细胞、能够产生可用作药品原料、化学原料、食品原料等的各种有用物质的细胞；优选为产生抗体的细胞或产生生理活性物质的细胞。
[1B-3-1]前述方式[1]、[1A]、[1B]、[1C]或[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的产生抗体的细胞是由产生抗体的B细胞得到的杂交瘤(产生抗体的杂交瘤)或由抗体表达载体转化的培养细胞(产生抗体的基因重组细胞)。
[1B-3-2]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的产生抗体的细胞优选为产生抗体的基因重组动物细胞。
[1B-3-3]前述方式[1B-3-2]中，可用作宿主的动物细胞是选自CHO细胞、CHO细胞亚株(CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-DXB11细胞、或以修饰糖链的方式进行了转化的CHO细胞等)、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、PERC6细胞、YB2/0细胞、YE2/0细胞、1R983F细胞、Namalwa细胞、Wil-2细胞、Jurkat细胞、Vero细胞、Molt-4细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞、KGH6细胞、P3X63Ag8.653细胞、C127细胞、JC细胞、LA7细胞、ZR-45-30细胞、hTERT细胞、NM2C5细胞、或UACC-812细胞中的细胞。
[1B-3-4]前述方式[1B-3-2]中，可用作宿主的动物细胞优选为选自CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、PERC6细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞、或C127细胞中的细胞；更优选为选自CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞、NS0细胞、HEK293细胞、或BHK细胞中的细胞；进一步优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
[1B-3-5]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞，优选其宿主细胞是选自CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞、或NS0细胞中的细胞；更优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
[1B-3-6]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞是产生可用作生物药品或生物药品原料的抗体的细胞。
[1B-3-7]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞是选自产生莫罗单抗-CD3、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、托珠单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、依库珠单抗、帕尼单抗、优特克单抗、戈利木单抗、卡那单抗、地诺单抗、奥法木单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、阿仑单抗、苏金单抗、雷莫芦单抗、伊匹单抗、依洛单抗、美泊利单抗、阿利库单抗、伊克珠单抗、布罗达单抗、埃罗妥珠单抗、派姆单抗、沙鲁单抗、贝洛托舒单抗、贝利木单抗、达雷木单抗、阿维单抗、杜匹鲁单抗、阿替珠单抗、艾米珠单抗、古塞库单抗、度伐利尤单抗、维多珠单抗、洛莫索珠单抗、利散吉珠单抗、耐昔妥珠单抗、雷夫利珠单抗、布罗索尤单抗、伊沙妥昔单抗、替拉珠单抗、沙妥珠单抗、加那珠单抗、地努妥昔单抗、弗雷曼珠单抗、厄瑞努单抗、卡西瑞单抗、伊德维单抗、阿尼鲁单抗、索罗维单抗、奥美珠单抗、那昔妥单抗、阿杜那单抗、他法司他单抗、玛格妥昔单抗、更汀芦单抗、替瑞利尤单抗、珂罗利单抗、奈莫利珠单抗、卡妥索单抗、帕拉莫妥单抗、法瑞西单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、恩诺单抗、赛妥珠单抗、贝兰妥单抗、朗妥昔单抗、替索妥单抗、德达博妥单抗、帕曲妥单抗等抗体的细胞；产生莫格利珠单抗、贝那利珠单抗、奥比妥珠单抗、伊奈利珠单抗等具有修饰糖链的抗体的细胞；产生包含雷珠单抗、伊达赛珠单抗、博纳吐单抗、布洛赛珠单抗、阿昔单抗、卡拉西单抗、赛妥珠单抗等抗体片段的低分子抗体的细胞等中的细胞。
[1B-3-8]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞是产生抗体的动物细胞，优选为产生抗体的CHO细胞、产生抗体的Sp2/0细胞或产生抗体的NS0细胞，更优选为产生抗体的CHO细胞。
[1B-3-9]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞优选其宿主细胞为CHO细胞的产生抗体的CHO细胞，例如选自产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生洛莫索珠单抗的CHO细胞、产生利散吉珠单抗的CHO细胞、产生耐昔妥珠单抗的CHO细胞、产生雷夫利珠单抗的CHO细胞、产生布罗索尤单抗的CHO细胞、产生伊沙妥昔单抗的CHO细胞、产生替拉珠单抗的CHO细胞、产生沙妥珠单抗的CHO细胞、产生加那珠单抗的CHO细胞、产生地努妥昔单抗的CHO细胞、产生弗雷曼珠单抗的CHO细胞、产生厄瑞努单抗的CHO细胞、产生卡西瑞单抗的CHO细胞、产生伊德维单抗的CHO细胞、产生阿尼鲁单抗的CHO细胞、产生索罗维单抗的CHO细胞、产生奥美珠单抗的CHO细胞、产生那昔妥单抗的CHO细胞、产生阿杜那单抗的CHO细胞、产生他法司他单抗的CHO细胞、产生玛格妥昔单抗的CHO细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞、产生伊奈利珠单抗的CHO细胞、产生博纳吐单抗的CHO细胞、产生布洛赛珠单抗的CHO细胞、产生阿昔单抗的CHO细胞、产生卡拉西单抗的CHO细胞、或产生抗GPVI抗体的CHO细胞中的细胞；选自产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、或产生抗GPVI抗体的CHO细胞中的细胞。
[1B-3-10]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生生理活性物质的细胞与前述方式[1-3-4]中记载的产生生理活性物质的细胞相同。
[1B-3-11]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生生理活性物质的细胞是选自胰岛素分泌细胞、胰岛、胰岛细胞、或来自胰腺β细胞的MIN6细胞中的细胞。
[1B-3-12]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞是由生理活性物质表达载体转化的培养细胞(产生生理活性物质的基因重组细胞)。
[1B-3-13]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞是产生生理活性物质的基因重组动物细胞。
[1B-3-14]前述方式[1B-3-13]中，作为可用作宿主的动物细胞，是选自CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞或PERC6细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞或C127细胞中的细胞；优选为选自CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞和NS0细胞、HEK293细胞或BHK细胞中的细胞；更优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
[1B-3-15]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞优选为其宿主细胞选自CHO细胞、CHO细胞亚株、HEK293细胞或BHK细胞中的细胞；更优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
[1B-3-16]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞是产生可用作生物药品或生物药品原料的生理活性物质的细胞。
[1B-3-17]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞是选自产生阿替普酶、孟替普酶、伊米苷酶、维拉苷酶、阿加糖酶、拉罗尼酶、阿葡糖苷酶、阿伐糖苷酶、艾杜硫酶、加硫酶、依洛硫酸酯酶、拉布立酶、链道酶、细胞利波纳酶、谷卡匹酶、透明质酸酶、黄曲霉酶等酶的细胞；依他凝血素、辛凝血素、培罗辛凝血素(rurioctocog)、妥罗凝血素、罗诺凝血素、培达凝血素(damoctocog)、塞莫凝血素、诺那凝血素、阿布诺凝血素、卡德凝血素、依伐凝血素(efraloctocog)、艾诺凝血素、血栓调节素、抗凝血酶、沃尼凝血素、白蛋白等凝血因子和血液相关蛋白的细胞；产生胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、谷赖胰岛素、德谷胰岛素、生长激素、索马帕西坦、美卡舍明、卡培立肽、伏索利肽、胰高血糖素、促卵泡素、绒膜促性腺素、杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、替度鲁肽、特立帕肽、美曲普汀等激素的细胞；产生干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ-1a等干扰素的细胞；产生依泊汀、达贝泊汀、罗米司亭等造血因子的细胞；产生非格司亭、来格司亭、替西白介素、曲弗明、培贝夫明(ベルフェルミン)、依那西普、阿氟西普、地尼白介素等细胞因子及其受体的细胞；产生阿巴西普等细胞表面抗原、细胞表面受体及其配体的细胞中的细胞。
[1B-3-18]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞是产生生理活性物质的动物细胞，优选为产生生理活性物质的CHO细胞、产生生理活性物质的HEK293细胞或产生生理活性物质的BHK细胞，更优选为产生生理活性物质的CHO细胞。
[1B-3-19]前述方式[1]、[1A]、[1B]～[1D]中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞优选其宿主细胞为作为CHO细胞的产生生理活性物质的细胞CHO细胞，例如，选自产生阿替普酶的CHO细胞、产生阿葡糖苷酶的CHO细胞、产生培罗辛凝血素的CHO细胞、产生杜拉鲁肽的CHO细胞、产生干扰素β-1a的CHO细胞、产生达贝泊汀的CHO细胞、产生依那西普的CHO细胞、产生阿氟西普的CHO细胞或产生阿巴西普的CHO细胞中的细胞。
[1B-4]前述方式[1B]～[1D]中，能够在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的成分与前述方式[1-4]中记载的成分相同；作为优选的成分，与前述方式[1-4-1]中记载的成分相同。
[1B-5]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量与前述方式[1-5]中记载的重均分子量的范围相同。
[1B-6]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量与前述方式[1-6]中记载的重均分子量的范围相同。
[1B-7]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团(Akn-L1-NH2基：Akn-L1-与前述方式[1]、[1B-1-1]或[1B-1-2]中的定义相同)的导入率与前述方式[1-7]中记载的导入率的范围相同。
[1B-8]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团(N3-L2-NH2基：-L2-与前述方式[1]、[1B-2-1]或[1B-2-2]中的定义相同)的导入率与前述方式[1-8]中记载的导入率的范围相同。
[1B-9]前述方式[1B]～[1D]中，能够在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的制备中所用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量与前述方式[1-9-1]中记载的重均分子量的范围相同。
[1B-10-1]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度与前述方式[1-10-1]中记载的浓度的范围相同。
[1B-10-2]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度与前述方式[1-10-2]中记载的浓度的范围相同。
[1B-10-3]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与前述方式[1-10-3]中记载的浓度的范围相同。
[1B-10-4]前述方式[1B]～[1D]中，能够在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中追加含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的浓度与前述方式[1-10-4]中记载的浓度的范围相同。
[1B-11-1]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度和海藻酸溶液的浓度的总浓度优选为约0.5～约2.0重量％；更优选为选自约1.0重量％、约1.5重量％和约2.0重量％中的浓度；进一步优选为约1.5重量％。
[1B-11-2]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1∶C2)＝(约0.2∶约1.3)、(约0.5∶约1.0)、(约1.0∶约0.5)、(约1.5∶0)、(约0.66∶约1.34)、和(约0.34∶约0.66)中的组合。
[1B-11-3]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1A∶C1N∶C2)＝(约0.1∶约0.1∶约1.3)、(约0.25∶约0.25∶约1.0)、(约0.5∶约0.5∶约0.5)、(约0.75∶约0.75∶0)、(约0.33∶约0.33∶约1.34)、和(约0.17∶约0.17∶约0.66)中的组合。
[1B-11-4]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的混合溶液中的各衍生物的溶液的容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如为(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
[1B-11-5]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中包含海藻酸溶液、或由海藻酸溶液形成的海藻酸凝胶时，芯层的形成中所用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、和海藻酸溶液的混合溶液中的各溶液的容量(v1、v2、v3)的容量比为例如v1+v2+v3＝15的比率，例如为(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等的组合。
[1B-12]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由前述方式[1-12]中记载的式(III-L)(式中的定义与前述方式[1-12]中的定义相同)所示的基团得到的化学交联。
[1B-12-1]前述方式[1B-12]的式(III-L)中，优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的-L1-分别与前述方式[1-12-1]中记载的定义相同；最优选-X-为(CL-2)或(CL-2-r)中的下述部分结构式的2价连接基团：
[化18]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1B-12-2]前述方式[1B-12]的式(III-L)中，优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的-L2-分别与前述方式[1-12-2]中记载的定义相同；最优选为下述部分结构式的2价连接基团：
[化19]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1B-12-3]前述方式[1B-12]中，优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的式(III-L)所示的基团的-L2-X-L1-的组合分别与前述方式[1-12-3]中记载的定义相同；最优选-L2-X-L1-为下述式中的任一者：
[化20]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1B-12A]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由前述方式[1-12A]中记载的式(III-L)[式(III-L)中的各定义与前述方式[1-12A]中记载的定义相同]所示的基团得到的化学交联。
[1B-12A-1]前述方式[1B-12A]中，优选的、更优选的、进一步优选的-L1-分别与前述方式[1-12A-1]中记载的基团相同；优选的、更优选的、进一步优选的-L2-分别与前述方式[1-12A-1]中记载的基团相同。
[1B-12A-2]前述方式[1B-12A]中，式(III-L)所示的基团的-L2-X-L1-的优选的、更优选的、进一步优选的组合与[1-12A-2]中记载的组合相同；特别优选的组合为下述式中的任一者：
[化21]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
[1B-13]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶包含介由前述方式[1-12]的式(III-L)[式(III-L)中，各定义与前述方式[1-12]的定义相同]或前述方式[1B-12A]的式(III-L)[式(III-L)中，各定义与方式[1B-12A]的定义相同]所示的基团得到的化学交联和介由2价金属离子的离子交联。
[1B-13A]前述方式[1B]～[1D]中，芯层中所含的交联海藻酸凝胶的离子交联形成中所用的2价金属离子与前述方式[1-13A]中记载的2价金属离子相同。
[1B-14]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的离子交联形成中所用的2价金属离子的供给源与前述方式[1-14]中记载的包含2价金属离子的水溶液相同。
[1B-15-1]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物与前述方式[1-15-1]中记载的阳离子性聚合物相同。
[1B-15-2]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的优选的、更优选的、进一步优选的阳离子性聚合物分别与前述方式[1-15-2]中记载的阳离子性聚合物相同。
[1B-15-3]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物为壳聚糖。
[1B-15-4]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物与前述方式[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物相同。
[1B-16]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自阴离子性多糖类、硫酸化多糖类、合成聚合物、阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
[1B-16-1]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自例如海藻酸、透明质酸、半乳糖醛酸、卡拉胶(ラギナン)、琥珀葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、海藻酸、果胶、果胶酸、羧甲基纤维素、琼脂等阴离子性多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
[1B-16-2]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层为海藻酸。
[1B-16-3]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自前述方式[1]或[1-1-5]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、前述方式[1]或[1-2-5]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由前述方式[1]或[1-1-5]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和前述方式[1]或[1-2-5]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、以及它们的混合物中的阴离子性聚合物。
[1B-16-4]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自海藻酸、前述方式[1]或[1-1-5]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、前述方式[1]或[1-2-5]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由前述方式[1]或[1-1-5]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和前述方式[1]或[1-2-5]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、以及它们的混合物中的阴离子性聚合物。
[1B-16-4-1]前述方式[1B-16-3]或[1B-16-4]中，方式[1]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的衍生物分别与前述方式[1-1-1]、方式[1-1-2]、方式[1-1-3]、方式[1-1-4]中记载的相同。
[1B-16-4-2]前述方式[1B-16-3]或[1B-16-4]中，方式[1-1-5]的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的优选的、更优选的、进一步优选的衍生物分别与前述方式[1-1-5]中记载的相同。
[1B-16-4-3]前述方式[1B-16-3]或[1B-16-4]中，方式[1]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的优选的、更优选的、进一步优选的、特别优选的衍生物分别与前述方式[1-2-1]、方式[1-2-2]、方式[1-2-3]、方式[1-2-4]中记载的相同。
[1B-16-4-4]前述方式[1B-16-3]或[1B-16-4]中，方式[1-2-5]的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的、优选的、更优选的、进一步优选的衍生物分别与前述方式[1-2-5]中记载的相同。[1B-16-5]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自例如硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、岩藻多糖、硫酸角质素、或肝素等硫酸化多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
[1B-16-6]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自例如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸等合成聚合物、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
[1B-16-7]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层是选自例如聚谷氨酸、聚天冬氨酸等阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
[1B-17]前述方式[1B]～[1D]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径为例如约0.1～约2000μm的范围。
通过使用将前述方式中记载的Akn、-L1-、-L2-、X的定义适宜组合得到的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，可任意地形成前述方式的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的交联海藻酸凝胶的优选方式。
[1B-18-1]前述方式[1B]～[1D]的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-1]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1B-3-1]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-1]中记载的阳离子性聚合物；阴离子性聚合物层选自前述方式[1B-16]～[1B-16-7]中记载的阴离子性聚合物的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1B-18-2]前述方式[1B]～[1D]的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维更优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-1-5]的更优选的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-2]中记载的海藻酸衍生物或前述方式[1-2-5]的更优选的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1B-3-2]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]～[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物；阴离子性聚合物层选自前述方式[1B-16-1]中记载的阴离子性聚合物的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1B-18-3]前述方式[1B]～[1D]的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进一步优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-3]中记载的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-3]中记载的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1B-3-3]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自前述方式[1-15-2]或[1-15-4]中记载的阳离子性聚合物；阴离子性聚合物层选自前述方式[1B-16-2]～[1B-16-4-4]中记载的阴离子性聚合物的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1B-18-4]前述方式[1B]～[1D]的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维特别优选为交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-1-4]中记载的海藻酸衍生物、且式(II)所示的海藻酸衍生物选自前述方式[1-2-4]中记载的海藻酸衍生物；产生抗体的细胞选自前述方式[1B-3-6]～[1B-3-9]中记载的细胞；阳离子性聚合物层选自聚-L-鸟氨酸、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺、或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)；阴离子性聚合物层选自海藻酸、前述方式[1-1-1]～[1-1-4]、[1-2-5]中记载的式(I)所示的海藻酸衍生物、前述方式[1-2-1]～[1-2-4]、[1-2-5]中记载的式(II)所示的海藻酸衍生物、和由前述方式[1-1-1]～[1-1-4]、[1-1-5]中记载的式(I)所示的海藻酸衍生物和前述方式[1-2-1]～[1-2-4]、[1-2-5]中记载的式(II)所示的海藻酸衍生物形成的交联体的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[1B-18-5]前述方式[1B]～[1D]的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维最优选为下述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)所示的海藻酸衍生物具有作为Akn-L1-的下述部分结构式所示的基团(各式中，虚线右侧不包括在内)：
[化22]
式(II)所示的海藻酸衍生物具有作为-L2-的下述部分结构式所示的基团(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)：
[化23]
产生抗体的细胞选自前述方式[1B-3-5]中记载的细胞、且优选产生抗体的细胞为产生抗体的CHO细胞；阳离子性聚合物层选自聚-L-鸟氨酸、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺、或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)；
阴离子性聚合物层选自海藻酸、具有作为Akn-L1-的下述部分结构式(各式中，虚线右侧不包括在内)：
[化24]
的式(I)所示的海藻酸衍生物、具有作为-L2-的下述部分结构式(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)：
[化25]
的式(II)所示的海藻酸衍生物、以及由具有作为Akn-L1-的前述部分结构式(ALK-1a-3a)或(ALK-2-3)的式(I)所示的海藻酸衍生物和具有作为-L2-的前述部分结构式(LN-1-3)、(LN-3-3a)或(LN-5-3a)的式(II)所示的海藻酸衍生物形成的交联体。
[1B-18-6]前述方式[1B-18-1]～[1B-18-5]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的交联海藻酸凝胶包含前述方式[1-4]～[1-4-1]中记载的任一种可添加的成分。
通过对前述方式中记载的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维中的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)、阴离子性聚合物(多层阴离子性聚合物)的各要素进行组合，可任意地形成多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法的优选方式。
[2]第2方式如下所述。制造方法，其是将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及使用前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层用阳离子性聚合物被覆而形成的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法，该制造方法的特征在于包括：
步骤(1)：将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及前述方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液注射至包含2价金属离子的溶液中，得到在芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)的步骤，
步骤(2)：使步骤(1)中得到的在芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)与包含阳离子性聚合物的溶液接触，由此得到被阳离子性聚合物层被覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)的步骤。
[2A]前述方式[2]中的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是前述方式([1]～[1-17-5])的任一者中记载的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[2-1]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式[1-3]～[1-3-5]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[2-1-1]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式[1B-3]～[1B-3-19]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[2-2]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为例如约100,000Da～约3,000,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围，更优选为约500,000Da～约2,000,000Da的范围。
[2-3]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为例如约100,000Da～约3,000,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围，更优选为约500,000Da～约2,000,000Da的范围。
[2-4]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团：Akn-L1-NH2基(Akn-L1-与前述方式[1]～[1-1-4]中的定义相同)的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约10mol％的范围。
[2-5]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团：N3-L2-NH2基(-L2-与前述方式[1]、[1-2-1]～[1-2-4]中的定义相同)的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约15mol％的范围。
[2-6]前述方式[2]中，作为可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的成分，例如为选自海藻酸溶液、培养基、培养液、胶原溶液、甲基纤维素、蔗糖溶液、或它们的混合物等中的成分；优选为选自海藻酸溶液、培养基、培养液、或它们的混合物等中的成分。
[2-7]前述方式[2]中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,000,000Da的范围，更优选为约700,000Da～约1,500,000Da的范围。
[2-7A]前述方式[2]的纤维制造的步骤(1)中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围；优选为约300,000Da～约2,500,000Da的范围；更优选为选自约700,000Da～约1,400,000Da、约800,000Da～约1,500,000Da、约1,400,000～约2,000,000Da、或约1,500,000～约2,500,000中的范围。
[2-8]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度为例如约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。
本说明书中，记载为重量％的情况下，则意指w/v％。
[2-9]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度为例如约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。
[2-10]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度为例如约0.02～约2.0重量％的范围；优选为约0.1～约2.0重量％的范围；更优选为约0.15～约1.5重量％的范围。
[2-11]前述方式[2]中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的海藻酸溶液的浓度为例如，0～约1.98重量％的范围；优选为0～约1.8重量％的范围；更优选为0～约1.7重量％的范围。[2-11-1]前述方式[2]中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与海藻酸溶液的浓度的总浓度优选为约0.5～约2.0重量％；更优选为选自约1.0重量％、约1.5重量％和约2.0重量％中的浓度。
[2-11-2]前述方式[2]中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1∶C2)＝(约0.2∶约1.3)、(约0.5∶约1.0)、(约1.0∶约0.5)、(约1.5∶0)、(约0.66∶约1.34)、和(约0.34∶约0.66)中的组合。
[2-11-3]前述方式[2]中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，该式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合优选为选自(C1A∶C1N∶C2)＝(约0.1∶约0.1∶约1.3)、(约0.25∶约0.25∶约1.0)、(约0.5∶约0.5∶约0.5)、(约0.75∶约0.75∶0)、(约0.33∶约0.33∶约1.34)、和(约0.17∶约0.17∶约0.66)中的组合。
[2-12-1]前述方式[2]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的各容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如，(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
[2-12-2]前述方式[2]中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，添加了海藻酸溶液的混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的容量(v1)、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的容量(v2)和海藻酸溶液的容量(v3)的容量比为例如，v1+v2+v3＝15的比率，例如，(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等组合。
[2-13]前述方式[2]中，要注射包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的溶液中所含的2价金属离子为选自钙离子、镁离子、钡离子、锶离子、锌离子等中的2价金属离子；优选为钙离子、钡离子或锶离子；更优选为钙离子或钡离子。
[2-14]前述方式[2]中，要注射包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的溶液是选自氯化钙水溶液、碳酸钙水溶液、葡萄糖酸钙水溶液、氯化钡水溶液、氯化锶水溶液等中的包含2价金属离子的水溶液；优选为氯化钙水溶液或氯化钡水溶液。
[2-15]前述方式[2]或[2-14]中，2价金属离子的浓度为例如约1mM～约1M的范围、或约10～约500mM的范围；优选为约10～约100mM。
[2-16-1]前述方式[2]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液，例如，可以使用如图3所示的具有导入口1和排出口2的装置XX等，由装置XX的导入口1导入该混合溶液，并由装置XX的排出口2注射。
[2-16-2]前述方式[2-16-1]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液，例如，可以使用如图3所示的挤出筒YY等，由装置XX的排出口2注射。
[2-17]前述方式[2-16-2]中，作为组合装置XX和挤出筒YY而成的方式，例如，可以使用注射筒。此外，注射筒可以使用玻璃制或塑料制的注射筒。
[2-18]前述方式[2]、[2-16-1]和[2-16-2]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的注射速度(流速)为例如约100～约10000μL/分钟的范围。
[2-19-1]前述方式[2]中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液是包含选自聚氨基酸(碱性氨基酸的聚合物)、碱性多糖类、碱性聚合物、它们的盐等中的阳离子性聚合物的溶液。
[2-19-2]前述方式[2]中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液优选为包含选自作为聚氨基酸的聚-L-鸟氨酸(PLO)、聚-D-鸟氨酸(PDO)、聚-DL-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸(PDL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-DL-赖氨酸、聚-L-精氨酸(PLA)、聚-D-精氨酸(PDA)、聚-DL-精氨酸、聚-L-高精氨酸(PLHA)、聚-D-高精氨酸(PDHA)、聚-DL-高精氨酸、聚-L-组氨酸(PLH)、聚-D-组氨酸(PDH)、聚-DL-组氨酸和它们的盐中的阳离子性聚合物的溶液；更优选为包含选自聚-L-鸟氨酸、聚-L-赖氨酸和它们的盐中的阳离子性聚合物的溶液；进一步优选为包含选自聚-L-鸟氨酸或其盐中的阳离子性聚合物的溶液。
[2-19-3]前述方式[2]中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液例如为包含选自作为碱性多糖类的壳聚糖或其盐中的阳离子性聚合物的溶液。
[2-19-4]前述方式[2]中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液例如为包含选自作为碱性聚合物的聚亚甲基-CO-胍(PMCG)、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯基胺(PVA)、聚乙烯亚胺、烯丙基胺-二烯丙基胺共聚物、烯丙基胺-马来酸共聚物、和它们的盐中的阳离子性聚合物的溶液。
[2-19-4-1]前述方式[2-19-4]中，优选包含阳离子性聚合物的溶液是包含选自聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺、聚亚甲基-CO-胍(PMCG)和它们的盐中的阳离子性聚合物的溶液。
[2-20]前述方式[2]中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液可以包含氯化钙溶液、缓冲液等成分。
[2-21]前述方式[2]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造时的温度为例如约4～约37℃的范围。
通过对前述方式中记载的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法和各要素进行组合，可任意形成聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法的优选方式。
[2B]第2B方式如下所述。制造方法，其是将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及使用前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层依次用阳离子性聚合物和阴离子性聚合物被覆而形成的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法，该制造方法的特征在于包括：
步骤(1)：将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液注射至包含2价金属离子的溶液中，得到在芯层中包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)的步骤，
步骤(2)：使步骤(1)中得到的在芯层中包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)与包含阳离子性聚合物的溶液接触，由此得到被阳离子性聚合物层被覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)的步骤，
