CN108779184A - 用于生物聚合物的脱乙酰化的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于使包含乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的方法，包括：a1)提供包含乙酰基基团的生物聚合物；a2)使包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺(NH2OH)或其盐在100℃或更低的温度反应持续2‑200小时，以形成至少部分脱乙酰化的生物聚合物；以及a3)回收至少部分脱乙酰化的生物聚合物。
Description
本发明的技术领域
本发明涉及包含交联的多糖的水凝胶的领域以及此类水凝胶在医学应用和/或化妆品应用中的用途。更具体地，本发明涉及由交联的糖胺聚糖、特别地交联的透明质酸、软骨素或硫酸软骨素制成的水凝胶。
发明背景
吸水凝胶或水凝胶被广泛地应用于生物医学领域。它们通常经过聚合物的化学交联至无限网络来制备。虽然许多多糖吸收水直到它们被完全溶解，但相同的多糖的交联的凝胶通常可以吸收一定量的水直到它们被饱和，即，它们具有有限的液体保留能力或溶胀度。
透明质酸、软骨素和硫酸软骨素是众所周知的生物相容性聚合物。它们是天然存在的多糖，属于糖胺聚糖(GAG)的组。所有GAG是带负电荷的杂多糖链，该带负电荷的杂多糖链具有吸收大量水的能力。
透明质酸(HA)是用于医学和化妆品用途的最广泛地使用的生物相容性聚合物之一。HA是天然存在的多糖，属于糖胺聚糖(GAG)的组。透明质酸以及衍生自透明质酸的产品被广泛地用于生物医学和化妆品领域中，例如，在弹性手术(viscosurgery)期间以及作为真皮填充剂(dermal filler)。
硫酸软骨素(CS)是哺乳动物的结缔组织中发现的高度丰富的GAG，在所述结缔组织中，它与其他硫酸化GAG一起作为部分蛋白聚糖与蛋白质结合。先前已经表明，由于含有CS的水凝胶与天然细胞外基质相似，因此可以将含有CS的水凝胶成功地用于生物医学应用(Lauder,R.M.,Complement Ther Med 17:56-62,2009)。硫酸软骨素还被用于治疗骨关节炎，例如作为膳食补充剂。
糖胺聚糖的交联延长了构成网络的可降解聚合物的持续时间，这在很多应用中是有用的。然而，交联还可以降低糖胺聚糖的天然性质。因此，通常希望通过有效交联来保持低的修饰度，以保存糖胺聚糖本身的天然性质和作用。
发明概述
本发明的目的是提供具有作为可溶胀聚合物的糖胺聚糖(GAG)的水凝胶。
本发明的另外的目的是提供用于交联GAG分子的方法，该方法产生完全基于碳水化合物类型结构的水凝胶产品。
本发明的目的还有提供用于通过温和且有效的途径制备GAG分子的水凝胶的方法。
本发明的目的还有提供用于通过温和且有效的途径使包含N-乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的方法。
根据本文所示的方面，提供了用于使包含乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的方法，该方法包括：
a1)提供包含乙酰基基团的生物聚合物；
a2)使包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺(NH2OH)或其盐在100℃或更低的温度反应持续2-200小时，以形成至少部分脱乙酰化的生物聚合物；以及
a3)回收至少部分脱乙酰化的生物聚合物。
如本文使用的术语“生物聚合物”是指由活生物体产生的聚合物。生物聚合物分为三大类：多核苷酸、多肽和多糖。
本发明基于本发明的以下认识：羟胺(NH2OH)及其盐可以有利地被用于在温和的反应条件下使包含N-乙酰基基团的生物聚合物脱乙酰化。因此，根据实施方案，生物聚合物包含N-乙酰基基团，并且在步骤a2)中形成的至少部分脱乙酰化的生物聚合物是至少部分N-脱乙酰化的生物聚合物。
通过如本文关于生物聚合物使用的术语“至少部分脱乙酰化”，我们意指包含N-乙酰基基团的生物聚合物的至少一些N-乙酰基基团被裂解，导致在生物聚合物中形成游离胺基团。通过如本文使用的术语“至少部分脱乙酰化”，我们意指生物聚合物的N-乙酰基基团中的显著部分，特别地生物聚合物的N-乙酰基基团中的至少1％、优选地至少2％、至少3％、至少4％、至少5％被转化成游离胺基团。
通过如本文关于生物聚合物使用的术语“至少部分脱乙酰化的”，我们意指包含N-乙酰基基团的生物聚合物，其中至少一些N-乙酰基基团已经被裂解，导致在生物聚合物中形成游离胺基团。通过如本文使用的“至少部分脱乙酰化的”，我们意指生物聚合物的N-乙酰基基团中的显著部分，特别地生物聚合物的N-乙酰基基团中的至少1％、优选地至少2％、至少3％、至少4％、至少5％已经被转化成游离胺基团。
脱乙酰化的生物聚合物包含游离胺基团，并且可用于各种应用，例如用于需要游离胺基团存在的交联反应、轭合反应(conjugation reaction)或接枝反应。特别地，脱乙酰化的生物聚合物，例如脱乙酰化的糖胺聚糖，可以用于制备交联的生物聚合物，例如交联的糖胺聚糖，而不使用可能降低糖胺聚糖的天然性质的另外的交联剂。换句话说，脱乙酰化的生物聚合物可以被用于制备完全基于生物聚合物结构的交联的生物聚合物，而不需要另外的非生物聚合物交联剂。
本发明的脱乙酰化方法涉及羟氨解反应(hydroxylaminolysis reaction)。已经发现使用用于脱乙酰化的羟胺或其盐允许在温和条件下的N-脱乙酰化，导致敏感的多糖例如HA的聚合物主链的仅轻微降解。因此，使用用于脱乙酰化的羟胺或其盐允许产生具有保留的高分子量的脱乙酰化的HA。这与先前已知的方法例如使用肼或NaOH作为脱乙酰化剂的脱乙酰化形成对比，在先前已知的方法中高脱乙酰化度已经不可避免地伴随着聚合物主链的严重降解。
回收至少部分脱乙酰化的生物聚合物的步骤可以包括简单地保留或使用如其获得时那样的脱乙酰化的生物聚合物。回收至少部分脱乙酰化的生物聚合物的步骤还可包括脱乙酰化的生物聚合物的任何进一步处理，包括但不限于洗涤和纯化。
生物聚合物可以是修饰的生物聚合物，例如支化的或交联的生物聚合物。根据某些实施方案，生物聚合物是交联的生物聚合物。根据特定的实施方案，生物聚合物是生物聚合物凝胶。生物聚合物可以是例如由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联的透明质酸凝胶。
根据一些实施方案，在脱乙酰化方法中用作起始材料的包含乙酰基基团的生物聚合物是多糖。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是糖胺聚糖。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物选自由以下组成的组：硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖，例如透明质素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、细菌肝素前体(heparosan)、肝素、硫酸皮肤素(dermatan sulphate)和硫酸角质素，优选地透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是透明质酸。
透明质酸是用于医学用途的最广泛地使用的生物相容性聚合物之一。透明质酸和其他GAG是带负电荷的杂多糖链，该带负电荷的杂多糖链具有吸收大量水的能力。透明质酸以及衍生自透明质酸的产品被广泛地用于生物医学和化妆品领域中，例如，在弹性手术期间以及作为真皮填充剂。
吸水凝胶或水凝胶被广泛地用于生物医学领域。它们通常经过聚合物的化学交联至无限网络来制备。虽然天然透明质酸和某些交联的透明质酸产品吸收水直到它们被完全溶解，但交联的透明质酸凝胶通常吸收一定量的水直到它们被饱和，即，它们具有有限的液体保留能力或溶胀度。
因为在大部分活的生物体中，透明质酸除了其分子量之外以相同的化学结构存在，所以它给出最少的异物反应并且允许用于先进的医学用途。透明质酸分子的交联和/或其他修饰对于改善其在体内的持续时间通常是必要的。此外，这样的修饰影响透明质酸分子的液体保留能力。作为其结果，透明质酸已经是许多修饰尝试的主题。
在优选的实施方案中，糖胺聚糖是天然糖胺聚糖。用于与本发明有关的糖胺聚糖优选地为天然存在的糖胺聚糖。糖胺聚糖优选地以其天然状态使用。即糖胺聚糖的化学结构优选地没有通过添加官能团或类似物被改变或修饰。使用处于其天然状态的糖胺聚糖是优选的，因为这将提供更类似于天然分子的交联结构，这保存了糖胺聚糖本身的天然性质和作用，并且当交联的糖胺聚糖被引入体内时可以最小化免疫应答。
多糖，并且特别是糖胺聚糖例如透明质酸、软骨素和硫酸软骨素，在苛刻的反应条件下(例如非常高或低的pH值或高温)常常倾向于降解主链。因此，本发明的方法对于这样的多糖的脱乙酰化特别有用。
本发明的脱乙酰化方法可用于获得至少部分脱乙酰化的生物聚合物，其中保留了起始材料的分子量的显著部分。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物的重均分子量为步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的重均分子量的至少10％、优选地至少20％、更优选地至少25％。回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物的重均分子量还可以更高，例如是步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的重均分子量的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有至少10kDa的重均分子量。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有至少100kDa、至少500kDa、至少750kDa或至少1MDa的重均分子量。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有在1MDa-5MDa的范围内、优选地在2MDa-4MDa的范围内的重均分子量。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有至少10kD的重均分子量。根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有至少100kDa、至少500kDa、至少750kDa或至少1MDa的重均分子量。根据一些实施方案，回收的包含乙酰基基团的生物聚合物具有在0.1MDa-5MDa的范围内、优选地在0.5MDa-5MDa或0.5MDa-3MDa的范围内的重均分子量。
本公开内容的脱乙酰化方法也适用于较短的生物聚合物或生物低聚物，例如二聚体、三聚体、四聚体等。
