CN103788222A - Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重均分子量(Mw)约4.5～9kD的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖、含所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖的药物组合物、它们的制备方法及其在制备预防或治疗血栓性疾病的药物中的应用。所述低聚糖胺聚糖具有式(I)所示结构，式(I)所含取代基同说明书定义。所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药物组合物具有强效因子Ⅹ酶抑制活性和HC-II依赖的抗凝血酶活性，可用于制备抗血栓药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地，涉及重均分子量(Mw)4.5～9kD的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药学上可接受的盐，含所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的药物组合物，Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药物组合物的制备方法及其在制备预防或治疗血栓性疾病的药物中的应用。
背景技术
岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan,FGAG)是一类从棘皮动物体壁中获得的带有硫酸化岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖衍生物。不同棘皮动物来源及不用方法制备的FGAG在化学组成上既有共同点也存在差异。
不同来源的FGAG的共同点主要表现在组成单糖包括D-2-乙酰胺基-2-脱氧半乳糖(D-GalNAc)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA)和L-岩藻糖(L-Fuc)以及它们的硫酸酯。其中，D-GlcUA和D-GalNAc通过β-(1-3)及β-(1-4)糖苷键交替连接形成糖胺聚糖的主链，而L-Fuc则以侧链形式连接于主链(Ricardo P.et al.,JBC,1988,263(34):18176；Kenichiro Y.et al.,Tetrahedron Lett,1992,33(34):4959）。
不同来源的FGAG在结构上的不同点主要包括L-Fuc的硫酸化程度及位置不同以及主链硫酸化程度及位置不同。目前见于报道的FGAG的岩藻糖侧链的硫酸根取代大多比较复杂。例如，仿刺参(Stichopus japonicas)来源的FGAG主要含有三种类型的L-Fuc，即2,4-二硫酸酯(Fuc2S4S)、4-二硫酸酯(Fuc4S)及3,4-二硫酸酯(Fuc3S4S)，且Fuc2S4S约占L-Fuc总量的～60%，而其主链上的D-GalNAc主要为4,6-二硫酸酯(GalNAc4S6S)(Kenichiro Y,et al.TetrahedronLett,1992,33:4959)；玉足海参(Holothuria leucospilota)FGAG的L-Fuc类型不清楚，其主链上的D-GalNAc含4-硫酸酯基(GalNAc4S)(樊绘曾，等，药学学报，1983,18(3):203)；巴西产海参Ludwigothurea grisea的FGAG的L-Fuc中，Fuc4S含量最高(～49%)，另含Fuc2S4S(～20%)、-3S4S(～17%)及无硫酸酯基取代的L-Fuc(Fuc0S)，其主链D-GalNAc类型包括GalNAc6S(～53%)、-4S6S(～12%)和-4S(31%)(LuborB.et al.J.Biol.Chem.2007,282:14984)；梅花参(Thelenataananas)FGAG的L-Fuc类型包括Fuc2S4S(～53%)、-4S(～22%)、-3S(～25%)，所含D-GalNAc主要为GalNAc4S6S(～95%)及-6S(～5%)(WuM.,et al.Carbohydr.Polym.,2012,87(1):862)。此外，Isostichopus badionatus的FGAG的L-Fuc主要是Fuc-2S4S(～96%)，Holothuria vagabunda的FGAG的L-Fuc类型类似于巴西产海参，Stichopus tremulus的FGAG包括Fuc3S4S(～53%)、-2S4S(～22%)和-4S(～25%)(Chen SG,et al.Carbohydr.Polym.,2011,83(2):688)。