步骤(3)：使步骤(2)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)与包含阴离子性聚合物的溶液接触，由此得到被阴离子性聚合物层被覆的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB)的步骤。
[2C]前述方式[2B]中的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是前述方式([1B]～[1B-18-6])的任一者中记载的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[2B-1]前述方式[2B]中，纤维的制造中使用的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式前述方式[1-3]～[1-3-5]、[1B-3]～[1B-3-19]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[2B-2]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)或步骤(3)中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量与前述方式[2-2]中记载的重均分子量的范围相同。
[2B-3]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)或步骤(3)中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量与前述方式[2-3]中记载的重均分子量的范围相同。
[2B-4]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)或步骤(3)中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团：Akn-L1-NH2基(Akn-L1-与前述方式[1]、[1B-1-1]或[1B-1-2]中的定义相同)的导入率与前述方式[2-4]中记载的导入率的范围相同。
[2B-5]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)或步骤(3)中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团：N3-L2-NH2基(-L2-与前述方式[1]、[1B-2-1]或[1B-2-2]中的定义相同)的导入率与前述方式[2-5]中记载的导入率的范围相同。
[2B-6]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的成分与前述方式[2-6]中记载的成分相同。
[2B-7]前述方式[2B]的纤维制造的步骤(1)中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)、或前述方式[2B]的纤维制造的步骤(3)中使用海藻酸作为阴离子性聚合物时其溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量与前述方式[2-7A]中记载的分子量相同。
[2B-8]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度与前述方式[2-8]中记载的浓度的范围相同。
[2B-9]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)中使用的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度与前述方式[2-9]中记载的浓度的范围相同。
[2B-10]前述方式[2B]中，纤维的制造的步骤(1)中使用的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与前述方式[2-10]中记载的浓度的范围相同。
[2B-11]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，可在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加的海藻酸溶液的浓度与前述方式[2-11]中记载的浓度的范围相同。
[2B-11-1]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与海藻酸溶液的浓度的总浓度与前述方式[2-11-1]中记载的浓度的范围相同；进一步优选为约1.5重量％。
[2B-11-2]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合与前述方式[2-11-2]中记载的浓度的范围相同。
[2B-11-3]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，该式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合与前述方式[2-11-3]中记载的浓度的范围相同。
[2B-12-1]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的各容量比(v1、v2)为例如，v1+v2＝15的比率，例如，(v1：v2)＝(7.5：7.5)。
[2B-12-2]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，添加了海藻酸溶液的混合溶液中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的容量(v1)、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的容量(v2)和海藻酸溶液的容量(v3)的容量比与前述方式[2-12-2]中记载的组合相同。
[2B-13]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，要注射包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的溶液中所含的2价金属离子与前述方式[2-13]中记载的2价金属离子相同。
[2B-14]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(1)中，要注射包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的溶液与前述方式[2-14]中记载的包含2价金属离子的水溶液相同。
[2B-15]前述方式[2B]或[2B-14]中，纤维制造的步骤(1)中使用的2价金属离子的浓度为例如约1mM～约1M的范围、或约10～约500mM的范围；优选为约10～约100mM。
[2B-16-1]前述方式[2B]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液，例如，可以使用如图10所示的具有导入口1和排出口2的装置XX等，由装置XX的导入口1导入该混合溶液，并由装置XX的排出口2注射。
[2B-16-2]前述方式[2B-16-1]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液，例如，可以使用如图10所示的挤出筒YY等，由装置XX的排出口2注射。
[2B-17]前述方式[2B-16-2]中，作为组合装置XX和挤出筒YY而成的方式，例如，可以使用注射筒。此外，注射筒可以使用玻璃制或塑料制的注射筒。
[2B-18]前述方式[2B]、[2B-16-1]和[2B-16-2]中，包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的注射速度(流速)为例如约100～约10000μL/分钟的范围。
[2B-19-1]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(2)中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液与前述方式[2-19-1]中记载的溶液相同。
[2B-19-2]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(2)中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的优选的、更优选的、进一步优选的包含阳离子性聚合物的溶液分别与前述方式[2-19-2]中记载的溶液相同。
[2B-19-3]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(2)中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液例如为包含选自作为碱性多糖类的壳聚糖或其盐中的阳离子性聚合物的溶液。
[2B-19-4]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(2)中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液与前述方式[2-19-4]中记载的溶液相同。
[2B-20]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(2)中，使包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液可以包含氯化钙溶液、缓冲液等成分。
[2B-21]前述方式[2B]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造时的温度为例如约4～约37℃的范围。
[2B-22]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自阴离子性多糖类、硫酸化多糖类、合成聚合物、阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的盐、和它们的混合物等中的阴离子性聚合物的溶液。
[2B-23]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自海藻酸、前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、前述方式[1]中记载的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和/或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、它们的盐、和它们的混合物中的阴离子性聚合物的溶液。
[2B-24]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自例如海藻酸、透明质酸、半乳糖醛酸、卡拉胶、琥珀葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、海藻酸、果胶、果胶酸、羧甲基纤维素、琼脂等阴离子性多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的盐、和它们的混合物中的阴离子性聚合物的溶液。
[2B-25]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自例如硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、岩藻多糖、硫酸角质素、或肝素等硫酸化多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的盐、和它们的混合物中的阳离子性聚合物的溶液。
[2B-26]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自例如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸等合成聚合物、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的盐、和它们的混合物中的阳离子性聚合物的溶液。
[2B-27]前述方式[2B]中，纤维制造的步骤(3)中，使聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液是包含选自例如聚谷氨酸、聚天冬氨酸等阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的盐、和它们的混合物中的阳离子性聚合物的溶液。
通过对前述方式中记载的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法和各要素进行组合，可任意地形成多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法的优选方式。
[3]第3方式如下所述。抗体、生理活性物质等的制造方法，该方法使用聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及使用前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层用阳离子性聚合物被覆而形成的。一个方式的前述制造方法是将前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维加入培养容器中并添加培养基以浸渗前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维来进行培养的抗体、生理活性物质等的制造方法。
[3A]前述方式[3]中的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是前述方式([1]～[1-17-5])的任一者中记载的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[3-1]前述方式[3]中，培养容器是选自例如组织培养用板、三角烧瓶、T型烧瓶、转瓶、培养袋、动物细胞培养槽等中的容器；优选为三角烧瓶或动物细胞培养槽。培养可以选择例如静置培养或振荡培养等的任一方法，可以使用分批培养(batch culture)、补料分批培养(fed-batch culture)、连续培养等的任一方法，优选补料分批培养或连续培养。
[3-2]前述方式[3]～[3-1]的任一者中，培养时的温度例如为约28℃～约39℃的范围，例如为约30℃～约37℃的范围。
[3-3]前述方式[3]～[3-2]的任一者中，培养时的搅拌速度为例如约50～约250rpm，例如为约125rpm。
[3-4]前述方式[3]～[3-3]的任一者中，培养条件为例如将培养温度设为约28℃～约39℃的范围，在5％CO2气氛下在培养装置中以约125rpm的搅拌速度进行培养。
[3-5]前述方式[3]～[3-4]的任一者中，培养的时间为例如7天，或14天，或28天，或42天，或56天，或70天。
本说明书中，培养温度中，记载为“约”的情况下，可以包含该数值的±10％的值，在一些方式中可以包含该数值的±20％的值。
[3-6]前述方式[3]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式[1-3]～[1-3-5]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[3-6-1]前述方式[3]中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式[1B-3]～[1B-3-19]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[3-7]前述方式[3]～[3-5]的任一者所述的抗体、生理活性物质等的制造方法，其包括添加细胞增殖抑制剂。
通过对前述方式中记载的使用聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法和各要素进行组合，可任意地形成抗体、生理活性物质等的制造方法的优选方式。
[3B]第3B方式如下所述。抗体、生理活性物质等的制造方法，该方法使用多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及使用前述方式[1]中记载的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层依次用阳离子性聚合物和阴离子性聚合物被覆而形成的。一个方式中的前述制造方法是将前述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维加入培养容器中并添加培养基以浸渗前述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维来进行培养的抗体、生理活性物质等的制造方法。
[3C]前述方式[3B]中的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是前述方式([1B]～[1B-18-6])的任一者中记载的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
[3B-1]前述方式[3B]中，培养容器和培养与前述方式[3-1]中记载的相同。
[3B-2]前述方式[3B]～[3B-1]的任一者中，培养时的温度例如为约28℃～约39℃的范围，例如为约30℃～约37℃的范围。
[3B-3]前述方式[3B]～[3B-2]的任一者中，培养时的搅拌速度例如为约50～约250rpm，例如为约125rpm。
[3B-4]前述方式[3]～[3B-3]的任一者中，培养条件为例如将培养温度设为约28℃～约39℃的范围，在5％CO2气氛下在培养装置中以约125rpm的搅拌速度进行培养。
[3B-5]前述方式[3B]～[3B-4]的任一者中，培养的时间为例如7天，或14天，或28天，或42天，或56天，或70天。
[3B-6]前述方式[3B]中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与前述方式[1-3]～[1-3-5]、[1B-3]～[1B-3-19]中任一项所述的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞相同。
[3B-7]前述方式[3B]～[3B-5]的任一者所述的抗体、生理活性物质等的制造方法，其包括添加细胞增殖抑制剂。
通过对前述方式中记载的使用多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法和各要素进行组合，可任意地形成抗体、生理活性物质等的制造方法的优选方式。
[4]第4方式是抗体，其中在前述方式[3]～[3-7]的任一者所述的抗体的制造方法所得的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生的透过阳离子性聚合物层的抗体具有选自例如IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE等中的同种型。
[4B]第4B方式是抗体，其中在前述方式[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生的透过阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的抗体具有选自例如IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE等中的同种型。
[5]第5方式是抗体，其中在前述方式[3]～[3-7]的任一者所述的抗体的制造方法所得的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生的透过阳离子性聚合物层的抗体的分子量为例如约45,000～约1,000,000Da、约3,000～约1,000,000Da、约20,000～约1,000,000Da、约20,000～约400,000Da、约45,000～约400,000Da、约20,000～约200,000Da、约45,000～约200,000Da的范围。
[5B]第5B方式是抗体，其中在前述方式[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生且透过阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的抗体的分子量为例如约3,000～约1,000,000Da、约20,000～约1,000,000Da、约45,000～约1,000,000Da、约20,000～约400,000Da、约45,000～约400,000Da、约20,000～约200,000Da、约45,000～约200,000Da的范围。
[6]第6方式是胰岛素，其中通过前述方式[3]～[3-7]的任一者所述的制造方法，使用MIN6细胞产生的胰岛素的分子量为例如约5,000～10,000的范围。
[6B]第6B方式是生理活性物质，其中通过前述方式[3]～[3-7]、[3B]～[3B-7]中记载的制造方法，使用产生生理活性物质的细胞产生的生理活性物质的分子量为例如，例如约3,000～约1,000,000Da、约20,000～约1,000,000Da、约45,000～约1,000,000Da、约20,000～约400,000Da、约45,000～约400,000Da、约20,000～约200,000Da、约45,000～约200,000Da的范围。
[7]第7方式是前述方式[3]～[3-7]的任一者所述的抗体的制造方法中所得的抗体，所述抗体例如，使用产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞则为莫罗单抗-CD3、使用产生曲妥珠单抗的CHO细胞则为曲妥珠单抗、使用产生利妥昔单抗的CHO细胞则为利妥昔单抗、使用产生帕利珠单抗的CHO细胞则为帕利珠单抗、使用产生英夫利昔单抗的CHO细胞则为英夫利昔单抗、使用产生巴利昔单抗的CHO细胞则为巴利昔单抗、使用产生托珠单抗的CHO细胞则为托珠单抗、使用产生吉妥珠单抗的CHO细胞则为吉妥珠单抗、使用产生贝伐单抗的CHO细胞则为贝伐单抗、使用产生替伊莫单抗的CHO细胞则为替伊莫单抗、使用产生阿达木单抗的CHO细胞则为阿达木单抗、使用产生西妥昔单抗的CHO细胞则为西妥昔单抗、使用产生雷珠单抗的CHO细胞则为雷珠单抗、使用产生奥马珠单抗的CHO细胞则为奥马珠单抗、使用产生依库珠单抗的CHO细胞则为依库珠单抗、使用产生帕尼单抗的CHO细胞则为帕尼单抗、使用产生优特克单抗的CHO细胞则为优特克单抗、使用产生戈利木单抗的CHO细胞则为戈利木单抗、使用产生卡那单抗的CHO细胞则为卡那单抗、使用产生地诺单抗的CHO细胞则为地诺单抗、使用产生莫格利珠单抗的CHO细胞则为莫格利珠单抗、使用产生赛妥珠单抗的CHO细胞则为赛妥珠单抗、使用产生奥法木单抗的CHO细胞则为奥法木单抗、使用产生帕妥珠单抗的CHO细胞则为帕妥珠单抗、使用产生布伦妥昔单抗的CHO细胞则为本妥昔单抗、使用产生那他珠单抗的CHO细胞则为那他珠单抗、使用产生纳武单抗的CHO细胞则为纳武单抗、使用产生阿仑单抗的CHO细胞则为阿仑单抗、使用产生苏金单抗的CHO细胞则为苏金单抗、使用产生雷莫芦单抗的CHO细胞则为雷莫芦单抗、使用产生伊匹单抗的CHO细胞则为伊匹单抗、使用产生依洛单抗的CHO细胞则为依洛单抗、使用产生美泊利单抗的CHO细胞则为美泊利单抗、使用产生阿利库单抗的CHO细胞则为阿利库单抗、使用产生伊克珠单抗的CHO细胞则为伊克珠单抗、使用产生布罗达单抗的CHO细胞则为布罗达单抗、使用产生伊达赛珠单抗的CHO细胞则为伊达赛珠单抗、使用产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞则为埃罗妥珠单抗、使用产生派姆单抗的CHO细胞则为派姆单抗、使用产生沙鲁单抗的CHO细胞则为沙鲁单抗、使用产生贝洛托舒单抗的CHO细胞则为贝洛托舒单抗、使用产生贝利木单抗的CHO细胞则为贝利木单抗、使用产生达雷木单抗的CHO细胞则为达雷木单抗、使用产生阿维单抗的CHO细胞则为阿维单抗、使用产生杜匹鲁单抗的CHO细胞则为杜匹鲁单抗、使用产生阿替珠单抗的CHO细胞则为阿替珠单抗、使用产生贝那利珠单抗的CHO细胞则为贝那利珠单抗、使用产生伊珠单抗的CHO细胞则为奥英妥珠单抗、使用产生艾米珠单抗的CHO细胞则为艾米珠单抗、使用产生古塞库单抗的CHO细胞则为古塞库单抗、使用产生度伐利尤单抗的CHO细胞则为度伐利尤单抗、使用产生奥比妥珠单抗的CHO细胞则为奥比妥珠单抗、使用产生维多珠单抗的CHO细胞、或产生抗GPVI抗体的CHO细胞则为抗GPVI抗体。
[7-1]前述方式[3]～[3-7]的任一者所述的抗体的制造方法中，作为能够产生的抗体，例如，使用产生曲妥珠单抗的CHO细胞则为曲妥珠单抗、使用产生利妥昔单抗的CHO细胞则为利妥昔单抗、使用产生英夫利昔单抗的CHO细胞则为英夫利昔单抗、使用产生托珠单抗的CHO细胞则为托珠单抗、使用产生阿达木单抗的CHO细胞则为阿达木单抗、使用产生纳武单抗的CHO细胞则为纳武单抗或使用产生抗GPVI抗体的CHO细胞则为抗GPVI抗体；例如，使用产生托珠单抗的CHO细胞则为托珠单抗、或使用产生抗GPVI抗体的CHO细胞则为抗GPVI抗体。
[7B]第7B方式是前述方式[3]～[3-7]、[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中所得的抗体，所述抗体为莫罗单抗-CD3、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、托珠单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、依库珠单抗、帕尼单抗、优特克单抗、戈利木单抗、卡那单抗、地诺单抗、奥法木单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、阿仑单抗、苏金单抗、雷莫芦单抗、伊匹单抗、依洛单抗、美泊利单抗、阿利库单抗、伊克珠单抗、布罗达单抗、埃罗妥珠单抗、派姆单抗、沙鲁单抗、贝洛托舒单抗、贝利木单抗、达雷木单抗、阿维单抗、杜匹鲁单抗、阿替珠单抗、艾米珠单抗、古塞库单抗、度伐利尤单抗、维多珠单抗、洛莫索珠单抗、利散吉珠单抗、耐昔妥珠单抗、雷夫利珠单抗、布罗索尤单抗、伊沙妥昔单抗、替拉珠单抗、沙妥珠单抗、加那珠单抗、地努妥昔单抗、弗雷曼珠单抗、厄瑞努单抗、卡西瑞单抗、伊德维单抗、阿尼鲁单抗、索罗维单抗、奥美珠单抗、那昔妥单抗、阿杜那单抗、他法司他单抗、玛格妥昔单抗、更汀芦单抗、替瑞利尤单抗、珂罗利单抗、奈莫利珠单抗、卡妥索单抗、帕拉莫妥单抗、法瑞西单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、恩诺单抗、赛妥珠单抗、贝兰妥单抗、朗妥昔单抗、替索妥单抗、德达博妥单抗、帕曲妥单抗等抗体；莫格利珠单抗、贝那利珠单抗、奥比妥珠单抗、伊奈利珠单抗等具有修饰糖链的抗体；包含雷珠单抗、伊达赛珠单抗、博纳吐单抗、布洛赛珠单抗、阿昔单抗、卡拉西单抗、赛妥珠单抗等抗体片段的低分子抗体。
[7C]第7C方式是前述方式[3]～[3-7]、[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中所得的抗体，所述抗体是由产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的NS0细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的Sp2/0细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的Sp2/0细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的Sp2/0细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的NS0细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的Sp2/0细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的Sp2/0细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的Sp2/0细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的NS0细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的NS0细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的NS0细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的NS0细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的NS0细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生洛莫索珠单抗的CHO细胞、产生利散吉珠单抗的CHO细胞、产生耐昔妥珠单抗的NS0细胞、产生耐昔妥珠单抗的CHO细胞、产生雷夫利珠单抗的CHO细胞、产生布罗索尤单抗的CHO细胞、产生伊沙妥昔单抗的CHO细胞、产生替拉珠单抗的CHO细胞、产生沙妥珠单抗的CHO细胞、产生加那珠单抗的CHO细胞、产生地努妥昔单抗的Sp2/0细胞、产生地努妥昔单抗的CHO细胞、产生弗雷曼珠单抗的CHO细胞、产生厄瑞努单抗的CHO细胞、产生卡西瑞单抗的CHO细胞、产生伊德维单抗的CHO细胞、产生阿尼鲁单抗的NS0细胞、产生阿尼鲁单抗的CHO细胞、产生索罗维单抗的CHO细胞、产生奥美珠单抗的CHO细胞、产生那昔妥单抗的CHO细胞、产生阿杜那单抗的CHO细胞、产生他法司他单抗的CHO细胞、产生玛格妥昔单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的NS0细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的Sp2/0细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生伊奈利珠单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生博纳吐单抗的CHO细胞、产生布洛赛珠单抗的CHO细胞、产生阿昔单抗的CHO细胞、产生卡拉西单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生抗GPVI抗体的CHO细胞等CHO细胞产生的抗体。
[7C-1]前述方式[3]～[3-7]、[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中所得的抗体是由产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生洛莫索珠单抗的CHO细胞、产生利散吉珠单抗的CHO细胞、产生耐昔妥珠单抗的CHO细胞、产生雷夫利珠单抗的CHO细胞、产生布罗索尤单抗的CHO细胞、产生伊沙妥昔单抗的CHO细胞、产生替拉珠单抗的CHO细胞、产生沙妥珠单抗的CHO细胞、产生加那珠单抗的CHO细胞、产生地努妥昔单抗的CHO细胞、产生弗雷曼珠单抗的CHO细胞、产生厄瑞努单抗的CHO细胞、产生卡西瑞单抗的CHO细胞、产生伊德维单抗的CHO细胞、产生阿尼鲁单抗的CHO细胞、产生索罗维单抗的CHO细胞、产生奥美珠单抗的CHO细胞、产生那昔妥单抗的CHO细胞、产生阿杜那单抗的CHO细胞、产生他法司他单抗的CHO细胞、产生玛格妥昔单抗的CHO细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞、产生伊奈利珠单抗的CHO细胞、产生博纳吐单抗的CHO细胞、产生布洛赛珠单抗的CHO细胞、产生阿昔单抗的CHO细胞、产生卡拉西单抗的CHO细胞、产生抗GPVI抗体的CHO细胞等CHO细胞产生的抗体。
[7C-2]前述方式[3]～[3-7]、[3B]～[3B-7]中记载的抗体的制造方法中所得的抗体是由产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、和产生抗GPVI抗体的CHO细胞等CHO细胞产生的抗体；或由产生托珠单抗的CHO细胞或产生抗GPVI抗体的CHO细胞产生的抗体；或由产生托珠单抗的CHO细胞产生的抗体。
以下，对各方式更详细地进行说明。
1.海藻酸(Alginic acid)
以下，对本说明书中的作为式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的合成原料的海藻酸、作为可包含于芯层中的海藻酸溶液或海藻酸凝胶的原料的海藻酸、以及在阴离子性聚合物层的形成中使用的海藻酸进行说明。
本说明书中，记载为海藻酸的情况下，则意指选自海藻酸、海藻酸酯和它们的盐(例如，海藻酸钠)中的至少1种海藻酸(有时称为“海藻酸类”)。使用的海藻酸可以是天然来源、也可以是合成物，优选为天然来源。优选使用的海藻酸类是由巨藻(Lessonia)、巨囊藻(Macrocystis)、海带(Laminaria)、泡叶藻(Ascophyllum)、丛梗藻(durvillaea)、褐藻苷苔(Ecklonia cava)、黑海带(アラメ)、昆布等褐藻类提取的体内吸收性的多糖类，并且是D-甘露糖醛酸(M)与L-古罗糖醛酸(G)这2种糖醛酸以直链状聚合而成的聚合物。更具体地是D-甘露糖醛酸的均聚物级分(MM级分)、L-古罗糖醛酸的均聚物级分(GG级分)、以及D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸无规排列而得的级分(M/G级分)任意键合而成的嵌段共聚物。
海藻酸是由褐藻类的海藻提取、纯化而制造的天然多糖类的一种，是D-甘露糖醛酸(M)与L-古罗糖醛酸(G)聚合而成的聚合物。海藻酸的D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸的构成比(M/G比)、即凝胶强度，主要根据海藻等作为来源的生物的种类而不同，此外，也受该生物的生长环境、季节的影响，处于M/G比为约0.2的高G型至M/G比为约5的高M型的大范围。海藻酸的物理化学性质因海藻酸的M/G比、M与G的排列方式等而不同，另外有时优选的用途也不同。已知海藻酸类的凝胶化能力和生成的凝胶的性质受M/G比的影响，通常G比率高时凝胶强度变高。另外，M/G比还对凝胶的硬度、脆性、吸水性、柔软性等造成影响。因此，本发明中使用的海藻酸可以根据其最终使用用途而采用合适的M/G比、合适的粘度。
海藻酸的工业制造方法有酸法和钙法等，本发明中可使用通过任意的制造方法制造的海藻酸。优选通过纯化，由HPLC法得到的定量值为80～120质量％的范围的海藻酸，更优选在90～110质量％的范围的海藻酸，进一步优选在95～105质量％的范围的海藻酸。本发明中，将由HPLC法得到的定量值在前述的范围的海藻酸称为高纯度海藻酸。本发明中使用的海藻酸或其盐优选为高纯度海藻酸。作为市售品，例如可购入(株)KIMICA销售的KIMICA海藻酸系列，优选购入高纯度食品·医药品用级别的海藻酸使用。也可将市售品进一步适当纯化使用。例如，优选进行低内毒素处理。纯化方法、低内毒素处理方法例如可采用日本特开2007-75425号公报中记载的方法。本说明书中，记载为质量％时则意指w/w％或w/v％。
作为本发明中使用的“海藻酸”中的海藻酸的盐，为“海藻酸的1价金属盐”，是将海藻酸的D-甘露糖醛酸或L-古罗糖醛酸的羧酸的氢离子与Na+、K+等1价金属离子进行离子交换而制造的盐。作为海藻酸的1价金属盐，具体可举出海藻酸钠、海藻酸钾等，特别优选海藻酸钠。
本说明书中，有时将海藻酸记做(ALG)，将海藻酸的任意1个羧基记做-COOH，将海藻酸表述为(ALG)-COOH。
本发明中使用的海藻酸可以根据其最终的使用用途使用具有适当重均分子量的海藻酸。本发明中使用的海藻酸的重均分子量(GPC)为例如1万～1,000万；优选为10万～500万；更优选为15万～300万。
一些方式中，海藻酸为海藻酸钠。海藻酸钠可使用市售品的海藻酸钠。在此，后述实施例中使用的海藻酸钠选自下表中记载的A-1、A-2、A-3、B-1、B-2和B-3的海藻酸钠(经销商持田制药株式会社)。各海藻酸钠的1w/w％的水溶液的粘度、重均分子量和M/G比示于下表。
[表8]
前述海藻酸钠A-1、A-2、A-3、B-1、B-2和B-3的各物性值通过下述各种方法测定。测定方法不限于该方法，根据测定方法的不同，各物性值有时与上述不同。
[海藻酸钠的粘度测定]
根据日本药典(第16版)的粘度测定法，使用旋转粘度计法(锥板型旋转粘度计)测定。具体的测定条件如以下所示。试样溶液的制备使用MilliQ水进行。测定仪器使用锥板型旋转粘度计(粘度粘弹性测定装置レォストレスRS600(Thermo Haake GmbH)传感器：35/1)。转速在1w/w％海藻酸钠溶液测定时为1rpm。读取时间设为测定2分钟、从开始1分钟至2分钟的平均值。将3次测定的平均值作为测定值。测定温度设为20℃。
[海藻酸钠的重均分子量测定]
(1)通过凝胶渗透色谱(GPC)和(2)GPC-MALS的2种测定方法测定。测定条件如下所示。
[前处理方法]
在试样中加入洗脱液溶解后，用0.45μm膜过滤器过滤后作为测定溶液。
(1)凝胶渗透色谱(GPC)测定
[测定条件(相对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05％
检测器：RI检测器
柱温度：40℃
注入量：200μL
分子量标准：标准普鲁兰多糖、葡萄糖
(2)GPC-MALS测定
[折射率增量(dn/dc)测定(测定条件)]
差示折射率计：Optilab T-rEX
测定波长：658nm
测定温度：40℃
溶剂：200mM硝酸钠水溶液
试样浓度：0.5～2.5mg/mL(5浓度)
[测定条件(绝对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05％
检测器：RI检测器、光散射检测器(MALS)
柱温度：40℃
注入量：200μL
本说明书中，对于海藻酸、海藻酸衍生物、交联海藻酸和交联海藻酸的分子量，单位有时记为Da(道尔顿)。
海藻酸类的D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等作为来源的生物的种类而不同，此外，也受到该生物的生长环境、季节的影响，处于M/G为约0.2的高G型至M/G比为约5的高M型的大范围。已知海藻酸类的凝胶化能力和生成的凝胶的性质受M/G比的影响，通常G比率高时凝胶强度变高。另外，M/G比还对凝胶的硬度、脆性、吸水性、柔软性等造成影响。使用的海藻酸类和/或其盐的M/G比通常为0.1～4.0，某方式中为0.1～3.0，某方式中为0.1～2.0，某方式中为0.5～1.8，某方式中为0.8～1.2。另外，在其它方式中为0.1～0.5。
此外，本发明中使用的海藻酸可以根据其最终使用用途而采用合适的粘度、合适的M/G比。
本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示包含“～”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。
本说明书中，所使用的“海藻酸酯”、“海藻酸盐”没有特别限定，为了与交联剂反应，需要不具有阻碍交联反应的官能团。作为海藻酸酯，优选可举出海藻酸丙二醇酯等。
海藻酸例如可以采用海藻酸的1价盐、海藻酸的2价盐的形态。作为海藻酸的1价盐，可举出例如海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵等，优选为海藻酸钠或海藻酸钾，更优选为海藻酸钠。作为海藻酸的2价盐，可举出例如海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸钡、海藻酸锶等。
海藻酸为高分子多糖类，难以正确地确定分子量，通常重均分子量为1,000～1000万、优选为1万～800万、更优选为2万～300万。源自天然物的高分子物质的分子量测定中，已知根据测定方法不同会产生值的差异。
本说明书中，特定本发明的海藻酸衍生物或海藻酸或其盐的分子量的情况下，只要没有特别说明，则为通过尺寸排阻色谱(SEC)算出的重均分子量。作为本发明中使用的海藻酸或其盐，优选根据其最终使用用途使用适当的分量分布的物质。
例如，后述实施例中记载的凝胶渗透色谱(GPC)或凝胶过滤色谱(这些也总称为尺寸排阻色谱(SEC))的测定条件下，优选为10万～500万，更优选为15万～300万。此外，某方式中为50万～300万，更优选为100万～250万，进一步优选为100万～200万。
此外，例例如可通过GPC-MALS(SEC-MALS)法测定绝对重均分子量。通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)优选为1万以上、更优选为5万以上、进一步优选为6万以上，另外优选为100万以下、更优选为80万以下、进一步优选为70万以下、特别优选为50万以下。其优选范围为1万～100万，更优选为5万～80万，进一步优选为6万～50万。
通常，通过使用上述的SEC、SEC-MALS的方法算出高分子多糖类的分子量时，可产生约10％～约30％的测定误差。例如，如果为50万则值可在35万～65万的范围变动，如果为100万则值可在70万～130万程度的范围变动。本说明书中，分子量测定的记载中，记载为“约”时，则包括该数值的±10％的值，某方式中包括该数值的±20％的值。
在此，一般源自天然物的高分子物质不具有单一的分子量，为具有各种分子量的分子的集合体，因此测定具有一定幅度的分子量分布。代表性测定方法为凝胶过滤色谱。作为通过凝胶过滤色谱得到的分子量分布的代表性信息，可举出重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、分散比(Mw/Mn)。
重视分子量大的高分子对平均分子量的贡献的是重均分子量，如下式表示。
Mw＝∑(WiMi)/W＝∑(HiMi)/∑(Hi)
数均分子量将高分子的总重量除以高分子的总数算出。
Mn＝W/∑Ni＝∑(MiNi)/∑Ni＝∑(Hi)/∑(Hi/Mi)
在此，W为高分子的总重量，Wi为第i个高分子的重量，Mi为第i个的洗脱时间下的分子量，Ni为分子量Mi的个数，Hi为第i个的洗脱时间下的高度。
已知源自天然物的高分子物质的分子量测定因测定方法的不同值产生不同(透明质酸的例子：Chikako YOMOTA et.al.Bull.Natl.Health Sci.，Vol.117，pp135-139(1999)、Chikako YOMOTA et.al.Bull.Natl.Inst.Health Sci.，Vol.121，pp30-33(2003))。对于海藻酸的分子量测定，有记载由固有粘度(Intrinsic viscosity)算出的方法、通过SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle LaserLight Scattering Detection)算出的方法的文献(ASTM F2064-00(2006)，ASTMInternational发行)。本发明中，重均分子量按照上述文献所述的常规方法，例如尺寸排阻色谱(SEC)测定分子量，可使用通过以普鲁兰多糖作为标准物质的校准曲线算出的值。
另外，本发明中，重均分子量可以为按照上述文献所示的常规方法、通过例如尺寸排阻色谱(SEC)-MALS测定的绝对分子量。
海藻酸类的分子量测定可按照常规方法测定。
本说明书中，特定海藻酸或其盐的分子量时，只要没有特别说明，为通过凝胶过滤色谱算出的重均分子量。分子量测定中使用凝胶过滤色谱时的代表性条件可采用例如后述的本实施例的条件。柱例如可使用Superose6Increase 10/300GL柱(GE HealthcareScience公司)，作为展开溶剂，例如可使用包含0.15mol/L NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，作为分子量标准，可以使用蓝色葡聚糖、甲状腺球蛋白、铁蛋白、醛缩酶、伴白蛋白、卵白蛋白、核糖核酸酶A和抑肽酶。
本说明书中使用的海藻酸的粘度没有特别限定，以1w/w％的海藻酸类的水溶液测定粘度时，优选为10mPa·s～1000mPa·s，更优选为50mPa·s～800mPa·s。
海藻酸的水溶液的粘度的测定可以根据常规方法测定。例如，可以使用旋转粘度计法的同轴双筒型旋转粘度计、单筒型旋转粘度计(Brookfield型粘度计)、圆锥-平板型旋转粘度计(锥板型粘度计)等测定。优选期望依照日本药典(第16版)的粘度测定法。更优选使用锥板型粘度计。
海藻酸类由褐藻类提取而得，最初分子量大、粘度高，但在利用热的干燥、纯化等过程中，分子量变小，粘度变低。通过制造步骤的温度等条件管理、作为原料的褐藻类的选择、制造步骤中的分子量的分级等方法可制造分子量不同的海藻酸类。进一步，通过与具有不同分子量或粘度的其他批次的海藻酸类混合，也能形成具有目标分子量的海藻酸类。
本说明书中使用的海藻酸在一些方式中为未经低内毒素处理的海藻酸，或在另一些方式中，为经低内毒素处理的海藻酸。低内毒素是指内毒素水平低至实质上不引发炎症或发热的程度。更优选期望为经低内毒素处理的海藻酸类。
低内毒素处理可以通过公知的方法或基于其的方法进行。例如，可以通过纯化透明质酸钠的菅等的方法(例如参照日本特开平9-324001号公报等)、纯化β1，3-葡聚糖的吉田等的方法(例如参照日本特开平8-269102号公报等)、纯化海藻酸盐、结冷胶等生物体高分子盐的威廉等的方法(例如参照日本特表2002-530440号公报等)、纯化多糖的詹姆斯等的方法(例如参照国际公开第93/13136号小册子等)、路易斯等的方法(例如参照美国专利第5589591号说明书等)、纯化海藻酸盐的赫尔曼弗兰克等的方法(例如参照ApplMicrobiol Biotechnol(1994)40：638-643等)等或基于它们的的方法而实施。低内毒素处理不限于它们，可以通过洗涤、利用过滤器(除去内毒素的过滤器、带电过滤器等)的过滤、超滤、使用柱(内毒素吸附亲和柱、凝胶过滤柱、利用离子交换树脂的柱等)的纯化、在疏水性物质、树脂或活性炭等上的吸附、有机溶剂处理(利用有机溶剂的提取、添加有机溶剂导致的析出·沉降等)、表面活性剂处理(例如参照日本特开2005-036036号公报等)等公知的方法、或者适当组合它们而实施。在这些处理的步骤中可以适当组合离心分离等公知的方法。期望根据海藻酸的种类而适当选择。
内毒素水平可利用公知的方法确认，例如，可以通过利用鲎试剂(LAL)的方法、使用ェンドスペシ一(注册商标)ES-24S Set(生化学工业株式会公司)的方法等测定。
所使用的内毒素的处理方法没有特别限定，作为其结果，进行利用鲎试剂(LAL)的内毒素测定时，海藻酸类的内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，进一步优选为100EU/g以下，尤其优选为50EU/g以下，特别优选为30EU/g以下。本发明中，“实质上不含内毒素”意指通过日本药典内毒素试验测定的内毒素值在前述的数值范围。经低内毒素处理的海藻酸钠可由例如Sea Matrix(注册商标)(持田制药株式会社)、PRONOVATM UP LVG(FMCBioPolymer)等市售品而获得。