根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是具有在0.3kDa-10kDa的范围内的重均分子量的低聚生物聚合物。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的低聚生物聚合物具有在0.3kDa-10kDa的范围内的重均分子量。
在脱乙酰化方法中用作起始材料的包含乙酰基基团的生物聚合物通常被完全乙酰化或几乎完全乙酰化。通过如本文关于生物聚合物使用的术语“完全乙酰化”，我们意指其中所有或基本上所有游离胺基团已经被转化为N-乙酰基基团的生物聚合物。换句话说，“完全乙酰化”的生物聚合物不包含或基本上不包含游离胺基团。根据一些实施方案，在步骤a1)中用作起始材料的包含乙酰基基团的生物聚合物具有在98％-100％的范围内的乙酰化度。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有比步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的乙酰化度低至少1％、优选地低至少2％、优选地低至少3％、优选地低至少4％、优选地低至少5％的乙酰化度。换句话说，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物可以具有小于99％、优选地小于98％、小于97％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％或小于93％的乙酰化度。回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物还可以具有比步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的乙酰化度低至少10％、低至少15％、低至少20％、低至少30％、低至少40％或低至少50％的乙酰化度。在优选的实施方案中，至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有小于97％的乙酰化度。
脱乙酰化可以使用羟胺或其盐来实现。羟胺盐是指由羟胺和酸形成的盐。羟胺盐可以例如是由羟胺和酸形成的盐，所述酸选自由以下组成的组：矿物酸和有机酸或其混合物。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和矿物酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：硫酸、盐酸、氢碘酸、氢溴酸和磷酸、及其组合。优选的矿物酸包括盐酸、氢碘酸和氢溴酸。特别优选的矿物酸是氢碘酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和有机酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、乳酸、苯甲酸、和卤代羧酸例如三氟乙酸(TFA)和三氯乙酸、及其组合。
根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、和卤代羧酸优选地三氟乙酸、及其组合。根据实施方案，酸是卤代羧酸，优选地是三氟乙酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和酸形成的盐，所述酸选自由以下组成的组：盐酸、氢碘酸和氢溴酸、丙酸、新戊酸和三氟乙酸，优选地是氢碘酸或三氟乙酸。
步骤a2中的反应优选地在能够至少部分溶解包含乙酰基基团的生物聚合物和羟胺或其盐两者的溶剂中进行。溶剂可以是例如水或有机溶剂或其混合物。优选的溶剂的非限制性实例包括水或水与低级醇例如乙醇的混合物。然而，取决于包含待被裂解的酰胺基团的特定分子以及羟胺或其盐的选择，很多其它溶剂将是有用的。有用的有机溶剂的一个实例是四氢呋喃(THF)。
根据实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺在水中反应。
脱乙酰化过程可以优选地在水或水溶液中进行，所述水溶液任选地还包含另一种溶剂，例如乙醇。因此，根据一些实施方案，步骤a1)包括使包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺在水中接触，使得形成生物聚合物和羟胺的含水混合物或水溶液。在一些实施方案中，羟胺的浓度为含水混合物或水溶液的按重量计至少10％、优选地按重量计至少20％、优选地按重量计至少30％。较高的羟胺浓度可以增加反应速率。
羟胺通常以水溶液的形式提供，通常浓度为按重量计50％。在一些实施方案中，生物聚合物可以被直接地混合和溶解在羟胺或其盐的水溶液中，任选地被稀释。可选择地，羟胺的固体盐，例如盐酸羟胺或硫酸羟胺，可以被溶解在生物聚合物的水溶液中。添加羟胺的盐并将该盐转化为羟胺，可以作为将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺的水溶液中的可选择方案或补充方案来进行。
反应混合物中的羟胺的摩尔浓度优选地在5M-20M的范围内。例如，按重量计50％的羟胺的浓度大致对应于16M的摩尔浓度。
发明人已惊奇地发现，当使用羟胺盐代替羟胺本身时，可以以显著较低的摩尔浓度获得相同的反应速率。因此，反应混合物中的羟胺盐的摩尔浓度优选地在0.01M-10M的范围内、优选地在0.1M-5M的范围内。
根据一些实施方案，在步骤a1)中将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺或其盐的水溶液中。根据一些实施方案，在步骤a1)中将羟胺的盐溶解在包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。根据一些实施方案，将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺的水溶液中，以及将羟胺的盐溶解于在羟胺中的包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。
根据实施方案，步骤a2)中的反应温度为100℃或更低。优选地选择步骤a2)中的反应温度，以便不引起生物聚合物的过度降解。根据一些实施方案，步骤a2)中的温度在10℃-90℃、优选地20℃-80℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内。根据实施方案，步骤a2)中的反应包括在10℃-100℃、优选地20℃-90℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内的温度使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应。该温度可以例如在70℃-90℃的范围内，例如约80℃，或在30℃-50℃的范围内，例如约40℃。
步骤a2)中的反应时间取决于所需的脱乙酰化度。反应时间被优选地选择以便不引起生物聚合物的过度降解，并且还取决于温度和pH。反应时间通常可以是从5分钟至200小时或更多的任何时间。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2-200小时。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2-150小时、优选地5-150小时、优选地5-100小时。在其他实施方案中，例如在使用较高温度或pH的情况下，反应时间可以短得多，例如在5分钟至2小时的范围内、在30分钟至2小时的范围内、或在1-2小时的范围内。
优选地选择步骤a2)中的pH以便不引起生物聚合物的过度降解。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在4-12的范围内的pH值进行。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在9-11的范围内的pH值进行。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在6-8或7-8的范围内的pH值进行。通常优选的是较低的pH，以便避免生物聚合物的降解。
发明人通过大量实验已发现，添加pH降低剂可以显著地提高步骤a2)中的反应的反应速率，特别是当使用羟胺时。这种作用既令人惊讶又是高度有利的。值得注意的是，将pH降低剂相应添加至肼脱乙酰化反应不会导致反应速率的任何增加。反应期间较低的pH值也是优选的，以便避免生物聚合物的过度降解。因此，根据一些实施方案，通过添加pH降低剂，反应的pH被降低到在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在6-8或7-8的范围内的值。pH降低剂可以例如选自由以下组成的组：矿物酸、有机酸和pH降低盐、及其组合。在优选的实施方案中，pH降低剂包括盐酸羟胺或硫酸羟胺，优选地盐酸羟胺。
根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在惰性气氛和/或黑暗中进行。
通过上述脱乙酰化方法获得的产物可以具有与通过其他已知的脱乙酰化方法获得的相应产物显著不同的性质。根据本文所示的其他方面，提供了通过上述方法获得的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖。通过上述方法获得的部分脱乙酰化的糖胺聚糖具有降低的乙酰化度和保留的高重均分子量的组合。通过用于化学脱乙酰化的现有技术方法不能获得显著的脱乙酰化度和保留的高重均分子量的组合。
根据本文所示的其他方面，提供了具有99％或更低、优选地98％或更低、优选地97％或更低、优选地96％或更低的乙酰化度，以及0.1MDa或更高、优选地0.3MDa或更高、优选地0.5MDa或更高的重均分子量的脱乙酰化的糖胺聚糖。
本发明基于本发明的以下认识：羟胺(NH2OH)或其盐可以被有利地用于在温和的反应条件下使包含N-乙酰基基团的生物聚合物脱乙酰化。因此，根据本文所示的其他方面，提供了羟胺或其盐用于使包含乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的用途。所述用途的特征还可以如上文关于脱乙酰化方法所述的。
根据本文所示的其他方面，提供了一种制备包含交联的糖胺聚糖分子的水凝胶产品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖和任选的第二糖胺聚糖的溶液；
b)用偶联剂活化在至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖和/或任选的第二糖胺聚糖上的羧基基团，以形成活化的糖胺聚糖；