多种海参来源的FGAG具有强效抗凝血活性(张佩文,中国药理学与毒理学杂志,1988,2(2):98；Paulo AS.etal.,J.Biol.Chem.1996,271:23973)，但天然来源的FGAG也具有诱导血小板聚集的活性(Jiazeng L.et al,Thromb Haemos,1988,54(3):435；单春文,中药药理与临床,1989,5(3):33)和激活因子XII的表面激活活性(Roberto J.et al.Thromb Haemost.2010,103:994)。对于刺参来源的FGAG，通过解聚所获得的DHG可减弱血小板诱导聚集活性(Hideki N.etal.,Blood,1995,85(6):1527)。
海参来源的FGAG的抗凝血活性的药理学机制研究显示，FGAG具有不同于肝素、硫酸皮肤素的机制特点，例如，FGAG为强效的F.Xase抑制剂，可抑制内源性因子X酶对因子X的激活；存在依赖ATIII和HCII的抗凝血酶活性；存在抑制凝血酶IIa反馈激活因子XIII的活性(Hideki N.,1995)；存在因子XII激活活性(Roberto J.2010)。一般认为广泛的药理学机制与抗凝药物的出血倾向副作用有关(Bauer,Hematology,2006,(1):450)，提高FGAG的药理学作用靶点的选择性有益于降低出血倾向。
改善天然来源的FGAG的药理学作用靶点的选择性的可选择的途径之一是对其进行化学结构修饰。例如，对天然FGAG进行过氧化解聚(欧洲专利公开EP0408770；Kenichiro Y,1992)、脱硫酸化或羧基还原(Paulo AS etal.,ThrombosisResearch,2001,102:167)、部分酸水解(Yutaka Kariya,Biochem.J.,2002,132:335;Paulo AS etal.,Thrombosis Research,2001,102:167)等。现有资料显示，降低天然FGAG分子量可影响其药理学作用特点，例如降低诱导血小板聚集的活性，减弱依赖ATIII及HC-II依赖的抗凝血酶活性等(樊绘曾等,生物化学杂志,1993,9(2):146；马西,中华血液学杂志,1990,11(5):241；Paulo AS etal.,J.Biol.Chem.1996,271,23973;Hideki Nagase etal.,Blood,1995,85(6):1527)。然而简单解聚尚难获得抗凝效价与靶点选择性均较理想的抗凝活性产物。例如刺参FGAG重均分子量(Mw)低至约9kD时方能有效降低其血小板诱聚活性(樊绘曾等,生物化学杂志,1993,9(2):146)；而具有合适抗凝活性强度的解聚产物的Mw约为12～15kDa(Nagase etal.,Thromb Haemost,1997,77(2):399;Kazuhisa M etal.,Kidney Int.,2003,63:1548;Sheehan etal.,Blood,2006,107(10):3876;赵金华等.CN101724086A)。水解侧链岩藻糖以及部分去硫酸化都可以致FGAG抗凝血活性显著降低乃至消失，羧基还原对抗凝活性影响相对较小，但出血倾向仍然显著且对血小板活性的影响未知(Paulo AS etal.,Br J.Haematol.,1998,101:647;Paulo AS etal.,ThrombRes.2001,102:167)。
本发明人在海参来源的FGAG的抗凝活性构效关系研究中，对FGAG解聚方法进行了系统研究，例如建立了过渡金属离子催化的过氧化解聚法、β-消除解聚方法、脱酰脱氨基解聚方法等(赵金华等,CN101735336B;CN103145868A;CN103214591A)。前者可以提高解聚反应的效率和反应过程的可控性；后两者可以获得具有特殊的还原性或非还原性末端糖基，显著提高产物质量的可控性。此外，本发明人对FGAG所含结构片段及化学基团(如D-β-GlcUA所含羧基，D-β-GalNAc所含乙酰氨基等)的结构修饰方法及其结构修饰产物的构效关系进行了较为系统研究(刘吉开等,CN102558389A;赵金华等,CN102247401A;ZhaoL.et al.CarbohydrPolym.2013,(98):1514;Lian W.et al.BBA,2013,1830:4681)。但是，除了非选择性脱除硫酸酯基外，这些结构修饰方法均不能改变FGAG主链及侧链的硫酸酯化程度及位置。也就是说，FGAG主侧链硫酸化形式仍然取决于其天然来源。
如前文所述，不同物种来源的FGAG的主侧链硫酸化形式可以存在较大区别。本发明人前期工作已发现梅花参FGAG具有较弱的激活血小板活性的优势特点(赵金华等,CN101724086A;Wuet al.Food Chem.2010(122)716)。但是，梅花参FGAG所含侧链L-Fuc的硫酸酯基取代形式较复杂(Mingyi W.,2010;ZhaoL.,2013;Lian W.,2013)，其解聚产物的结构确证、产物化学结构均一性分析等质量分析相关的技术难度较大。文献报道I.badionatus来源的FGAG的侧链L-Fuc主要是Fuc2S4S(～96%)(Chen SG,2011)，此为FGAG类化合物结构研究提供了便利条件，由于Fuc2S4S结构与FGAG的f.XII激活活性相关(RobertoJ.2010)，这无疑限制了侧链以Fuc2S4S为主的FGAG的应用价值。