另外的一些方式中，本说明书中的作为式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的合成原料的海藻酸钠、以及可包含于芯层中的海藻酸溶液或作为海藻酸凝胶的原料的海藻酸钠没有特别限定，可选自例如前述表8中记载的海藻酸钠A-1、A-2、A-3、B-1、B-2或B-3。
另外的一些方式中，作为可在阴离子性聚合物层中使用的海藻酸溶液的原料的海藻酸钠没有特别限定，可选自例如前述表8中记载的海藻酸钠A-1、A-2、A-3、B-1、B-2或B-3。
本说明书中，使用前述海藻酸钠制备的海藻酸溶液(也称为海藻酸钠溶液)的浓度为例如约0.1～约3.3重量％的范围。
本说明书中，作为式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的合成原料的海藻酸钠优选为前述表8中记载的A-2、A-3、B-2或B-3，更优选为A-2或A-3。另外，式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的合成中使用的该海藻酸钠溶液的浓度优选为1.5～2.0重量％的范围。
本说明书中，可在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中含有的海藻酸溶液、或海藻酸凝胶的形成中所用的海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸钠优选为前述表8中记载的A-2、A-3、B-2或B-3，更优选为A-2或A-3。另外，使用该海藻酸钠制备的海藻酸溶液的浓度优选为约0.3～约1.5重量％的范围。
本说明书中，可在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用的海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸钠优选为前述表8中记载的A-2或B-2。另外，使用该海藻酸钠制备的海藻酸溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％等的范围的浓度。
本说明书中，海藻酸溶液意指使海藻酸溶解于溶剂而得的溶液。作为该溶剂，没有特别限定，可举出例如培养基、细胞培养用培养基、培养液、等渗缓冲液、水、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)和生理食盐水等。使海藻酸钠溶解于溶剂中时，称为海藻酸钠溶液。
一些方式中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中所用的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、海藻酸溶液没有特别限定，也可以混合胶原溶液、培养基、培养液等。应予说明，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、和海藻酸溶液的制备中使用的溶剂如后所述。
2.化学修饰海藻酸衍生物
一些方式中，本说明书中的化学修饰海藻酸衍生物是在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基团导入后述的Huisgen反应中的反应性基团、或该反应性基团的互补反应性基团而成的。更具体地，为下述式(I)所示的海藻酸衍生物：
[化26]
[式(I)中，(ALG)、Akn-L1-和-NH-CO-的定义与前述第1方式中的定义相同]、和下述式(II)所示的海藻酸衍生物：
[化27]
/>
[式(II)中，(ALG)、-L2-和-NH-CO-的定义与前述第1方式中的定义相同]。
2价连接基团(-L1-或-L2-)具体可以由前述方式中记载的2价连接基团中选择使用。
一些方式中，本说明书中的2价连接基团(-L1-或-L2-)只要不阻碍环状烷基(Akn-)和叠氮基的反应(Huisgen反应)，则也可使用任意的连接基团。具体地，可举出直链的亚烷基(-(CH2)n-、n＝1～30)[该基团中的-CH2-可以被多个(例如1～10个、或1～5个)-C(＝O)-、-CONH-、-O-、-NH-、-S-、碳原子数为3～8的环烷基环、苯环、杂环(吡啶环、哌啶环、哌嗪环等5～6元芳香族杂环或5～6元非芳香族杂环)等基团替代；该直链的亚烷基(-CH2-)的氢原子可以被多个(例如1～10个、或1～5个)选自氧代基(＝O)、C1-6烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基等基团)、卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)、羟基(-OH)等基团中的基团取代]，但不限定于此。
可将前述式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的-NH-CO-基中的亚氨基(-NH-)的氢原子置换为甲基而形成-N(Me)-CO-基。
前述式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物中的连接基团(-L1-、-L2-)与海藻酸的键合方式有-NH-CO-键、或-N(Me)-CO-键；优选为-NH-CO-键。前述-NH-CO-键、或-N(Me)-CO-键的-CO-来自海藻酸的羧基。
本说明书中，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物可通过例如后述的化学修饰海藻酸衍生物的合成方法来制造。
本说明书的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为约10万Da～约300万Da的范围；优选为约30万Da～约250万Da的范围，更优选为约50万Da～约200万Da的范围。另外，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物通过凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为约10万Da～约300万Da的范围；优选为约30万Da～约250万Da的范围，更优选为约50万Da～约200万Da的范围。
本说明书中，式(I)的Akn-L1-NH-基不需要与海藻酸构成单元的全部羧基键合，另外，式(II)的N3-L2-NH-基不需要与海藻酸构成单元的全部羧基键合。
本说明书中，将式(I)的Akn-L1-NH-基称为反应性基团时，式(II)的N3-L2-NH-基成为互补反应性基团。另外，相反将式(II)的N3-L2-NH-基称为反应性基团时，式(I)的Akn-L1-NH-基成为互补反应性基团。
本说明书中，式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约10mol％的范围。另外，式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团的导入率为例如约0.1～约30mol％的范围；优选为约0.3～约20mol％的范围；更优选为约0.5～约15mol％的范围。
前述反应性基团或互补反应性基团的导入率是将作为海藻酸的重复单元的糖醛酸单糖单元中的导入了各反应性基团的糖醛酸单糖单元的数以百分率表示的值。各反应性基团或互补反应性基团的导入率可通过后述实施例中记载的方法求出。
本说明书中，式(I)中的环状烷基(Akn)和式(II)中的叠氮基通过Huisgen反应形成三唑环，由此形成交联。
本说明书中，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物包含在其分子内的任意羧基处形成了1价盐(例如，钠盐等)的那些。
本说明书中，式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物可以在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的形成中使用，另外还可以在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用。
3.Huisgen反应
Huisgen反应(1，3-偶极加成环化反应)为具有如下述式所示的末端叠氮基和末端炔基的化合物间的缩合反应。反应结果具有可收率良好地得到二取代1，2，3-三唑环，且不生成多余的副产物的特征。认为该反应可生成1，4-或1，5-二取代三唑环，可通过使用铜催化剂(Cu catalyst)而位置选择性地得到三唑环。
[化28]
此外，Wittig和Krebs报告了不使用铜催化剂的Huisgen反应。即，仅混合环辛炔和苯基叠氮化物而得到环化加成体的反应(下述式中，R3＝苯基)。本反应由于环辛炔的三键张力较大，因此通过与苯基叠氮化物反应消除张力成为驱动力，反应自发地进行，因此不需要催化剂。
[化29]
如以上那样，Huisgen反应可使用具有取代的伯叠氮基、仲叠氮基、叔叠氮基、芳族叠氮基等的叠氮化合物、和具有作为叠氮基的互补反应性基团的末端或环状炔基的化合物。此外，Huisgen反应中，由于几乎仅叠氮基和炔基反应，反应基质中可取代各种官能团(例如酯基、羧基、烯基、羟基、氨基等)。
一些方式中，为了不生成不期望的副产物、且避免铜催化剂产生的细胞毒性而不使用铜催化剂，为了在短时间、容易且高效地在海藻酸分子间形成基于1，2，3-三唑环的交联，作为Huisgen反应的炔基，例如使用前述方式[1]中记载的环状炔基(环辛基)。
优选方式的海藻酸衍生物的交联方法中，该反应(Huisgen反应)中几乎不形成不期望的副产物。因此，可以将能够产生抗体、生理活性物质等的细胞包含在本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中。
4.化学修饰海藻酸衍生物的制造方法
本说明书中，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物如下述反应式所示那样，可以将式(AM-1)(Akn-L1-NH2：Akn-L1-与前述方式[1]中的定义相同)所示的胺、或式(AM-2)(N3-L2-NH2：-L2-与前述方式[1]中的定义相同)所示的胺与海藻酸的任意羧基通过使用任意的缩合剂(condensing agent)的缩合反应来制造。各反应的详细条件依照国际公开第2019/240219号小册子中记载的条件。
[化30]
前述式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的制造方法中，式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺的导入率(与前述方式中的式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基的导入率相同的含义)可通过考虑该胺的性质等并通过对下述(i)～(v)等的反应条件进行适宜选择组合来调节。(i)缩合剂的等量的增减、(ii)反应温度的上升·下降、(iii)反应时间的延长·缩短、(iv)反应基质的海藻酸的浓度的调整、(v)为了提高式(AM-1)或式(AM-2)的胺的溶解度而添加混合于水中的有机溶剂等。
以下示出式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺中的本说明书中使用的更具体的胺的制造方法。
以下的各制造方法中，x1a、x1b、y1b、x2、y2、z2、x3a、y3a、z3a、x3b、y3b、z3b、x4、y4、x5a、y5a、z5a、x5b、y5b、z5b、x6、y6、z6、x7a、y7a、z7a、v7a、x7b、y7b、z7b、v7b、a1、b1、a2、b2、a3、b3、a4、b4、a5和a6的定义是与前述方式[1]中记载的相同定义；RA＝甲基、乙基等C1～6烷基；P1是选自-C(O)O-tertBu基、-C(O)O-Bn基、-C(O)CH3基、-C(O)CF3基、-SO2Ph、-SO2PhMe基、-SO2Ph(NO2)基等中的氨基的保护基；E＝卤素原子(氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)、-OTs基、-OMs基等离去基团，X＝卤素原子(氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)。另外，以下的各制造方法中，式(SM-A1)、式(SM-A2)、式(SM-B)、式(SM-C1)、式(SM-C2)、式(SM-D)、式(SM-E1)、式(SM-E2)、式(SM-F)、式(SM-G1)、式(SM-G2)、式(SM-H)、式(SM-J)、式(SM-K)、式(SM-L)、式(RG-A1)、式(RG-A2)、式(RG-B1)、式(RG-C1)、式(RG-C2)、式(RG-D1)、式(RG-E1)、式(RG-E2)、式(RG-F1)、式(RG-F2)、式(RG-F3)、式(RG-G1-1)、式(RG-G1-2)、式(RG-G1-3)、式(RG-G2-1)、式(RG-G2-2)、式(RG-G2-3)、式(RG-H1)、式(RG-H2)、式(RG-I1)、式(RG-J1)、式(RG-K)、式(RG-L1)和式(RG-M)所示的化合物是市售化合物、或可由市售化合物通过文献公知的制造方法制造的化合物。
另外，以下的各制造方法中，保护基P1的保护·脱保护可按照文献公知的方法，例如，“Protective Groups in Organic Synthesis，第4版、2007年、John Wiley&Sons、Greene等人”的成书中记载的脱保护方法进行保护·脱保护。
另外，以下各制造方法中，记载为缩合反应时则意指与前述缩合反应相同的反应。
[制造方法A]
式(AM-1-1A)和式(AM-1-1B)所示的胺的制造方法：
[化31]
<步骤1>使用式(SM-A)的化合物和式(RG-A1)的化合物，进行缩合反应，由此得到缩合体。接着，加成溴后，使用tert-BuOK等碱进行脱溴化反应，由此形成炔基。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-1A)所示的胺、或其盐。
<步骤2>使用以与前述[制造方法A]<步骤1>相同的方法得到的式(SM-A2)的化合物和式(RG-A2)的化合物进行缩合反应，接着将保护基P1脱保护，由此可以制造式(AM-1-1B)所示的胺、或其盐。
[制造方法B]
式(AM-1-2)所示的胺的制造方法：
[化32]
使用式(SM-B)的化合物和式(RG-B 1)的化合物进行缩合反应，由此得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-2)所示的胺、或其盐。
[制造方法C]式(AM-1-3A)和式(AM-1-3B)所示的胺的制造方法：
[化33]
使用式(SM-C1)的化合物和式(RG-C1)的化合物，进行缩合反应，得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-3A)所示的胺、或其盐。
使用式(SM-C2)的化合物和式(RG-C2)的化合物，进行缩合反应，得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-3B)所示的胺、或其盐。
[制造方法D]式(AM-1-D)所示的胺的制造方法：
[化34]
使用式(SM-D)的化合物和式(RG-D1)的化合物进行缩合反应，得到缩合体。接着通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-D)所示的胺、或其盐。
[制造方法E]式(AM-1-E1)和式(AM-1-E2)所示的胺的制造方法：
[化35]
使用式(SM-E1)的化合物和式(RG-E1)的化合物，进行缩合反应，得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-E1)所示的胺、或其盐。
使用式(SM-E2)的化合物和式(RG-E2)的化合物，进行缩合反应，得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-E2)所示的胺、或其盐。
[制造方法F]式(AM-1-F)所示的胺的制造方法：
[化36]
<步骤1>使用式(SM-F)的化合物的化合物和式(RG-F1)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-F)所示的胺、或其盐。
<步骤2>使用式(SM-F)的化合物的化合物和式(RG-F2)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过在氢氧化钠等碱存在下，在甲醇、乙醇、四氢呋喃、水等不参与反应的溶剂或它们的混合溶剂中将酯基水解，可以制造式(IM-F1)所示的羧酸、或其盐。
<步骤3>使用[制造方法F]<步骤2>中得到的式(IM-F1)的化合物的化合物和式(RG-F3)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-F)所示的胺、或其盐。
[制造方法G]式(AM-1-G1)和式(AM-1-G2)所示的胺的制造方法：
[化37]
<步骤1>使用式(SM-G1)的化合物的化合物和式(RG-G1-1)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-G1)所示的胺、或其盐。
<步骤2>使用式(SM-G1)的化合物的化合物和式(RG-G1-2)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将酯基水解，可以制造式(IM-G1)所示的羧酸、或其盐。
<步骤3>使用[制造方法G]<步骤2>中得到的式(IM-G1)的化合物的化合物和式(RG-G1-3)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-G1)所示的胺、或其盐。
<步骤4>使用式(SM-G2)的化合物的化合物和式(RG-G2-1)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-G2)所示的胺、或其盐。
<步骤5>使用式(SM-G2)的化合物的化合物和式(RG-G2-2)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将酯基水解，可以制造式(IM-G2)所示的羧酸、或其盐(例如，锂盐、钠盐、钾盐等)。
<步骤6>使用[制造方法G]<步骤5>中得到的式(IM-G2)的化合物的化合物和式(RG-G2-3)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-1-G2)所示的胺、或其盐。
[制造方法H]
式(AM-2-H)所示的胺的制造方法：
[化38]
<步骤1>使用式(SM-H)的化合物和式(RG-H1)的化合物，依照文献公知的方法，例如，“European Journal of Organic Chemistry，2014(6)，p1280-1286；2014年”等中记载的方法，在(i)PPh3、和N2(CO2CHMe2)2的试剂存在下、在四氢呋喃等不参与反应的溶剂中，进行光延反应，接着与[制造方法F]<步骤2>中记载的方法相同地进行水解，由此可以制造式(IM-H1)所示的化合物、或其盐(例如锂盐、钠盐、钾盐等)。
<步骤2>使用[制造方法H]<步骤1>中得到的式(IM-H1)的化合物和式(RG-H2)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-2-H)所示的胺、或其盐。
[制造方法I]
式(AM-2-I)所示的胺的制造方法：
[化39]
<步骤1A>使用[制造方法H]<步骤1>中得到的式(IM-H1)的化合物和式(RG-I1)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-2-I)所示的胺、或其盐。
[制造方法J]
式(AM-2-J)所示的胺的制造方法：
[化40]
<步骤1>使用式(SM-J)的化合物和式(RG-J1)的化合物，进行缩合反应，由此可制造式(IM-J1)。
<步骤2>使用[制造方法J]<步骤1>中得到的式(IM-J1)的化合物，依照文献公知的方法，例如，“Organometallics，29(23)，p6619-6622；2010年”等中记载的方法，在二甲亚砜等不参与反应的溶剂中，与NaN3反应而导入叠氮基后，将保护基P1脱保护，由此可以制造式(AM-2-J)所示的胺、或其盐。
[制造方法K]
式(AM-2-K)所示的胺的制造方法：
[化41]
<步骤1>使用式(SM-K)的化合物和式(RG-K)的化合物，进行缩合反应，由此可以制造式(IM-K)。
<步骤2>使用[制造方法K]<步骤1>中得到的式(IM-K)的化合物，进行与[制造方法J]<步骤2>相同的反应、保护基P1的脱保护，由此可以制造式(AM-2-K)所示的胺、或其盐。
[制造方法L]
式(AM-2-L)所示的胺的制造方法：
[化42]
使用式(SM-L)的化合物和式(RG-L1)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-2-L)所示的胺、或其盐。
[制造方法M]
式(AM-2-M)所示的胺的制造方法：
[化43]
使用式(SM-L)的化合物和式(RG-M)的化合物，进行缩合反应而得到缩合体。接着，通过将保护基P1脱保护，可以制造式(AM-2-M)所示的胺、或其盐。
可用前述[制造方法A]～[制造方法M]制造的式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺以外的胺，例如，式(AM-1)的连接基团-L1-或式(AM-2)的连接基团-L2-为直链的亚烷基(-(CH2)n-、n＝1～30)[该基团中的-CH2-可以被多个(例如，1～10个、或1～5个)-C(＝O)-、-CONH-、-O-、-NH-、-S-、碳原子数为3～8的环烷基环、苯环、杂环(吡啶环、哌啶环、哌嗪环等5～6元芳香族杂环或5～6元非芳香族杂环)等基团替代；该直链的亚烷基(-CH2-)的氢原子可以被多个(例如，1～10个、或1～5个)选自氧代基(＝O)、C1-6烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基等基团)、卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)、羟基(-OH)等基团中的基团取代]时，通过将文献公知的方法，例如，“实验化学讲座第5版、各本、2007年、丸善”、“Comprehensive Organic Transformations，A Guide to Functional GroupPreparations，3rd Edition(Edited by Richard C.Larock)，2018年”、“StrategicApplications of Named Reactions in Organic Synthesis，(Edited by Laszlo Kurti，Barbara Czako)，Academic Press，2005年”等中记载的合成方法适宜组合，可以制造所期望的胺。
本说明书中，式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺(也包括各式的下位式)有时形成制药学上可接受的盐(例如，酸加成盐；例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、对甲苯磺酸盐等)。
本说明书中的化合物可以形成盐，可以依照常规方法，例如，通过混合包含适量的酸或碱的溶液而形成目标的盐后进行分离过滤，或者馏去该混合溶剂，由此得到。作为关于盐的综述，出版有Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use、Stahl&Wermuth(Wiley-VCH、2002)，该书中有详细记载。
本说明书中，式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺(也包括各式的下位式)或其盐可以与水、乙醇、甘油等溶剂形成溶剂化物。
本说明书中，若无特别说明，在环状基上取代有可变取代基时，意指该可变取代基不与环状基的特定的碳原子键合。例如，下述式A中的可变取代基Rs意指可在该式A中的碳原子i、ii、iii、iv或v的任一者上进行取代。
[化44]
5-1.交联海藻酸凝胶
本说明书中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶存在具有使用前述“2.化学修饰海藻酸衍生物”的项目中记载的化学修饰海藻酸衍生物形成的(i)介由2价金属离子键得到的交联、(ii)介由化学键得到的交联、或(iii)介由2价金属离子键和化学键两者得到的交联的交联海藻酸凝胶(也可以称为交联海藻酸或化学交联海藻酸)。前述各纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶是包含通过进行Huisgen反应(交联反应)而形成的基于三唑环的化学交联、以及通过使2价金属离子(例如，钙离子等)共存而形成的离子交联的两者作为交联的交联海藻酸凝胶。另外，前述各纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶是包含通过进行Huisgen反应(交联反应)而形成的基于三唑环的化学交联作为交联的交联海藻酸凝胶。
本说明书中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶，可通过使用前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，进行在该衍生物间形成化学交联的Huisgen反应(交联反应)而得到。或者，可通过使前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与2价金属离子共存而在该衍生物间形成离子交联而得到。或者，还可通过使用前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，进行Huisgen反应(交联反应)，在该衍生物间形成化学交联，进而使2价金属离子共存，由此在该衍生物间形成离子交联而得到。
本说明书中，“形成有交联”、“形成了交联”、或“进行交联反应”意指使用前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，进行Huisgen反应，由此在该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物间形成化学交联(化学键)，或者意指通过使前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与2价金属离子共存而在该式(I)的化学修饰海藻酸衍生物和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的各衍生物间形成离子交联(离子键)，或者意指形成基于前述Huisgen反应的化学交联和基于2价金属离子的离子交联两者。此外，还意指通过使海藻酸(海藻酸钠等)与2价金属离子共存而在海藻酸中形成离子交联。
通过使前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与2价金属离子接触而形成离子交联，成为离子交联海藻酸凝胶的时间为例如瞬时(例如，1～5秒)～数小时(例如，1～3小时)。另外，在前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物间进行Huisugen反应而形成化学交联，成为化学交联海藻酸凝胶的时间为例如数秒～24小时、数秒～12小时、或数秒～30分钟。
作为用于得到前述交联海藻酸凝胶的2价金属离子，没有特别限定，可举出例如钙离子、镁离子、钡离子、锶离子、锌离子等，优选为钙离子、钡离子或锶离子，更优选为钙离子或钡离子。
作为包含2价金属离子的溶液，没有特别限定，可举出例如包含钙离子的溶液(例如，氯化钙水溶液、碳酸钙水溶液、葡萄糖酸钙水溶液等水溶液)、包含钡离子的溶液(例如，氯化钡水溶液等水溶液)、包含锶离子的溶液(例如，氯化锶水溶液等水溶液)，优选为包含钙离子的溶液或包含钡离子的溶液，更优选为氯化钙水溶液或氯化钡水溶液。
包含2价金属离子的溶液的2价金属离子浓度(例如，钙离子或钡离子浓度)没有特别限定，例如为约1mM～约1M的范围、或约10～约500mM的范围；优选为约10～约100mM。
制备包含2价金属离子的溶液等时使用的溶剂没有特别限定，可举出例如自来水、纯水(例如，蒸馏水、离子交换水、RO水、RO-EDI水等)、超纯水(MilliQ水)、培养基、细胞培养用培养基、培养液、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、和生理食盐水等；优选为生理食盐水或超纯水。
前述各纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶中具有离子交联和化学交联时，离子交联的反应是瞬时且可逆的，与之相对，化学交联的反应可在比较温和的条件下缓慢进行反应，是非可逆的。利用该性质，通过适当组合化学交联和离子交联，可有效率地制作本发明的交联海藻酸凝胶。例如，使用后述的“11.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法”中的装置XX，将式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液注射至包含2价金属离子的溶液中，由此可以形成离子交联，瞬时制作纤维(纤维)形状的交联海藻酸凝胶。另外，通过同时在式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物间进行Huisgen反应(交联反应)而形成化学交联，可得到包含离子交联和化学交联两者的纤维(纤维)形状的交联海藻酸凝胶。交联海藻酸凝胶的物性可以通过例如对使用的包含2价金属离子的水溶液(例如氯化钙水溶液)的浓度、或者导入化学修饰海藻酸衍生物中的反应性基团的导入率进行改变等的方法来调整。
利用前述交联反应，使用式(I)和(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，可以将本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶制作为纤维(纤维)形状(也称为“交联海藻酸凝胶纤维”)。应予说明，制作该交联海藻酸凝胶纤维时，可以在式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸(例如，海藻酸钠)溶液来制作。
本发明中，作为强化(例如，获得长期稳定性等)纤维结构的方法之一，利用了化学交联(Huisugen反应)。使用前述那样制作的具有离子交联和化学交联两者的交联海藻酸凝胶纤维，在培养液中进行培养时，形成了离子交联的2价金属离子缓慢、可逆地释放，虽然形成仅残留有化学交联的交联海藻酸凝胶纤维，但凝胶结构通过非可逆的化学交联得到保持，可以稳定地继续进行培养。
本发明的通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶没有特别限定，可以包含例如胶原溶液、胶原凝胶、培养基、细胞培养用培养基、培养液、甲基纤维素、蔗糖溶液、海藻酸溶液、海藻酸凝胶等其它成分。
本说明书中，单纯地记载为“海藻酸凝胶”的情况下，则意指通过在海藻酸(例如，海藻酸钠)或其溶液中共存2价金属离子而形成了离子交联的海藻酸凝胶。
5-2.交联海藻酸凝胶中的化学交联
本说明书中，交联海藻酸凝胶可以通过混合前述式(I)和前述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行Huisgen反应而得到。
本说明书中，交联海藻酸凝胶介由化学交联(由炔基和叠氮基形成的基于三唑环的交联)形成三维的网孔结构。优选的化学修饰海藻酸衍生物是改善了交联后的交联海藻酸凝胶的稳定性的那些。应予说明，交联海藻酸凝胶的物性例如可通过作为原料的式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸中的各反应性基团的导入率来调整。
一些方式的交联海藻酸凝胶是介由下述式(III-L)所示的基团交联而得的交联海藻酸凝胶，
[化45]
式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；-L1-、-L2-和-X-与前述方式[1-12]中的定义相同。
一些方式中，制作交联海藻酸凝胶时的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合比，以式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的重量比计，例如为1∶1.0～4.0、或1∶1.0～3.0、或1∶1.0～2.0、或1∶1.0～1.5、或1∶1；优选为1∶1.0～3.0。
一些方式中，制作交联海藻酸凝胶时的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合比，以式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的重量比计，例如为1∶1.0～4.0、或1∶1.0～3.0、或1∶1.0～2.0、或1∶1.0～1.5、或1∶1。
一些方式中，制作交联海藻酸凝胶时的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合比更优选以式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团的导入率(mol％)比计，例如为1∶1.0～4.0、或1∶1.0～3.0、或1∶1.0～2.0、或1∶1.0～1.5、或1∶1；优选为1∶1.0～3.0。
一些方式中，制作交联海藻酸凝胶时的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合比更优选以式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物与式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团的导入率(mol％)比计，例如为1∶1.0～4.0、或1∶1.0～3.0、或1∶1.0～2.0、或1∶1.0～1.5、或1∶1。
交联海藻酸凝胶不需要海藻酸的构成单元的全部羧基具有上述式(III-L)的交联。交联海藻酸凝胶中的上述式(III-L)所示的交联的导入率(也称为交联率)为例如约0.1～约80％、约0.3～约60％、约0.5～约30％、或约1.0～约10％的范围。
用于得到本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的Huisgen反应中的前述式(I)或式(II)所示的海藻酸衍生物的溶液的浓度为例如约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。
用于得到本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶的使用前述式(I)和式(II)所示的海藻酸衍生物的Huisgen反应中，在前述式(I)和式(II)所示的海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，该海藻酸溶液的浓度为例如0％～约1.98重量％的范围；优选为、0％～约1.8重量％的范围；更优选为0～约1.7重量％的范围。
Huisgen反应的反应温度(制作交联海藻酸凝胶、交联海藻酸凝胶纤维时的温度)通常外温为约4～约60℃，优选外温为约15～约37℃的范围。
6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维
本说明书中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维意指将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、和通过使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层用阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)被覆而得的纤维状(纤维状)的结构体(聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法如后述)。
另外，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是包含芯层和配置于芯层的外侧的阳离子性聚合物层的纤维状(纤维状)的结构体。前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成了交联的交联海藻酸凝胶，前述阳离子性聚合物层是阳离子性聚合物。
另外，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是包含芯层和配置于芯层的外侧的阳离子性聚合物层的纤维状(纤维状)的结构体。前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、以及交联海藻酸凝胶，前述交联海藻酸凝胶包含通过使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联，前述阳离子性聚合物层为阳离子性聚合物。
图1示出将交联海藻酸凝胶纤维用阳离子性聚合物被覆而形成的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的一例的截面图。该聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径为c，包含直径a的芯层5和厚度b的阳离子性聚合物层4，芯层5含有包含产生抗体、生理活性物质等的细胞6的交联海藻酸凝胶。该芯层5的交联海藻酸凝胶是通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶。
一些方式的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层除了使用前述方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶之外，只要是没有细胞毒性的物质则没有特别限定，还可以包含胶原溶液、胶原凝胶、培养基、细胞培养用培养基、培养液、甲基纤维素、蔗糖溶液、海藻酸溶液、海藻酸凝胶等其它成分；优选可以包含选自海藻酸溶液、海藻酸凝胶、培养基、培养液中的成分。
“聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维”是纤维的外径(图2中的c)为例如约0.1～约2000μm程度的纤维状的结构体，因此有时也称为“聚合物涂层交联海藻酸微纤维”。
相对于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的中心轴的垂直方向的截面形状并不限于圆形，可以是非对称结构、变形的形状，例如截面形状可以是圆形、椭圆系或多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)等多种形状，优选为图2所示的圆形的截面形状。
聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径(非圆形的情况下，将长径或最大径视为外径)为例如约0.1～约2000μm、约0.2μm～约2000μm、约1～约1000μm、约2～约500μm、约2～约200μm等的范围。
聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的直径为例如约0.1～约2000μm、约0.2μm～约2000μm、约1～约1000μm、约2～约500μm、约2～约200μm等的范围。芯层的截面的直径优选为小于纤维截面的直径且为50％以上。
聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的聚合物层(b)的厚度可以通过“(聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径-芯层的直径)/2(图2中b＝(c-a)/2)”求出。聚合物层的厚度为例如约0.1～约200μm、约1～约200μm、约5μm～约200μm等。
上述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的直径、外径和聚合物层的内径的值例如可以在聚合物层中使用荧光显色的阳离子性聚合物制作纤维，由相差光学显微镜得到的图像进行测量。表示为该聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的数个位置的测量值的平均值。上述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层和聚合物层通常具有实质上均匀的厚度，优选各层具有±10％的范围内的厚度均匀性。
聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的长度没有特别限定，例如为约0.01～约100m，或约0.1～约75m，或约0.3～约50m。
本说明书中，一些方式的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层可以使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液来形成。此时，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度例如分别为约0.01～约1.5重量％的范围；优选为约0.05～约1.0重量％的范围；更优选为约0.08～约0.75重量％的范围。另外，式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度例如为约0.02～约2.0重量％的范围；优选为约0.1～约2.0重量％的范围；更优选为约0.15～约1.5重量％的范围。另外，在前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时的该海藻酸的浓度例如为0～约1.98重量％的范围；优选为0～约1.8重量％的范围；更优选为0～约1.7重量％的范围。
本说明书中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合没有特别限定，可举出例如(C1：C2)＝(约0.2：约1.3)、(约0.5：约1.0)、(约1.0：约0.5)、(约1.5：0)、(约0.66：约1.34)、(约0.34：约0.66)、(约0.16：约0.34)等组合。这些浓度之外，还可以对C1和C2的浓度进行适宜组合来制备。
本说明书中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，该式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合没有特别限定，可举出例如，(C1A：C1N：C2)＝(约0.1：约0.1：约1.3)、(约0.25：约0.25：约1.0)、(约0.5：约0.5：约0.5)、(约0.75：约0.75：0)、(约0.33：约0.33：约1.34)、(约0.17∶约0.17∶约0.66)、(约0.08∶约0.08∶约0.34)等组合。这些浓度之外，还可以对C1A、C1N、C2的浓度进行适宜组合来制备。
本说明书中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的各容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如，(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
本说明书中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，添加了海藻酸溶液的混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的容量(v1)、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的容量(v2)和海藻酸溶液的容量(v3)的容量比为例如v1+v2+v3＝15的比率，例如，(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等组合。
本说明书中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，该海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)的分子量没有特别限定，通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围、约300,000Da～约2,000,000Da的范围、约700,000Da～约2,000,000Da等的范围。
本说明书中，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，该海藻酸溶液的制备中使用的海藻酸(例如，海藻酸钠等)的分子量没有特别限定，通过凝胶过滤色谱法(GPC法)测定得到的重均分子量为例如约150,000Da～约2,500,000Da的范围、约300,000Da～约2,500,000Da的范围、约700,000Da～约1,400,000Da、约800,000Da～约1,500,000Da、约1,400,000～约2,000,000Da、约1,500,000～约2,500,000等的范围。
制作聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层时使用的式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、海藻酸溶液等的制备时所用的溶剂没有特别限定，可举出例如培养基、细胞培养用培养基、培养液、等渗缓冲液、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、和生理食盐水等；优选为培养基、细胞培养用培养基、培养液、生理食盐水或等渗缓冲液。
7.阳离子性聚合物
聚阳离子是指1分子中具有2个以上阳离子性基团的化合物，阳离子性基团是指阳离子基团或可以衍生为阳离子基团的基团。作为阳离子性基团，可举出例如氨基；甲基氨基、乙基氨基等单烷基氨基；二甲基氨基、二乙基氨基等二烷基氨基；亚氨基；胍基等基团。氨基也可以是配位键合有质子的-NH3 +基。
本说明书中，阳离子性聚合物是指1分子中具有2个以上阳离子性基团的聚合物。作为阳离子性聚合物，可举出具有阳离子性基团的单体聚合而成的物质。此外，阳离子性聚合物优选为具有能够在水中溶解的亲水性、且具有通过阳离子性基团在水中解离而带正电荷的特性的那些。作为阳离子性聚合物，特别优选1分子中具有2个以上氨基的聚合物。
本说明书中，作为阳离子性聚合物，优选为下述物质，其中在包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶纤维的表面中，该交联海藻酸凝胶纤维具有的羧基和阳离子性聚合物的阳离子性基团通过静电相互作用而使该交联海藻酸凝胶纤维的表面被阳离子性聚合物被覆(参照图2)，由此可以提高交联海藻酸凝胶纤维的强度。此外，阳离子性聚合物优选为能够使由芯层中所含的产生抗体、生理活性物质等的细胞产生的抗体、生理活性物质等透过被覆芯层的阳离子性聚合物(聚合物层)而释放至聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维之外的物质。