c)使用至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖的氨基基团、经由活化的糖胺聚糖的活化的羧基基团使活化的糖胺聚糖交联，以提供通过酰胺键交联的糖胺聚糖。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是具有99％或更低、优选地98％或更低、优选地97％或更低、优选地96％或更低的乙酰化度以及0.1MDa或更高、优选地0.3MDa或更高、优选地0.5MDa或更高的重均分子量的脱乙酰化的糖胺聚糖。根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖通过上述脱乙酰化方法来获得。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是选自由以下组成的组的脱乙酰化的糖胺聚糖：脱乙酰化的透明质酸、脱乙酰化的软骨素和脱乙酰化的硫酸软骨素、及其混合物。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是脱乙酰化的透明质酸。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的任选的第二糖胺聚糖是选自由以下组成的组的糖胺聚糖：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的任选的第二糖胺聚糖是透明质酸。
制备水凝胶产品的方法包括通过共价键、优选地酰胺键使糖胺聚糖分子交联，其通常使用用于糖胺聚糖分子主链上的羧基基团的活化剂和至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖的氨基基团。根据本发明的方法的交联可以通过温和且有效的途径来实现，产生高收率，且糖胺聚糖分子的降解最小。
经由在存在于糖胺聚糖上的氨基和羧基基团之间形成酰胺键使糖胺聚糖直接交联，提供了完全基于碳水化合物类型结构的水凝胶产品。这最小化了交联对糖胺聚糖的天然性质的干扰。
在一些实施方案中，活化步骤b)和交联步骤c)同时发生。在其他实施方案中，活化步骤b)发生在交联步骤c)之前并且与交联步骤c)分开发生。
在优选的实施方案中，方法还包括提供具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm的范围内的平均尺寸的交联的糖胺聚糖的颗粒。
在一个优选的实施方案中，步骤b)中的偶联剂是肽偶联试剂。肽偶联试剂可以选自由以下组成的组：基于三嗪的偶联试剂、碳二亚胺偶联试剂、咪唑鎓衍生的偶联试剂、Oxyma和COMU。优选的肽偶联试剂是基于三嗪的偶联试剂，包括由以下组成的组：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)，优选地DMTMM。另一种优选的肽偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，优选地是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组合的N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)。另一种优选的肽偶联试剂是2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)。
根据本文所示的其他方面，提供了通过本发明方法获得的水凝胶产品。
根据相关的方面，本公开内容还提供了水凝胶产品作为药物的用途，例如在治疗软组织紊乱(soft tissue disorder)中的用途。提供了通过向患者施用治疗有效量的水凝胶产品来治疗患有软组织紊乱的患者的方法。还提供了通过向患者施用治疗有效量的水凝胶产品来为患者提供矫正治疗或美学治疗的方法。
根据本文所示的其他方面，提供了通过本发明方法获得的水凝胶产品，其用作药物。
根据本文所示的其他方面，提供了通过本发明方法获得的水凝胶产品，其用于治疗软组织紊乱。
根据本文所示的其他方面，提供了通过本发明方法获得的水凝胶产品用于制造用于治疗软组织紊乱的药物的用途。
根据本文所示的其他方面，提供了通过向患者施用治疗有效量的通过本发明方法获得的水凝胶产品来治疗患有软组织紊乱的患者的方法。
根据本文所示的其他方面，提供了通过向患者施用治疗有效量的通过本发明方法获得的水凝胶产品来为患者提供矫正治疗或美学治疗的方法。
根据本文所示的其他方面，提供了通过化妆治疗皮肤的方法，所述方法包括向皮肤施用通过本发明方法获得的水凝胶产品。
本发明的其他方面和优选的实施方案依据本发明的以下详细公开内容和所附权利要求将是明显的。
附图简述
图1是说明交联的透明质酸的形成的反应方案，其包括1)透明质酸的脱乙酰化以形成部分脱乙酰化的透明质酸，2)通过酰胺形成使部分脱乙酰化的透明质酸交联，以及3)游离胺基团的再乙酰化和在交联和再乙酰化期间形成的酯键的碱水解。
图2是说明交联的透明质酸的形成的反应方案，其包括1)透明质酸的脱乙酰化以形成部分脱乙酰化的透明质酸，2)通过酰胺形成使部分脱乙酰化的透明质酸与未脱乙酰化的透明质酸交联，以及3)游离胺基团的再乙酰化和在交联和再乙酰化期间形成的酯键的碱水解。
发明详述
本公开内容提供了用于制备由交联的糖胺聚糖(GAG)分子制成的水凝胶的有利的工艺、所得水凝胶产品及其用途。GAG是带负电荷的杂多糖链，该带负电荷的杂多糖链具有吸收大量水的能力。在根据本公开的水凝胶产品中，交联的GAG分子是提供凝胶性质的可溶胀的聚合物。本文所述的制备工艺对GAG分子是温和的，但提供了有效的交联。
制备包含交联的糖胺聚糖分子的水凝胶产品的本发明方法包括以下步骤：
a)提供包含至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖和任选的第二糖胺聚糖的溶液；
b)用偶联剂活化在至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖和/或任选的第二糖胺聚糖上的羧基基团，以形成活化的糖胺聚糖；
c)使用至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖的氨基基团、经由活化的糖胺聚糖的活化的羧基基团使活化的糖胺聚糖交联，以提供通过酰胺键交联的糖胺聚糖；以及任选的以下步骤
d)使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖的残留的胺基团酰化，以形成酰化的交联的糖胺聚糖；
和/或
e)使步骤c)或d)中提供的交联的糖胺聚糖经受碱处理，以水解在步骤c)中的酰胺交联期间作为副产物形成的酯交联部(crosslink)。
本文讨论的水凝胶产品是通过糖胺聚糖分子的酰胺偶联获得的。使用二胺或多胺官能的交联剂与偶联剂一起进行酰胺偶联是制备可用于水凝胶产品的交联的糖胺聚糖分子的有吸引力的途径。交联可以使用基于非碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂(di-or multinucleofile crosslinker)例如六亚甲基二胺(HMDA)、或基于碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂例如二氨基海藻糖(DATH)与糖胺聚糖一起来实现。交联还可以使用单独的或与第二糖胺聚糖组合的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖来实现，由此脱乙酰化的糖胺聚糖本身充当双亲核体或多亲核体交联剂。
因此，本公开内容通过在水介质中使用包含至少两个亲核体官能团例如胺基团的交联剂进行交联来提供GAG分子水凝胶，所述亲核体官能团能够通过涉及使用偶联剂的反应直接与GAG分子的羧酸基团形成共价键。
包含至少两个亲核体官能团的交联剂可以是例如基于非碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂或基于碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂。
基于碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂是优选的，因为它们提供完全基于碳水化合物类型结构或其衍生物的水凝胶产品，这最小化了交联对糖胺聚糖的天然性质的干扰。交联剂本身也可以有助于维持或增加水凝胶的性质，例如当与与透明质酸相关的结构交联时，或者当与具有高保水性的结构交联时。
基于碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂可以例如选自由以下组成的组：双亲核体或多亲核体官能的二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。
在优选的实施方案中，双亲核体或多亲核体交联剂是至少部分脱乙酰化的多糖，即已经被至少部分脱乙酰化以提供具有游离胺基团的多糖的乙酰化的多糖。至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖可以被单独地交联或与第二糖胺聚糖组合交联，由此脱乙酰化的糖胺聚糖本身充当双亲核体或多亲核体交联剂。
在优选的实施方案中，交联的GAG通过以下获得：
1)使用存在于至少部分脱乙酰化的GAG中的游离胺和羧酸基团使至少部分脱乙酰化的GAG与部分脱乙酰化的GAG交联，如图1中所示；或者
2)使用存在于至少部分脱乙酰化的GAG中的游离胺基团和存在于GAG中的羧酸基团使至少部分脱乙酰化的GAG与非脱乙酰化的GAG交联，如图2中所示。
根据一些实施方案，糖胺聚糖选自由以下组成的组：硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖，例如透明质素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、细菌肝素前体、肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。根据一些实施方案，糖胺聚糖选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。根据一些实施方案，糖胺聚糖是透明质酸。
透明质酸(HA)是用于医学和化妆品用途的最广泛地使用的生物相容性聚合物之一。HA是天然存在的多糖，属于糖胺聚糖(GAG)的组。透明质酸由分别通过β(1→3)和β(11→)糖苷键组装的两种交替的单糖单元D-N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(GlcA)组成。透明质酸以及衍生自透明质酸的产品被广泛地用于生物医学和化妆品领域中，例如，在弹性手术期间以及作为真皮填充剂。