糙海参(Holothuria scabra)多糖见于报道,但其研究仅限于总多糖制备工艺与活性的初步研究(沈鸣等.中国海洋药物,2003,91(1):1)、酸性粘多糖的初步理化性质分析(陈健等.食品与发酵工业,2006,32(10):123)及提取工艺探讨(郑艾初等.现代食品科技,2007,23(5):65)。本发明人在对一系列海参来源的FGAG进行系统研究中发现，糙海参多糖不仅包括FGAG，还包括几种结构和聚合度不同的酸性岩藻聚糖(Fucan sulfate)以及类似糖原结构的中性多糖。由于数种酸性岩藻聚糖及中性多糖具有与FGAG近似的分子量，因此，现有文献方法获得的多糖类成分应当并非纯净的糙海参FGAG。
多糖类化学结构分析具有较高的技术难度，本发明人在综合采用糖化学分析、酶法分析、特殊衍生物制备及其波谱解析技术研究糙海参FGAG的化学结构过程中发现，糙海参FGAG具有非常特殊的化学结构特征，即其所含侧链L-Fuc主要是α-L-Fuc3S4S(占其全部侧链取代基的75%以上)。NMR谱图及精细化学结构分析显示，糙海参FGAG的重复结构单元较刺参、巴西产海参L.grisea、梅花参等前文所述多种海参来源的FGAG的重复结构单元更为规则。显然，这种化学结构的规则性有利于实现其潜在的应用价值。
另一方面，多种类型的聚阴离子物质具有f.XII激活(表面激活)活性，如聚磷酸、RNA片段、细菌内毒素、过硫酸软骨素等(Mackmanet al.,J Thromb Haemost.2010,8(5):865)。鉴于资料显示，侧链岩藻糖硫酸酯化程度较高的Fuc2S4S结构与FGAG激活f.XII的活性相关(Roberto J.,2010)，侧链L-Fuc上的硫酸酯基的负电荷载量自然成为关注FGAG激活f.XII活性的关键性结构特征。然而，本发明人在大量的比较试验研究中进一步惊奇发现，尽管糙海参FGAG主侧链均具有较高的负电荷载量(其主链中的β-D-GalNAc主要为4,6-二硫酸酯基取代，75%以上的侧链α-L-Fuc存在3,4-二硫酸酯基取代)，但其原型和解聚产物的f.XII激活活性却在所见海参来源的FGAG中最弱。
采用本发明人已建立的技术(赵金华等,CN101735336A;CN103145868A;CN103214591A)制备糙海参FGAG解聚衍生物，本发明人进一步惊奇发现，相对于其他多种海参来源的FGAG解聚产物，糙海参FGAG解聚产物可在更低分子量(Mw约4.5～9kD)时保持强效抗凝活性，例如，可在Mw约5-8kD时呈现最强的f.Xase抑制活性，在Mw约5kD时呈现最强的HCII依赖的抗凝血酶活性。随后，本发明人从格皮氏海参(P.graeffei)提取纯化了侧链主要为L-Fuc3S4S的结构近似的FGAG类化合物。采用前文所述本发明人建立的技术方法获得解聚产物后，其解聚产物具有近似糙海参FGAG解聚产物的抗凝活性以及不影响f.XII及血小板的活性特征。
侧链L-Fuc的硫酸酯化方式而非简单的电荷负载量显著影响着FGAG及其衍生物的药理药效学活性特征。侧链主要为L-Fuc3S4S的FGAG解聚产物具有更为规则的重复结构单元，并且具有更为优势的抗凝药理学作用特征。
血栓性疾病目前仍然是人类主要的致死性病因，抗凝血药物在血栓性疾病的预防和临床治疗中具有重要作用。肝素类药物是主要的临床用药，但存在严重出血倾向的缺陷，一般认为其出血倾向与其较广泛的凝血因子影响以及共同途径凝血抑制相关，而f.Xase抑制和HCII依赖的抗f.IIa活性机制可能有利于降低抗凝活性成分的出血倾向。
糙海参和格皮氏海参等海参来源的侧链主要为L-Fuc3S4S的低聚糖胺聚糖可具有强效抗凝活性，其抗凝机制主要为f.Xase抑制和HCII依赖的抗f.IIa活性；而侧链主要为L-Fuc3S4S的低聚糖胺聚糖具有更为规则的重复结构单元和具有更为优势的抗凝药理学作用特征，因此具有重要的预防和临床治疗血栓性疾病的应用潜力。
发明内容
本发明首先提供一种Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物是具有式(I)所示结构的低聚同系糖胺聚糖类化合物的混合物，
式(I)中：
A环为β-D-葡萄糖醛酸基或其羧基还原产物β-D-葡萄糖基(β-D-GlcUA或β-D-Glc)。其中，
R1为-COO-、-CH2OH、–COR10，其R10为相互独立的直链或支链的取代或未取代的C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基；