本说明书中，作为阳离子性聚合物，可举出例如聚氨基酸(碱性氨基酸的聚合物)、碱性多糖类(例如壳聚糖等)、碱性聚合物(聚亚甲基-CO-胍(PMCG)、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯基胺(PVA)、聚乙烯亚胺、烯丙基胺-二烯丙基胺共聚物和烯丙基胺-马来酸共聚物等)的阳离子性聚合物，优选为选自作为聚氨基酸的聚-L-鸟氨酸(PLO)、聚-D-鸟氨酸(PDO)、聚-DL-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸(PDL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-DL-赖氨酸、聚-L-精氨酸(PLA)、聚-D-精氨酸(PDA)、聚-DL-精氨酸、聚-L-高精氨酸(PLHA)、聚-D-高精氨酸(PDHA)、聚-DL-高精氨酸、聚-L-组氨酸(PLH)、聚-D-组氨酸(PDH)和聚-DL-组氨酸中的阳离子性聚合物；更优选为聚-L-鸟氨酸、聚-L-赖氨酸或聚烯丙基胺；进一步优选为聚-L-鸟氨酸。
本说明书中，作为制备包含阳离子性聚合物的溶液时使用的阳离子性聚合物，可举出例如前述聚氨基酸、碱性多糖类、碱性聚合物和它们的盐(盐酸盐、氢溴酸盐等)。前述阳离子性聚合物可以使用市售品或由市售品制备得到的物质。
本说明书中，阳离子性聚合物的聚合度没有特别限定，可举出例如50～6,000的聚合度、50～2,000的聚合度、100～1,500的聚合度等。聚-L-鸟氨酸的情况下为例如130～1,300的聚合度，聚烯丙基胺的情况下为例如50～1,800的聚合度，壳聚糖的情况下为例如60～6,000的聚合度。
本说明书中，阳离子性聚合物的重均分子量(Mw)没有特别限定，可举出例如500～1,000,000的范围内、1,000～500,000的范围内、3,000～300,000的范围内、5,000～100,000的范围内、10,000～50,000的范围内等。阳离子性聚合物的重均分子量(Mw)可以通过凝胶渗透色谱(GPC)测定。
例如，聚-L-鸟氨酸的情况下可以使用市售品的聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐[例如，分子量：70,000～150,000(富士胶片-和光纯药制)、分子量：15,000～30,000、30,000～70,000、5,000～15,000(Sigma-Aldrich制)等]；例如，聚烯丙基胺的情况下可以使用市售品的聚烯丙基胺[例如，分子量：1,600、3,000、5,000、8,000、15,000、25,000(日东纺制)、～15,000、～65,000(Sigma-Aldrich制)等]、市售品的聚烯丙基胺盐酸盐[例如，分子量：1,600、3,000、5,000、15,000、100,000(日东纺制)、～17,500、50,000(Sigma-Aldrich制)等]；例如，壳聚糖的情况下可以使用市售品的壳聚糖[例如，分子量：～15,000(富士胶片-和光纯药制)、5,000、50,000、100,000、160,000、180,000(Sigma-Aldrich制)等]。
作为阳离子性聚合物之一的壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化物，从其水溶性的观点出发，可以使用其脱乙酰化度为例如40～100％的范围内、45～90％的范围内、或50～80％的范围内等的壳聚糖。
包含阳离子性聚合物的溶液的浓度没有特别限定，只要是能够均匀涂覆海藻酸凝胶纤维的表面的浓度即可，可举出例如约0.01～约10.0重量％、约0.01～约5.0重量％、约0.02～约1.0重量％的浓度，优选为约0.02～约5.0重量％、更优选为约0.05～约1.0重量％的浓度。
包含阳离子性聚合物的溶液的粘度没有特别限定，例如为10.0～500.0mPa·s的范围内、20.0～300.0mPa·s的范围内、50.0～200.0mPa·s的范围内等。
在包含阳离子性聚合物的溶液中，可以并用2种以上的阳离子性聚合物。
作为包含阳离子性聚合物的溶液的溶剂，只要是能够溶解阳离子性聚合物则没有特别限定，可举出例如水(自来水、纯水(例如，蒸馏水、离子交换水、RO水、RO-EDI水等)、超纯水(MilliQ水))、无机盐类的水溶液(磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、生理食盐水等)等，优选为能够使阳离子性聚合物的电荷量更多的超纯水、水或生理食盐水。
8.多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维
本说明书中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维意指将前述的“6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维”中记载的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的外侧用阴离子性聚合物(阴离子性聚合物层)被覆而得的纤维状(纤维状)的结构体。即，将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、和通过使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联海藻酸凝胶的芯层用阳离子性聚合物被覆，并将所得聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的外侧用阴离子性聚合物被覆而得的纤维状的结构体(多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法如后述)。
另外，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是包含芯层、配置于芯层的外侧的阳离子性聚合物层、和配置于阳离子性聚合物层的外侧的阴离子性聚合物层的纤维状(纤维状)的结构体。前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞与使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成了交联的交联海藻酸凝胶，前述阳离子性聚合物层是阳离子性聚合物，前述阴离子性聚合物层是阴离子性聚合物。
另外，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是包含芯层、配置于芯层的外侧的阳离子性聚合物层、和配置于阳离子性聚合物层的外侧的阴离子性聚合物层的纤维状(纤维状)的结构体。前述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、以及交联海藻酸凝胶，前述交联海藻酸凝胶包含通过使用前述式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的交联，前述阳离子性聚合物层是阳离子性聚合物，前述阴离子性聚合物层是阴离子性聚合物。
图8示出多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的一例的截面图。该多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径为e，包含直径a的芯层5、厚度b的阳离子性聚合物层4和厚度d的阴离子性聚合物层7，芯层5含有包含产生抗体、生理活性物质等的细胞6的交联海藻酸凝胶。该芯层5的交联海藻酸凝胶是通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶。
一些方式的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层除了通过使用前述方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶之外，只要是没有细胞毒性的物质则没有特别限定，还可以包含胶原溶液、胶原凝胶、培养基、细胞培养用培养基、培养液、甲基纤维素、蔗糖溶液、海藻酸溶液、海藻酸凝胶等其它成分；优选可以包含选自海藻酸溶液、海藻酸凝胶、培养基、培养液中的成分。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是纤维的外径(图8中的e)为例如约0.1～约2000μm程度的纤维状的结构体，因此有时也称为多层聚合物涂层交联海藻酸微纤维。
相对于多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的中心轴的垂直方向的截面形状并不限于圆形，可以是非对称结构、变形的形状，例如截面形状可以是圆形、椭圆系或多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)等多种形状，优选为图8所示的圆形的截面形状。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径(非圆形的情况下，将长径或最大径视为外径)为例如约0.1～约2000μm、约0.2μm～约2000μm、约1～约1000μm、约2～约500μm、约2～约200μm等的范围。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的直径为例如约0.1～约2000μm、约0.2μm～约2000μm、约1～约1000μm、约2～约500μm、约2～约200μm等的范围。芯层的直径优选为小于纤维的直径且为50％以上。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层(b)的厚度可以通过前述“6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维”中记载的方法求出。此外，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层(e)的厚度可以通过“(多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径-聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径)/2(图8中e＝(d-a)/2)”求出。阴离子性聚合物层的厚度为例如约0.1～约200μm、约1～约200μm、约5μm～约200μm等。
上述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的直径、外径、阳离子性聚合物层的内径、阴离子性聚合物层的内径的值例如可以在各聚合物层中使用荧光显色的聚合物制作纤维，由相差光学显微镜的图像进行测量。表示为该多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的数个位置的测量值的平均值。上述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层和聚合物层通常具有实质上均匀的厚度，优选各层具有±10％的范围内的厚度均匀性。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的长度没有特别限定，例如为约0.01～约100m，或约0.1～约75m，或约0.3～约50m。
本说明书中，一些方式的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层可以使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液来形成。此时，式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度范围与前述6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维中记载的相同。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的形成中使用的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与海藻酸溶液的浓度、浓度的组合、各溶液的容量比与前述“6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维”中记载的相同。
制作多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层时使用的式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、海藻酸溶液等的制备时所用的溶剂与前述“6.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维”中记载的溶剂相同。
9.阴离子性聚合物
聚阴离子是指1分子中具有2个以上阴离子性基团的化合物，阴离子性基团是指阴离子基团或可衍生为阴离子基团的基团。作为阴离子性基团，可举出例如羧基、硫酸基等酸性官能团。
本说明书中，阴离子性聚合物层是指通过与阳离子性聚合物的静电相互作用而被覆阳离子性聚合物层的外侧的层。作为形成阴离子性聚合物层的阴离子性聚合物，只要可以通过与阳离子性聚合物的静电相互作用而形成膜则没有特别限制，可举出例如具有羧基或硫酸基等酸性官能团的聚合物。具体地，可举出例如海藻酸、聚半乳糖醛酸、果胶、果胶酸、羧甲基纤维素、卡拉胶、透明质酸和硫酸软骨素等多糖类、聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸等合成聚合物等、以及它们的化学修饰体，还包括它们的化学交联体。此外，该阴离子性聚合物只要具有能够通过与阳离子性聚合物的静电相互作用而形成膜的特性即可，还可以是整体显示中性的聚合物。
本说明书中，阴离子性聚合物优选为能够将前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层被覆为阴离子性聚合物层、能够形成多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(参照图9)的物质。此外，阴离子性聚合物优选为能够将在前述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生的抗体、生理活性物质等透过阳离子性聚合物层，然后透过被覆该阳离子性聚合物层的阴离子性聚合物层而释放至该纤维之外的物质。
本说明书中，阴离子性聚合物层是选自例如阴离子性多糖类、硫酸化多糖类、合成聚合物、阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物，具体为选自例如海藻酸、透明质酸、聚半乳糖醛酸、卡拉胶、琥珀葡聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、果胶、果胶酸、羧甲基纤维素、琼脂等阴离子性多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
本说明书中，阴离子性聚合物层是选自例如海藻酸、前述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和/或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、以及它们的混合物中的阴离子性聚合物；例如是选自硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、岩藻多糖、硫酸角质素、或肝素等硫酸化多糖类、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物；例如是选自丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸等合成聚合物、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物；例如是选自聚谷氨酸、聚天冬氨酸等阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物。
本说明书中，阴离子性聚合物层优选选自海藻酸、前述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和/或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、以及它们的混合物中的阴离子性聚合物。
制备包含阴离子性聚合物的溶液时的溶剂只要是能够溶解阴离子性聚合物则没有特别限定，可举出例如水(自来水、纯水(例如，蒸馏水、离子交换水、RO水、RO-EDI水、等)、超纯水(MilliQ水))、无机盐类的水溶液(磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、生理食盐水等)等，优选使用水或生理食盐水。其中，使用海藻酸、式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物作为阴离子性聚合物时，排除包含发生凝胶化的多价(2价、3价)金属离子的溶液。
本说明书中，阴离子性聚合物的重均分子量(Mw)没有特别限定，例如为约500～约5,000,000的范围、约300,000～约2,000,000的范围、约150,000～约2,500,000的范围、约100,000～约3,000,000的范围。阴离子性聚合物的重均分子量(Mw)可以通过凝胶渗透色谱(GPC)测定。
本说明书中，使用海藻酸作为阴离子性聚合物时，其重均分子量(Mw)例如为约150,000Da～约2,500,000Da的范围、约150,000Da～约800,000Da的范围、约300,000Da～约700,000Da的范围、约700,000Da～约1,400,000Da、约800,000Da～约1,500,000Da、约1,400,000～约2,000,000Da、约1,500,000～约2,500,000等的范围。
本说明书中，使用式(I)或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物作为阴离子性聚合物时，其重均分子量(Mw)例如为约100,000～约3,000,000的范围、约300,000Da～约2,500,000的范围、约500,000～约2,000,000等的范围。
包含阴离子性聚合物的溶液的浓度没有特别限定，只要是能够均匀涂覆聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的表面的浓度即可，例如为约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。优选为0.15重量％。
在包含阴离子性聚合物的溶液中，可以并用2种以上的阴离子性聚合物。
本说明书中，本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液时，该溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。此外，例如为约0.05～约0.15重量％、约0.075～约0.2重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液时，该溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。此外，例如为约0.05～约0.15重量％、约0.075～约0.2重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用海藻酸溶液时，该溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。此外，例如为约0.05～约0.15重量％、约0.075～约0.2重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液时，它们的混合溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。优选为0.15重量％。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物和海藻酸的混合溶液时，该混合溶液的浓度为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％的范围的浓度。优选为0.15重量％。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液时，该混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如，(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物和海藻酸的混合溶液时，该混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和海藻酸溶液的容量比(v1、v2、v3)为例如v1+v2+3v3＝15的比率，例如，(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等组合。
本说明书中，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的形成中使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物时，有时在涂覆后的阴离子性聚合物层中，式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成化学交联。该化学交联是下述式(III-LA)所示的基团：
[化46]
式(III-LA)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；-L1A-、-L2A-和-XA-分别与前述方式[1-12]中的对应的-L1-、-L2-和-X-的定义相同。
10.芯层中所含的细胞
本说明书中，能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的细胞并无特别限制，可举出例如：产生抗体(人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体等各种单克隆抗体或它们的双特异性抗体、低分子化抗体、糖链修饰抗体等各种修饰型抗体)的细胞、产生生理活性物质(酶、细胞因子、激素、凝血因子、疫苗等)的细胞、能够产生可用作药品原料、化学原料、食品原料等的各种有用物质的细胞。优选为产生抗体的细胞或产生生理活性物质的细胞。
本说明书中，作为能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的产生抗体的细胞，可举出由产生抗体的B细胞得到的杂交瘤(产生抗体的杂交瘤)、或由抗体表达载体转化的培养细胞(产生抗体的基因重组细胞)。
本说明书中，作为能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞，可举出由生理活性物质表达载体转化的培养细胞(产生生理活性物质的基因重组细胞)。
可用作这些基因重组的宿主的培养细胞没有特别限定，可举出细菌或酵母等微生物、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。
作为可用作宿主的微生物，可举出例如大肠杆菌、酿酒酵母、裂殖酵母或毕赤酵母等，作为可用作宿主的昆虫细胞，可举出例如Sf9细胞、Sf21细胞或Hiah five细胞等。
作为可用作宿主的动物细胞，可以适宜选自例如CHO细胞、CHO细胞亚株(CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-DXB11细胞、或以修饰糖链的方式进行了转化的CHO细胞等)、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、PERC6细胞、YB2/0细胞、YE2/0细胞、1R983F细胞、Namalwa细胞、Wil-2细胞、Jurkat细胞、Vero细胞、Molt-4细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞、KGH6细胞、P3X63Ag8.653细胞、C127细胞、JC细胞、LA7细胞、ZR-45-30细胞、hTERT细胞、NM2C5细胞、或UACC-812细胞等(这些细胞有的记载于可由American Type CultureCollection获得的ATCC细胞系目录中)中。应予说明，本说明书中，只要没有特别说明，则记为“CHO细胞”时意指包含“CHO细胞亚株”，对于其它细胞则意指包含各细胞亚株的细胞。
本说明书中，作为能够封入聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞，优选为由抗体表达载体转化的动物细胞，即，产生抗体的基因重组动物细胞。另外，作为能够封入芯层中的产生生理活性物质的细胞，优选为由生理活性物质表达载体转化的动物细胞，即，产生生理活性物质的基因重组动物细胞。
作为可用作它们的宿主的动物细胞，具体为CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、或PERC6细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞、或C127细胞；更优选为选自CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞和NS0细胞、HEK293细胞和BHK细胞中的细胞；进一步优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。此外，在某方式中，作为产生抗体的细胞的宿主细胞，优选为CHO细胞、CHO细胞亚株、Sp2/0细胞或NS0细胞；更优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。此外，作为产生生理活性物质的细胞的宿主细胞，优选为CHO细胞、CHO细胞亚株、HEK293细胞或BHK细胞；更优选为CHO细胞或CHO细胞亚株。
本说明书中，作为能够包含于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞，没有特别限定，可举出产生可用作生物药品或生物药品原料的抗体的细胞。此外，作为产生生理活性物质的细胞，并无特别限定，可举出产生可用作生物药品或生物药品原料的生理活性物质的细胞。
作为生物药品，可举出例如针对各种癌症、自身免疫疾病·炎症性疾病、眼疾病、血液疾病、脑神经疾病、遗传性罕见病、内分泌代谢系疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌肉·骨骼疾病、传染病等各种疾病的药品。
生物药品中，抗体药品的具体靶标并无特别限定，可举出C5(补体)、CD3、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD52、CD79、IL-1β、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-17、IL-17R、IL-23、IFNAR、PCSK9、CGRP、CGRPR、GD2(神经节苷脂)、HER2、HER3、TROP2、BCMA、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、KIR、SLAMF7、RANKL、TNF-α、BLyS、EGFR、VEGF、VEGFR、FGF、粘连蛋白、整联蛋白、EpCAM、CCR4、TfR、TF、FIXa、FX、GPVI、硬化蛋白、淀粉样蛋白β、IgE、或各种病毒等(也包括它们的亚型、亚基和片段)，可以在芯层中包含产生针对这些靶标的抗体的细胞。
本说明书中，作为能够包含于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞，并无特别限定，具体可举出：产生莫罗单抗-CD3、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、托珠单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、依库珠单抗、帕尼单抗、优特克单抗、戈利木单抗、卡那单抗、地诺单抗、奥法木单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、阿仑单抗、苏金单抗、雷莫芦单抗、伊匹单抗、依洛单抗、美泊利单抗、阿利库单抗、伊克珠单抗、布罗达单抗、埃罗妥珠单抗、派姆单抗、沙鲁单抗、贝洛托舒单抗、贝利木单抗、达雷木单抗、阿维单抗、杜匹鲁单抗、阿替珠单抗、艾米珠单抗、古塞库单抗、度伐利尤单抗、维多珠单抗、洛莫索珠单抗、利散吉珠单抗、耐昔妥珠单抗、雷夫利珠单抗、布罗索尤单抗、伊沙妥昔单抗、替拉珠单抗、沙妥珠单抗、加那珠单抗、地努妥昔单抗、弗雷曼珠单抗、厄瑞努单抗、卡西瑞单抗、伊德维单抗、阿尼鲁单抗、索罗维单抗、奥美珠单抗、那昔妥单抗、阿杜那单抗、他法司他单抗、玛格妥昔单抗、更汀芦单抗、替瑞利尤单抗、珂罗利单抗、奈莫利珠单抗、卡妥索单抗、帕拉莫妥单抗、法瑞西单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、恩诺单抗、赛妥珠单抗、贝兰妥单抗、朗妥昔单抗、替索妥单抗、德达博妥单抗、帕曲妥单抗等抗体的细胞；产生莫格利珠单抗、贝那利珠单抗、奥比妥珠单抗、伊奈利珠单抗等具有修饰糖链的抗体的细胞；产生包含雷珠单抗、伊达赛珠单抗、博纳吐单抗、布洛赛珠单抗、阿昔单抗、卡拉西单抗、赛妥珠单抗等抗体片段的低分子抗体的细胞等。
本说明书中，作为能够包含于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞，并无特别限定，具体可举出产生抗体的动物细胞，优选为产生抗体的CHO细胞、产生抗体的Sp2/0细胞或产生抗体的NS0细胞，更优选为产生抗体的CHO细胞。
更具体地，作为前述产生抗体的动物细胞，并无特别限定，可举出例如：产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的NS0细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的Sp2/0细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的Sp2/0细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的Sp2/0细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的NS0细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的Sp2/0细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的Sp2/0细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的Sp2/0细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的NS0细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的NS0细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的NS0细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的NS0细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的NS0细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生洛莫索珠单抗的CHO细胞、产生利散吉珠单抗的CHO细胞、产生耐昔妥珠单抗的NS0细胞、产生耐昔妥珠单抗的CHO细胞、产生雷夫利珠单抗的CHO细胞、产生布罗索尤单抗的CHO细胞、产生伊沙妥昔单抗的CHO细胞、产生替拉珠单抗的CHO细胞、产生沙妥珠单抗的CHO细胞、产生加那珠单抗的CHO细胞、产生地努妥昔单抗的Sp2/0细胞、产生地努妥昔单抗的CHO细胞、产生弗雷曼珠单抗的CHO细胞、产生厄瑞努单抗的CHO细胞、产生卡西瑞单抗的CHO细胞、产生伊德维单抗的CHO细胞、产生阿尼鲁单抗的NS0细胞、产生阿尼鲁单抗的CHO细胞、产生索罗维单抗的CHO细胞、产生奥美珠单抗的CHO细胞、产生那昔妥单抗的CHO细胞、产生阿杜那单抗的CHO细胞、产生他法司他单抗的CHO细胞、产生玛格妥昔单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的NS0细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的Sp2/0细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生伊奈利珠单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生博纳吐单抗的CHO细胞、产生布洛赛珠单抗的CHO细胞、产生阿昔单抗的CHO细胞、产生卡拉西单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生抗GPVI抗体的CHO细胞等。
例如，作为前述产生抗体的CHO细胞，可举出：产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生帕利珠单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生巴利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生吉妥珠单抗的CHO细胞、产生贝伐单抗的CHO细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的CHO细胞、产生雷珠单抗的CHO细胞、产生奥马珠单抗的CHO细胞、产生依库珠单抗的CHO细胞、产生帕尼单抗的CHO细胞、产生优特克单抗的CHO细胞、产生戈利木单抗的CHO细胞、产生卡那单抗的CHO细胞、产生地诺单抗的CHO细胞、产生莫格利珠单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生奥法木单抗的CHO细胞、产生帕妥珠单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生那他珠单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、产生阿仑单抗的CHO细胞、产生苏金单抗的CHO细胞、产生雷莫芦单抗的CHO细胞、产生伊匹单抗的CHO细胞、产生依洛单抗的CHO细胞、产生美泊利单抗的CHO细胞、产生阿利库单抗的CHO细胞、产生伊克珠单抗的CHO细胞、产生布罗达单抗的CHO细胞、产生伊达赛珠单抗的CHO细胞、产生埃罗妥珠单抗的CHO细胞、产生派姆单抗的CHO细胞、产生沙鲁单抗的CHO细胞、产生贝洛托舒单抗的CHO细胞、产生贝利木单抗的CHO细胞、产生达雷木单抗的CHO细胞、产生阿维单抗的CHO细胞、产生杜匹鲁单抗的CHO细胞、产生阿替珠单抗的CHO细胞、产生贝那利珠单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生艾米珠单抗的CHO细胞、产生古塞库单抗的CHO细胞、产生度伐利尤单抗的CHO细胞、产生奥比妥珠单抗的CHO细胞、产生维多珠单抗的CHO细胞、产生洛莫索珠单抗的CHO细胞、产生利散吉珠单抗的CHO细胞、产生耐昔妥珠单抗的CHO细胞、产生雷夫利珠单抗的CHO细胞、产生布罗索尤单抗的CHO细胞、产生伊沙妥昔单抗的CHO细胞、产生替拉珠单抗的CHO细胞、产生沙妥珠单抗的CHO细胞、产生加那珠单抗的CHO细胞、产生地努妥昔单抗的CHO细胞、产生弗雷曼珠单抗的CHO细胞、产生厄瑞努单抗的CHO细胞、产生卡西瑞单抗的CHO细胞、产生伊德维单抗的CHO细胞、产生阿尼鲁单抗的CHO细胞、产生索罗维单抗的CHO细胞、产生奥美珠单抗的CHO细胞、产生那昔妥单抗的CHO细胞、产生阿杜那单抗的CHO细胞、产生他法司他单抗的CHO细胞、产生玛格妥昔单抗的CHO细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的CHO细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞、产生伊奈利珠单抗的CHO细胞、产生博纳吐单抗的CHO细胞、产生布洛赛珠单抗的CHO细胞、产生阿昔单抗的CHO细胞、产生卡拉西单抗的CHO细胞、产生抗GPVI抗体的CHO细胞等。
例如为选自产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生利妥昔单抗的CHO细胞、产生英夫利昔单抗的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞、产生阿达木单抗的CHO细胞、产生纳武单抗的CHO细胞、和产生抗GPVI抗体的CHO细胞中的CHO细胞；例如为产生托珠单抗的CHO细胞。
这样产生的抗体可以在产生后进行修饰或改变，具体可举出PEG化、药物的结合修饰、放射标记等。即，PEG化抗体、抗体药物复合物等修饰抗体的生产中，可举出作为原料的抗体的产生中所用的细胞(产生原料抗体的细胞)作为能够封入芯层中的细胞。作为该产生原料抗体的细胞，没有特别限制，作为产生PEG化抗体的原料抗体的细胞，可举出例如，产生赛妥珠单抗聚乙二醇的原料抗体片段的细胞，具体可举出产生赛妥珠单抗的CHO细胞等；作为产生抗体药物复合物的原料抗体的细胞，可举出例如产生吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗tiuxetan、曲妥珠单抗伊姆坦辛、曲妥珠单抗德卢替康(deruxtecan)、本妥昔单抗维汀(Vedotin)、奥英妥珠单抗奥佐米星、沙西妥昔单抗(Cetuximab sarotalocan sodium)、泊洛妥珠单抗维汀、恩诺单抗维汀、戈沙妥珠单抗(Sacituzumab Goviteca)、贝兰妥单抗莫福汀(Mafodotin)、朗妥昔单抗特司林(Tesirine)、替索妥单抗维汀、德达博妥单抗德卢替康、帕曲妥单抗德卢替康等原料抗体的细胞，具体可举出产生吉妥珠单抗的NS0细胞、产生替伊莫单抗的CHO细胞、产生曲妥珠单抗的CHO细胞、产生布伦妥昔单抗的CHO细胞、产生伊珠单抗的CHO细胞、产生西妥昔单抗的Sp2/0细胞、产生泊洛妥珠单抗的CHO细胞、产生恩诺单抗的CHO细胞、产生赛妥珠单抗的Sp2/0细胞、产生贝兰妥单抗的CHO细胞、产生朗妥昔单抗的CHO细胞、产生替索妥单抗的CHO细胞等。
此外，还可以将产生抗体或抗体片段与其他蛋白或肽的融合蛋白的细胞包含在芯层中，可举出例如产生帕滨芙普α(Pabinafusp alfa)的CHO细胞、产生滨曲芙普α(Bintrafusp alfa)的CHO细胞等。
关于“抗体”，在“14.抗体的分类”和“15.抗体·生理活性物质的产生和纯化方法”中详述。
本说明书中，生理活性物质意指对生物表现出生理作用、药理作用的物质和化合物组。作为对生物表现出生理作用、药理作用的物质和化合物组，可举出例如：酶、胰岛素、生物碱、细胞因子(干扰素、白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子等)、植物激素、神经递质、信息素、激素(动物激素)、生长因子、生长调节因子、生长抑制因子、活化因子、造血因子、凝血因子、疫苗(减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白疫苗等)等。
此外，这些物质的受体、细胞表面抗原、细胞表面受体和它们的配体也是表现出生理作用、药理作用的物质，包含于生理活性物质中。进一步，除了生物体本来具有的生理活性物质之外，对生理活性物质进行修饰、改变的物质、活化或抑制生理活性的物质、对多种生理活性物质或其一部分区域、片段进行组合而得的融合蛋白也只要是表现出生理作用、药理作用的物质，则包含于生理活性物质中，本说明书中，将它们也包括在内称为生理活性物质。本说明书中，作为生理活性物质，优选为蛋白性的生理活性物质、即包含蛋白或肽的生理活性物质。
本说明书中，作为能够包含在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞，没有特别限定，如上所述可举出产生可用作生物药品或生物药品原料的生理活性物质的细胞。
作为可用作生物药品的生理活性物质，没有特别限定，可举出例如：t-PA、葡糖脑苷脂酶、半乳糖苷酶、透明质酸酶、艾杜糖醛酸酶、葡糖苷酶、硫酸酯酶、尿酸氧化酶、DNA降解酶、腺苷脱氨酶、三肽基肽酶、透明质酸酶、苯丙氨酸解氨酶和碱性磷酸酶等酶；FVIIa、FVIII、FIX、FXIII、血栓调节素、抗凝血酶、白蛋白等凝血因子和血液相关蛋白；胰岛素、生长激素、利尿肽、性腺刺激激素、GLP-1、GLP-2、甲状旁腺激素、瘦蛋白等激素；IFN-α、IFN-β、IFN-γ等干扰素；促红细胞生成素、血小板生成素等造血因子；G-CSF、IL-2、IL-10、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-17R、TNFR、EGF、EGFR、FGF、VEGF、VEGFR、PDGF、PDGFR、TGF-β等细胞因子和它们的受体；CTLA-4等细胞表面抗原、细胞表面受体和它们的配体；来自B型肝炎病毒的抗原、来自乳头瘤病毒的抗原、来自水痘带状疱疹病毒的抗原、来自SARS-CoV-2的抗原等疫苗用蛋白·肽等，还可举出它们的亚型、亚基、活性片段，可以将产生这些生理活性物质的细胞包含于芯层中。
本说明书中，作为生理活性物质还包含结构改变的物质，可举出例如，施加了使物质活性发生改变的氨基酸序列的改变的物质，具体可举出：胰岛素类似物、GLP-1类似物、促红细胞生成素类似物等。此外，还包含本来物质的一部分区域、片段的氨基酸序列的物质，可以是将这些一部分区域、片段的氨基酸序列多个序列组合而成的物质；具体可举出：胰岛素类似物、FVIII类似物、甲状旁腺激素类似物等。进一步，还包含将二种以上的物质、其一部分区域、片段组合而成的融合蛋白，可举出例如：酶和抗体的融合蛋白、细胞因子受体和抗体Fc部分的融合蛋白、细胞表面抗原胞外结构域与抗体Fc部分的融合蛋白、凝血因子和抗体Fc部分的融合蛋白、凝血因子和血浆蛋白的融合蛋白等。可以将产生这些结构改变的生理活性物质的细胞包含于芯层中。
这样产生的生理活性物质可以在产生后进行修饰、改变，具体可举出PEG化、糖链修饰、药物的结合修饰、放射标记等。即，在PEG化蛋白、脂肪酸加成肽等修饰蛋白·肽的生产中，可以用于作为原料的蛋白·肽的生产，具体可举出产生PEG化FVIII、PEG化促红细胞生成素、脂肪酸加成胰岛素类似物等原料蛋白·肽的细胞，可以在芯层中包含产生这些作为原料的生理活性物质的细胞(产生原料生理活性物质的细胞)。
本说明书中，作为能够包含于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞，并无特别限定，具体可举出：产生阿替普酶、孟替普酶、伊米苷酶、维拉苷酶、阿加糖酶、拉罗尼酶、阿葡糖苷酶、阿伐糖苷酶、艾杜硫酶、加硫酶、依洛硫酸酯酶、拉布立酶、链道酶、细胞利波纳酶、谷卡匹酶、透明质酸酶、黄曲霉酶等酶的细胞；产生依他凝血素、辛凝血素、培罗辛凝血素、妥罗凝血素、罗诺凝血素、培达凝血素、塞莫凝血素、诺那凝血素、阿布诺凝血素、卡德凝血素、依伐凝血素、艾诺凝血素、血栓调节素、抗凝血酶、沃尼凝血素、白蛋白等凝血因子和血液相关蛋白的细胞；产生胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、谷赖胰岛素、德谷胰岛素、生长激素、索马帕西坦、美卡舍明、卡培立肽、伏索利肽、胰高血糖素、促卵泡素、绒膜促性腺素、杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、替度鲁肽、特立帕肽、美曲普汀等激素的细胞；产生干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ-1a等干扰素的细胞；产生依泊汀、达贝泊汀、罗米司亭等造血因子的细胞；产生非格司亭、来格司亭、替西白介素、曲弗明、培贝夫明、依那西普、阿氟西普、地尼白介素等细胞因子和它们的受体的细胞；产生阿巴西普等细胞表面抗原、细胞表面受体和它们的配体的细胞；还可举出产生它们的亚型、亚基、活性片段的细胞。
本说明书中，作为能够包含于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生生理活性物质的细胞，没有特别限定，具体可举出产生生理活性物质的动物细胞，优选为产生生理活性物质的CHO细胞、产生生理活性物质的HEK293细胞或产生生理活性物质的BHK细胞，更优选为产生生理活性物质的CHO细胞。
更具体地，作为前述产生生理活性物质的动物细胞，并无特别限定，可举出例如：产生阿替普酶的CHO细胞、产生伊米苷酶的CHO细胞、产生阿加糖酶的CHO细胞、产生拉罗尼酶的CHO细胞、产生阿葡糖苷酶的CHO细胞、产生阿伐糖苷酶的CHO细胞、产生艾杜硫酶的CHO细胞、产生加硫酶的CHO细胞、产生依洛硫酸酯酶的CHO细胞、产生链道酶的CHO细胞、产生细胞利波纳酶的CHO细胞、产生透明质酸酶的CHO细胞、产生黄曲霉酶的CHO细胞、产生培罗辛凝血素的CHO细胞、产生妥罗凝血素的CHO细胞、产生罗诺凝血素的CHO细胞、产生诺那凝血素的CHO细胞、产生阿布诺凝血素的CHO细胞、产生血栓调节素的CHO细胞、产生抗凝血酶的CHO细胞、产生沃尼凝血素的CHO细胞、产生促卵泡素的CHO细胞、产生绒膜促性腺素的CHO细胞、产生杜拉鲁肽的CHO细胞、产生干扰素β-1a的CHO细胞、产生依泊汀的CHO细胞、产生达贝泊汀的CHO细胞、产生罗米司亭的CHO细胞、产生依那西普的CHO细胞、产生阿氟西普的CHO细胞、产生阿巴西普的CHO细胞等产生生理活性物质的CHO细胞；产生塞莫凝血素的HEK293细胞、产生依伐凝血素的HEK293细胞、产生艾诺凝血素的HEK293细胞等产生生理活性物质的HEK293细胞；产生孟替普酶的BHK细胞、产生依他凝血素的BHK细胞、产生辛凝血素的BHK细胞、产生培达凝血素的BHK细胞等产生生理活性物质的BHK细胞；产生维拉苷酶的HT-1080细胞、产生阿加糖酶的HT-1080细胞、产生艾杜硫酶的HT-1080细胞等产生生理活性物质的HT-1080细胞；产生促卵泡素的PERC6细胞等产生生理活性物质的PERC6细胞等。
例如，作为前述产生生理活性物质的CHO细胞，可举出产生阿替普酶的CHO细胞、产生阿葡糖苷酶的CHO细胞、产生培罗辛凝血素的CHO细胞、产生杜拉鲁肽的CHO细胞、产生干扰素β-1a的CHO细胞、产生达贝泊汀的CHO细胞、产生依那西普的CHO细胞、产生阿氟西普的CHO细胞和产生阿巴西普的CHO细胞等。
应予说明，在此列举的生理活性物质有时记为如上所述在产生后施加了修饰、改变的物质名，可以在芯层中包含产生作为这些的原料的生理活性物质的细胞。例如，艾拉培加酶、培伐利酶、培罗辛凝血素α聚乙二醇、妥罗凝血素α聚乙二醇、培达凝血素α聚乙二醇、诺那凝血素β聚乙二醇、培维索孟、聚乙二醇干扰素αα-2a、聚乙二醇干扰素α-2b、依泊汀β聚乙二醇、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇培贝夫明等经PEG化的生理活性物质中，可以在芯层中包含产生作为这些的原料的生理活性物质的细胞。