除非另外说明，否则术语“透明质酸”涵盖各种链长度和电荷状态以及具有各种化学修饰的透明质酸、透明质酸盐/酯或透明质素的所有变体以及变体的组合。换言之，该术语还涵盖具有各种抗衡离子的透明质酸的各种透明质酸盐，例如透明质酸钠。透明质酸可以从动物源和非动物源的各种来源获得。非动物源的来源包括酵母以及优选地细菌。单个透明质酸分子的分子量通常在0.1MDa-10MDa的范围内，但其他分子量是可能的。
术语“软骨素”是指具有由交替的非硫酸化的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-半乳糖胺部分组成的二糖重复单元的GAG。为了避免疑义，术语“软骨素”不涵盖任何形式的硫酸软骨素。
术语“硫酸软骨素”是指具有由交替的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-半乳糖胺部分组成的二糖重复单元的GAG。硫酸盐部分可以存在于各种不同位置。优选的硫酸软骨素分子是4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素。
软骨素分子可以从动物源和非动物源的各种来源获得。非动物源的来源包括酵母以及优选地细菌。单个软骨素分子的分子量通常在1kDa-500kDa的范围内，但其他分子量是可能的。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是具有99％或更低、优选地98％或更低、优选地97％或更低、优选地96％或更低的乙酰化度以及0.1MDa或更高、优选地0.5MDa或更高的重均分子量的脱乙酰化的糖胺聚糖。根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖通过上述脱乙酰化方法来获得。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是脱乙酰化的糖胺聚糖，所述脱乙酰化的糖胺聚糖选自由以下组成的组：脱乙酰化的硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖，例如脱乙酰化的透明质素、脱乙酰化的软骨素、脱乙酰化的硫酸软骨素、脱乙酰化的硫酸乙酰肝素、脱乙酰化的细菌肝素前体、脱乙酰化的肝素、脱乙酰化的硫酸皮肤素和脱乙酰化的硫酸角质素。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖选自由以下组成的组：脱乙酰化的透明质酸、脱乙酰化的软骨素和脱乙酰化的硫酸软骨素、及其混合物。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖是脱乙酰化的透明质酸。
根据一些实施方案，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的任选的第二糖胺聚糖是选自由以下组成的组的糖胺聚糖：硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖，例如透明质素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、细菌肝素前体、肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的任选的第二糖胺聚糖选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。优选地，在制备水凝胶产品的方法的步骤a)中采用的任选的第二糖胺聚糖是透明质酸。
经由在存在于糖胺聚糖上的氨基和羧基基团之间形成酰胺键使糖胺聚糖直接交联，提供了完全基于碳水化合物类型结构的水凝胶产品。这最小化了交联对糖胺聚糖的天然性质的干扰。
制备水凝胶产品的方法包括通过共价键、优选地酰胺键使糖胺聚糖分子交联，其通常使用用于糖胺聚糖分子主链上的羧基基团的活化剂和至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖的氨基基团。根据本发明的方法的交联可以通过温和且有效的途径来实现，产生高收率，且糖胺聚糖分子的降解最小。
根据一些实施方案，活化步骤b)和交联步骤c)同时发生。
根据一些实施方案，步骤b)的偶联剂是肽偶联试剂。使用肽偶联剂的交联相对于许多其他常见的交联方法(例如BDDE交联)是有利的，因为它允许在中性pH进行交联，且糖胺聚糖分子的降解最小。
根据一些实施方案，肽偶联试剂选自由以下组成的组：基于三嗪的偶联试剂、碳二亚胺偶联试剂、咪唑鎓衍生的偶联试剂、Oxyma和COMU。
根据一些实施方案，肽偶联试剂是基于三嗪的偶联试剂。根据一些实施方案，基于三嗪的偶联试剂选自由以下组成的组：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。根据一些实施方案，基于三嗪的偶联试剂是DMTMM。
根据一些实施方案，肽偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂。根据一些实施方案，碳二亚胺偶联试剂是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组合的N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)。
术语“交联的糖胺聚糖”或“交联的糖胺聚糖分子”在本文中指的是在糖胺聚糖分子链之间包含通常地共价交联部的糖胺聚糖，其产生由交联部保持在一起的糖胺聚糖分子的连续网络。
交联的GAG产品优选地是生物相容的。这意味着在被治疗的个体中不发生或仅发生非常温和的免疫应答。即，在被治疗的个体中不发生或仅发生非常温和的、不合意的局部效应或全身效应。
根据本公开内容的交联的产物是凝胶或水凝胶。即，它可以被视作水不溶性的，但当经受液体、通常地含水液体时为基本上稀释的GAG分子的交联体系。
交联的GAG分子优选地以凝胶颗粒的形式存在。凝胶颗粒优选地具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm例如0.2mm-0.5mm或0.5mm-0.8mm的范围内的平均尺寸。
根据一些实施方案，步骤c)还包括提供具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm例如0.2mm-0.5mm或0.5mm-0.8mm的范围内的平均尺寸的交联的糖胺聚糖的颗粒。
凝胶按重量计主要包含液体并且可以例如包含90％-99.9％的水，但它表现得类似固体，这归因于在液体内的三维交联的GAG分子网络。由于凝胶的显著的液体含量，凝胶在结构上是柔性的并且类似于天然组织，这使得它作为组织工程中的支架以及对于组织填充(tissue augmentation)是非常有用的。它还可用于治疗软组织紊乱和矫正治疗或美学治疗。其优选地被用作可注射制剂。
水凝胶产品还可以包含未交联的，即未结合至三维交联的GAG分子网络的GAG分子的部分。然而，优选的是，在凝胶组合物中的按重量计至少50％、优选地按重量计至少60％、更优选地按重量计至少70％、并且最优选地按重量计至少80％的GAG分子形成交联的GAG分子网络的一部分。
水凝胶产品可以存在于水溶液中，但它也可以以干燥的形式或沉淀的形式存在，例如，在乙醇中。水凝胶产品优选地是可注射的。
根据实施方案，至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖通过用于生物聚合物的至少部分脱乙酰化的新颖方法来获得，其中所述生物聚合物是糖胺聚糖，所述方法包括：
a1)提供包含乙酰基基团的生物聚合物；
a2)使包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺(NH2OH)或其盐在100℃或更低的温度反应持续2-200小时，以形成至少部分脱乙酰化的生物聚合物；以及
a3)回收至少部分脱乙酰化的生物聚合物。
已经发现羟胺(NH2OH)及其盐可以被有利地用于在温和的反应条件下使包含乙酰基基团的生物聚合物脱乙酰化。脱乙酰化的生物聚合物可用于各种应用，例如用于需要游离胺基团存在的交联反应、轭合反应或接枝反应。
本发明的脱乙酰化方法涉及羟氨解反应。已经发现使用用于脱乙酰化的羟胺或其盐允许在温和条件下的N-脱乙酰化，导致敏感的多糖例如HA的聚合物主链的仅轻微降解。因此，使用用于脱乙酰化的羟胺或其盐允许产生具有保留的高分子量的脱乙酰化的HA。这与先前已知的方法例如使用肼或NaOH作为脱乙酰化剂的脱乙酰化形成对比，在先前已知的方法中高脱乙酰化度已经不可避免地伴随着聚合物主链的严重降解。
根据实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是糖胺聚糖，其优选地选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是透明质酸。
透明质酸可以从动物源和非动物源的各种来源获得。非动物源的来源包括酵母以及优选地细菌。单个透明质酸分子的分子量通常在0.1MDa-10MDa的范围内，但其他分子量是可能的。
在某些实施方案中，所述透明质酸的浓度在1mg/ml至100mg/ml的范围内。在一些实施方案中，所述透明质酸的浓度在2mg/ml至50mg/ml的范围内。在具体的实施方案中，所述透明质酸的浓度在5mg/ml至30mg/ml的范围内或在10mg/ml至30mg/ml的范围内。在某些实施方案中，透明质酸是交联的。交联的透明质酸包含在透明质酸链之间的交联部，其产生了透明质酸分子的连续网络，该连续网络通过共价交联部、透明质酸链的物理缠结以及各种相互作用例如静电相互作用、氢键结合(hydrogen bonding)和范德华力被保持在一起。
透明质酸的交联可以通过用化学交联剂修饰来实现。化学交联剂可以例如选自由二乙烯砜(divinyl sulfone)、多环氧化物(multiepoxide)和二环氧化物组成的组。根据实施方案，透明质酸通过包含两个或更多个缩水甘油醚官能团的双官能或多官能的交联剂来交联。根据实施方案，化学交联剂选自由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1,2-乙二醇二缩水甘油醚(EDDE)和二环氧辛烷组成的组。根据优选的实施方案，化学交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。
多糖，并且特别是糖胺聚糖例如透明质酸、软骨素和硫酸软骨素，在苛刻的反应条件下(例如非常高或低的pH值或高温)常常倾向于降解主链。因此，本发明的方法对于这样的多糖的脱乙酰化特别有用。