B环为取代的β-D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖基(β-D-GalNAc)。其中，
R2为-COCH3或-H；
R3和R4为相互独立的-H或-SO3 -；
C环为硫酸酯化的α-L-岩藻糖基(α-L-Fuc)。其中，
R5，R6和R7是相互独立的-H或-SO3 -；并且以摩尔比计，R5为-H、R6和R7为-SO3 -的α-L-岩藻糖基(α-L-Fuc3S4S)占全部α-L-岩藻糖基的比例不低于75%；
R8是式(II)或式(III)所示结构：
式(II)和式(III)中：
A环为β-D-葡萄糖醛酸基或其羧基还原产物β-D-葡萄糖基(β-D-GlcUA或β-D-Glc)，A’环为分别4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基(ΔUA)，式中的R1同前文定义；
C环为α-L-岩藻糖基(α-L-Fuc)，其中，R5、R6和R7同前文定义；
R9是式(IV)、式(V)或式(VI)所示结构：
式(IV)、(V)和(VI)中，
B为取代的D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖基(α/β-D-GalNAc)，B’为取代的D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖-3-基的醛基还原产物：其糖醇、糖胺或N-取代的糖胺，B”为取代的2,5-脱水塔罗糖基(anTal)或其糖醇、糖胺及N-取代糖胺。其中，
R3和R4同前文定义；
R11为羟基、氨基、C1-C6烷基氨基、C7-C12芳基氨基；
R12为羰基、双羟基、羟基、氨基、C1-C6烷基氨基、C7-C12芳基氨基。
当R8为式(III)所示结构时，R9具有式(IV)或式(V)所示结构；当R9为式(VI)所示结构时，R8具有式(II)所示结构。
n为2～20的整数；并且，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%。
以摩尔比计，式(I)化合物中，α-L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部L-岩藻糖基的比例不低于75%；
所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD，且其多分散系数(PDI)值小于或等于1.6。
本发明所述低聚糖胺聚糖混合物中，其合适的Mw范围为约4.5～9kD，PDI在约1～1.6之间。本领域技术人员可以理解，本发明所述混合物由一系列聚合度不同的式(I)所示化合物组成。由式(I)所示结构可见，本发明之低聚糖胺聚糖混合物具有特征性的重复结构单元，其为式(I)结构式的括号内部分，即，
-{-3)-D-GalNAc4S6S-(β1-4)-[L-Fuc-(α1-3)]-D-GlcUA-(β1-}n-
根据纯化的结构片段研究，当n≥2时，式(I)化合物即具有一定强度的HCII依赖的抗凝血酶活性，而当n超过约20以上时，式(I)化合物就可能具有血小板活性，因此，在本说明所述低聚糖胺聚糖混合物的制备过程中，n<2和n>20的更低和更聚合度的化合物都将被除去。在更优选的实施方案中，n<3和n>15的较低和较高聚合度的化合物也尽可能被除去。
根据相关的纯化结构片段活性研究，n为约4～9的整数时，式(I)化合物可具有较好的抗凝药理学活性特征。一般地，在本发明定义的低聚糖胺聚糖混合物的重均分子量及PDI范围内，所述混合物中，n为4～9的化合物占全部化合物的比例通常不低于75%，该比例通常可根据所述混合物的高效凝胶色谱(HPGPC)的图谱积分及同系化合物的结构单元的分子量计算。
本发明所述低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，一般由海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖经化学解聚法解聚制备。其中所述海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖具有如下特征：
(1)所述糖胺聚糖是从一些特定物种海参中提取获得，其化学属性是具有侧链岩藻糖取代基的糖胺聚糖衍生物(即岩藻糖化糖胺聚糖，FGAG)；
(2)所述糖胺聚糖中，其单糖组成包括摩尔比在1:(1±0.3):(1±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；以摩尔比计，其所含L-岩藻糖基中，3,4-二硫酸酯化-L-岩藻糖基(Fuc3S4S)所占比例不低于75%。
(3)所述糖胺聚糖的单糖连接方式是，D-葡萄糖醛酸与D-乙酰氨基半乳糖分别以β(1-4)糖苷键和β(1-3)糖苷键交替链接形成多糖主链，L-岩藻糖基以侧链的形式以α(1-3)糖苷键连接于主链上的D-葡萄糖醛酸。