作为能够产生生理活性物质的细胞，除了前述产生生理活性物质的基因重组细胞之外，还包含天然细胞、施加了人工改变操作的细胞，也包含由多个细胞组成的细胞块，可举出例如：胰岛素分泌细胞、胰岛、胰岛细胞、多巴胺分泌细胞、脑垂体细胞、生长激素分泌细胞、甲状旁腺细胞、神经生长因子分泌细胞、凝血因子分泌细胞、肝细胞、甲状旁腺细胞、促红细胞生成素分泌细胞、去甲肾上腺素分泌细胞等。本说明书中，作为产生生理活性物质的细胞，在某方式中为胰岛素分泌细胞、胰岛或胰岛细胞、或来自胰腺β细胞的MIN6细胞。
“胰岛素分泌细胞”意指具有分泌胰岛素的功能的细胞，例如，在构成胰岛的细胞中，意指分泌胰岛素的β细胞。此外，“胰岛素分泌细胞”可以是通过分化、成熟、改变等而具有胰岛素分泌功能的细胞，还可以包含例如，使iPS细胞、ES细胞或成体干细胞(例如，间充质干细胞)等干细胞分化而得的具有胰岛素分泌功能的细胞、使幼稚细胞、祖细胞成熟而得的具有胰岛素分泌功能的细胞、以及通过基因重组而赋予了胰岛素分泌功能的细胞。在此，使该细胞分化、成熟包括对该细胞进行培养，即，进行分化或成熟而得的细胞可以包含培养得到的细胞。
“胰岛”别名也称为朗格尔汉斯岛，是由平均约2000个胰岛细胞构成的细胞块。胰岛由分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞、分泌生长抑素的δ细胞、分泌生长激素释放素的ε细胞、和分泌膵多肽的PP(pancreatic polypeptide；胰多肽)细胞的5种细胞构成。
本说明书中，“胰岛细胞”只要包含上述构成胰岛的5种细胞中的至少1种细胞即可，优选至少包含β细胞。一些方式中，作为胰岛细胞，可以是包含α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞和PP细胞的全部的混合物，也可以使包含于胰岛中的状态的那些。
此外，“胰岛细胞”还可以是通过分化、成熟、改变等而成为胰岛细胞的那些。此时，“胰岛细胞”还可以包含例如，使iPS细胞、ES细胞和成体干细胞(例如，间充质干细胞)等干细胞分化而得的胰岛细胞、和使幼稚细胞、祖细胞成熟而得的胰岛细胞。
作为“胰岛素分泌细胞”或“胰岛(包含胰岛细胞)”，在用作移植用途的情况下，优选具有在向患者移植时能够恢复患者的病态的程度的生存性和功能。作为胰岛素分泌细胞、胰岛或胰岛细胞的功能，可举出例如分泌胰岛素，优选在移植后也维持葡萄糖应答性。
“胰岛素分泌细胞”、“胰岛”或“胰岛细胞”的供体为动物、优选脊椎动物、更优选哺乳类，具体可举出人、猪、猴、大鼠或小鼠等，进一步优选为人或猪。在一些方式中，从消除供体不足的观点出发，“胰岛素分泌细胞”、“胰岛”或“胰岛细胞”的供体是猪。作为“胰岛素分泌细胞”、“胰岛”或“胰岛细胞”，可以是由作为供体的动物得到的胰岛或胰岛细胞、或由来自供体的细胞得到的胰岛素分泌细胞或胰岛细胞的任一者，例如可以是由来自人的ES细胞或iPS细胞分化得到的胰岛素分泌细胞或胰岛细胞。
“胰岛素分泌细胞”、“胰岛”或“胰岛细胞”来自猪的情况中，可举出成体的猪胰岛、或胎生期、新生儿期、或周产期的猪胰岛、或由该胰岛得到的胰岛素分泌细胞或胰岛细胞。该胰岛可以适宜培养后使用，也可以使用使胎生期、新生儿期、或周产期的猪胰岛成熟后的胰岛。
作为凝血因子分泌细胞，可举出例如第VIII因子分泌细胞和第IX因子分泌细胞。
11.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法
在此，提供将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞且通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶(芯层)用阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)被覆而成的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法。例如，提供包括使用如图3所示的装置XX的该纤维的制造方法。
以下，对前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法进行说明。
前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法没有特别限定，例如，使用图3所示的装置XX进行。此处的装置XX是优选用于制作聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的装置。
装置XX例如如图3所示，是能够制作具有1个导入口、1个排出口的微细流路的装置，通过从导入口导入溶液并以适当的速度流动，溶液从排出口成为纤维状(纤维状)而排出。
装置XX可以通过例如使用图3所示的挤出筒YY等，将从装置XX的导入口导入的、包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液挤出，由此从装置XX的排出口注射该混合溶液。
作为具备装置XX和挤出筒YY的装置，可以使用例如注射筒。注射筒的情况下，装置XX为外筒，用于将导入装置XX的溶液从排出口挤出的挤出筒YY为内筒。使用注射筒的情况下，可以使用玻璃制或塑料制的注射筒。
如图3所示，作为接收由装置XX的排出口2排出的纤维状物质的容器，可以使用含有包含2价金属离子的溶液的烧杯等容器DD。另外，作为用于将交联海藻酸凝胶纤维CLA的表面用阳离子性聚合物被覆的容器，可使用含有包含阳离子性聚合物的溶液的烧杯等容器EE。
图3是说明聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造过程的1个方式的示意图。作为一例，对使用包含细胞(能够产生抗体、生理活性物质等的细胞)的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的制作方法进行说明。
聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维可通过例如包括下述步骤(S)～(2)的方法来制造。
步骤(S)：从装置XX的导入口1导入包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的步骤，
步骤(1)：从装置XX的排出口2，将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液注射至包含2价金属离子的溶液中，与2价金属离子接触，得到包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)的步骤，
步骤(2)：使步骤(1)中得到的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA)与包含阳离子性聚合物的溶液接触，由此得到用阳离子性聚合物层被覆而形成的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)的步骤。
步骤(S)中，使前述芯层中所含的细胞中说明的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞悬浮或溶解于包含式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液中。此时，除了能够产生抗体、生理活性物质等的细胞之外，还可以添加海藻酸溶液、培养基、培养液、胶原溶液、甲基纤维素、蔗糖溶液等成分。
步骤(1)中，将步骤(S)中制备的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液(或悬浮液)缓慢释放至包含2价金属离子的溶液中，由此使释放的溶液依次进行凝胶化，从而可以制造纤维状(纤维状)的结构物。通过与包含2价金属离子的溶液接触，在式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物之间进行离子交联，同时还进行基于Huisgen反应的化学交联，从而可以制作凝胶。
步骤(2)中，使步骤(1)中得到的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维与包含阳离子性聚合物的溶液接触，由此将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的交联海藻酸凝胶纤维的表面用阳离子性聚合物层被覆。
通过进行前述(S)～(2)的步骤，可以制造本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)。
本说明书中，“接触”意指将某溶液(例如，化学修饰海藻酸衍生物的溶液)或凝胶(例如，交联海藻酸凝胶)浸渍或添加于另外的溶液(例如，包含2价金属离子的溶液、包含阳离子性聚合物的溶液、包含阴离子性聚合物的溶液)中等。
从装置XX的排出口2注射的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的流速(注射速度)可以是例如约100～约10000μL/分钟左右。例如，制作在芯层中包含产生抗GPVI抗体的CHO细胞或产生托珠单抗的CHO细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维时的流速为例如250μL/分钟、4mL/分钟、10mL/分钟等，制作在芯层中包含MIN6细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维时的流速为例如125μL/分钟。流速(注射速度)可以使用注射器泵等进行调整，从而可以制造各种尺寸的纤维。另外，通过改变装置XX的排出口2的大小(直径)，还可以制造能够调节芯层直径的纤维。
在装置XX的排出口2，适宜组合并连接鲁尔锁用针头(金属制等材质)、硅管、玻璃毛细管等，可以将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液释放至包含2价金属离子的溶液中。
从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液例如使用前述方式[1]中记载的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，添加溶剂(例如培养基、细胞培养用培养基、培养液、等渗缓冲液、磷酸缓冲生理食盐水、和生理食盐水等等)，从而规定浓度(例如，各化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度为约0.01～约1.5重量％、式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度为约0.02～约2.0重量％)的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液。
在从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液的情况下，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度与海藻酸溶液的浓度的总浓度制备为例如约0.5～约2.0重量％的范围。
在从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，包含该式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液的浓度(C1(重量％))与海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合没有特别限定，可例如(C1∶C2)＝(约0.2∶约1.3)、(约0.5∶约1.0)、(约1.0∶约0.5)、(约1.5∶0)、(约0.66∶约1.34)、(约0.34∶约0.66)、(约0.16∶约0.34)等组合。这些浓度之外，还可以对C1和C2的浓度进行适宜组合来制备。
在从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，该式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1A(重量％))、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的浓度(C1N(重量％))和海藻酸溶液的浓度(C2(重量％))的组合没有特别限定，可举出例如(C1A∶C1N∶C2)＝(约0.1∶约0.1∶约1.3)、(约0.25∶约0.25∶约1.0)、(约0.5∶约0.5∶约0.5)、(约0.75∶约0.75：0)、(约0.33∶约0.33∶约1.34)、(约0.17∶约0.17∶约0.66)、(约0.08∶约0.08∶约0.34)等组合。这些浓度之外，还可以对C1A、C1N、C2的浓度进行适宜组合来制备。
从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的各容量比(v1、v2)为例如v1+v2＝15的比率，例如为(v1∶v2)＝(7.5∶7.5)。
在从装置XX的导入口1导入的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液中添加海藻酸溶液时，添加海藻酸溶液的混合溶液中的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物的容量(v1)、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的溶液的容量(v2)和海藻酸溶液的容量(v3)的容量比为例如v1+v2+v3＝15的比率，例如为(v1∶v2∶v3)＝(5∶5∶5)、(2.5∶2.5∶10)、(1∶1∶13)等组合。
制作的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维CFB的外径没有特别限定，如上所述为例如约0.1～约200μm的范围。聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维CFB的长度没有特别限定，如上所述为例如约0.3～约50m左右即可。作为该纤维的截面形状，如上所述可举出例如圆形、椭圆系、四边形、五边形等多边形等。
使从装置XX的排出口2注射的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液接触的包含2价金属离子的溶液如前述“5-1.交联海藻酸凝胶”所述，可举出例如包含钙离子、镁离子、钡离子、锶离子、锌离子等的溶液。
包含2价金属离子的溶液的2价金属离子浓度为例如约1mM～约1M的范围、或约10～约500mM的范围；优选为约10～约100mM。
制备包含2价金属离子的溶液时所用的溶剂如前述“5-1.交联海藻酸凝胶”所述，可举出例如水、和生理食盐水等。
使从装置XX的排出口2注射的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞以及式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液与包含2价金属离子的溶液接触的时间为例如约1分钟～60分钟、1分钟～30分钟等。
使前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法的步骤(2)中得到的交联海藻酸凝胶纤维CLA接触的包含阳离子性聚合物的溶液是如前述“7.阳离子性聚合物”所述的包含阳离子性聚合物的溶液，可举出例如包含聚氨基酸、碱性多糖、碱性聚合物等的溶液。
使前述交联海藻酸凝胶纤维CLA接触的包含阳离子性聚合物的溶液的浓度如前述“7.阳离子性聚合物”所述，例如为约0.02～约0.2重量％、约0.05～约0.1重量％等。
使前述交联海藻酸凝胶纤维(CLA)接触的包含阳离子性聚合物的溶液可以包含用于调节氯化钙水溶液、氯化钠水溶液、溶液的pH的缓冲液(乙酸、乙酸钠、氢氧化钠、羟乙基哌嗪乙磺酸等的水溶液)等成分。
使前述交联海藻酸凝胶纤维CLA与包含阳离子性聚合物的溶液接触的时间为例如约1分钟～60分钟、1分钟～30分钟等。
一些方式中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制法时的温度为例如约4～约37℃的范围。
根据前述制造方法，可以容易地得到具有包含一定数目的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的芯层的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
一些方式中，通过在培养液中培养聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，可以培养产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等，产生抗体、生理活性物质等。聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维通过适当更换培养液，可以将产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等连续培养数周～数月。
对于前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的强度，可以依照本领域技术人员公知的方法，通过振荡崩解试验、拉伸强度试验等进行测定。
12.多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法
在此，提供将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞且使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而形成的交联海藻酸凝胶(芯层)用阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)和阴离子性聚合物(阴离子性聚合物层)被覆而成的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法。例如，提供使用聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法，所述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)使用如图3或图10所示的装置XX而得到。
以下，对多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法进行说明。
多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维可以通过在前述“11.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法”中记载的步骤(S)～步骤(2)之后进行下述步骤(3)来制造。
步骤(3)：使步骤(2)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)与包含阴离子性聚合物的溶液接触而进一步用阴离子性聚合物进行涂覆的步骤。
步骤(3)中，使步骤(2)中得到的包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)与包含阴离子性聚合物的溶液接触，由此将包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的表面用阴离子性聚合物层被覆。
通过进行前述(S)～(3)的步骤，可以制造本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB)。
作为用于使用阴离子性聚合物进行被覆的容器，可使用如图10所示的含有包含阴离子性聚合物的溶液的烧杯等容器FF。
制作的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB)的外径没有特别限定，如上所述为例如约0.1～约200μm的范围。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB)的长度没有特别限定，如上所述为例如约0.3～约50m左右即可。作为该纤维的截面形状，如上所述可举出例如圆形、椭圆系、四边形、五边形等多边形等。
使前述步骤(2)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的阴离子性聚合物是前述“9.阴离子性聚合物”中记载的阴离子性聚合物，优选为选自阴离子性多糖类、硫酸化多糖类、合成聚合物、阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、它们的混合物等中的阴离子性聚合物等。更优选使前述步骤(3)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)与选自海藻酸、前述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物和/或式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、和它们的混合物中的阴离子性聚合物接触。由此，经阳离子性聚合物涂覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)的表面进一步被海藻酸、前述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物等涂覆。
在此，使用式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物作为阴离子性聚合物时，可以使用与芯层中所用的该海藻酸衍生物相同或不同的物质。
使前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)接触的包含阴离子性聚合物的溶液的浓度如前述“9.阴离子性聚合物”所述为例如约0.01～约5.0重量％、约0.05～约1.0重量％、约0.1～约0.5重量％、约0.15～约0.4重量％等的范围的浓度。
使前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB)与包含阴离子性聚合物的溶液接触的时间为例如约1分钟～60分钟、1分钟～30分钟等。
一些方式中，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB)的制法时的温度为例如约4～约37℃的范围。
根据前述制造方法，可以容易地得到具有包含一定数目的能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的芯层的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
一些方式中，通过在培养液中培养多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，可以培养产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等，产生抗体、生理活性物质等。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维通过适当更换培养液，可以将产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等连续培养数周～数月。
对于前述多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的强度，可以依照本领域技术人员公知的方法，通过振荡崩解试验、拉伸强度试验等进行测定。
本说明书中的记载中，记载为“约”的情况若无特别说明则可以包括该数值的±20％、优选该数值的±10％的值。
13.产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养方法
在此，提供使用通过前述制造方法制作的在芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法。例如，将前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维加入培养容器，添加培养基以浸渗前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维来进行培养，由此可以制造抗体、生理活性物质等。以下，有时将“抗体、生理活性物质等的制造方法”称为“产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养方法”。
根据优选方式的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养方法，在用前述制作方法制作在芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维后的早期阶段，可以使其浸润于培养液而开始产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养。籍此，如图4所示，可以立即进行向芯层供给培养液(营养源)和氧，即，可以在不使芯层中所含的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等坏死的情形下进行培养。在特别优选的方式中，可以在充分防止聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的坏死的同时产生抗体、生理活性物质等。
根据优选方式的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养方法，在用前述制作方法制作在芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维后的早期阶段，可以使其浸润于培养液而开始产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的培养。籍此，如图11所示，可以立即进行向多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层供给培养液(营养源)和氧，即，可以在不使该芯层中所含的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等坏死的情况下进行培养。在特别优选的方式中，可以在充分防止多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的坏死的同时产生抗体、生理活性物质等。
本发明的在芯层中包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维在培养时对存在于纤维外的培养液(营养源)和氧等成分具有充分的透过性。
以下，对产生抗体的细胞的培养方法的一例进行具体说明，但并不限定于此。在带通气盖的三角烧瓶(Corning公司、Cat.431143)中加入通过前述的制造方法制作的在芯层包含产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，添加后述表31的组成的培养基(30mL)，浸渗凝胶纤维后，在37℃、5％CO2气氛下在培养箱内在使用振荡器(PanasonicHealthcare(株)MIR-S100C)的125rpm的条件下边振荡边进行培养。培养期间，2～3天一次，取出培养基1.8mL，添加Feed液(Irvine公司制、JX Feed 003)或表31的组成的培养基1.8mL，将培养基的总量保存为30mL。此外，培养期间每周进行一次培养基的一半量交换。
此外，以下对产生生理活性物质的细胞的培养方法的一例进行具体说明，但并不限定于此。将通过前述的制造方法制作的在芯层包含产生生理活性物质的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维加入低粘附表面皿，添加后述表35的组成的培养基(5mL)，在37℃、5％CO2气氛下、在培养箱内进行静置培养。
以下，对产生抗体的细胞的培养方法的一例进行具体说明，但并不限定于此。在带有通气盖的三角烧瓶(Corning公司、Cat.431143)中加入通过前述的制造方法制作的在芯层包含产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，添加后述表31的组成的培养基(30mL)，浸渗凝胶纤维后，在37℃、5％CO2气氛下在培养箱内在使用振荡器(PanasonicHealthcare(株)MIR-S100C)的125rpm的条件下边振荡边开始培养，5天后将培养温度设置为30℃，在相同温度下继续培养。培养期间，2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加表XX的组成的培养基1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，将培养基的总量保持为30mL。此外，每周实施一次培养液的一半量交换。
使用某方式的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的制造技术，由于芯层中所含的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等不会增殖到一定数目以上，对细胞的物理压力上，因此封入的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等具有长期持续产生抗体、生理活性物质等的可能性，在这一点上是优异的。
此外，以下对产生生理活性物质的细胞的培养方法的一例进行具体说明，但并不限定于此。将通过前述的制造方法制作的在芯层包含产生生理活性物质的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维加入例如低粘附表面皿，添加后述表35的组成的培养基等，在37℃、5％CO2气氛下、在培养箱内进行静置培养。
特别优选的方式中，有可能显著提高抗体的生产·纯化效率(例如，通过使用优选方式的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，与需要大规模培养罐的悬浮培养不同，可以通过小规模的生产设备培养抗体)，可期待作为适于少量·多种品种的抗体药品制造的下一次型抗体药品的连续生产技术。
由培养产生的抗体(例如，抗GPVI抗体、产生托珠单抗的CHO细胞)或生理活性物质(例如，胰岛素)可以贮留于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中，优选透过聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层和阳离子性聚合物层而贮留于聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维外的培养液中。
另外，由培养产生的抗体(例如，产生托珠单抗的CHO细胞)或生理活性物质可以贮留于多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中，优选透过多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层而贮留于多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维外的培养液中。
应予说明，抗体、生理活性物质等的回收·纯化可以参照后述记载进行。
优选方式中，如图4所示，在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层内产生的抗体、生理活性物质等透过芯层和阳离子性聚合物层而依次释放至该纤维外，从而能够形成可连续培养抗体、生理活性物质等的循环。应予说明，此时代谢物和废物也可以释放到该纤维外。
优选方式中，如图11所示，在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层内产生的抗体、生理活性物质等透过芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层而依次释放至该纤维外，从而能够形成可连续培养抗体、生理活性物质等的循环。应予说明，此时代谢物和废物也可以释放到该纤维外。
实际上，在后述实施例中，作为芯层中所含的细胞而使用选自产生抗GPVI抗体的CHO细胞、产生托珠单抗的CHO细胞或MIN6细胞中的细胞，作为芯层的交联海藻酸凝胶的形成中所用的式(I)的化学修饰海藻酸衍生物而使用选自下述式中的化学修饰海藻酸衍生物，
[化47]
式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；
作为式(II)的化学修饰海藻酸衍生物而使用选自下述式中的化学修饰海藻酸衍生物，
[化48]
式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；
作为阳离子性聚合物层的阳离子性聚合物而使用聚-L-鸟氨酸、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯亚胺或聚亚甲基-CO-胍(PMCG)，以制作聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
另外，将前述制作的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的外侧，使用选自作为阴离子性聚合物的海藻酸、下述式(I)的化学修饰海藻酸衍生物：
[化49]
[式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键]中的化学修饰海藻酸衍生物、下述式(II)的化学修饰海藻酸衍生物：
[化50]
[式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键]中的化学修饰海藻酸衍生物，进行被覆，由此制作多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
此外，培养前述得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，结果确认到产生的抗体(抗GPVI抗体、托珠单抗)或生理活性物质(胰岛素)透过芯层和阳离子性聚合物层而贮留于培养液中。
进一步，培养前述得到的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，结果确认到产生的抗体(托珠单抗)透过芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层而贮留于培养液中。
作为培养在芯层中包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养容器，例如为选自组织培养用板、三角烧瓶、T型烧瓶、转瓶、培养袋、动物细胞培养槽等中的容器；优选为三角烧瓶或动物细胞培养槽。培养可以选择静置培养、振荡·摇动培养等的任一方法。
为了提高抗体、生理活性物质等的生产率，增加每次培养的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的细胞数是有效的，但另一方面，会引起过度增殖，培养环境变差，可能缩短培养时间。一些方式的抗体、生理活性物质等的制造方法中，作为用减少聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等的过度增殖引起的对细胞的物理压力的方法，例如，作为芯层中所含的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等不增殖到一定数目以上的方法，可举出培养中的培养温度的控制、培养液中添加细胞增殖抑制剂等方法。
一些方式的抗体、生理活性物质等的制造方法中，培养温度例如为约28～约39℃的范围，例如为约30℃～约37℃的范围。
一些方式的抗体、生理活性物质等的制造方法中，培养开始至结束时的培养温度也可以适时变化。例如，可以使培养开始时的温度为约37℃，并在培养一定时间培养后的阶段使其变化为约30℃。
一些方式的抗体、生理活性物质等的制造方法中，培养时间为例如7天以上，或10天以上，或20天以上，或30天以上，或40天以上，或50天以上，或60天以上，或70天以上。
一些方式的抗体、生理活性物质等的制造方法中，培养时间为例如7天，或14天，或28天，或35天，或42天，或49天，或56天，或63天，或70天。
一些方式的抗体的制造方法中，还可以在培养液中添加细胞增殖抑制剂。细胞增殖抑制剂是能够在培养期间抑制过度细胞增殖的试剂，可举出例如二甲亚砜、丁酸钠、丙戊酸、氯化锂、戊酸、甲氨蝶呤(MTX)等添加剂。将细胞增殖抑制剂添加至培养液中的时机可以是培养开始时、或者培养期间(能够增殖到所需细胞数的时刻)的任一时刻。本说明书中，使用产生抗GPVI抗体的细胞进行培养时，添加甲氨蝶呤(MTX)。
本说明书中，细胞培养用培养基可以使用市售的培养基基材或已制备的培养基、或者自制的培养基。另外，也可以使用天然培养基(例如有大豆-酪蛋白消化培养基(SCD培养基)等)或合成培养基(是用化学药品补充增殖所需的全部各种营养素的培养基)。另外，该培养基没有特别限定，可以是包含细胞的生存增殖所需的成分(无机盐、炭水化物、激素、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素等)的基础培养基，可举出例如Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM)、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI-1640、Basal Medium Eagle(BME)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、G016培养基、DMEM(High Glucose)等。
另外，前述培养基中可以进一步包含血清。作为前述血清，没有特别限定，可举出例如FBS/FCS(Fetal Bovine/Calf Serum)、NCS(Newborn Calf serum)、CS(Calf Serum)、HS(Horse Serum)等。培养基中所含的血清的浓度为例如2重量％以上且10重量％以下。
本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维由于其芯层的交联海藻酸凝胶纤维的两端被阳离子性聚合物被覆，因此在培养期间防止、抑制或降低包含于芯层中的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等细胞大量(例如，1×105个以上)泄漏至纤维外。
本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维由于其芯层的交联海藻酸凝胶纤维的两端被阳离子性聚合物和阴离子性聚合物被覆，因此在培养期间防止、抑制或降低包含于芯层中的产生抗体的细胞、产生生理活性物质的细胞等细胞大量(例如，1×105个以上)泄漏至纤维外。
13-1.芯层中的活细胞数的计算方法
以下，对培养开始时、培养期间或培养后的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层中所含的产生抗体的细胞的活细胞数的一例测定方法进行具体说明，但并不限定于此。
将含有产生抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维、聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(0.2mL)转移至15mL试管(离心管(带印刷刻度·散装)，型号：2325-015-MYP)中，添加后述表31的组成的G016培养基(4.5mL)至以试管的刻度计约4.5mL。接着，添加1mg/mL海藻酸裂解酶(聚α-古罗糖醛酸裂解酶重组食半乳聚糖卓贝尔氏黄杆菌(Polyα-guluronate lyase Recombinant Zobellia galactanivorans))(Creative Enzymes，Cat#NATE-1563)30μL，在30℃、125rpm下振荡搅拌1小时以上。振荡搅拌期间，适宜进行溶液的吹打或前述海藻酸裂解酶的添加，直至交联海藻酸凝胶纤维均匀溶解。确认前述交联海藻酸凝胶纤维均匀溶解后，确认液量，追加前述G016培养基，调为5mL。采集前述溶液的一部分并计数细胞数。使用2次测定的平均值，作为交联海藻酸凝胶纤维中的活细胞数。
14.抗体的分类
抗体根据制作时的免疫动物种类而称为小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、人抗体等。为了减少人使用时的免疫原性，作为将来自不同种类的抗体的部分区域转换为人序列而成的修饰抗体，有嵌合抗体和人源化抗体，可作为生物药品使用。此外，也有使用整合了人抗体基因的小鼠等而由人抗体基因产生的抗体，称为人型抗体、或简称为人抗体，可作为生物药品使用。
除了上述各种抗体之外，还开发了被称为下一代抗体的各种修饰抗体，本说明书中，修饰抗体也包含在“抗体”中。例如有对2种以上抗原显示特异性的抗体即多价抗体，特别是显示双特异性的抗体被称为双特异性抗体，是高功能化抗体之一。也有将抗体的Fc部位除去而进行了低分子化的抗体即低分子化抗体，可举出Fab、F(ab’)2、scFv(单链Fv)、VHH等，可作为生物药品使用。进一步，也制作了双特异性低分子化抗体，例如scFv-scFv可作为生物药品使用。在Fc区域等中引入突变以改变糖链的抗体也是修饰抗体的一例。通过预先转化宿主细胞以改变糖链，也可以产生糖链修饰抗体，可举出例如除去岩藻糖的抗体。应予说明，本说明书中，抗体或抗体片段与其它蛋白或肽的融合蛋白也可列举为修饰抗体、即抗体的一例，在作为与前述生理活性物质的融合蛋白的情况下，也包括在生理活性物质中。
抗体根据恒定区结构上的不同，分类为下述表所示的类别(同种型)、亚类。
人Ig的分类
[表9]
15.抗体·生理活性物质的产生和纯化方法
一些方式的抗体的制造方法中，作为通过培养产生抗体的细胞而在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生并能透过聚合物层的抗体，并无特别限定，可举出具有例如选自IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等中的种类(同种型)的抗体。将产生抗体用作生物药品时，优选为IgG抗体。
一些方式的抗体的制造方法中，通过培养产生抗体的细胞而在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生并能透过阳离子性聚合物层、或在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生并能透过阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的抗体的分子量没有特别限定，例如为约45,000～约1,000,000Da的范围的抗体。此外，能透过阳离子性聚合物层的抗体的分子量为例如约3,000～约1,000,000Da、约20,000～约1,000,000Da、约20,000～约400,000Da、约45,000～约400,000Da、约20,000～约200,000Da、约45,000～约200,000Da的范围的抗体。
一些方式的生理活性物质的制造方法中，通过培养产生生理活性物质的细胞而在聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生并能透过阳离子性聚合物层、或在多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层产生并能透过阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层的生理活性物质的分子量没有特别限定，例如为约3,000～约1,000,000Da、约20,000～约1,000,000Da、约45,000～约1,000,000Da、约20,000～约400,000Da、约45,000～约400,000Da、约20,000～约200,000Da、约45,000～约200,000Da的范围的生理活性物质。
本说明书中，使用前述各产生抗体的细胞通过前述抗体的制造方法进行培养时，产生与使用的产生抗体的细胞对应的抗体。例如，使用产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞时，产生作为抗体的莫罗单抗-CD3。
本说明书中，使用前述各产生生理活性物质的细胞通过前述生理活性物质的制造方法进行培养时，产生与使用的产生生理活性物质的细胞对应的生理活性物质。