本发明的脱乙酰化方法可用于获得至少部分脱乙酰化的生物聚合物，其中保留了起始材料的分子量的显著部分。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物的重均分子量为步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的重均分子量的至少10％、优选地至少20％、更优选地至少25％。回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物的重均分子量还可以更高，例如是步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的重均分子量的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有至少10kDa的重均分子量。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有至少100kDa、至少500kDa、至少750kDa或至少1MDa的重均分子量。根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物具有在1MDa-5MDa的范围内、优选地在2MDa-4MDa的范围内的重均分子量。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有至少10kD的重均分子量。根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有至少100kDa、至少500kDa、至少750kDa或至少1MDa的重均分子量。根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有在0.1MDa-5MDa的范围内、优选地在0.5MDa-5MDa或0.5MDa-3MDa的范围内的重均分子量。
本公开内容的脱乙酰化方法也适用于较短的生物聚合物或生物低聚物，例如二聚体、三聚体、四聚体等。
根据一些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是具有在0.3kDa-10kDa的范围内的重均分子量的低聚生物聚合物。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的低聚生物聚合物具有在0.3kDa-10kDa的范围内的重均分子量。
在脱乙酰化方法中用作起始材料的包含乙酰基基团的生物聚合物通常被完全乙酰化或几乎完全乙酰化。通过如本文关于生物聚合物使用的术语“完全乙酰化”，我们意指其中所有或基本上所有游离胺基团已经被转化为N-乙酰基基团的生物聚合物。换句话说，“完全乙酰化”的生物聚合物不包含或基本上不包含游离胺基团。根据一些实施方案，在步骤a1)中用作起始材料的包含乙酰基基团的生物聚合物具有在98％-100％的范围内的乙酰化度。
根据一些实施方案，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有比步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的乙酰化度低至少1％、优选地低至少2％、优选地低至少3％、优选地低至少4％、优选地低至少5％的乙酰化度。换句话说，回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物可以具有小于99％、优选地小于98％、小于97％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％或小于93％的乙酰化度。回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物还可以具有比步骤a1)中的包含乙酰基基团的生物聚合物的乙酰化度低至少10％、低至少15％、低至少20％、低至少30％、低至少40％或低至少50％的乙酰化度。
脱乙酰化可以使用羟胺或其盐来实现。羟胺盐是指由羟胺和酸形成的盐。羟胺盐可以例如是由羟胺和酸形成的盐，所述酸选自由以下组成的组：矿物酸和有机酸或其混合物。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和矿物酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：硫酸、盐酸、氢碘酸、氢溴酸和磷酸、及其组合。优选的矿物酸包括盐酸、氢碘酸和氢溴酸。特别优选的矿物酸是氢碘酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和有机酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、乳酸、苯甲酸、和卤代羧酸例如三氟乙酸(TFA)和三氯乙酸、及其组合。
根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、和卤代羧酸优选地三氟乙酸、及其组合。根据实施方案，酸是卤代羧酸，优选地是三氟乙酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和酸形成的盐，所述酸选自由以下组成的组：盐酸、氢碘酸和氢溴酸、丙酸、新戊酸和三氟乙酸。
步骤a2中的反应优选地在能够至少部分溶解包含乙酰基基团的生物聚合物和羟胺或其盐两者的溶剂中进行。溶剂可以是例如水或有机溶剂或其混合物。优选的溶剂的非限制性实例包括水或水与低级醇例如乙醇的混合物。然而，取决于特定的生物聚合物以及羟胺或其盐的选择，很多其它溶剂将是有用的。有用的有机溶剂的一个实例是四氢呋喃(THF)。
根据实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺在水中反应。
脱乙酰化过程可以优选地在水或水溶液中进行，所述水溶液任选地还包含另一种溶剂，例如乙醇。因此，根据一些实施方案，步骤a1)包括使包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺在水中接触，使得形成生物聚合物和羟胺的含水混合物或水溶液。在一些实施方案中，羟胺的浓度为含水混合物或水溶液的按重量计至少10％、优选地按重量计至少20％、优选地按重量计至少30％。较高的羟胺浓度可以增加反应速率。
羟胺通常以水溶液的形式提供，通常浓度为按重量计50％。在一些实施方案中，生物聚合物可以被直接地混合和溶解在羟胺的水溶液中，任选地被稀释。可选择地，羟胺的固体盐，例如盐酸羟胺或硫酸羟胺，可以被溶解在生物聚合物的水溶液中。添加羟胺的盐并将该盐转化为羟胺，可以作为将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺的水溶液中的可选择方案或补充方案来进行。
反应混合物中的羟胺的摩尔浓度优选地在5M-20M的范围内。例如，按重量计50％的羟胺的浓度大致对应于16M的摩尔浓度。
发明人已惊奇地发现，当使用羟胺盐代替羟胺本身时，可以以显著较低的摩尔浓度获得相同的反应速率。因此，反应混合物中羟胺盐的摩尔浓度优选地在0.01M-10M的范围内、优选地在0.1M-5M的范围内。
根据一些实施方案，在步骤a1)中将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺或其盐的水溶液中。根据一些实施方案，在步骤a1)中将羟胺的盐溶解在包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。根据一些实施方案，将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺的水溶液中，以及将羟胺的盐溶解于在羟胺中的包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。
发明人已惊奇地发现，当使用羟胺盐代替羟胺本身时，可以以显著较低的摩尔浓度获得相同的反应速率。因此，反应混合物中羟胺盐的摩尔浓度优选地在0.01M-10M的范围内、优选地在0.1M-5M的范围内。
根据一些实施方案，在步骤a1)中将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺或其盐的水溶液中。根据一些实施方案，在步骤a1)中将羟胺的盐溶解在包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。根据一些实施方案，将包含乙酰基基团的生物聚合物溶解在羟胺的水溶液中，以及将羟胺的盐溶解于在羟胺中的包含乙酰基基团的生物聚合物的水溶液中。
步骤a2)中的反应温度优选地为100℃或更低。选择步骤a2)中的反应温度，以便不引起生物聚合物的过度降解。根据一些实施方案，步骤a2)中的温度在10℃-90℃、优选地20℃-80℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内。根据实施方案，步骤a2)中的反应包括在10℃-100℃、优选地20℃-90℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内的温度使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应。该温度可以例如在70℃-90℃的范围内，例如约80℃，或在30℃-50℃的范围内，例如约40℃。
步骤a2)中的反应时间取决于所需的脱乙酰化度。反应时间被优选地选择以便不引起生物聚合物的过度降解，并且还取决于温度和pH。反应时间通常可以是从5分钟至200小时或更多的任何时间。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2-200小时。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2-150小时、优选地5-150小时、优选地5-100小时。在其他实施方案中，例如在使用较高温度或pH的情况下，反应时间可以短得多，例如在5分钟至2小时的范围内、在30分钟至2小时的范围内、或在1-2小时的范围内。
优选地选择步骤a2)中的pH以便不引起生物聚合物的过度降解。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在4-12的范围内的pH值进行。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在9-11的范围内的pH值进行。根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在6-8或7-8的范围内的pH值进行。通常优选的是较低的pH(例如大约中性pH)，例如在6-8或7-8的范围内，以便避免生物聚合物的降解。