已知不同物种海参所含岩藻糖化糖胺聚糖(FGAG)的基本化学结构具有一定的相似性，但主链和侧链糖基上的硫酸酯化形式可以有所不同。对于本发明所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖，其特征性的结构特点在于其侧链岩藻糖硫酸酯化形式主要为3,4-二取代。本发明已经发现，具有这种结构特点的FGAG可存在于新鲜或干燥的糙海参Holothuria scabra或格皮氏海参Pearsonothuriagraeffei体壁和或内脏。由于全球海参物种多达数千种，目前只有一小部分海参物种的糖胺聚糖经过系统的调查研究，因此可能存在含有本发明定义的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的其它海参物种。显然，从这些物种海参中提取的FGAG也可以用于制备本发明所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物。
如后文所述，由海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖制备本发明之低聚糖胺聚糖混合物的化学解聚法一般包括β-消除法、脱氨基解聚法及过氧化解聚法等，不同的解聚方法及其解聚后修饰所得产物可具有不同的末端结构特征。为此，本发明进一步提供具有式(VII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(VII)中：
化学结构片段A、A’、B、B’、C同前文定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R11均同前文所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(VII)化合物中，α-L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD。
本发明所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物还可以是具有式(VIII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(VIII)中：
化学结构片段A、B、B”、C同前文所述定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R12均同前文所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(VIII)化合物中，α-L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD。
本发明人已发现，式(VIII)化合物还原端B”为2,5-脱水塔罗糖(AnTal)时，所述AnTal的C1位羰基易于结合一分子水形成二醇(AnTal-diol)式水合物结构，显然这种水合物或二醇式化合物也在本发明的范围之内。
本发明提供的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物还可以是具有式(IX)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(IX)中：
化学结构片段A、B、B’、C同前文所述定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R11均同前文所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(VIII)化合物中，α-L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9.0kD。
一般来说，本发明所述的药学上可接受的盐可以是碱金属和/或碱土金属盐。本发明中，优选的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物为钠盐、钾盐或钙盐。
进一步地，本发明还提供一种本发明所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一：从包括但不限于新鲜或干燥的糙海参Holothuria scabra或格皮氏海参Pearsonothuriagraeffei体壁和或内脏提取并纯化获得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分。
本发明中，所述提取步骤包括将海参切碎、粉碎或匀浆后，用水作为提取溶媒，任选采用蛋白酶酶解处理和/或无机碱处理法获得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的提取液；所述纯化步骤任选采用乙醇和/或丙酮沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、透析法和/或超滤法获得纯化和/或部分纯化的含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分。