作为产生的抗体，可举出例如，使用产生莫罗单抗-CD3的CHO细胞则为莫罗单抗-CD3(IgG；150,000)、使用产生曲妥珠单抗的CHO细胞则为曲妥珠单抗(IgG；148,000)、使用产生利妥昔单抗的CHO细胞则为利妥昔单抗(IgG；144,510)、使用产生帕利珠单抗的NS0细胞则为帕利珠单抗(IgG；147,700)、使用产生英夫利昔单抗的Sp2/0细胞或产生英夫利昔单抗的CHO细胞则为英夫利昔单抗(IgG；149,000)、使用产生巴利昔单抗的Sp2/0细胞则为巴利昔单抗(IgG；147,000)、使用产生托珠单抗的CHO细胞则为托珠单抗(IgG；148,000)、使用产生吉妥珠单抗的CHO细胞则为吉妥珠单抗(IgG；150,000)、使用产生贝伐单抗的CHO细胞则为贝伐单抗(IgG；149,000)、使用产生替伊莫单抗的CHO细胞则为替伊莫单抗(IgG；148,000)、使用产生阿达木单抗的CHO细胞则为阿达木单抗(IgG；148,000)、使用产生西妥昔单抗的Sp2/0细胞则为西妥昔单抗(IgG；151,800)、使用产生雷珠单抗的CHO细胞则为雷珠单抗(IgG(Fab)；48,000)、使用产生奥马珠单抗的CHO细胞则为奥马珠单抗(IgG；149,000)、使用产生依库珠单抗的NS0细胞则为依库珠单抗(IgG；145,235)、使用产生帕尼单抗的CHO细胞则为帕尼单抗(IgG；147,000)、使用产生优特克单抗的Sp2/0细胞则为优特克单抗(IgG；148,079～149,690)、使用产生戈利木单抗的Sp2/0细胞则为戈利木单抗(IgG；149,802～151,064)、使用产生卡那单抗的Sp2/0细胞则为卡那单抗(IgG；148,000)、使用产生地诺单抗的CHO细胞则为地诺单抗(IgG；150,000)、使用产生莫格利珠单抗的CHO细胞则为莫格利珠单抗(IgG；149,000)、使用产生赛妥珠单抗的CHO细胞则为赛妥珠单抗(IgG(Fab’)；50,000)、产生奥法木单抗的NS0细胞则为奥法木单抗(IgG；149,000)、使用产生帕妥珠单抗的CHO细胞则为帕妥珠单抗(IgG；148,000)、使用产生布伦妥昔单抗的CHO细胞则为本妥昔单抗(IgG；148,000)、使用产生那他珠单抗的NS0细胞则为那他珠单抗(IgG；146,178)、使用产生纳武单抗的CHO细胞则为纳武单抗(IgG；145,000)、使用产生阿仑单抗的CHO细胞则为阿仑单抗(IgG；150,000)、使用产生苏金单抗的CHO细胞则为苏金单抗(IgG；151,000)、使用产生雷莫芦单抗的NS0细胞则为雷莫芦单抗(IgG；147,000)、使用产生伊匹单抗的CHO细胞则为伊匹单抗(IgG；148,000)、使用产生依洛单抗的CHO细胞则为依洛单抗(IgG；141,789)、使用产生美泊利单抗的CHO细胞则为美泊利单抗(IgG；149,000)、使用产生阿利库单抗的CHO细胞则为阿利库单抗(IgG；145892.049.)、使用产生伊克珠单抗的CHO细胞则为伊克珠单抗(IgG；149,000)、使用产生布罗达单抗的CHO细胞则为布罗达单抗(IgG；147,000)、使用产生伊达赛珠单抗的CHO细胞则为伊达赛珠单抗(IgG(Fab)；47,782)、使用产生埃罗妥珠单抗的NS0细胞则为埃罗妥珠单抗(IgG；148,000)、使用产生派姆单抗的CHO细胞则为派姆单抗(IgG；149,000)、使用产生沙鲁单抗的CHO细胞则为沙鲁单抗(IgG；150,000)、使用产生贝洛托舒单抗的CHO细胞则为贝洛托舒单抗(IgG；148,000)、使用产生贝利木单抗的NS0细胞则为贝利木单抗(IgG；147,000)、使用产生达雷木单抗的CHO细胞则为达雷木单抗(IgG；148,000)、使用产生阿维单抗的CHO细胞则为阿维单抗(IgG；147,000)、使用产生杜匹鲁单抗的CHO细胞则为杜匹鲁单抗(IgG；152,000)、使用产生阿替珠单抗的CHO细胞则为阿替珠单抗(IgG；144,611)、使用产生贝那利珠单抗的CHO细胞则为贝那利珠单抗(IgG；148,000)、使用产生伊珠单抗的CHO细胞则为奥英妥珠单抗(IgG；149,000)、使用产生艾米珠单抗的CHO细胞则为艾米珠单抗(IgG；148,000)、使用产生古塞库单抗的CHO细胞则为古塞库单抗(IgG；146,000)、使用产生度伐利尤单抗的CHO细胞则为度伐利尤单抗(IgG；149,000)、使用产生奥比妥珠单抗的CHO细胞则为奥比妥珠单抗(IgG；148,000～150,000)、使用产生维多珠单抗的CHO细胞则为维多珠单抗(IgG；150,000)或产生抗GPVI抗体的CHO细胞则为抗GPVI抗体(IgG；150,000)(抗体名后的括号内示出该抗体的类别(同种型)和分子量)。应予说明，可通过本发明的抗体的制造方法得到的抗体并不限于前述类别(同种型)、亚类。
产生的抗体经由例如下述3个步骤进行纯化。
〔步骤1〕为了基本上除去培养基中所含的抗体之外的蛋白和固体物，进行离心分离法或利用过滤器的过滤等。
〔步骤2〕例如，通过亲和色谱(抗体的情况下，使用Protein A或Protein G的亲和色谱)、或离子交换色谱等色谱取出目标抗体。
〔步骤3〕为了除去在步骤2中混入的夹杂物，进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱或羟基磷灰石色谱等，高纯度纯化目标抗体。
产生的生理活性物质经由例如与前述步骤相同的方法进行纯化。
使用Protein A或Protein G的亲和色谱：
作为IgG的纯化方法，已知例如使用Protein A或Protein G的抗体的纯化方法。作为使用Protein A的抗体的纯化方法，可举出下述方法作为1例。(1)通过使用填充有固定了Protein A的珠粒的柱，并对前述〔步骤1〕的方法得到的溶液中添加血清而成的溶液进行过滤，从而IgG与柱中的珠粒结合，其它血清成分向柱外流出。(2)然后，使酸性溶液通过柱，由此切断结合于珠粒上的IgG，向柱外洗脱而得到IgG。应予说明，由于Ig与Protein A和Protein G的结合力根据动物种类、亚类而不同，因此可以根据目的选择使用Protein A或Protein G。
离子交换色谱：
是利用蛋白具有的电性质(电荷)分离蛋白的方法。由于显示正电荷的碱性蛋白与带负电荷的阳离子交换体(载体)离子结合，显示负电荷的酸性蛋白与带正电荷的阴离子交换体结合，因此通过使含有蛋白的试样通过填充有离子交换体的柱，蛋白与离子交换体结合。然后，通过使通过柱的溶剂的盐浓度为高浓度，蛋白与离子交换体的离子结合变弱，从结合力弱的蛋白开始依次从离子交换体脱离，向柱外流出。阳离子交换体或阴离子交换体的选择是根据用作试样的蛋白的电荷来进行选择。
凝胶过滤色谱：
是利用蛋白的分子量的不同来分离蛋白的方法。通过使试样通过填充有带小孔的载体的柱，分子量小的蛋白进入前述小孔并流出，分子量大的蛋白不进入前述小孔而流出，因此对于通过柱的时间而言，分子量小的蛋白慢，分子量大的蛋白快，从而可以时间差地分离蛋白。
羟基磷灰石色谱：
是使用作为磷酸钙的1种的羟基磷灰石的色谱。是利用主要基于钙离子的金属亲和性和磷酸基的阳离子交换的多个相互作用来分离蛋白的方法。氨基酸的羧基和氨基分别与载体发生相互作用而吸附，通过使高浓度磷酸或高盐浓度的溶剂流动而进行目标物与杂质的分离。
16.聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的物性
[聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性的确认方法]
本说明书中，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性可以通过例如以下的试验方法来确认。更具体地，可以通过后述实施例中记载的方法来确认。
<振荡崩解试验>：通过将由上述的制造方法得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维悬浮于磷酸缓冲生理食盐水中(PBS)，使其振荡一段时间后，确认纤维的崩解容易度(振荡崩解度)，由此可以测定其物理强度。作为具体的试验方法，可举出例如后述实施例中记载的方法。
<拉伸强度试验>：使用通过上述制造方法得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，使用拉伸强度测定装置，确认其断裂值(mN)，由此可以测定其物理强度。作为具体的试验方法，可举出例如后述实施例中记载的方法。
本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的强度起因于构成该纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶、以及在芯层与阳离子性聚合物层之间形成的交联海藻酸凝胶与阳离子性聚合物的静电作用对于本发明的纤维的强度具有最佳的性质。
本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的强度起因于构成该纤维的芯层中所含的交联海藻酸凝胶、在芯层与阳离子性聚合物层之间形成的交联海藻酸凝胶与阳离子性聚合物的静电作用、以及在阳离子性聚合物层与阴离子性聚合物层之间形成的阳离子性聚合物与阴离子性阳离子性聚合物的静电作用对于本发明的纤维的强度具有最佳的性质。
本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维具有高物理稳定性，同时由于在芯层产生的抗体、生理活性物质等可以从芯层释放并进一步透过聚合物层，因此还具有合适的透过性，也是适于生产抗体、生理活性物质等的结构体。
17.化学修饰海藻酸衍生物的反应性基团(互补反应性基团)的导入率测定
反应性基团或互补反应性基团导入率意指将导入至作为海藻酸的重复单元的糖醛酸单糖单元中的反应性基团或互补反应性基团的数目以百分率表示的值。
后述实施例中，反应性基团或互补反应性基团导入率(mol％)通过1H-NMR的积分比计算。另外，导入率的计算所需的海藻酸的量可通过利用标准曲线的咔唑硫酸法来测定，反应性基团或互补反应性基团的量也可以通过利用标准曲线的吸光度测定法来测定。
18.化学修饰海藻酸衍生物的分子量的测定
将后述实施例中得到的化学修饰海藻酸衍生物的固体溶解于含有0.15mol/L的NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，制备0.1％或0.2％溶液，通过孔径0.22μm的聚醚砜制过滤过滤器(Minisart High Flow Filter、Sartorius社)将不溶物除去后，作为凝胶过滤用样品。通过分光光度计DU-800(Beckman-Coulter公司)测定各样品的光谱，确定各化合物的凝胶过滤中的测定波长。对于不具有特异性吸收波长的化合物，使用差示折射计。
将凝胶过滤用样品的200μL供于Superose6 Increase10/300 GL柱(GEHealthcare Science公司)。凝胶过滤是使用AKTA Explorer 10S作为色谱装置，使用含有0.15mol/L NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)作为展开溶剂，在室温、流速0.8mL/min的条件下实施。样品的溶出曲线是通过监测用各化合物确定的波长的吸收而制作的。所得色谱图使用Unicorn5.31软件(GE Healthcare Science公司)进行解析，确定峰范围。
导入了反应性基团或互补反应性基团的海藻酸的分子量使用蓝色葡聚糖(分子量200万Da、SIGMA公司)、甲状腺球蛋白(分子量66.9万Da、GE Healthcare Science公司)、铁蛋白(分子量44万Da、GE Healthcare Science公司)、醛缩酶(分子量15.8万Da、GEHealthcare Science公司)、伴白蛋白(分子量7.5万Da、GE Healthcare Science公司)、卵白蛋白(分子量4.4万Da、GE Healthcare Science公司)、核糖核酸酶A(分子量1.37万Da、GEHealthcare Science公司)和抑肽酶(分子量6500Da、GE Healthcare Science公司)作为标准品，在与导入了反应性基团或互补反应性基团的海藻酸相同的条件下进行凝胶过滤，利用Unicorn软件确定各成分的洗脱液量。以该各成分的洗脱液量为横轴、以分子量的对数值为纵轴分别进行绘图，进行线性回归，制作标准曲线。从蓝色葡聚糖至铁蛋白、从铁蛋白至抑肽酶制作2种标准曲线。
使用该标准曲线，先计算得到的色谱图的洗脱时间i处的分子量(Mi)。接着，将洗脱时间i处的吸光度读取为Hi。由这些数据根据下式求出重均分子量(Mw)。
[数1]
应予说明，本说明书中引用的全部文献、以及公开公报、专利公报、其它专利文献不论其目的如何均作为参照并入本说明书中。
此外，本发明的目的、特征、有点及其构思通过本说明书的记载，对于本领域技术人员而言是显而易见的，根据本说明书的记载，本领域技术人员可以实施本发明。用于实施发明的最佳形态和具体实施例等表示本发明的优选实施方式，且是为了例示或说明而示出，并不将本发明限定于此。对于本领域技术人员而言，在本说明书公开的本发明的意图以及范围内，能够基于本说明书的记载进行各种修饰是显而易见的。
实施例
以下，通过实施例来说明本发明，但本发明并不受以下实施例限定。
[化学修饰海藻酸衍生物的合成法]
核磁共振波谱(NMR)的测定使用JEOL JNM-ECX400FT-NMR(日本电子)。液相色谱-质谱(LC-Mass)通过以下方法测定。使用[UPLC]Waters AQUITY UPLC系统和BEH C18柱(2.1mm×50mm、1.7μm)(Waters)，使用乙腈∶0.05％三氟乙酸水溶液＝5∶95(0分钟)～95∶5(1.0分钟)～95∶5(1.6分钟)～5∶95(2.0分钟)的流动相和梯度条件。
1H-NMR数据中，NMR信号图案中，s意指单峰，d意指双峰，t意指三重峰，q意指四重峰，m意指多重峰，br意指宽峰，J意指耦合常数，Hz意指赫兹、CDCl3意指氘代氯仿、DMSO-d6意指氘代二甲基亚砜、D2O意指重水。1H-NMR数据中，对于羟基(OH)、氨基(NH2)、羧基(COOH)的质子等的由于为宽带而无法确认的信号，不记载数据。
LC-Mass数据中，M意指分子量，RT意指保留时间，[M+H]+，[M+Na]+意指分子离子峰。
实施例中的“室温”或“r.t.”通常表示约0℃至约35℃的温度。实施例中的“DMT-MM”意指4-(4,6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(CAS REGISTRY No.：3945-69-5)，可以使用市售品或通过文献公知的方法合成的那些。
实施例中的反应性基团导入率(mol％)表示导入的反应性基团的摩尔数相对于由1H-NMR(D2O)的积分比算出的构成海藻酸的单糖(古罗糖醛酸和甘露糖醛酸)单元的摩尔数的比例。
实施例中，海藻酸钠使用显示出前述表8中记载的物性值的海藻酸钠(A-1～A-3或B-2～B-3)。此外，海藻酸钠或各种海藻酸衍生物根据需要实施过滤灭菌。
表24-1～表24-2中示出(实施例1)～(实施例18)中得到的导入了反应性基团的海藻酸衍生物的物性值(具体地，反应性基团导入率(mol％)、分子量和重均分子量(Da))。
表25-1～表25-3中示出实施例中的各中间体的1H-NMR、LC-Mass的数据。
(实施例1a～i)导入二苯并环辛炔-氨基的海藻酸(1-A2、1-A1、1-A3、1-B2、1-B2b、1-B2c、1-A2b、1-A2c和1-A2d)的合成：
[化51]
通过下述的合成方法和反应条件合成1-A2、1-A1、1-A3、1-B2、1-B2b、1-B2c、1-A2b、1-A2c和1-A2d的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％或2重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液。在该溶液中，滴加市售的二苯并环辛炔-胺(3-氨基-1-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-1-丙酮)[CAS REGISTRY NO.：1255942-06-3](SM1)的乙醇(EtOH 1)溶液，在室温下搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇，在室温下搅拌。滤取所得的沉淀，用乙醇(EtOH2)洗涤后，减压干燥，得到标题化合物。实施例1g、1h和1i通过将之前的操作中得到的固体溶解于水中并进行冷冻干燥而得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表10]
[表11]
(实施例2)导入5-氨基-1-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-1-戊酮基(ADIBO-C5-胺)的海藻酸(2-B2)的合成：
[化52]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：B-2)水溶液(28.5mL)中，加入DMT-MM(60mg)、通过文献公知的方法得到的ADIBO-C5-胺[CAS REGISTRY NO.：2401876-29-5](SM2)(22mg)的乙醇(2.9mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(72μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(285mg)后，加入乙醇(57mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物(277mg)。
(实施例3)导入2-氨基-N-[3-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-3-氧代丙基]乙酰胺基的海藻酸(3-A2)的合成：
[化53]
<步骤1>(9H-芴-9-基)甲基-N-[3-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-3-氧代丙基]乙酰胺-2-氨基甲酸酯(IM3-1)的合成：
将式SM1的化合物(50mg)、N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酸[CAS REGISTRYNO.：29022-11-5](54mg)溶解于乙腈(1.5mL)中。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(76mg)、N,N-二异丙基乙胺(70μL)，在室温下搅拌4.5小时。在反应液中加入乙酸乙酯(15mL)、水(5mL)，分液后，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，用硅胶柱色谱纯化，以浅米色无定形形式得到标题化合物(63mg)。
<步骤2>2-氨基-N-[3-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-3-氧代丙基]乙酰胺(IM3-2)的合成：
(实施例3)在<步骤1>中得到的式IM3-1的化合物(63mg)中，加入哌啶(56μL)的N，N-二甲基甲酰胺(315μL)溶液，在室温下搅拌30分钟。在反应液中加入乙酸乙酯(15mL)、水(5mL)，分液后，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。在所得固体中，加入叔丁基甲基醚(5mL)，研磨后滤取，以浅米色固体形式得到标题化合物(10mg)。此外，由滤液回收，以淡黄色胶状物形式追加得到标题化合物(11mg)。
<步骤3>导入2-氨基-N-[3-(11，12-二脱氢二苯并[b，f]吖辛因-5(6H)-基)-3-氧代丙基]乙酰胺基的海藻酸(3-A2)的合成：
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(19mL)中，加入DMT-MM(106mg)、(实施例3)<步骤3>中得到的式IM3-2的化合物(21mg)的乙醇(1.9mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(48μL)。在30℃下搅拌3小时后，依次加入氯化钠(0.19g)、乙醇(38mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水中后，冷冻干燥，以白色固体形式得到标题化合物(188mg)。
(实施例4a～g)导入N-(4-(氨基甲基)苄基)-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺基的海藻酸(4-B2、4-A2、4-B2b、4-A2b、4-A2c、4-A2d和4-A3)的合成：
[化54]
通过下述的合成方法和反应条件合成4-B2、4-A2、4-B2b、4-A2b、4-A2c、4-A2d和4-A3的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％或2重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，在室温搅拌下加入DMT-MM。接着，在室温下滴加文献公知的方法得到的N-[[4-(氨基甲基)苄基]-2-(2-环辛炔-1-酰氧基)-乙酰胺[CAS REGISTRY NO.：2401876-33-1](SM4)的乙醇(EtOH1)溶液，进行搅拌。冷却至室温后，加入氯化钠，然后加入乙醇(EtOH2)，进行搅拌。滤取所得的沉淀，用乙醇(2mL)洗涤3次后，减压下干燥，得到标题化合物。实施例4c、4d、4e、4f和4g通过将之前的操作中得到的固体溶解于水中并进行冷冻干燥而得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表12]
[表13]
(实施例5a、b)导入N-(4-(2-氨基乙氧基)苄基)-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺基的海藻酸(5-A2和5-B2)的合成：
[化55]
<步骤1>(4-(2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙氧基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(IM-5-1)的合成：
在室温下，向市售的(4-羟基苄基)氨基甲酸叔丁酯(式RG5-1、CAS REGISTRY NO.：149505-94-2)(0.36g)、通过市售或文献公知的方法合成得到的N-(2-溴乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺(式SM5、CAS REGISTRY NO.：75915-38-7)(0.46g)、碘化钾(0.35g)和N-甲基吡咯烷酮(3.6mL)的混合物中，加入碳酸钾(0.45g)，在140℃下搅拌5小时。反应结束后，冷却至室温，用水(10mL)稀释。用甲基叔丁基醚(10mL)提取3次，将有机层依次用1N-氢氧化钠水溶液(5mL)2次、水(5mL)、饱和食盐水(5mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤有机层后，减压下浓缩，由此得到粗产物。将得到的粗产物通过硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯)纯化，以白色无定形形式得到标题化合物(0.202g)。
<步骤2>N-(2-(4-(氨基甲基)苯氧基)乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺盐酸盐(IM5-2)的合成：
在(实施例5)<步骤1>中得到的式IM5-1的化合物(0.2g)和1，4-二噁烷(1.4mL)的混合物中，在水冷搅拌下，加入4N-氯化氢/1，4-二噁烷(1.4mL)后，在室温下搅拌7小时。在反应液中加入二异丙基醚(20mL)，将悬浮液在室温下搅拌1天。过滤析出物，将回收的固体减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物(0.15g)。
<步骤3>N-(2-(4-((2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)甲基)苯氧基)乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺(IM5-3)的合成：
在依照文献公知的方法(Org.Process Res.Dev.(2018)22：108-110)合成的2-(2-环辛炔-1-酰氧基)-乙酸(式RG5-2)[CAS REGISTRY NO.：917756-42-4](50mg)、(实施例5)<步骤2>中合成的式IM5-2的化合物(81.96mg)和乙醇(1mL)的混合物中，在冰冷搅拌下，加入DMT-MM(137.22mg)和三乙基胺(38.25μL)，在室温下搅拌1小时30分。反应结束后，加入水(2mL)，搅拌悬浮液，加入甲基叔丁基醚(0.5mL)。将分离的水层用甲基叔丁基醚(5mL)提取2次，依次用水(5mL)、饱和食盐水(5mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤干燥的有机层，减压下浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯)纯化，以白色无定形形式得到标题化合物(99mg)。
<步骤4>N-(4-(2-氨基乙氧基)苄基-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺(IM5-4)的合成：
在(实施例5)<步骤3>中得到的式IM5-3的化合物(99mg)和甲醇(1485μL)的混合物中，在水冷搅拌下，加入碳酸钾(64.17mg)和水(495μL)，在室温下搅拌15小时。反应结束后，减压下浓缩甲醇，将生成的水层用乙酸乙酯(5mL)提取3次。将有机层依次用水(5mL)和饱和食盐水(5mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤干燥的有机层后，减压下浓缩，由此以黄色油状物形式得到标题化合物(68mg)的粗产物。
<步骤5>导入N-(4-(2-氨基乙氧基)苄基)-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺基的海藻酸(5-A2和5-B2)的合成：
通过下述的合成方法和反应条件合成式5-A2和5-B2的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，在室温搅拌下加入DMT-MM。接种在室温下滴加(实施例5)<步骤4>中得到的式IM5-4的化合物的水(1mL)和乙醇(EtOH 1)溶液，在相同温度下搅拌后，依次加入氯化钠、乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水后，冷冻干燥，得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表14]
| 实施例 | 5a | 5b |
| 化合物 | 5-A2 | 5-B2 |
| 海藻酸钠 | A-2 | B-2 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 49.44 | 40.08 |
| DMT-MM(mg) | 152.54 | 123.66 |
| IM5-4(mg) | 37.79 | 30.64 |
| EtOH 1(mL) | 1 | 1 |
| 反应时间(小时) | 15 | 15 |
| 反应温度 | r.t. | r.t. |
| NaCl(mg) | 500 | 400 |
| EtOH 2(mL) | 98.88 | 80.16 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 479 | 356 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例6a、6b、6c)导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺基的海藻酸(6-A2、6-B2和6-B2b)的合成：
[化56]
通过下述的合成方法和反应条件合成6-A2、6-B2和6-B2b的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，在室温搅拌下，依次加入DMT-MM、通过文献公知的方法得到的N-(2-氨基乙基)-2-(2-环辛炔-1-酰氧基)-乙酰胺[CAS REGISTRY NO.：1809789-76-1](SM6)的乙醇(EtOH 1)溶液、1摩尔浓度碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。在反应液中加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，进行搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，得到标题化合物。将之前的操作中得到的固体溶解于水，冷冻干燥，由此得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表15]
(实施例7)N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺基导入海藻酸(7-A2)的合成：
[化57]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制、A-2)水溶液(40mL)中，在室温搅拌下，依次加入DMT-MM(112mg)、通过文献公知的方法得到的N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2-环辛炔-1-酰氧基)-乙酰胺[CAS REGISTRY NO.：2401876-51-3](SM7)(30mg)的乙醇(4.0mL)溶液、1摩尔浓度碳酸氢钠水溶液(101μL)，在30℃下搅拌3小时。在反应液中加入氯化钠(0.4g)后，加入乙醇(80mL)，搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水，冷冻干燥，以白色固体形式得到标题化合物(410mg)。
(实施例8a、8b)导入N-(2-氨基乙基)-2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙酰胺基的海藻酸(8-A2、8-B2)的合成：
[化58]
<步骤1>(2-氧代-2-((2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(IM8-1)的合成：
将通过文献公知的方法得到的N-(2-氨基乙基)-2，2,2-三氟乙酰胺盐酸盐(式SM8)[CAS REGISTRY NO.：496946-73-7](100mg)和N-(叔丁氧基羰基)甘氨酸(式RG8-1)[CAS REGISTRY NO.：4530-20-5](91mg)溶解于乙腈(3.0mL)中。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(217mg)、N，N-二异丙基乙胺(281μL)，在室温下搅拌3.5小时。在反应液中加入乙酸乙酯(15mL)、水(5mL)，分液后，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残渣通过硅胶柱色谱(洗脱溶剂：40％乙酸乙酯/正己烷→乙酸乙酯)纯化，以浅米色无定形形式得到标题化合物(180mg)。
<步骤2>N-(2-(2-氨基乙酰胺)乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺盐酸盐(IM8-2)的合成：
在(实施例8)<步骤1>中得到的式IM8-1的化合物(180mg)中，在冰水冷下加入4N-氯化氢/1，4-二噁烷(1.2mL)后，在室温下搅拌0.8小时。在反应液中加入二异丙基醚(3.6mL)，搅拌30分钟。过滤所得固体，以白色固体形式得到标题化合物(114mg)。
<步骤3>N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙酰胺)乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺(IM8-3)的合成：
在通过文献公知的方法得到的2-(2-环辛炔-1-酰氧基)-乙酸(式RG5-2)[CASREGISTRY NO.：917756-42-4](80mg)、(实施例8)<步骤2>中得到的式IM8-2的化合物(110mg)中，加入乙醇(1.6mL)、DMT-MM(219mg)、三乙基胺(67μL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入水(3.2mL)，在室温下搅拌30分钟后，过滤固体，用水洗涤。向所得固体加入乙酸乙酯/乙醇(1/1、10mL)，滤去不溶物。将滤液减压浓缩，以白色固体形式得到标题化合物(101mg)。
<步骤4>N-(2-(氨基乙基)-2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙酰胺(IM8-4)的合成：
在(实施例8)<步骤3>中得到的式IM8-3的化合物(60mg)的甲醇(1.8mL)溶液中，加入碳酸钾(59mg)的水(0.3mL)溶液，在室温下搅拌4小时。将反应液减压浓缩后，加入水(2mL)，用氯化钠饱和。用乙酸乙酯(15mL，10mL×4)提取，将有机层减压浓缩。在残渣中加入乙酸乙酯(10mL)、乙醇(1mL)，滤去不溶物。将所得滤液减压浓缩，以无色树胶状物质的形式得到标题化合物(49mg)。
<步骤5>导入N-(2-氨基乙基)-2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙酰胺基的海藻酸(8-A2和8-B2)的合成：
通过下述的合成方法和反应条件合成式8-A2和8-B2的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、式IM8-4的化合物的乙醇(EtOH 1)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，搅拌后依次加入氯化钠、乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水中后，冷冻干燥，以白色固体形式得到标题化合物。将之前的操作中得到的固体溶解于水，冷冻干燥，由此得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表16]
(实施例9)导入N-(2-氨基乙基)-3-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)丙酰胺基的海藻酸(9-A2)的合成：
[化59]
<步骤1>(3-氧代-3-((2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(IM9-1)的合成：
将通过文献公知的方法得到的N-(2-氨基乙基)-2，2，2-三氟乙酰胺盐酸盐(式SM8)(110mg)和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸(式RG9-1)[CAS REGISTRY NO.：3303-84-2](113.5mg)溶解于乙腈(3.3mL)中，加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(261mg)、N，N-二异丙基乙胺(319μL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入乙酸乙酯(15mL)、水(5mL)，分液后，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，用甲基叔丁基醚(20mL)研磨。滤取固体，溶解于乙酸乙酯(20mL)中。将有机层依次用1N-柠檬酸、水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残渣用甲基叔丁基醚(10mL)研磨后，滤取固体，以白色固体形式得到标题化合物(80mg)。
<步骤2>3-氨基-N-(2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙基)丙酰胺盐酸盐(IM9-2)的合成：
在(实施例9)<步骤1>中得到的式IM9-1的化合物(80mg)中，在冰水冷下加入4N-氯化氢/1，4-二噁烷(1.1mL)后，在室温下搅拌2小时。在反应液中，加入二异丙基醚(3.4mL)，进行1.5小时搅拌。过滤所得固体，以白色固体形式得到标题化合物(61mg)。
<步骤3>3-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)-N-(2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙基)丙酰胺(IM9-3)的合成：
在通过文献公知的方法得到的式RG5-2的化合物(44mg)、(实施例9)<步骤2>中得到的式IM9-2的化合物(61mg)中，加入乙醇(1.2mL)、DMT-MM(115mg)、三乙基胺(39μL)，在室温下搅拌2小时。在反应液中，加入水(3.7mL)，用乙酸乙酯(15mL，5mL)提取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。在所得固体中加入叔丁基甲基醚(10mL)，研磨，过滤。将所得固体通过硅胶柱色谱(80％乙酸乙酯/正己烷→乙酸乙酯→20％甲醇/乙酸乙酯)纯化，以淡黄色固体形式得到标题化合物(60mg)。
<步骤4>N-(2-(氨基乙基)-3-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)丙酰胺(IM9-4)的合成：
在(实施例9)<步骤3>中得到的式IM9-3的化合物(60mg)的甲醇(3.0mL)溶液中，加入碳酸钾(42mg)的水(0.3mL)溶液，在室温下搅拌3小时搅拌后，进一步加入碳酸钾(42mg)的水(0.3mL)溶液，在室温下进行16.5小时搅拌。将反应液减压浓缩后，加入饱和食盐水(2mL)，进一步用氯化钠饱和。用乙酸乙酯(15mL，10mL×4)提取，将提取层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。在残渣中加入乙酸乙酯(5mL)和数滴甲醇，滤去不溶物。将所得滤液减压浓缩，以无色油状物形式得到标题化合物(31mg)。
<步骤5>N-(2-氨基乙基)-3-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)丙酰胺基导入海藻酸(9-A2)的合成：
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(41mL)中，加入DMT-MM(114mg)、(实施例9)<步骤4>中得到的式IM9-4的化合物(30.5mg)的乙醇(4.1mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(103μL)。在30℃下搅拌3小时后，依次加入氯化钠(0.41g)、乙醇(82mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水中后，冷冻干燥，以白色固体形式得到标题化合物(406mg)。
(实施例10)导入3-氨基-N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙氧基)乙基)丙酰胺基的海藻酸(10-A2)的合成：
[化60]
<步骤1>(2-(2-(3-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(IM10-1)的合成：
在通过文献公知的方法得到的式SM10的化合物[CAS REGISTRY NO.：50632-82-1](400mg)、和市售品或通过文献公知的方法得到的式RG10-1的化合物((2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯、CAS REGISTRY NO.：127828-22-2)(441mg)的乙醇(4.0mL)溶液中，加入DMT-MM(897mg)，进行3.5小时搅拌。在反应液中加入水(5mL)，用乙酸乙酯(20mL、10mL)提取后，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，将残渣通过硅胶柱色谱([洗脱溶剂·比率％]乙酸乙酯∶正己烷＝30∶70→乙酸乙酯∶正己烷＝100∶0)纯化，以无色油状物形式得到标题化合物(451mg)。
<步骤2>N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺盐酸盐(IM10-2)的合成：
在(实施例10)<步骤1>中得到的式IM10-1的化合物(451mg)中，在冰水冷下加入4N-氯化氢/1，4-二噁烷(3.16mL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中，加入二异丙基醚(6.4mL)，减压浓缩，以无色树胶状物质的形式得到标题化合物(433mg)。
<步骤3>N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙氧基)乙基-3-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(IM10-3)的合成：
在通过文献公知的方法得到的式RG5-2的化合物(111mg)、和(实施例10)<步骤2>中得到的式IM10-2化合物(215mg)中，加入乙醇(1.7mL)、DMT-MM(253mg)、三乙基胺(102μL)，在室温下搅拌21小时。在反应液中加入水(5mL)，用乙酸乙酯(15mL)提取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将所得残渣通过硅胶柱色谱([洗脱溶剂·比率％]乙酸乙酯∶正己烷＝30∶70→乙酸乙酯∶正己烷＝100∶0→甲醇∶乙酸乙酯＝15∶85)纯化，以无色油状物形式得到标题化合物(35mg)。
<步骤4>3-氨基-N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙氧基)乙基)丙酰胺(IM10-4)的合成：
在(实施例10)<步骤3>中得到的式IM10-3的化合物(35mg)的甲醇(700μL)溶液中，加入碳酸钾(33mg)的水(175μL)溶液，在室温下进行16.5小时搅拌。将反应液减压浓缩后，加入水(2mL)，用氯化钠饱和。用乙酸乙酯(10mL×5)提取，将提取层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。在残渣中加入乙酸乙酯(10mL)和数滴甲醇，滤去不溶物。将所得滤液减压浓缩，以无色树胶状物质的形式得到标题化合物(24mg)。
<步骤5>导入3-氨基-N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-酰氧基)乙酰胺)乙氧基)乙基)丙酰胺基的海藻酸(10-A2)的合成：
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(28mL)中，加入DMT-MM(78mg)、(实施例10)<步骤4>中得到的式IM10-4的化合物(24mg)的乙醇(2.8mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(71μL)。在30℃下进行3.5小时搅拌后，依次加入氯化钠(0.28g)、乙醇(56mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将所得固体溶解于水中后，冷冻干燥，以白色固体形式得到标题化合物(272mg)。
(实施例11a～1)导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(11-A2、11-A1、11-A3、11-B2、11-B2b、11-B2c、11-A2b、11-A2c、11-B2d、11-A2d、11-A2e和11-A3)的合成：
[化61]
通过下述的合成方法和反应条件合成11-A2、11-A1、11-A3、11-B2、11-B2b、11-B2c、11-A2b、11-A2c、11-B2d、11-A2d、11-A2e和11-A3的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％或2重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、通过文献公知的方法合成的式SM11的化合物(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-19-3)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以固体形式得到标题化合物。实施例11g、11h、11i、11j、11k和11l通过将之前的操作中得到的固体溶解于水中并进行冷冻干燥而得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表17]
| 实施例 | 11a | 11b | 11c | 11d |
| 化合物 | 11-A2 | 11-A1 | 11-A3 | 11-B2 |
| 海藻酸钠 | A-2 | A-1 | A-3 | B-2 |
| 0.67重量％海藻酸Na水溶液(mL) | * | * | * | * |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 19.6 | 19.32 | 15.06 | 60.0 |
| 2重量％海藻酸Na水溶液(mL) | * | * | * | * |
| DMT-MM(mg) | 50.19 | 49.47 | 38.57 | 125.6 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 181.4 | 178.8 | 139.4 | 211.8 |
| SM11(mg) | 54.37 | 53.59 | 41.78 | 45.4 |
| 反应时间(小时) | 5 | 20 | 5 | 3 |
| 反应温度 | r.t. | r.t. | r.t. | 30℃ |
| NaCl(mg) | 200 | 200 | 150 | 600 |
| EtOH 2(mL) | 39.2 | 38.64 | 60.24 | 120 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 198 | 221 | 155 | 553 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 |
[表18]
| 实施例 | 11e | 11f | 11g | 11h |
| 化合物 | 11-B2b | 11-B2c | 11-A2b | 11-A2c |
| 海藻酸钠 | B-2 | B-2 | A-2 | A-2 |
| 0.67重量％海藻酸Na水溶液(mL) | * | * | * | * |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 35.0 | 60.0 | 120 | 120 |
| 2重量％海藻酸Na水溶液(mL) | * | * | * | * |
| DMT-MM(mg) | 14.7 | 67.0 | 335.0 | 200.97 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 26.5 | 90.8 | 453.9 | 272.4 |
| SM11(mg) | 5.3 | 18.1 | 90.7 | 54.4 |
| 反应时间(小时) | 3.5 | 3 | 3 | 3.5 |
| 反应温度 | 30℃ | 30℃ | 30℃ | 30℃ |
| NaCl(mg) | 350 | 600 | 1200 | 1200 |
| EtOH 2(mL) | 70 | 120 | 240 | 240 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 304 | 568 | 1171 | 1169 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 |
[表19]
| 实施例 | 11i | 11j | 11k | 11l |
| 化合物 | 11-B2d | 11-A2d | 11-A2e | 11-A3 |
| 海藻酸钠 | B-2 | A-2 | A-2 | A-3 |
| 0.67重量％藻酸Na水溶液(mL) | * | * | * | 150 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 250 | * | * | * |
| 2重量％海藻酸Na水溶液(mL) | * | 300 | 225 | * |
| DMT-MM(mg) | 697.8 | 1005 | 754 | 167 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 945.7 | 1362 | 1021 | 227 |
| SM11(mg) | 189.0 | 272.1 | 204 | 45 |