发明人通过大量实验已发现，添加pH降低剂还可以显著地提高步骤a2)中反应的反应速率，特别是当使用羟胺时。这种作用既令人惊讶又是高度有利的。值得注意的是，将pH降低剂相应添加至肼脱乙酰化反应不会导致反应速率的任何增加。反应期间较低的pH值也是优选的，以便避免生物聚合物的过度降解。因此，根据一些实施方案，通过添加pH降低剂，反应的pH被降低到在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在6-8或7-8的范围内的值。pH降低剂可以例如选自由以下组成的组：矿物酸、有机酸和pH降低盐、及其混合物或组合。有用的矿物酸的实例包括但不限于硫酸、盐酸和氢碘酸、氢溴酸和磷酸。有用的有机酸的实例包括但不限于乙酸、丙酸、新戊酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、乳酸、苯甲酸、和卤代羧酸例如三氟乙酸和三氯乙酸。有用的pH降低盐的实例包括但不限于氯化铵、溴化铵、碘化铵、盐酸羟胺和硫酸羟胺。在优选的实施方案中，pH降低剂包括盐酸羟胺或硫酸羟胺，最优选地盐酸羟胺。在一些实施方案中，pH降低剂是氢碘酸(HI)。在一些实施方案中，pH降低剂是三氟乙酸(TFA)。
根据一些实施方案，步骤a2)中的反应在惰性气氛和/或黑暗中进行。
通过上述脱乙酰化方法获得的产品可以具有与通过其他已知的脱乙酰化方法获得的相应产品显著不同的性质。
通过本发明的方法获得的水凝胶产品可以任选地经受步骤d)：使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖的残留的胺基团酰化，以形成酰化的交联的糖胺聚糖。此过程在本文中也称为再酰化或再乙酰化。
已经发现，在包含酰胺交联的糖胺聚糖分子的水凝胶产品中残留的游离胺基团的酰化，例如乙酰化，可以被用于改变水凝胶产品的机械性质。不希望受限于任何具体的科学解释，预期的是，游离胺基团的酰化可以减少水凝胶产品中的充当另外的交联部的两性离子络合物的形成，从而导致较软的凝胶的形成。
根据一些实施方案，步骤d)包括使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖的残留的胺基团乙酰化，以形成乙酰化的交联的糖胺聚糖。呈其天然形式的糖胺聚糖是N-乙酰化的。因此，水凝胶产品中的游离胺基团的乙酰化可以被预期产生更类似于天然糖胺聚糖的水凝胶产品。
根据一些实施方案，步骤d)包括使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖在适于形成乙酰化的交联的糖胺聚糖的反应条件下与乙酰化剂反应。
根据一些实施方案，乙酰化剂选自由以下组成的组：乙酸酐、乙酸异丙烯酯和乙酸的预活化的酯。
再乙酰化可根据标准方案使用例如乙酸酐、乙酸异丙烯酯或乙酸的预活化的酯，典型地在水溶液或醇溶液或其混合物中，或在纯的条件(neat condition)下进行。优选地，再乙酰化过程可以使用醇优选地甲醇或乙醇、乙酰化剂、以及如果需要的话，有机碱或无机碱，在固态反应中进行。
过度乙酰化(over-acetylation)、O-乙酰化、酯形成和/或酸酐形成的潜在问题可以通过包括交联后的碱处理步骤来应对。如果需要，可以将再乙酰化步骤从该过程排除，以供应两性离子水凝胶。
通过本发明的方法获得的水凝胶产品任选地经受步骤e)：使步骤c)或d)中提供的交联的糖胺聚糖经受碱处理以水解在步骤c)中酰胺交联期间作为副产物形成的酯交联部。
使用二胺或多胺官能的交联剂与偶联剂一起进行酰胺偶联是制备可用于水凝胶产品的交联的糖胺聚糖分子的有吸引力的途径。交联可以使用基于非碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂例如六亚甲基二胺(HMDA)、或基于碳水化合物的双亲核体或多亲核体交联剂例如二氨基海藻糖(DATH)与糖胺聚糖一起来实现。交联还可以使用单独的或与第二糖胺聚糖组合的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖来实现，由此脱乙酰化的糖胺聚糖本身充当双亲核体或多亲核体交联剂。
已经发现使用偶联剂进行糖胺聚糖的偶联反应或交联以形成酰胺键通常与一部分的酯键的同时形成相关。酯键部分的大小可以取决于反应条件、浓度和使用的偶联剂而变化。与酰胺键相比，酯键在水凝胶产品的处理和储存例如高温灭菌(高压灭菌法)期间更容易降解。这意味着包含酯键、或酯键与酰胺键的组合的水凝胶产品的性质将倾向于随着酯键降解而随时间变化。为了获得较长时间段内保持其原始性质的水凝胶，优选的是，糖胺聚糖通过酰胺键来交联。
本发明人现已发现，使具有酰胺交联部和酯交联部两者的交联的糖胺聚糖经受碱处理可以水解在酰胺交联期间作为副产物形成的酯交联部而不会同时降解酰胺键。还发现的是，在选择合适的反应条件之后，酯键的水解可以在糖胺聚糖主链没有过度降解的情况下实现。
制备水凝胶产品的方法任选地包括步骤d)：使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖的残留的胺基团酰化，以形成酰化的交联的糖胺聚糖。
在包含酰胺交联的糖胺聚糖分子的水凝胶产品中残留的游离胺基团的酰化，例如乙酰化，可以被用于改变水凝胶产品的机械性质。不希望受限于任何具体的科学解释，预期的是，游离胺基团的酰化可以减少水凝胶产品中的充当另外的交联部的两性离子络合物的形成，从而导致较软的凝胶的形成。
根据一些实施方案，步骤d)包括使步骤c)中提供的交联的糖胺聚糖的残留的胺基团乙酰化，以形成乙酰化的交联的糖胺聚糖。呈其天然形式的糖胺聚糖是N-乙酰化的。因此，水凝胶产品中游离胺基团的乙酰化可以被预期产生更类似于天然糖胺聚糖的水凝胶产品。
使用酰化剂酰化糖胺聚糖以形成酰胺键通常与一部分的酯键的同时形成相关。酯键部分的大小可以取决于反应条件、浓度和使用的酰化剂而变化。与酰胺键相比，酯键在水凝胶产品的处理和储存例如高温灭菌(高压灭菌法)期间更容易降解。这意味着包含酯键、或酯键与酰胺键的组合的水凝胶产品的性质将倾向于随着酯键降解而随时间变化。为了获得较长时间段内保持其原始性质的水凝胶，优选的是，糖胺聚糖通过酰胺键来酰化。
本发明人现已发现，使具有酰胺交联部和酯交联部两者的酰化的交联的糖胺聚糖经受碱处理可以水解在酰化期间形成的酯键而不会同时降解酰胺键。还发现的是，在选择合适的反应条件之后，酯键的水解可以在糖胺聚糖主链没有过度降解的情况下实现。
碱处理选择性地水解来自交联过程、或来自再乙酰化过程的O-乙酰化和酸酐形成的不太稳定的酯键，并导致材料中增加的酰胺键/酯键比率。
所得水凝胶产品的典型应用包括制备用于治疗软组织紊乱的可注射制剂，包括但不限于矫正治疗和美学治疗。
如本文关于各种聚合物例如多糖使用的术语“分子量”是指聚合物的重均分子量Mw，这在科学文献中被很好地定义。重均分子量可以通过例如静态光散射、小角度中子散射、X射线散射和沉降速度来确定。分子量的单位为Da或g/mol。
本领域的技术人员意识到，本发明绝不限于以上描述的优选的实施方案。相反地，在所附的权利要求的范围内，许多修改和变型是可能的。另外，根据对附图、公开内容和所附权利要求的研究，技术人员在实践所要求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施方案的变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他要素或者步骤，并且不定冠词“一(a)”或“一(an)”并不排除多个。在相互不同的从属权利要求中陈述某些措施的纯粹事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。
实施例
不希望受限于此，本发明将在下文中通过实施例的方式来例证。
定义和分析
Mw-重均分子量(mass average molecular mass)
SwF-盐水中溶胀因子分析，已溶胀至其最大值的1g凝胶的体积(mL/g)
SwC-盐水中的溶胀能力，每克PS的总液体摄取量(mL/g)。
SwCCPS-校正的溶胀度，针对GelP校正的，1克PS的总液体摄取量(mL/g)。
[PS]-多糖浓度(mg/g)。
GelP-凝胶部分是对作为凝胶网络的一部分的PS的百分比的描述。90％的数意味着10％的多糖不是凝胶网络的一部分。
CrD酰胺-用SEC-MS分析酰胺交联度(％)并且定义为：
DoA-乙酰化度。乙酰化度(DoA)是乙酰基基团与透明质酸二糖的摩尔比。根据以下等式，通过比较透明质素二糖残基的乙酰基信号的积分与脱乙酰化的葡萄糖胺残基的C2-H信号的积分，可以从NMR光谱计算DoA。
NMR-将1H NMR光谱记录在BRUKER Biospin AVANCE 400光谱仪上。将化学位移报告为从在适当的有机溶液中的内标物TMS向低磁场的δ值。产品的纯度和结构由Waters2690光电二极管阵列检测器系统上的LCMS(254nm)使用以下条件来确认：柱，对称C-18；溶剂A，水0.1％甲酸；溶剂B，CH3CN；流量，2.5ml/min；运行时间，4.5min；梯度，从0％溶剂B至100％溶剂B；质量检测器，微质量ZMD(micro mass ZMD)。纯化直接通过质量触发的制备型LCMS Waters X-Terra反相柱(C-18，5微米二氧化硅，19mm直径，100mm长度，40ml/分钟的流量)和作为洗脱剂的水(含有0.1％甲酸)和乙腈的逐渐减小极性的混合物来进行。将含有期望的化合物的部分蒸发至干，以得到通常为固体的最终化合物。
实施例1-通过羟氨解的透明质酸的脱乙酰化
将0.2g或20g的HA(Mw 2500kDa，DoA 100％)溶解在羟胺(Sigma-Aldrich 50体积％溶液)或羟胺/水的混合物中，如表1中所示。将溶液在30℃-70℃在黑暗中并在氩气下温育持续5-353小时。温育后，将混合物通过乙醇沉淀。过滤所得沉淀，用乙醇洗涤，并然后重新溶于水中。溶液通过超滤来纯化，并随后冻干，以得到作为白色固体的脱乙酰化的HA(de-Ac HA)。实施例1-1至实施例1-14使用约0.2g HA来进行并且实施例1-15至实施例1-16使用20g HA来进行。
与肼解(实施例2)和碱法(实施例3和实施例4)相比，通过羟氨解进行脱乙酰化更有效，并且更好地保存HA主链的Mw。
表1.
a:SEC-UV b:SEC-MALS
实施例2-通过肼解的透明质酸的脱乙酰化-对比实施例
如表2中所示，将0.2g的HA(Mw 2500kDa，DoA 100％)溶解在硫酸肼在一水合肼中的10mL的1％溶液中。反应在30℃-55℃在黑暗中并在氩气下进行持续24-120小时。将混合物用乙醇沉淀。过滤所得沉淀，用乙醇洗涤，并然后重新溶于水中。最终脱乙酰化的HA产物在超滤后得到，并冷冻干燥。与羟氨解(实施例1)相比，通过肼解进行的脱乙酰化给出HA主链的更多的降解，即脱乙酰化的产物的更低的Mw。
表2.
实施例3-通过均相碱水解的透明质酸的脱乙酰化-对比实施例
将HA(1000kDa)称重到反应容器中，添加NaOH溶液并混合反应直到获得均匀溶液。将混合物如表3中所示在没有搅拌的情况下温育，并随后用水和EtOH稀释。混合物通过添加1.2M HCl来中和，通过添加EtOH来沉淀。将沉淀物用乙醇(70w/w％)洗涤，然后用乙醇洗涤，并真空干燥过夜以得到固体。与羟氨解(实施例1)相比，通过均相碱水解进行脱乙酰化给出HA主链的更多的降解，即脱乙酰化的产物的更低的Mw。
表3.