一般来说，本发明所述含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分是指：(1)所述多糖组分的糖胺聚糖部分具有均一性分子量，即在分析型凝胶色谱柱上呈单一的多糖色谱峰，且多分散系数在1～1.5之间；(2)该多糖组分中Fuc3S4S取代的糖胺聚糖含量不低于约80%。其中，所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖是指：(i)其为海参来源的糖胺聚糖类多糖，其组成单糖包括摩尔比在1:(1±0.3):(1±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；(ii)以摩尔比计，其所含L-岩藻糖基中，3,4-二硫酸酯化-L-岩藻糖基所占比例不低于75%。
目前仅发现糙海参和格皮氏海参体壁和内脏含有本发明定义的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖，但是，在全球约1200多种海参(张春云等,海洋水产研究,2004,25(3):89)品种中，已进行FGAG分离纯化的海参品种还很少，因此，含有符合本发明定义上的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的海参品种可能并不限于糙海参和格皮氏海参。显然，本领域技术人员容易理解，对于符合本发明定义的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖，即使来源于其他海参品种，也可用于制备本发明所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其要学上可接受的盐。
步骤二：将步骤一所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖解聚至重均分子量(Mw)为约4.5kD～9kD的低聚糖胺聚糖混合物。所述解聚方法任选采用：β-消除解聚法(方法1)、脱酰脱氨基解聚法(方法2)或过氧化解聚法(方法3)。
方法1.β-消除解聚法。所述方法包括通过季铵盐化和酯化反应将“步骤一”所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖所含己糖醛酸上的游离羧基部分地转化为羧酸酯基，获得羧酸酯化程度约10%～50%的所述多糖的羧酸酯化物，并利用该步骤除去原多糖组分中残存非酸性多糖类杂质成分；继而在非水溶剂中，在碱性试剂存在下，使所得羧酸酯化物发生β-消除反应并获得目标分子量范围的解聚产物，并通过分子量差异去除原多糖组分中残存的岩藻多糖类杂质。
本发明人此前申请的发明专利(CN201310099800.9)已对β-消除解聚法解聚FGAG的一般步骤进行了描述。本发明之“方法1”中，在将“步骤一”所得多糖组分含有的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖中的己糖醛酸之游离羧基部分地转化为羧酸酯基的过程中，可首先将所述多糖组分进行季铵盐转化。一般来说，该步骤可以向“步骤一”所述多糖组分的水溶液中加入季铵碱如苄索氯铵，离心获得季铵盐化的酸性多糖沉淀。
现已发现，海参多糖中，除FGAG外，还含有岩藻聚糖硫酸酯(Fucan sulfate,FS)以及类似糖原的中性多糖(neutral polysaccharide,NP)。由于部分类型的FS和NP具有近似FGAG的分子量范围，因此，海参FGAG提取纯化过程中，采用分级沉淀法尚难完全除去提取物中所含的FS和NP。本发明方法中，在步骤一所述多糖组分的季铵盐化处理过程中，由于中性多糖类成分不被季铵盐沉淀，因此，季铵盐沉淀经过离心和纯水洗涤处理，可以非常有效地去除可能存在的分子量分布近似于所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的中性多糖。
所得季铵盐化的酸性多糖沉淀经洗涤、干燥后，将其溶解于非质子化溶剂如二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)中与化学计量的卤代烃反应，可获得FGAG季铵盐的羧酸酯衍生物。所述卤代烃中烃基包括但不限于C1-C6直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的脂族烃基；取代或未取代的C7-C12芳族烃基等。本发明优选的卤代烃包括溴化苄和氯化苄。
一般来说，本发明目标产物的重均分子量在4.5～9.0kD范围内，鉴于β-消除反应的实际反应效率，所述FGAG羧酸酯衍生物的酯化程度一般选择在10%～50%的范围内。所述羧酸酯衍生物的酯化程度可通过1H NMR谱图计算。