| 反应时间(小时) | 3.5 | 3.6 | 3 | 3.5 |
| 反应温度 | 30℃ | 32℃ | 32 | 32 |
| NaCl(mg) | 2500 | 6000 | 4500 | 1000 |
| EtOH 2(mL) | 500 | 600 | 450 | 300 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 2420 | 5600 | 4160 | 860 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例12)4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺基导入海藻酸(12-A2)的合成：
[化62]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(19.6mL)中，在冰冷搅拌下，加入DMT-MM(50.19mg)、通过文献公知的方法合成的式SM12的化合物(4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRYNO.：2401876-22-8)(70.35mg)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(181.4μL)，在室温下搅拌5小时。加入氯化钠(200mg)后，加入乙醇(39.2mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物(199mg)。
(实施例13a、b)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(13-A2和13-A2b)的合成：
[化63]
通过下述的合成方法和反应条件合成13-A2和13-A2b的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、通过文献公知的方法合成的式SM13的化合物(N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-38-6)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以固体形式得到标题化合物。将之前的操作中得到的固体溶解于水，冷冻干燥，由此得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表20]
| 实施例 | 13a | 13b |
| 化合物 | 13-A2 | 13-A2b |
| 海藻酸钠 | A-2 | A-2 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 40 | 140 |
| DMT-MM(mg) | 112 | 234.5 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 151 | 317.7 |
| SM13(mg) | 30 | 63.5 |
| 反应时间(小时) | 3 | 3 |
| 反应温度 | 30℃ | 32℃ |
| NaCl(mg) | 400 | 1400 |
| EtOH 2(mL) | 80 | 280 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 408 | 1320 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例14a～c)导入N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(14-A2、14-B2和14-A2b)的合成：
[化64]
通过下述的合成方法和反应条件合成14-A2、14-B2和14-A2b的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、通过文献公知的方法合成的式SM14的化合物(N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-25-1)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以固体形式得到标题化合物。实施例13-A2b通过将之前的操作中得到的固体溶解于水中并进行冷冻干燥而得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表21]
| 实施例 | 14a | 14b | 14c |
| 化合物 | 14-A2 | 14-B2 | 14-A2b |
| 海藻酸钠 | A-2 | B-2 | A-2 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 20 | 20 | 30 |
| DMT-MM(mg) | 84 | 84 | 83.7 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 252 | 151 | 113.5 |
| SM14(mg) | 52 | 26 | 19.3 |
| 反应时间(小时) | 3 | 3 | 3 |
| 反应温度 | 30℃ | 30℃ | 30℃ |
| NaCl(mg) | 200 | 200 | 300 |
| EtOH 2(mL) | 40 | 40 | 60 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 185 | 187 | 276 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例15)导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(15-A2)的合成：
[化65]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(40mL)中，加入DMT-MM(112mg)、通过文献公知的方法合成的式SM15的化合物(N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-41-1)(38mg)的乙醇(4.0mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(151μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(0.4g)后，加入乙醇(80mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将之前的操作中得到的固体溶解于水中，进行冷冻干燥，由此以白色固体形式得到标题化合物(416mg)。
(实施例16a，b)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(化合物：16-A2、16-A2b)的合成：
[化66]
通过下述的合成方法和反应条件合成16-A2和16-A2b的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、通过文献公知的方法合成的式SM16的化合物(N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-47-7)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以固体形式得到标题化合物。将之前的操作中得到的固体溶解于水，冷冻干燥，由此得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表22]
| 实施例 | 16a | 16b |
| 化合物 | 16-A2 | 16-A2b |
| 海藻酸钠 | A-2 | A-2 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 40 | 140 |
| DMT-MM(mg) | 112 | 234 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 151 | 318 |
| SM16(mg) | 31 | 61 |
| 反应时间(小时) | 3 | 3 |
| 反应温度 | 30℃ | 32℃ |
| NaCl(mg) | 400 | 1400 |
| EtOH 2(mL) | 80 | 280 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 400 | 1310 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例17a～c)导入N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(17-B2、17-B2b和17-A2)的合成：
[化67]
通过下述的合成方法和反应条件合成17-B2、17-B2b和17-A2的化合物。
[合成方法]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制)水溶液中，加入DMT-MM、通过文献公知的方法合成的式SM17的化合物(N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺盐酸盐；CASREGISTRY NO.：164013-00-7)、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液，进行搅拌。加入氯化钠后，加入乙醇(EtOH 2)，在室温下搅拌。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以固体形式得到标题化合物。实施例17c通过将之前的操作中得到的固体溶解于水中并进行冷冻干燥而得到标题化合物。
[反应条件·结果]
[表23]
| 实施例 | 17a | 17b | 17c |
| 化合物 | 17-B2 | 17-B2b | 17-A2 |
| 海藻酸钠 | B-2 | B-2 | A-2 |
| 1重量％海藻酸Na水溶液(mL) | 30.0 | 60.0 | 30 |
| DMT-MM(mg) | 63 | 67 | 84 |
| 1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(μL) | 113 | 91 | 113 |
| SM17(mg) | 18 | 15 | 18 |
| 反应时间(小时) | 3 | 3 | 3 |
| 反应温度 | 30℃ | 30℃ | 30℃ |
| NaCl(mg) | 300 | 600 | 300 |
| EtOH 2(mL) | 60 | 120 | 60 |
| 后处理搅拌时间(分钟) | 30 | 30 | 30 |
| 收量(mg) | 282 | 560 | 271 |
| 形态(颜色·形状) | 白色固体 | 白色固体 | 白色固体 |
(实施例18)导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(18-A2)的合成：
[化68]
在制备为1重量％的海藻酸钠(持田制药株式会社制：A-2)水溶液(40mL)中，加入DMT-MM(112mg)、通过文献公知的方法合成的式SM18的化合物(N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺盐酸盐；CAS REGISTRY NO.：2401876-48-8)(45mg)的乙醇(4.0mL)溶液、1摩尔浓度-碳酸氢钠水溶液(151μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(0.4g)后，加入乙醇(80mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取得到的沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥。将之前的操作中得到的固体溶解于水中，进行冷冻干燥，由此以白色固体形式得到标题化合物(408mg)。
[表24-1]
| Ex， | Cpd.No. | MWL(nm) | MWD(Da) | WAMW(Da) | RGIR(mol％)($) |
| 1a | 1-A2 | 280 | 12,000-2,650,000 | 1,530,000 | 6.9 |
| 1b | 1-A1 | 280 | 5,000-2,620,000 | 1,150,000 | 6.5 |
| 1c | 1-A3 | 280 | 27,000-2,660,000 | 1,710,000 | 6.6 |
| 1d | 1-B2 | 288 | 3,730-2,850,000 | 1,410,000 | 4.9 |
| 1e | 1-B2b | 287 | 13,700-2,520,000 | 1,400,000 | 0.8 |
| 1f | 1-B2c | 287 | 2,230-2,570,000 | 1,420,000 | 1.9 |
| 1g | 1-A2b | - | - | - | 4.9 |
| 1h | 1-A2c | - | - | - | 0.8 |
| 1i | 1-A2d | - | - | - | 0.9 |
| 2 | 2-B2 | 287 | 2,080-2,570,000 | 1,400,000 | 2.7 |
| 3 | 3-A2 | 290 | 1,000-2,690,000 | 1,260,000 | 4.3 |
| 4a | 4-B2 | 215 | 1,850-2,830,000 | 1,380,000 | 4.5 |
| 4b | 4-A2 | - | - | - | 4.4 |
| 4c | 4-B2b | - | - | - | 2.4 |
| 4d | 4-A2b | - | - | - | 0.6 |
| 4e | 4-A2c | - | 35,600-2,520,000 | 1,380,000 | 0.7 |
| 4f | 4-A2d | - | - | - | 0.7 |
| 4g | 4-A3 | - | - | - | 0.5 |
| 5a | 4-A2 | 220 | 8,000-2,650,000 | 1,420,000 | 4.6 |
| 5b | 4-B2 | 220 | 5,000-2,680,000 | 1,400,000 | 4.1 |
| 6a | 6-A2 | # | 13,000-2,820,000 | 1,420,000 | 4.3 |
| 6b | 6-B2 | # | 13,000-2,590,000 | 1,410,000 | 4.2 |
| 6c | 6-B2b | # | 13,000-2,670,000 | 1,410,000 | 2.1 |
| 7 | 7-A2 | # | 13,000-3,640,000 | 1,400,000 | 3.2 |
| 8a | 8-A2 | # | 13,000-2,660,000 | 1,370,000 | 5.0 |
| 8b | 8-B2 | # | 17,000-2,540,000 | 1,380,000 | 2.4 |
| 9 | 9-A2 | # | 14,000-2,720,000 | 1,370,000 | 4.3 |
| 10 | 10-A2 | # | 13,000-2,580,000 | 1,350,000 | 4.4 |
| 11a | 11-A2 | 255 | 15,000-2,530,000 | 1,510,000 | 6.1 |
| 11b | 11-A1 | 255 | 5,000-2,590,000 | 1,140,000 | 9.4 |
| 11c | 11-A3 | 255 | 18,000-2,690,000 | 1,650,000 | 6.9 |
| 11d | 11-B2 | 249 | 7,630-2,590,000 | 1,420,000 | 3.7 |
| 1le | 11-B2b | 249 | 2,290-2,560,000 | 1,410,000 | 0.6 |
| 11f | 11-B2c | 249 | 11,800-2,540,000 | 1,420,000 | 1.5 |
| 11g | 11-A2b | - | - | - | 4.3 |
| 11h | 11-A2c | - | - | - | 2.7 |
| 11i | 11-B2d | - | - | - | 4.9 |
| 11j | 11-A2d | - | - | - | 3.1 |
| 11k | 11-A2e | 250 | 8,710-2,600,000 | 1,350,000 | 3.0 |
| 111 | 11-A3 | - | - | - | 3.0 |
| 12 | 12-A2 | 255 | 10,000-2,850,000 | 1,460,000 | 4.3 |
Cpd.No.：化合物编号、MWL：测定波长、MWD：分子量分布、WAMW：重均分子量、RGIR：反应性基团导入率、#：差示折射计，$：NMR积分比
[表24-2]
| Ex. | Cpd.No. | MWL(nm) | MWD(Da) | WAMW(Da) | RGIR(mol％)($) |
| 13a | 13-A2 | 230 | 7,740-2,660,000 | 1,430,000 | 4.7 |
| 13b | 13-A2b | - | - | - | 2.7 |
| 14a | 14-A2 | 255 | 11,000-2,660,000 | 1,530,000 | 9.4 |
| 14b | 14-B2 | 232 | 5,190-2,660,000 | 1,410,000 | 11.1 |
| 14c | 14-A2b | - | - | - | 4.9 |
| 15 | 15-A2 | 230 | 7,120-2,710,000 | 1,450,000 | 4.2 |
| 16a | 16-A2 | 270 | 5,130-2,690,000 | 1,410,000 | 3.9 |
| 16b | 16-A2b | - | - | - | 2.7 |
| 17a | 17-B2 | 267 | 6,430-2,590,000 | 1,410,000 | 5.1 |
| 17b | 17-B2b | 267 | 1,820-2,560,000 | 1,410,000 | 2.0 |
| 17c | 17-A2 | - | - | - | 5.0 |
| 18 | 18-A2 | 270 | 5,020-2,670,000 | 1,430,000 | 4.2 |
Cpd.No.：化合物编号、MWL：测定波长、MWD：分子量分布、WAMW：重均分子量、RGIR：反应性基团导入率、#：差示折射计，$：NMR积分比
[表25-1]
*：[M+Na]+、IM No.＝中间体编号、RT＝保留时间
[表25-2]
*：[M+Na]+、IM No.＝中间体编号、RT＝保留时间
[表25-3]
*：[M+Na]+、IM No.＝中间体编号、RT＝保留时间
(实施例F1-A)交联海藻酸凝胶纤维的制作(1)
使用由化合物4-A2d或化合物1-A2d制备的3重量％炔水溶液(炔溶液)和由化合物11-A2d、化合物13-A2b或化合物16-A2b制备的3重量％的叠氮化物水溶液(叠氮化物溶液)，按照表26中示出的组合，将前述炔溶液和叠氮化物溶液等容量混合，制备化学修饰海藻酸混合溶液(F1A-M1)。将混合溶液F1A-M1和由海藻酸钠(B-2)制备的3重量％海藻酸水溶液(ALGS)以表26中示出的比率混合，制为海藻酸混合溶液(F1A-M2)。接着，将混合溶液F1A-M2和20mg/mL的含有蓝色葡聚糖(cytiva制、Blue Dextran 2000、代码编号17036001)的1.8重量％食盐水等容量混合，制为海藻酸混合溶液(F1A-M3)。将混合溶液F1A-M3填充至Hamilton注射器中，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(AS ONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min向该氯化钙水溶液中注射1分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为交联海藻酸凝胶纤维(CLA-1A)而得到(参照表26中CLA-1A No.)。
[表26]
(实施例F1-B)交联海藻酸凝胶纤维的制作(2)
将由化合物4-A2d制备的3重量％化合物4-A2d水溶液和由化合物11-A2d制备的3重量％化合物11-A2d水溶液等容量混合，制备化学修饰海藻酸的混合溶液(F1B-M1)。将混合溶液F1B-M1和由海藻酸钠(B-2)制备的3重量％海藻酸钠水溶液以1/2的容量比率混合，制为3重量％海藻酸混合溶液(F1B-M1B)。将混合溶液F1B-M1B制备为表27所示的浓度(表27中；F1B-M2的浓度)，将其与另外制备的含有蓝色葡聚糖(cytiva制、Blue Dextran 2000、代码编号17036001)的食盐水(F1B-BS：蓝色葡聚糖的浓度与氯化钠的浓度如表27所示)以表27中示出的容量比率混合，制为海藻酸混合溶液(F1B-M3)。以混合溶液F1B-M3中的蓝色葡聚糖浓度(mg/mL)与氯化钠浓度(mg/mL)达到蓝色葡聚糖10mg/mL、氯化钠9mg/mL的方式制备。将混合溶液F1B-M3填充于Hamilton注射器中。接着，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(AS ONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min注射1分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为交联海藻酸凝胶纤维(CLA-1B)而得到(参照表27中CLA-1B No.)。
[表27]
(实施例F1-C)聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作(1)
将前述(实施例F1-A)或(实施例F1-B)中得到的氯化钙水溶液中的交联海藻酸凝胶纤维用细胞过滤器过滤并收集。将收集的交联海藻酸凝胶纤维添加至表28中示出的各组成的含阳离子性聚合物的水溶液中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟，对交联海藻酸凝胶纤维进行聚合物涂覆。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐液5mL洗涤2次，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-1)(参照表29中CFB-1 No.)。
[表28]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液的组成 |
| F1-c1 | 0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/100mM氯化钙 |
| F1-c2 | 0.1％聚烯丙基胺盐酸盐/100mM氯化钙 |
[表29]
| No. | CLA-1A，1B No. | 含阳离子性聚合物的水溶液 | CFB-1 No. |
| F1-C-1 | FB1-A-1 | F1-c1 | FB1-A-1-c1 |
| F1-C-2 | FB1-A-2 | F1-c1 | FB1-A-2-c1 |
| F1-C-3 | FB1-A-3 | F1-c1 | FB1-A-3-c1 |
| F1-2-4 | FB1-A-4 | F1-c1 | FB1-A-4-c1 |
| F1-C-5 | FB1-A-6 | F1-c1 | FB1-A-6-c1 |
| F1-C-6 | FB1-A-7 | F1-c1 | FB1-A-7-c1 |
| F1-C-7 | FB1-A-8 | F1-c1 | FB1-A-8-c1 |
| F1-C-8 | FB1-A-9 | F1-c1 | FB1-A-9-c1 |
| F1-C-9 | FB1-B-1 | F1-c1 | FB1-B-1-c1 |
| F1-C-10 | FB1-B-2 | F1-c1 | FB1-B-2-c1 |
| F1-C-11 | FB1-A-6 | F1-c2 | FB1-A-6-c2 |
(实施例F1-D)聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性
(1)纤维的EDTA处理
将前述(实施例F1-C)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-1)添加至20mM EDTA·2Na/生理食盐液(5mL)中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟。将经前述螯合处理的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维再次用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐液5mL洗涤2次。所得聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维浸渍于5mL生理食盐液中直至实施稳定性评价试验。
(2)振荡崩解试验
将经前述EDTA处理的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维用细胞过滤器分离后，添加至加入有10mL的PBS溶液的25mL离心管中，在37℃下振荡24小时。
前述EDTA处理后、振荡后的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性基于以下指标进行评价。
稳定性评价(评分)：
3：完全观察不到纤维的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等
2：纤维的一部分观察到崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出(累积小于100μg/mL)等
1：纤维观察到明显的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出(累积100μg/mL以上)等
[表30]
(实施例F2-A)含有产生抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维的制作
制备具有下述表31的组成的G016培养基。接着，将甲氨蝶呤(以下称为MTX)以达到1mmol/L的方式溶解于D-PBS中，制备MTX溶液。将前述MTX溶液以终浓度达到1μmol/L的方式用G016培养基稀释，制备产生抗体的培养基溶液。
[表31]
使用以下述表32和表33的配方制备的炔水溶液和叠氮化物水溶液，以表34所示的组合等容量混合，制备海藻酸混合溶液(F2A-M1)。
[表32]
3重量％炔水溶液(含有0.9重重％氯化钠)
| F2A1 | 3.3重量％化合物4-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F2A2 | 3.3重量％化合物4-A2c水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F2A3 | 3.3重量％化合物1-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
[表33]
3重量%叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| F2N1 | 3.3重量％化合物11-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F2N2 | 3.3重量％化合物11-A2e水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F2N3 | 3.3重量％化合物13-A2b水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F2N4 | 3.3重量％化合物16-A2b水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
将混合溶液F2A-M1和海藻酸钠(B-2)与0.9重量％氯化钠水溶液制备的3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2)或海藻酸钠(A-2)与由0.9重量％氯化钠水溶液的3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2A)以表34所示的比率混合，制为海藻酸混合溶液(F2A-M2)。接着，将混合溶液F2A-M2和含有产生抗GPVI抗体的细胞(2×107细胞/mL)的产生抗体的培养基溶液等容量混合，制为混合溶液(F2A-M3)。将混合溶液F2A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min向该氯化钙水溶液中注射2分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此得到含有产生抗GPVI抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA-G)(参照表34中CLA-G No.)。
[表34]
(实施例F2-B)含有产生生理活性物质的细胞的交联海藻酸凝胶纤维的制作
制备具有下述表35的组成的完全培养基。
[表35]
培养基组成
将(实施例F2-A)的表32和33中记载的F2A1的炔水溶液和F2N2的叠氮化物水溶液等容量混合，制备化学修饰海藻酸混合溶液(F2B-M1)。将混合溶液F2B-M1和由海藻酸钠(B-2)与0.9重量％氯化钠水溶液制备的3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)以1：2的比率混合，制为海藻酸混合溶液(F2B-M2)。接着，将混合溶液F2B-M2与含有MIN6细胞(1×107细胞/mL)的表35的完全培养基等容量，制为混合溶液F2B-M3。将混合溶液F2B-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将针头的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速125μL/min向该氯化钙水溶液中注射2分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为含有MIN6细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA-M)(FB2-B-1)而得到。
(实施例F2-C)含有细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将前述(实施例F2-A)或(实施例F2-B)中得到的含有各种细胞的交联海藻酸凝胶纤维，使用含有表36所示各组成的阳离子性聚合物的溶液，与前述(实施例F1-C)中记载的方法相同地(振荡搅拌时间30分钟)进行涂覆，由此得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S)(参照表37中CFB-S No.)。
[表36]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液的组成 |
| F2-c1 | 0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/100mM氯化钙 |
| F2-c2 | 0.1％聚烯丙基胺盐酸盐/100mM氯化钙 |
[表37]
| No. | CLA-G，CLA-M No. | 含阳离子性聚合物的水溶液 | CFB-S No. |
| F2-C-1 | FB2-A-1 | F2-c1 | FB2-A-1-c1 |
| F2-C-2 | FB2-A-2 | F2-c1 | FB2-A-2-c1 |
| F2-C-3 | FB2-A-3 | F2-c1 | FB2-A-3-c1 |
| F2-C-4 | FB2-A-4 | F2-c1 | FB2-A-4-c1 |
| F2-C-5 | FB2-A-5 | F2-c1 | FB2-A-5-c1 |
| F2-C-6 | FB2-A-6 | F2-c1 | FB2-A-6-c1 |
| F2-C-7 | FB2-A-7 | F2-c1 | FB2-A-7-c1 |
| F2-C-8 | FB2-A-8 | F2-c1 | FB2-A-8-c1 |
| F2-C-9 | FB2-A-9 | F2-c1 | FB2-A-9-c1 |
| F2-C-10 | FB2-A-5 | F2-c2 | FB2-A-5-c2 |
| F2-C-11 | FB2-B-1 | F2-c1 | FB2-B-1-c1 |
| F2-C-12 | FB2-A-10 | F2-c1 | FB2-A-10-c1 |
(实施例F3)确认利用阳离子性聚合物的交联海藻酸凝胶纤维的涂覆
使用(实施例F1-A)的No.F1-A-6所示的条件下制作的交联海藻酸凝胶纤维(FB1-A-6)，浸渍于含有0.1％聚-L-赖氨酸-FITC标签/100mM氯化钙的水溶液中。进行与(实施例F1-C)相同的操作后，将所得纤维的表面用荧光显微镜观察。
观察结果示于图7。在凝胶纤维的表面确认到涂覆有聚-L-赖氨酸-FITC(与图7的背景(黑色)相反颜色的部分是聚-L-赖氨酸-FITC)。该结果暗示交联海藻酸凝胶纤维被阳离子性聚合物所涂覆。
(实施例F4-A)交联海藻酸凝胶纤维的制作(3)
由海藻酸钠(B-2)和注射用生理食盐水(大冢制药工厂制)(INs)制备3重量％海藻酸水溶液(含有0.9重量％氯化钠)(ALGS2)。接着，以下述表38和表39的配方制备炔水溶液和叠氮化物水溶液。
[表38]
3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重重％氯优钠)
| F4A1 | 3.3重量％化合物4-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F4N1 | 3.3重量％化合物11-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
[表39]
3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液
| F4A2 | 3重量％化合物1-A2d水溶液 |
| F4N2 | 3重量％化合物13-A2b水溶液 |
| F4N3 | 3重量％化合物16-A2b水溶液 |
将前述炔水溶液(F4A1、F4A2)和叠氮化物水溶液(F4N1、F4N2和F4N3)以下表的组合等容量混合，制为化学修饰海藻酸混合溶液(F4A-M1)。将混合溶液F4A-M1和ALGS2以1：2的比率混合，制为海藻酸混合溶液(F4A-M2)。接着，以下表40的配方，用海藻酸混合溶液(F4A-M2)、9.9重量％氯化钠水溶液和注射用生理食盐水(大冢制药工厂制)(INs)制备，制为混合溶液(F4A-M3)。应予说明，F4A-M3中所含的总海藻酸浓度为约1.5重量％。接着，将混合溶液F4A-M3填充于Hamilton注射器中，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(ASONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min向该氯化钙水溶液中注射1分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此得到交联海藻酸凝胶纤维(CLA-X1)(参照表40中CLA-X1No.)。
[表40]
(实施例F4-B)交联海藻酸凝胶纤维的制作(4)
将前述(实施例F4-A)记载的炔水溶液(F4A1)和叠氮化物水溶液(F4N1)等容量混合，制为化学修饰海藻酸混合溶液(F4B-M1)。将混合溶液F4B-M1和前述ALGS2以下表41的配方制备，制为海藻酸混合溶液(F4B-M2)。接着，以下表41所示的海藻酸混合溶液F4B-M2和INs的混合比率制备混合溶液(F4B-M3)。接着，将混合溶液F4B-M3填充于Hamilton注射器中，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(AS ONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min向该氯化钙水溶液中注射1分钟。将注射于前述氯化钙水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此得到交联海藻酸凝胶纤维(CLA-X2)(参照表41中CLA-X2 No.)。
[表41]
(实施例F4-C)聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作(2)
将前述(实施例F4-A)或(实施例F4-B)中得到的氯化钙水溶液中的交联海藻酸凝胶纤维(CLA-X1和CLA-X2)用细胞过滤器过滤并收集。将收集的交联海藻酸凝胶纤维添加至0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/100mM氯化钙的水溶液中，在37℃、125rpm下振荡搅拌30分钟，对交联海藻酸凝胶纤维进行聚合物涂覆。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐液5mL洗涤2次，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-X)(参照表42中CFB-X No.)。
[表42]
| No. | CLA-X1 No. | CLA-X2 No. | CFB-X No. |
| F4-C-1 | FB4-A-1 | - | FB4-A-1-c |
| F4-C-2 | FB4-A-2 | - | FB4-A-2-c |
| F4-C-3 | FB4-A-3 | - | FB4-A-3-c |
| F4-C-4 | FB4-A-4 | - | FB4-A-4-c |
| F4-C-5 | FB4-A-5 | - | FB4-A-5-c |
| F4-C-6 | FB4-A-6 | - | FB4-A-6-c |
| F4-C-7 | - | FB4-B-1 | FB4-B-1-c |
| F4-C-8 | - | FB4-B-2 | FB4-B-2-c |
| F4-C-9 | - | FB4-B-3 | FB4-B-3-c |
| F4-C-10 | - | FB4-B-4 | FB4-B-4-c |
| F4-C-11 | - | FB4-B-5 | FB4-B-5-c |
| F4-C-12 | - | FB4-B-6 | FB4-B-6-c |
(实施例F4-D)聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的拉伸试验
前述(实施例F4-C)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-X)的拉伸试验使用小型台式凝胶强度测定机EZ-SX 5NC1(岛津、No.I308256D0592)、负载传感器(LOADCELL)SMT1-5N(S/N＝913193)，在注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)中，将纤维设置于夹具进行测定。测定值以纤维断裂时的应力为MPa、应变为％而示于表43。
[表43]
| No. | CFB-X No. | 应力(MPa) | 应变(％) |
| F4-D-1 | FB4-A-1-c | 0.248 | 116 |
| F4-D-2 | FB4-A-2-c | 0.290 | 137 |
| F4-D-3 | FB4-A-3-c | 0.285 | 127 |
| F4-D-4 | FB4-A-4-c | 0.331 | 141 |
| F4-D-5 | FB4-A-5-c | 0.199 | 103 |
| F4-D-6 | FB4-A-6-c | 0.219 | 121 |
| F4-D-7 | FB4-B-1-c | 0.205 | 107 |
| F4-D-8 | FB4-B-2-c | 0.436 | 174 |
| F4-D-9 | FB4-B-3-c | 0.253 | 140 |
| F4-D-10 | FB4-B-4-c | 0.165 | 111 |
| F4-D-11 | FB4-B-5-c | 0.063 | 72 |
| F4-D-12 | FB4-B-6-c | 0.482 | 174 |
表43中，No.F4-D-1～F4-D-10和F4-D-12中，确认为显示出0.1MPa以上的拉伸强度和100％以上的应变(伸长率)的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
(实施例FI-1)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入(实施例F2-C)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB2-A-1-c1、FB2-A-2-c1、FB2-A-3-c1、FB2-A-4-c1、FB2-A-5-c1、FB2-A-6-c1、FB2-A-7-c1、FB2-A-8-c1、FB2-A-9-c1和FB2-A-10-c1)，添加(实施例F2-A)中记载的产生抗体的培养基溶液(30mL)，在37℃、5％CO2气氛下、在培养箱内以125rpm边振荡边实施14天或20天培养。2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加前述产生抗体的培养基溶液1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，保持培养基的总量为30mL。此外，每周实施一次培养液的一半量的交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，培养期间的累积抗体量和培养液中检出的产生抗GPVI抗体的CHO细胞的浓度如表44所示。
[表44]
(实施例FI-2)含有产生生理活性物质的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
<步骤1>含有MIN6细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
将(实施例F2-C)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB2-B-1-c1)加入60mm超低粘附表面皿(Corning公司制、产品编号：3261)，添加(实施例F2-B)中记载的完全培养基(5mL)，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内静置培养3天或14天。
<步骤2>胰岛素分泌能力评价
对(实施例FI-2)<步骤1>中培养了3天或14天的封入MIN6细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维中的MIN6细胞的胰岛素分泌能力进行评价。将封入MIN6细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维在低葡萄糖溶液(2mM葡萄糖/KRBH/0.1％BSA)10mL中培养2小时，将溶液更换为高葡萄糖溶液(20mM葡萄糖/KRBH/0.1％BSA)10mL，然后进一步培养2小时。然后再次溶液交换为低葡萄糖溶液10mL，培养2小时。使用超高灵敏度小鼠胰岛素测定试剂盒(森永生科学研究所制)测定各步骤结束时的溶液中胰岛素浓度。可确认到依赖于葡萄糖浓度而释放胰岛素。
[表45]
| 低葡萄糖溶液 | 高葡萄糖溶液 | 低葡萄糖溶液 | |
| 第3天的胰岛素浓度(ng/mL) | 3.9 | 43.4 | 2.0 |
| 第14天的胰岛素浓度(ng/mL) | 10.5 | 48.9 | 11.4 |
(实施例F5-A)含有产生抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维的制作
以与(实施例F2-A)中记载的表32和表33的配方相同地制备化合物4-A2d和化合物11-A2d的3重量％水溶液(含有0.9重量％氯化钠)后，将各水溶液等容量混合，制备化学修饰海藻酸混合溶液(F5A-M1)。将前述混合溶液F5A-M1、由海藻酸钠(B-2)和注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)(INs)制备的3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2)以F5A-M1：ALGS2＝5：10的比率混合，制为海藻酸混合溶液(F5A-M2)。接着，混合溶液F5A-M2和包含产生托珠单抗的CHO细胞(1×108细胞/mL)的具有(实施例F2-A)中记载的组成的G016培养基等容量混合，制为含有细胞的海藻酸混合溶液(F5A-M3)。将前述混合溶液F5A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液或含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min向该氯化钙或氯化钡水溶液中注射0.8分钟。将注射于前述水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，得到含有产生托珠单抗的CHO细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA-G5)(参照表46中CLA-G5 No.)。
[表46]
(实施例F5-B)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将(实施例F5-A)中得到的含有产生抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维(CLA-G5)添加至表47中示出的各组成的含阳离子性聚合物的水溶液中，在37℃、125rpm下振荡搅拌30分钟，对含有细胞的交联海藻酸凝胶纤维进行聚合物涂覆。应予说明，聚合物涂覆中使用的水溶液使用要涂覆的纤维量的10倍量。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐水5mL洗涤2次，得到含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S2)(参照表48中CFB-S2 No.)。
[表47]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液的组成 |
| F5-c1 | 0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/100mM氯化钙 |