实施例4-通过非均相碱水解的透明质酸的脱乙酰化-对比实施例
将HA(1000kDa)称重到反应容器中，并添加EtOH中的NaOH(70％w/w％)，如表4中所示。将非均相混合物温育，并随后通过添加1.2M HCl来中和。将沉淀物用乙醇(75w/w％)洗涤，然后用乙醇洗涤，并真空干燥过夜以得到固体。
与羟氨解(实施例1)相比，通过非均相碱水解进行脱乙酰化给出HA主链的更多的降解，即脱乙酰化的产物的更低的Mw。
表4.
实施例5-交联脱乙酰化的HA
将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，如果需要，对DMTMM混合物调节pH，并随后将溶液添加到脱乙酰化的HA中。通过摇动持续3.5分钟并用刮刀混合或通过将混合物压过过滤器来均化反应混合物。将反应混合物置于35℃的水浴中持续24小时。通过从水浴中取出来停止反应，并将凝胶用刮刀切成小块或压过过滤器。用0.25M NaOH将反应混合物调节至pH>13，搅拌持续约60分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶在乙醇中沉淀并用乙醇(70w/w％)洗涤，并真空干燥过夜。将干燥的凝胶在0.7％NaCl中的磷酸盐缓冲液中溶胀持续至少两小时。控制pH，并必要时调节至7.4。用细滤器减小凝胶颗粒的尺寸。将凝胶填充在注射器中，并将注射器通过高压灭菌法来灭菌。表5中提供的结果示出了通过使用DMTMM、使具有不同的Mw和DoA的脱乙酰化的HA交联来形成水凝胶。
表5.
实施例6-使脱乙酰化的HA和HA的混合物交联
随着翻滚式搅拌(end-over-end stirring)持续24小时，将HA和脱乙酰化的HA溶解在50mL Falcon管中的40mL的水(Milli-Q)中。完全溶解后，将样品冷冻干燥。将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，对DMTMM混合物测量pH，并随后将其添加到冷冻干燥的混合物中。将反应混合物均化并置于35℃的水浴中持续24小时。通过从水浴中取出来停止反应，并用刮刀将凝胶切成小块。用0.25M NaOH将反应混合物调节至pH>13持续约60分钟。将凝胶用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶用乙醇沉淀并用乙醇(70％)洗涤，并真空干燥过夜。将干燥的凝胶在0.7％NaCl中的磷酸盐缓冲液中溶胀持续至少两小时。控制pH，并必要时调节至7.4。用细滤器减小凝胶颗粒的尺寸。将凝胶填充在注射器中，并将注射器通过高压灭菌法来灭菌。表5中提供的结果示出了通过使用DMTMM使脱乙酰化的HA与HA交联来形成水凝胶。
表6.
实施例7-使HMW脱乙酰化的HA和LMW脱乙酰化的HA的混合物交联
将两种不同Mw的脱乙酰化的HA混合在一起。将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，如果需要，对DMTMM混合物调节pH，并随后将溶液添加至脱乙酰化的HA中。将反应混合物通过用刮刀混合或通过将混合物压过过滤器而均化。将反应混合物置于23℃的培养箱中持续24小时。通过从培养箱中取出来停止反应，并将凝胶用刮刀切成小块或压过过滤器。用0.25M NaOH将反应混合物调节至pH>13，搅拌持续约60分钟，并随后用1.2M HCl中和至pH 7.4。
表7.
实施例8-水凝胶的非均相再乙酰化
将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，如果需要，对DMTMM混合物调节pH，并随后将溶液添加到脱乙酰化的HA中。通过摇动持续3.5分钟并用刮刀混合或通过将混合物压过过滤器来均化反应混合物。将反应混合物置于35℃的水浴中持续24小时。通过从水浴中取出来停止反应，并将凝胶用刮刀切成小块或压过过滤器。用0.25M NaOH将反应混合物调节至pH>13，搅拌持续60分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶在乙醇中沉淀并用乙醇(70w/w％)洗涤，并真空干燥过夜。
将沉淀的凝胶悬浮在MeOH中并添加Ac2O(20当量/HA二糖)。将悬浮液在40℃温育持续24小时，然后过滤，将所得固体用70w/w％EtOH洗涤，用EtOH洗涤，并随后真空干燥过夜。将乙酰化的凝胶溶解在0.25M NaOH中，搅拌持续60分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶在乙醇中沉淀并用乙醇(70w/w％)洗涤，并真空干燥过夜。将干燥的凝胶在0.7％NaCl中的磷酸盐缓冲液中溶胀持续至少两小时。
作为对照实验(实施例8-3)，将HA(310kDa)悬浮在MeOH中，并添加Ac2O(20当量/HA二糖)。将悬浮液在40℃温育持续24小时，然后过滤，将所得固体用70w/w％EtOH、用EtOH洗涤，并随后真空干燥过夜。将产物溶解于0.25M NaOH中，搅拌持续60分钟，并随后用1.2MHCl中和。中和后，将凝胶在乙醇中沉淀并用乙醇(70w/w％)洗涤，并真空干燥过夜。分析所得产物的Mw。将结果总结在表8中。
表8.
实施例9-水凝胶的均相再乙酰化
将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并且必要时控制和调节pH。随后将DMTMM溶液添加到脱乙酰化的HA中。通过摇动持续3.5分钟并用刮刀混合或通过将混合物压过过滤器来均化悬浮液。将反应混合物置于23℃的培养箱中持续24小时。通过从培养箱中取出来停止反应，并将凝胶用刮刀混合或压过1mm钢丝网两次。然后向所得材料中添加0.25M NaOH(pH>13)，并混合持续60分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶粒度通过细滤器减小。然后，将凝胶在EtOH中沉淀，并用70w/w％EtOH和EtOH洗涤。将所得材料真空干燥过夜。
将沉淀的凝胶粉末添加到去离子水中，并静置混合持续60分钟。将三乙醇胺(1.5当量/HA二糖)和Ac2O(1当量/HA二糖)添加到凝胶悬浮液中。将反应混合物在23℃混合持续60分钟。然后向乙酰化的凝胶中添加0.25M NaOH(pH>13)，混合持续45分钟，并随后用1.2MHCl中和。中和后，将凝胶在EtOH中沉淀，并用70w/w％EtOH+100mM NaCl、70w/w％EtOH然后是EtOH来洗涤，并真空干燥过夜。将干燥的凝胶在Na-磷酸盐缓冲液中在室温溶胀持续至少两小时，并然后通过细滤器减小粒度。
作为对照实验(实施例9-3)，将脱乙酰化的HA(1700kDa)添加到去离子水中，并静置混合持续60分钟。将三乙醇胺(1.2当量/HA二糖)和Ac2O(1当量/HA二糖)添加到HA混合物中。将反应混合物在23℃混合持续60分钟，然后添加0.25M NaOH(pH>13)，混合持续40分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将混合物在EtOH中沉淀，用70w/w％EtOH+100mM NaCl、70w/w％EtOH然后是EtOH来洗涤，并真空干燥过夜。分析所得产物的Mw和DoA。将结果总结在表9中。
表9.
实施例10-交联的HA凝胶的碱水解
将偶联剂DMTMM溶解在Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，如果需要，对DMTMM混合物调节pH，并随后将溶液添加到脱乙酰化的HA中。通过摇动持续3.5分钟并用刮刀混合或通过将混合物压过过滤器来均化反应混合物。将反应混合物置于35℃的水浴中持续24小时。通过从水浴中取出来停止反应，并将凝胶用刮刀切成小块或压过过滤器。
将凝胶分成两部分，对于凝胶的一部分，用0.25M NaOH将pH调节到pH>13，并搅拌约60分钟，并随后用1.2M HCl中和。中和后，将凝胶在乙醇中沉淀，并用乙醇(70w/w％)洗涤，然后用乙醇洗涤，并真空干燥过夜。如果决定，将干燥的凝胶在0.7％NaCl中的磷酸盐缓冲液中在室温溶胀持续至少两小时，并然后通过细滤器减小粒度。如果需要，控制凝胶pH并调节至7.2-7.5。
用水稀释凝胶的第二部分，并调节pH至6.5-7.5。中和后，将凝胶用乙醇沉淀，并用乙醇(70w/w％)洗涤，然后用乙醇洗涤，并真空干燥过夜。如果决定，将干燥的凝胶在0.7％NaCl中的磷酸盐缓冲液中在室温溶胀持续至少两小时，并然后通过细滤器减小粒度。如果需要，控制凝胶pH并调节至7.2-7.5。
进行碱处理以水解在交联步骤期间在HA链之间形成的分子间和分子内酯键、和在再乙酰化步骤期间形成的潜在O-乙酸酯和酸酐以及由偶联试剂形成的残留的活性酯。碱水解排他地导致材料中的酰胺键。
作为对照实验(实施例10-13至10-15，表10.3)，向Na-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中添加HA。通过摇动持续3.5分钟和将混合物压过过滤器来均化反应混合物。将反应混合物置于5℃、35℃或50℃的水浴中持续24小时。通过从水浴中取出来停止反应，并将混合物压过过滤器。用0.25M NaOH将混合物调节至pH>13持续60-100分钟。将混合物用1.2M HCl中和。中和后，将HA用乙醇沉淀，并用乙醇(70％)洗涤，用乙醇洗涤，并真空干燥过夜。分析所得产物的Mw。表10.1-10.3中总结的结果显示，交联后的碱处理为凝胶提供增加的溶胀性能以及较低的CrD。
表10.1
表10.2
| 实施例 | 起始Mw(kDa) | 起始DoA(％) | DMTMM(mol％) | 时间(min) | CrD* |
| 10-9 | 1700 | 95 | 2.4 | 0 | 0.34 |
| 10-10 | 1700 | 95 | 2.4 | 60 | 0.30 |
| 10-11 | 950 | 89 | 4.0 | 0 | 0.88 |
| 10-12 | 950 | 89 | 4.0 | 60 | 0.73 |
对于表10.2中非碱处理的凝胶的*CrD也包含酯交联部。
表10.3
| 实施例 | 起始Mw(kDa) | 温度(℃) | 时间(min) | 最终Mw(kDa) |
| 10-13 | 1360 | 5 | 100 | 1340b |
| 10-14 | 920 | 35 | 60 | 860a |
| 10-15 | 1360 | 50 | 70 | 1230b |
a:SEC-UV b:SEC-MALS
实施例11-N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺
的制备
在室温，将N-((2R,3S,5S)-2,4,5-三羟基-6-三苯甲基氧基甲基-四氢-吡喃-3-基)-乙酰胺(556mg，1.20mol，1.00当量)在THF-H2O的混合物(20ml，4:1)中的溶液用固体硼氢化钠(49.92mg，1.32mol，1.10当量)处理[气体逸出]。将反应混合物在室温搅拌持续2h，浓缩至干以得到作为白色固体的N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺(500mg，89.54％)，使用所述白色固体而不需另外纯化。
LCMS:tR＝1.01分钟，纯度＝100％；ES+，464.26(M-H)-。
实施例12-N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺
的脱乙酰化
将N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺(1当量)在羟胺(10倍体积)中的悬浮液用酸添加剂处理以降低pH至7或不处理pH，如表11、实施例12-1至12-9中所示。将混合物在80℃加热，直到达到脱乙酰化的完全转化。在与实施例2相同的条件下，用肼(pH 13)对N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺进行脱乙酰化也被包括作为实施例13-10。
在表11中展示了结果。结果表明，用羟胺的脱乙酰化程序比用肼的脱乙酰化程序进行得快得多，并且通过添加pH降低剂显著地更快。
表11.