本发明人已发现，FGAG羧酸酯衍生物在碱性条件下的水和含水溶剂中极易发生水解，所以，本发明所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的β-消除解聚反应中，所述羧酸酯衍生物在碱性试剂存在下的非水溶剂中进行，由此获得解聚产物。本发明中，优选的非水溶剂是乙醇，优选碱性试剂为乙醇钠。
FGAG羧酸酯衍生物在碱性试剂条件下可发生β-消除反应解聚，而FS不含己糖醛酸而不被解聚，其结果是，原多糖组分中分子量接近的FGAG和FS经β-消除法处理后，其分子量范围就有了很大差异。进一步采用凝胶过滤、超滤和/或透析法处理，可以容易地去除解聚产物中残存的FS类成分。因此，通过β-消除反应不仅可以获得目标分子量范围的本发明所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物，还可以有效去除原多糖组分中残留的FS类多糖成分，提高本发明所述产物的纯度。
按照上述方法处理获得的β-消除解聚反应产物经纯化后即可作为本发明所述低聚同系糖胺聚糖混合物，这种同系糖胺聚糖混合物中，其部分葡萄糖醛酸仍以羧酸酯形式存在，所述羧酸酯的酯基部分为C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基。这种含羧酸酯基的低聚同系糖胺聚糖混合物可以任选在碱性条件下的水和含水溶剂中水解酯基，获得不含羧酸酯的低聚同系糖胺聚糖。
进一步地，低聚同系糖胺聚糖所含葡萄糖醛酸基上的羧基可进一步在碳化二亚胺类化合物存在下被还原剂如硼氢化钠还原成相应的己糖基，即D-葡萄糖基。
所得低聚同系糖胺聚糖还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-半乳糖基转化为相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。将多糖和/或寡糖的末端还原糖转化为对应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺是本领域技术人员熟知的方法，例如，碱性条件下的硼氢化钠或氰基硼氢化钠处理可以容易地将还原糖还原为糖醇；碳酸氢铵和氰基硼氢化钠处理可以将还原糖转化为相应的糖胺；而在有机胺存在下可以将还原性末端还原氨基化，其反应是有机胺与末端糖基的C1位醛基反应生成席夫碱，后者在还原剂存在下被还原成次级胺，即形成N取代的糖胺。
本发明“步骤二”所述β-消除解聚法制备所需低聚同系糖胺聚糖混合物的步骤可概述如下：
含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的多糖组分(海参多糖提取物)
↓季铵盐化转化，并除去中性多糖
含Fuc3S4S取代糖胺聚糖季铵盐的多糖组分
↓羧基酯化反应(非质子溶剂中，与卤代烃反应)
含部分羧酸酯化的Fuc3S4S取代糖胺聚糖季铵盐的多糖组分
↓β-消除反应(非水溶剂中，强碱处理)
↓纯化(凝胶层析、超滤和/或透析)
部分羧酸酯化的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖
(任选)↓羧酸酯水解(含水溶剂中，碱处理)
Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖
(任选)↓羧基还原(含水溶剂中，碳化二亚胺/还原剂处理)
羧基还原的低聚糖胺聚糖
(任选)↓末端还原(含水溶剂中，碱性条件下还原剂处理)或
↓末端还原氨基化(碳酸氢铵/有机胺及还原剂处理)
端基为相应的氨基己糖醇或糖胺和取代糖胺的低聚糖胺聚糖
方法2.脱酰脱氨基解聚法。所述脱酰脱氨基解聚法包括在有或无硫酸肼存在下，采用肼处理“步骤一”所得多糖组分，使其所含糖胺聚糖类化合物中约10-35%的D-乙酰氨基半乳糖基发生脱乙酰化反应，获得部分脱乙酰化产物；继而以亚硝酸处理所得部分脱乙酰化产物，使之发生脱氨基反应并解聚，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖基的低聚同系糖胺聚糖混合物。
本发明人另一项专利申请(CN201310127447.0)已描述脱酰脱氨基解聚法解聚FGAG的一般步骤。一般来说，“方法2”所述部分脱乙酰化反应是将“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分溶解于无水或含水肼中，所得多糖的肼溶液中，可加入少量硫酸肼或盐酸肼作为反应催化剂，亦可直接加入少量硫酸或盐酸作为反应催化剂，继而在加热(例如60℃～110℃)和搅拌下反应，使多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的脱乙酰化程度达到约10%～35%。所述脱乙酰化反应优选在氮气氛围下进行。所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的脱乙酰化程度可以通过1H NMR波谱检测确认。