| F5-c2 | 0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
[表48]
(实施例FI-3)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入1根(实施例F5-B)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB5-A-1-c1或FB5-A-2-c2)，添加(实施例F2-A)中记载的G016培养基(30mL)，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125rpm边振荡边开始培养，5天后使培养温度为30℃，在相同温度下继续培养。这期间，2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加前述G016培养基1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，保持培养基的总量为30mL。此外，每周实施一次培养液的一半量的交换。在培养期间，利用CedexBio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表49所示。由培养结果可确认到在各纤维的培养中抗体的产生量经时性地增加。
[表49]
(实施例F6)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将含有产生托珠单抗的CHO细胞(3×107细胞/mL或1×108细胞/mL)的具有(实施例F2-A)中记载的组成的G016培养基和前述(实施例F5-A)中制备的混合溶液F5A-M2等容量混合，制为含有细胞的海藻酸混合溶液(F6A-M3)。应予说明，在混合溶液F6A-M3中，炔化合物和叠氮基化合物以终浓度为0.5重量％，产生托珠单抗的CHO细胞以表50所示浓度而含有。将前述混合溶液F6A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min在该水溶液中注射表50中记载的时间。注射于前述溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为含有产生托珠单抗的CHO细胞的交联海藻酸凝胶纤维而得到。接着，使用含有0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐、0.9％氯化钠和20mmmol/L氯化钡的水溶液，与前述(实施例F5-B)中记载的方法相同地进行涂覆，由此得到含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S3)(参照表50中CFB-S3No.)。
[表50]
(实施例FI-4)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入(实施例F6)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(1根FB6-1-c1、FB6-2-c1或FB6-4-c1，2根FB6-3-c1)，添加具有(实施例F2-A)中记载的组成的G016培养基，使凝胶纤维和G016培养基的总量为30mL，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125pm边振荡边开始培养，5天后使培养温度为30℃，在相同温度下继续培养。培养开始2天后，取出培养液1.8mL，添加Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，将培养基的总量保持为30mL。以后，2～3天一次，实施培养液的一半量的交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表51所示。由培养结果可确认到在各纤维的培养中抗体的产生量经时性地增加。
[表51]
(实施例F7)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将含有产生抗GPVI抗体的细胞(2×107细胞/mL)的(实施例F2-A)中记载的产生抗体的培养基溶液和前述(实施例F5-A)制备的混合溶液F5A-M2等容量混合，制为含有细胞的海藻酸混合溶液(F7A-M3)。应予说明，混合溶液F7A-M3中以终浓度0.5重量％含有炔化合物和叠氮基化合物。将前述混合溶液F7A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23 NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min在该水溶液中注射表52中记载的时间。将注射于前述水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为含有产生抗GPVI抗体的细胞的交联海藻酸凝胶纤维而得到。接着，使用含有0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐、0.9％氯化钠和20mmmol/L氯化钡的水溶液，与前述(实施例F5-B)中记载的方法相同地进行涂覆，由此得到含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S4)(参照表52中CFB-S4No.)。
[表52]
| No. | 注射时间(分钟) | CFB-S4 No. |
| F7-1 | 1.2 | FB7-1-c1 |
| F7-2 | 4 | FB7-2-c1 |
| F7-3 | 6 | FB7-3-c1 |
(实施例FI-5)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入(实施例F7)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(1根FB7-1-c1或FB7-2-c1，2根FB7-3-c1)，添加(实施例F2-A)中记载的产生抗体的培养基溶液，使凝胶纤维和产生抗体的培养基溶液的总量为30mL，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125rpm边振荡边培养。培养开始2天后，取出培养液1.8mL，添加Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，将培养基的总量保持为30mL。以后，2～3天一次，使用产生抗体的培养基溶液实施培养液的一半量的交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生抗GPVI抗体的细胞的浓度如表53所示。由培养结果可确认到在各纤维的培养中抗体的产生量经时性地增加。
[表53]
(实施例F8)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
以下表54的配方由各种海藻酸钠和注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)(INs)制备3重量％海藻酸水溶液(含有0.9重量％氯化钠)。接着，以下表55的配方制备3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)。
[表54]
3重量％海藻酸钠水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| No. | 组成 |
| ALGS2A | 海藻酸钠(A-2)/INs |
| ALGS3 | 海藻酸钠(B-3)/INs |
| ALGS3A | 海藻酸钠(A-3)/INs |
[表55]
3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| No. | 组成 |
| F8A1 | 3.3重量％化合物4-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F8A2 | 化合物4-A3/INs |
| F8N1 | 3.3重量％化合物11-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F8N2 | 化合物11-A3/INs |
将前述表54和55中记载的3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)以下表56所示的配方等容量混合，制备化学修饰海藻酸混合溶液(F8A-M1)。将混合溶液F8A-M1、前述3重量％海藻酸钠水溶液(含有0.9重量％氯化钠)以下表56中记载的组合，以达到5∶10的方式混合，制备海藻酸混合溶液(F8A-M2)。接着，将含有产生托珠单抗的CHO细胞(1×108细胞/mL)的具有(实施例F2-A)中记载的组成的G016培养基和混合溶液F8A-M2等容量混合，制为含有细胞的海藻酸混合溶液(F8A-M3)。应予说明，混合溶液F8A-M3中以终浓度0.5重量％含有炔化合物和叠氮基化合物。
将混合溶液F7A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min注射0.8分钟。注射于前述水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为含有产生托珠单抗的CHO细胞的交联海藻酸凝胶纤维而得到。接着，使用所得含有产生托珠单抗的CHO细胞的交联海藻酸凝胶纤维和、含有0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐、0.9％氯化钠和20mmmol/L氯化钡的水溶液，与前述(实施例F5-B)中记载的方法相同地进行涂覆，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S5)(参照表56中CFB-S5 No.)。
[表56]
(实施例FI-6)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入1根(实施例F8)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB8-1-c1、FB8-2-c1、FB8-3-c1、FB8-4-c1或FB8-5-c1)，添加具有(实施例F2-A)中记载的组成的G016培养基(30mL)，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125rpm边振荡边开始培养，5天后使培养温度为30℃，在相同温度下继续培养。这期间，2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加前述G016培养基1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，保持培养基的总量为30mL。此外，每周实施一次培养液的一半量的交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表57所示。由培养结果可确认到在各纤维的培养中抗体的产生量经时性地增加。
[表57]
(实施例F9)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将含有产生托珠单抗的CHO细胞(1×108细胞/mL)的具有(实施例F2-A)中记载的组成的GO16培养基和前述(实施例F5-A)制备的海藻酸混合溶液F5A-M2等容量混合，制为含有细胞的海藻酸混合溶液(F9A-M3)。应予说明，混合溶液F9A-M3中以终浓度0.5重量％含有炔化合物和叠氮基化合物。将前述混合溶液F9A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min在该水溶液中注射0.8分钟。注射于前述溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为含有产生托珠单抗的CHO细胞的交联海藻酸凝胶纤维而得到。将所得前述含有细胞的交联海藻酸凝胶纤维，使用含有表58所示各组成的阳离子性聚合物水溶液，与前述(实施例F5-B)中记载的方法相同地进行涂覆，由此得到含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-S6)(参照表59中CFB-S6No.)。
[表58]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液的组成 |
| F9-c1 | 0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
| F9-c2 | 0.1％聚(亚甲基-CO-胍)盐酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
| F9-c3 | 0.075％直链聚乙烯亚胺盐酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
[表59]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液 | CFB-S6 No. |
| F9-1 | F9-c1 | FB9-1-c1 |
| F9-2 | F9-c2 | FB9-2-c2 |
| F9-3 | F9-c3 | FB9-3-c3 |
(实施例FI-7)含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入1根前述(实施例F9)中得到的含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-1-c1、FB9-2-c2或FB9-3-c3)，添加(实施例F2-A)中记载的G016培养基(30mL)，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125pm边振荡边开始培养，5天后使培养温度为30℃，在相同温度下继续培养。这期间，2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加前述G016培养基1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，或实施培养液的一半量交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表60所示。由培养结果可确认到在FB9-1-c1和FB9-1-c3的纤维的培养中，抗体的产生量经时性地增加。
[表60]
(实施例F10)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
<步骤a>交联海藻酸凝胶纤维的制作
将制备为3.0重量％的海藻酸水溶液1和含有20mg/mL的蓝色葡聚糖(cytiva制、Blue Dextran 2000、代码编号17036001)的1.8重量％食盐水等量混合，填充于Hamilton注射器中。将金属针头(武藏工程制、SNA-19G-B)、硅管(AS ONE制、)和玻璃毛细管(NARISHIGE制、G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将玻璃毛细管的前端浸渍于100mmol/L的氯化钙水溶液中，以流速250μL/min送液1分钟。回收的交联海藻酸凝胶纤维在相同浓度的氯化钙水溶液(10mL)中静置30分钟。应予说明，步骤a中使用的海藻酸水溶液1是海藻酸钠(A-2)的水溶液或化合物4-A2c/化合物11-A2e的混合溶液。
<步骤b>PLO涂覆
使用细胞过滤器，由(实施例F10)<步骤a>中得到的含有交联海藻酸凝胶纤维的氯化钙水溶液中分离交联海藻酸凝胶纤维。将分离的交联海藻酸凝胶纤维添加于制备为0.1重量％的聚-L-鸟氨酸(PLO)水溶液(5mL)[含有0.1％聚-L-鸟氨酸盐酸盐和100mmmol/L氯化钙的水溶液]中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟。然后，使用细胞过滤器由前述聚-L-鸟氨酸水溶液分离阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，使用生理食盐水5mL洗涤2次。
<步骤c>海藻酸涂覆
将(实施例F10)<步骤b>中得到的PLO涂覆的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维添加于制备为0.15重量％的海藻酸水溶液2(5mL)中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟。然后，使用细胞过滤器由前述海藻酸水溶液分离多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-10)(参照下表61中CFB-10No.)，使用生理食盐水5mL洗涤2次。应予说明，步骤c中使用的海藻酸水溶液2是海藻酸钠(A-2)的水溶液或化合物4-A2c/化合物11-A2e的混合溶液。
[表61]
| No. | 海藻酸水溶液①中的组成 | 海藻酸水溶液②的组成 | CFB-10 No. |
| F10-1 | 仅A-2 | 仅A-2 | FB10-1 |
| F10-2 | 仅A-2 | 4-A2c/11-A2e | FB10-2 |
| F10-3 | 4-A2c/11-A2e | 仅A-2 | FB10-3 |
| F10-4 | 4-A2c/11-A2e | 4--A2c/11-A2e | FB10-4 |
(实施例F10B)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
使用化合物4-A2d的3重量％水溶液、化合物11-A2d的3重量％水溶液和海藻酸钠(A-2)水溶液，以下表62所示组合制备海藻酸溶液(F10B-M1)。接着，将含有20mg/mL蓝色葡聚糖(Blue Dextran 2000，GE Healthcare Science，17036001)的1.8％氯化钠水溶液和F10B-M1等容量混合，制备海藻酸混合溶液(F10B-M2)。应予说明，混合溶液F10B-M2中，以炔化合物和叠氮基化合物的终浓度为1.5重量％或海藻酸钠的终浓度为1.5重量％的方式含有。将混合溶液F10B-M2填充于Hamilton注射器中，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(ASONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min在该溶液中注射1分钟。将注射于前述溶液中的纤维状形态的物质在相同浓度的溶液中静置30分钟，得到交联海藻酸凝胶纤维。使用细胞过滤器过滤所得含有交联海藻酸凝胶纤维的溶液，分离前述凝胶纤维。将分离的凝胶纤维添加至含有0.1％聚-L-鸟氨酸盐酸盐、0.9％氯化钠和20mmmol/L氯化钡的含阳离子性聚合物的水溶液(5mL)中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟，得到阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。将所得凝胶纤维再次使用细胞过滤器过滤，使用生理食盐液5mL洗涤2次。接着，将海藻酸钠(A-2)溶解于生理食盐水，制备终浓度0.15％海藻酸溶液(F10B-M3)。将前述洗涤的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维添加至F10B-M3(5mL)中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟，得到多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-10B)(参照下表62中CFB-10B No.)。将所得CFB-10B使用细胞过滤器过滤，使用生理食盐液5mL洗涤2次。
[表62]
| No. | F10B-M1中的组成 | CFB-10B No. |
| F10B-1 | 仅A-2 | FB10B-1 |
| F10B-2 | 4-A2d/11-A2d | FB10B-2 |
(实施例F11)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性
<步骤d>螯合处理
将(实施例F10)<步骤c>中得到的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(参照下表63中CFB-10No.)添加至20mM的EDTA·2K/生理食盐水(5mL)中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟。然后，使用细胞过滤器由EDTA·2K/生理食盐水分离多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，使用生理食盐水5mL洗涤2次。将回收的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(参照下表63中CFB-11 No.)浸渍于5mL生理食盐水中，直至实施稳定性评价试验。
<步骤e>稳定性评价
将(实施例F11)<步骤d>中得到的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维转移至加入有5mL的PBS溶液的15mL离心管中，在37℃下振荡(Water Bath Shaker(TAITEC制、personal II)、180rpm)1天。然后，将该纤维转移至加入有10mL的PBS溶液的25mL离心管中，在37℃下进一步振荡1小时。观察结果示于下述表63中。多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性基于以下指标通过目视进行评价。
稳定性评价(评分)：
3：完全观察不到纤维的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等
2：纤维的一部分观察到崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等
1：纤维观察到明显的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等，不能保持结构体的功能
[表63]
(实施例F11B)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性
(1)纤维的EDTA处理
使用前述(实施例F10B)制作的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-10B)(参照下表64中CFB-10B No.)，实施与(实施例F11)相同的操作，由此得到进行了螯合处理的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-11B)(参照下表64中CFB-11B No.)。
(2)振荡崩解试验
使用细胞过滤器分离前述EDTA处理的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维后，添加至加入有10mL的PBS溶液的25mL离心管中，在37℃下振荡41小时。
前述EDTA处理后、振荡后的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的稳定性基于以下指标通过目视进行评价。
稳定性评价(评分)：
3：完全观察不到纤维的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等
2：纤维的一部分观察到崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等
1：纤维观察到明显的崩解/溶解/变形/蓝色葡聚糖的溶出等，不能保持结构体的功能
[表64]
(实施例F12)含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
将前述实施例(实施例F5-A)制备的海藻酸混合溶液F5A-M2与注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)(INs)以1：19的比率混合，制备含阴离子性聚合物的水溶液(前述含阴离子性聚合物的水溶液中含有0.15重量％的F5A-M2)。接着，将前述实施例F9中记载的方法得到的含有产生抗体的细胞的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB9-1-c1、FB9-2-c2或FB9-3-c3)浸渍于纤维的10倍量的前述含阴离子性聚合物的水溶液中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟，用阴离子性聚合物进行涂覆。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用INs7mL洗涤3次，得到含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB-S1)(参照表65中ACFB-S1 No.)。
[表65]
| No. | CFB-S6 No. | ACFB-S1 No. |
| F12-1 | FB9-1-c1 | FB12-ac1 |
| F12-2 | FB9-2-c2 | FB12-ac2 |
| F12-3 | FB9-3-c3 | FB12-ac3 |
(实施例FI-8)含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入1根(实施例F12)中得到的含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB12-ac1、FB12-ac2或FB12-ac3)，实施与(实施例FI-7)相同的操作。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述封入产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表66所示。
[表66]
(实施例F13-A)含有产生抗体的细胞的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
使用产生托珠单抗的CHO细胞，实施与前述(实施例F5-A)和(实施例F5-B)相同的操作，由此制作含有产生抗体的细胞的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CLA-G13)(参照下表67CLA-G13No.)。应予说明，CLA-G13中以终浓度5×107细胞/mL含有产生托珠单抗的CHO细胞。
[表67]
(实施例F13-B)含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
以下表68和表69的配方制备3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)。接着，将海藻酸钠(B-2)与注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)(INs)混合而制备3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2)，将海藻酸钠(A-2)与INs混合而制备3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2A)。
[表68]
炔水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| F13A1 | 3.3重量％化合物4-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F13A2 | 3.3重量％化合物1-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水济液以10/1的比率混合而制备 |
[表69]
叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| F13N1 | 3.3重量％化合物11-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F13N2 | 3.3重量％化合物13-A2b水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F13N3 | 3.3重量％化合物16-A2b水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
将前述炔、叠氮基、ALGS2、ALGS2A或INs以表70所示组合混合，制备含阴离子性聚合物的水溶液。应予说明，含阴离子性聚合物的水溶液中所含的总海藻酸浓度为约0.15重量％，分别以达到表70的比率的方式混合。接着，使用(实施例F13-A)中得到的阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CLA-G13)(参照下表70CLA-G13No.)和含阴离子性聚合物的水溶液，与(实施例F12)相同地实施例利用阴离子性聚合物的涂覆操作，由此得到含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB-S2)(参照下表70ACFB-S2No.)。
[表70]
(实施例FI-9)含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养
在125mL聚碳酸酯制三角烧瓶中，加入1根(实施例F13-B)中得到的含有产生抗体的细胞的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB13-B-1-ac1、FB13-B-2-ac2、FB13-B-3-ac2、FB13-B-4-ac2、FB13-B-5-ac2、FB13-B-6-ac2、FB13-B-7-ac2和FB13-B-8-ac2)，添加(实施例F2-A)中记载的GO16培养基(30mL)，在37℃、5％CO2气氛下，在培养箱内以125rpm边振荡边开始培养，5天后使培养温度为30℃，在相同温度下继续培养。这期间，2～3天一次，取出培养液1.8mL，添加前述G016培养基1.8mL或Feed液(Irvine公司制、目录号JX F003)1.8mL，保持培养基的总量为30mL。此外，每周实施一次培养液的一半量的交换。在培养期间，利用Cedex Bio分析仪(Roche Diagnostics公司)测定培养液的IgG浓度作为人IgG浓度。在使用前述含有产生抗体的细胞的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的培养中，各测定目的累积抗体浓度和培养液中检出的产生托珠单抗的CHO细胞的浓度如表71所示。
[表71]
(实施例F14)确认利用阴离子性聚合物·阳离子性聚合物的交联海藻酸凝胶纤维的涂覆
与(实施例F2-A)中记载的配方相同地制备炔化合物4-A2d和叠氮基化合物11-A2d的3重量％水溶液(含有0.9重量％氯化钠)。接着，将3重量％炔和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)等容量混合，由此制备化学修饰海藻酸混合溶液(F14A-M1)。将混合溶液F14A-M1和由海藻酸钠(B-2)与注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)(INs)制备的3重量％海藻酸水溶液(含有0.9％氯化钠)(ALGS2)以F14A-M1∶ALGS2＝5∶10的比率混合，制备海藻酸混合溶液(F14A-M2)。接着，将F14A-M2与INs等容量混合，制备混合溶液(F14A-M3)。将前述水溶液F14A-M3填充于Hamilton注射器中，将鲁尔锁用针头(关东化学株式会社，15/23NL-F)与注射器连接，设置于注射器泵。将前述针头的前端浸渍于含有含0.9％氯化钠的20mmol/L的氯化钡水溶液的烧杯中，以流速250μL/min注射0.8分钟。将注射于前述溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，由此作为交联海藻酸凝胶纤维而得到。接种将纤维切断为约20cm后，进行与(实施例F9)相同的操作(涂覆使用的水溶液为2mL)，由此得到阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。应予说明，涂覆使用的含阳离子性聚合物的水溶液的组成如下表72所示，对各纤维使用2mL。接着，将由海藻酸钠(A-2)和荧光素-5-氨基硫脲(CAS REGISTORY No.：76863-28-0)合成的荧光标记海藻酸(LA)以终浓度为0.15重量％的方式溶解于生理食盐水中，制备含阴离子性聚合物的水溶液(LAPS)。接着，将阳离子聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维浸渍于2mL的LAPS中，在37℃、125rpm下振荡搅拌20分钟，用阴离子性聚合物进行涂覆。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐水8mL洗涤1次，得到阴离子·阳离子聚合物交联海藻酸凝胶纤维(LCLA-G)(参照表73中LCLA-GNo.)。使用荧光显微镜观察所得纤维的表面。
观察结果示于图22和23。在凝胶纤维的表面确认到涂覆有LA(与图22和23的背景相反的颜色是LA)。
[表72]
| No. | 含阳离子性聚合物的水溶液的组成 |
| F14-c1 | 0.1％聚(亚甲基-CO-胍)盐酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
| F14-c2 | 0.1％直链聚乙烯亚胺盐酸盐/0.9％氯化钠/20mM氯化钡 |
[表73]
(实施例F15-A)聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
由海藻酸钠(B-2)和注射用生理食盐水(大冢制药工厂制)(INs)制备3重量％海藻酸水溶液(含有0.9重量％氯化钠)(ALGS2)。接着，以下述表74的配方制备炔水溶液和叠氮化物水溶液。
[表74]
3重量％炔水溶液和叠氮化物水溶液(含有0.9重量％氯化钠)
| F15A1 | 3.3重量％化合物4-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
| F15N1 | 3.3重量％化合物11-A2d水溶液与9.9重量％氯化钠水溶液以10/1的比率混合而制备 |
将F15A1、F15N1和ALGS2以下表75的组合和比率混合，制备3重量％海藻酸溶液(F15A-M1)。接着，将F15A-M1和INs等容量混合，由此制备混合溶液(F15A-M2)。应予说明，F15A-M2中所含的总海藻酸浓度为1.5重量％。将混合溶液F15A-M2填充于Hamilton注射器中，将金属针头(武藏工程，SNA-19G-B)、硅管(AS ONE，)和玻璃毛细管(NARISHIGE，G-1)依次与注射器连接，设置于注射器泵。将前述玻璃毛细管的前端浸渍于含有100mmol/L的氯化钙水溶液的烧杯中，以流速250μL/min注射0.8分钟。将注射于前述水溶液中的纤维状形态的物质静置30分钟以上，作为交联海藻酸凝胶纤维而得到。将所得交联海藻酸凝胶纤维用细胞过滤器过滤并收集，添加至含有0.1％聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐和100mmmol/L氯化钙的水溶液中，在37℃、125rpm下振荡搅拌30分钟，将交联海藻酸凝胶纤维用阳离子性聚合物涂覆。应予说明，聚合物涂覆中使用的水溶液使用要涂覆的纤维量的10倍量。将水溶液中的纤维用细胞过滤器过滤并收集，使用生理食盐液7mL洗涤3次，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-G15A)(参照表75中CFB-G15A No.)。
[表75]
(实施例F15-B)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作
以下表76所示的组成将前述F15A-M1用INs以总海藻酸浓度为0.15重量％的方式稀释，制备含阴离子性聚合物的水溶液。将实施例F15-A中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(FB15-A-1-c1或FB15-A-2-c1)添加至前述含阴离子性聚合物的水溶液中，实施与(实施例F12)相同的涂覆操作，由此得到多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(ACFB-G15B)(参照表76中ACFB-G15B No.)。
[表76]
(实施例F15-C)多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的拉伸试验
前述(实施例F15-B)中得到的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维(CFB-G15B)的拉伸试验使用小型台式凝胶强度测定机EZ-SX 5NCl(岛津、No.I308256D0592)、负载传感器(LOAD CELL)SMT1-5N(S/N＝913193)，在注射用生理食盐水(大塚制药工厂制)中，将纤维设置于夹具进行测定。测定值以纤维断裂时的应力为MPa、应变为％而示于表77。
[表77]
| No. | ACFB-G15B No. | 应力(MPa) | 应变(％) |
| F15-C-1 | FB15-B-1-ac1 | 0.188 | 113 |
| F15-C-2 | FB15-B-2-ac1 | 0.205 | 118 |
| F15-C-3 | FB15-B-3-ac1 | 0.124 | 71 |
表77中，No.F15-C-1和F15-C-2中，确认为显示出0.1MPa以上的拉伸强度和100％以上的应变(伸长率)的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
产业实用性
本文中提供芯层被阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)被覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞和交联海藻酸凝胶。此外，还可以提供该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的培养方法。进一步，还提供芯层被阳离子性聚合物(阳离子性聚合物层)和阴离子性聚合物(阴离子性聚合物层)被覆的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述芯层包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞和交联海藻酸凝胶。此外，还可以提供该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的培养方法。
符号说明
a：聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的芯层的直径
b：聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的厚度
c：聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径
d：多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的外径
e：多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阴离子性聚合物层的厚度
4：阳离子性聚合物层
5：芯层
6：细胞(能够产生抗体、生理活性物质等的细胞)
7：阴离子性聚合物层
XX：装置
YY：挤出筒
1：导入口
2：排出口
DD：容器(例如，烧杯)(含2价金属离子的溶液)
EE：容器(例如，烧杯)(含阳离子性聚合物的溶液)
FF：容器(例如，烧杯)(含阴离子性聚合物的溶液)
CLA：交联海藻酸凝胶纤维
CFB：聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维
ACFB：多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维
Claims (10)
1.多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其包含：含有包埋于交联海藻酸凝胶中的产生抗体的细胞或产生生理活性物质的细胞的芯层、被覆前述芯层的阳离子性聚合物层、和被覆前述阳离子性聚合物层的阴离子性聚合物层；所述交联海藻酸凝胶通过使用式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而获得，
式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物是下述式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物，
[化69]
式(I)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；Akn-L1-是选自下述表中记载的部分结构式中的基团，其中Akn表示环状烷基，-L1-为与环状烷基(Akn)键合的2价的连接基团；
[表78-1]
[表78-2]
各式中，虚线右侧不包括在内；
式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物是下述式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物，
[化70]
式(II)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基得到的酰胺键；-L2-表示选自下述表中记载的部分结构式中的连接基团，
[表79]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内。
2.根据权利要求1所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，芯层中所含的产生抗体的细胞是产生抗体的基因重组动物细胞，并且其宿主细胞选自CHO细胞、CHO细胞亚株、COS细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、SP2细胞、PERC6细胞、YB2/0细胞、YE2/0细胞、1R983F细胞、Namalwa细胞、Wil-2细胞、Jurkat细胞、Vero细胞、Molt-4细胞、HEK293细胞、BHK细胞、HT-1080细胞、KGH6细胞、P3X63Ag8.653细胞、C127细胞、JC细胞、LA7细胞、ZR-45-30细胞、hTERT细胞、NM2C5细胞和UACC-812细胞。
3.根据权利要求1所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，芯层中所含的产生生理活性物质的细胞是选自胰岛素分泌细胞、胰岛、胰岛细胞、多巴胺分泌细胞、脑垂体细胞、生长激素分泌细胞、甲状旁腺细胞、神经生长因子分泌细胞、凝血因子分泌细胞、肝细胞、甲状旁腺细胞、促红细胞生成素分泌细胞、去甲肾上腺素分泌细胞和生理活性物质表达载体(基因重组细胞)中的细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，在芯层中追加含有的成分是选自海藻酸溶液、海藻酸凝胶、培养基、培养液、胶原溶液、甲基纤维素和蔗糖溶液中的成分。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，阳离子性聚合物层是选自聚氨基酸、碱性多糖类和碱性聚合物中的阳离子性聚合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，阳离子性聚合物层是选自聚-L-鸟氨酸(PLO)、聚-D-鸟氨酸(PDO)、聚-DL-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸(PDL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-DL-赖氨酸、聚-L-精氨酸(PLA)、聚-D-精氨酸(PDA)、聚-DL-精氨酸、聚-L-高精氨酸(PLHA)、聚-D-高精氨酸(PDHA)、聚-DL-高精氨酸、聚-L-组氨酸(PLH)、聚-D-组氨酸(PDH)、聚-DL-组氨酸、聚亚甲基-CO-胍(PMCG)、聚烯丙基胺(PAA)、聚乙烯基胺(PVA)、聚乙烯亚胺、烯丙基胺-二烯丙基胺共聚物和烯丙基胺-马来酸共聚物中的阳离子性聚合物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，阴离子性聚合物层是选自阴离子性多糖类、硫酸化多糖类、合成聚合物、阴离子性聚氨基酸、它们的化学修饰体、它们的交联体、和它们的混合物中的阴离子性聚合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，其中，阴离子性聚合物层是选自海藻酸、权利要求1所述的式(I)所示的化学修饰海藻酸衍生物、权利要求1所述的式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物、由权利要求1所述的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物形成的交联体、和它们的混合物中的阴离子性聚合物。
9.多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法，其是权利要求1-8中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制造方法，该方法的特征在于，包括：
(1)将含有产生抗体的细胞或产生生理活性物质的细胞以及权利要求1所述的式(I)和式(II)所示的化学修饰海藻酸衍生物的混合溶液注射到包含2价金属离子的溶液中，得到包含能够产生抗体或生理活性物质的细胞的交联海藻酸凝胶纤维的工序，
(2)使(1)中得到的包含产生抗体的细胞或产生生理活性物质的细胞的交联海藻酸凝胶纤维与包含阳离子性聚合物的溶液接触，由此得到被阳离子性聚合物层被覆的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的工序，
(3)使(2)中得到的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维与包含阴离子性聚合物的溶液接触，由此得到被阴离子性聚合物层被覆的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的工序。
10.抗体或生理活性物质的制造方法，该方法使用权利要求1-8中任一项所述的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。
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