将反应混合物通过制备型LCMS直接纯化，以得到作为白色固体的(2R,3R,4S)-2-氨基-6-(三苯甲基氧基)己烷-1,3,4,5-四醇。
LCMS:tR＝0.88分钟，纯度＝99％；ES+，422.11(M-H)-。
1H NMR(DMSO-d6)δ:7.47–7.37(m,6H),7.30(dd,J＝8.3,6.7Hz,6H),7.26–7.15(m,3H),3.92(m,1H),3.83–3.74(m,1H),3.62–3.53(m,1H),3.52–3.41(m,1H),3.34–3.27(m,1H),3.22–3.16(m,1H),3.13–3.04(m,1H),3.01–2.91(m,1H)
实施例13-N-(4-氨基苯乙基)乙酰胺的制备
向4-(2-氨基乙基)苯胺(1.50g；11.01mmol；1.00当量)添加纯的乙酸对甲酚酯(1.65g，11.0mmol，1.00当量)并将反应混合物在室温搅拌持续30h。将所得橙色溶液直接吸附在硅胶上，并通过快速色谱法(硅胶，DCM/MeOH0％-5％)纯化，以得到N-(4-氨基苯乙基)乙酰胺(1.76g，89.7％收率)
LCMS:tR＝0.58分钟，纯度＝99.5％；ES+，179.5(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.78(s,3H),2.50(m,被DMSO信号隐藏的2H)3.14(m,2H),4.83(s,2H),6.49(d,J＝7.5Hz,2H),6.84(d,J＝7.5Hz,2H),7.82(s,1H)。
实施例14-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备
在室温向N-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-乙酰胺(500mg，2.81mmol，1.00当量)在DCM(20ml)中的搅拌的溶液添加三乙胺(0.51ml，3.65mmol，1.30当量)，然后添加二碳酸二叔丁酯(673.48mg，3.09mmol，1.10当量)。将反应混合物在室温搅拌持续1h，用水(5ml)、NaHSO4(含水的)(5ml)的饱和溶液和水(3×5ml)洗涤，经MgSO4干燥并浓缩至干，以得到作为浅橙色固体的(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(496mg，63％收率)。
LCMS:tR＝1.11分钟，纯度＝100％；ES+，279.5(M+H)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.57(s,9H),1.87(s,3H),2.75–2.64(m,2H),3.36–3.20(m,2H),7.27–7.07(m,2H),7.45(d,J＝8.3Hz,2H),7.94(t,J＝5.6Hz,1H),9.31(s,1H)。
实施例15-NH2OH.HI的制备
在0℃，在5分钟的时间段内向50％NH2OH(含水的)(9.28ml，0.15mol，1.00当量)的搅拌的溶液小心地滴加57％HI(含水的)，直到实现7的pH。形成致密的白色结晶固体，其通过过滤收集，用冰冷水小心洗涤，以得到羟胺氢碘酸盐(6.80g，28％)。
实施例16-NT-NH2OH.TFA的制备
在0℃，在5分钟的时间段内向50％NH2OH(含水的)(9.28ml，0.15mol，1.00当量)的搅拌的溶液小心地滴加TFA，直到实现7的pH。将反应混合物在氮气鼓泡下浓缩，以得到作为澄清无色油的羟胺.三氟乙酸盐(11.0g，98％)。
实施例17-NH2OH及其盐相对于常用的转酰胺化剂(transamidation agent)例如
NH2NH2.H2O和NaOH的比较研究
向(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)-氨基甲酸叔丁酯(50mg，0.18mmol)在所选溶剂(5倍体积)中的搅拌的溶液/悬浮液中添加盐(5当量)，并将所得混合物在80℃加热持续完成反应所需的时间。结果总结在表12中。
LCMS:tR＝0.81分钟，纯度＝100％；ES+，237.51(M+H)+。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.26(s,1H),8.40(s,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H),2.89(m,2H),2.80–2.63(m,2H),1.47(s,9H)(分离为甲酸盐)。
表12.
*体积＝1g＝1ml＝1倍体积。
Claims (24)
1.一种用于使包含乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的方法，包括：
a1)提供包含乙酰基基团的生物聚合物；
a2)使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺(NH2OH)或其盐在100℃或更低的温度反应持续2-200小时，以形成至少部分脱乙酰化的生物聚合物；以及
a3)回收所述至少部分脱乙酰化的生物聚合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含乙酰基基团的生物聚合物是糖胺聚糖，优选地选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物的重均分子量为步骤a1)中的所述包含乙酰基基团的生物聚合物的重均分子量的至少10％、优选地至少20％、更优选地至少25％。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a1)中的所述包含乙酰基基团的生物聚合物具有98％-100％的范围内的乙酰化度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所回收的至少部分脱乙酰化的生物聚合物具有比步骤a1)中的所述包含乙酰基基团的生物聚合物的乙酰化度低至少1％、优选地低至少2％、优选地低至少3％、优选地低至少4％、优选地低至少5％的乙酰化度。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺或其盐在100℃或更低的温度反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺或其盐在10℃-90℃、优选地20℃-80℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内的温度反应。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺或其盐反应持续2-200小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺或其盐反应持续2-150小时、优选地5-150小时、优选地5-100小时。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺在水中反应。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的羟胺的摩尔浓度在5M-20M的范围内。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)包括使所述包含乙酰基基团的生物聚合物与羟胺盐反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述羟胺盐是羟胺与氢碘酸或三氟乙酸的盐。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的所述羟胺盐的浓度在0.1M-5M的范围内。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的所述反应在至少能够至少部分溶解所述羟胺盐的溶剂中进行。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的所述反应在4-12的范围内的pH值进行。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的所述反应在9-11的范围内的pH值进行。
18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤a2)中的所述反应在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在7-8的范围内的pH值进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过添加pH降低剂将所述反应的pH降低到在4-9的范围内、优选地在6-9的范围内、优选地在7-8的范围内的值。
20.通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法获得的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖。
21.至少部分脱乙酰化的脱乙酰化的糖胺聚糖，具有99％或更低、优选地98％或更低、优选地97％或更低、优选地96％或更低的乙酰化度，以及0.1MDa或更高、优选地0.3MDa或更高、优选地0.5MDa或更高的重均分子量。
22.羟胺或其盐用于使包含乙酰基基团的生物聚合物至少部分脱乙酰化的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述包含乙酰基基团的生物聚合物是糖胺聚糖，优选地选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。
24.一种制备水凝胶产品的方法，所述水凝胶产品包含交联的糖胺聚糖分子，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含根据权利要求20或21所述的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖以及任选的第二糖胺聚糖的溶液；
b)用偶联剂活化在所述至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖和/或所述任选的第二糖胺聚糖上的羧基基团，以形成活化的糖胺聚糖；
c)使用所述至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖的氨基基团、经由所述活化的糖胺聚糖的活化的羧基基团使所述活化的糖胺聚糖交联，以提供通过酰胺键交联的糖胺聚糖。
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