脱乙酰化产物的脱氨基解聚反应一般在冰浴至室温条件下进行，即将含有Fuc3S4S取代的糖胺聚糖脱乙酰化产物的多糖组分水溶后，加入亚硝酸溶液使溶液pH至约2～5，或者直接将含有Fuc3S4S取代的糖胺聚糖脱乙酰化产物的多糖组分溶解于pH约2～5的亚硝酸溶液中。一般来说，Fuc3S4S取代的糖胺聚糖脱乙酰化产物的脱氨基解聚反应较为迅速而彻底，反应时间为5～60min即可使反应完全。为避免酸性环境下的侧链岩藻糖脱落，该反应完成后，一般立即加碱性溶液如碳酸钠调pH至约8～9以终止反应。
如前文所述，糙海参和格皮氏海参多糖中，除FGAG外，一般还含有FS和NP类多糖成分。由于部分类型的FS和NP具有近似FGAG的分子量范围，因此海参FGAG提取纯化过程中，采用分级沉淀法尚难完全除去提取物中所含的FS和NP。采用脱酰脱氨基解聚法解聚含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分时，由于FS和NP均不含氨基己糖，在“方法2”所述处理步骤中基本不发生解聚反应，因此按方法2所述步骤处理后，“步骤一”所得多糖组分中，原本与Fuc3S4S取代的糖胺聚糖分子量分布近似的FS和NP的分子量基本不变，而Fuc3S4S取代的糖胺聚糖分子量显著降低，由此基于分子量分布的显著差异，可以容易地通过凝胶层析、超滤和/或透析法将残留于多糖组分中的FS和NP多糖成分除去。
类似地，低聚同系糖胺聚糖可以任选进行羧基还原处理，将D-葡萄糖醛酸基还原成D-葡萄糖基；还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的2,5-脱水塔罗糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。还原低聚同系糖胺聚糖之羧基及还原性端基糖的方法同方法1所述。
本发明“步骤二”所述脱酰脱氨基解聚法制备所需低聚同系糖胺聚糖混合物的步骤可概述如下：
含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的海参多糖提取物
↓肼解(肼，任选以硫酸(肼)或盐酸(肼)作为催化剂)
含部分脱乙酰化的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分
↓脱氨基解聚(含水溶剂中，亚硝酸处理)
↓纯化(凝胶层析、超滤和/或透析)
Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖
(任选)↓末端还原(含水溶剂中，碱性条件下还原剂处理)或
↓末端还原氨基化(碳酸氢铵/有机胺及还原剂处理)
端基为氨基己糖醇或相应的糖胺、取代糖胺的低聚糖胺聚糖
方法3.过氧化解聚法。所述方法包括在Cu2+存在下，采用终浓度3%～10%的H2O2处理“步骤一”所得纯化的糖胺聚糖混合物的水溶液，获得目标分子量范围内的低聚同系糖胺聚糖混合物。
过氧化解聚法的一般步骤可见于本发明人已授权专利(CN101735336B)。鉴于“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分中，除FGAG外，一般还含有分子量分布近似的FS和NP类多糖成分。前述β-消除解聚法及脱酰脱氨基解聚法具有严格的糖苷键选择性，可解聚含有己糖醛酸和氨基己糖的FGAG，而不能解聚FS和NP类多糖。与之不同的是，尽管过氧化解聚法对FGAG、FS及NP的解聚效率也存在差异，但均有一定解聚作用，因此，通过解聚产物的分子量差异有效去除FS和NP类多糖存在一定的困难。一般来说，其产物的纯化仍需进一步进行阴离子交换树脂层析等纯化技术处理。
类似地，低聚同系糖胺聚糖可以任选进行羧基还原处理，将D-葡萄糖醛酸基还原成D-葡萄糖基；还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-半乳糖基转化为其对应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。还原低聚同系糖胺聚糖之羧基及还原性端基糖的方法同方法1所述。
通过方法1～方法3之任一方法制备的本发明所述解聚产物及末端还原处理的解聚产物均任选采用乙醇和/或丙酮沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、透析法和/或超滤法等本领域内熟知的方法进行纯化，并通过减压干燥和/或冷冻干燥法获得低聚Fuc3S4S取代的同系糖胺聚糖混合物的固形物。
显然，“步骤二”所述方法中：“方法1”适合于制备式(VII)所示低聚糖胺聚糖混合物；“方法2”适合于制备式(VIII)所示低聚糖胺聚糖混合物；“方法3”适合于制备式(IX)所示低聚糖胺聚糖混合物。所述式(VII)、式(VIII)及式(IX)所示糖胺聚糖类化合物均在本发明所述式(I)所示低聚Fuc3S4S取代的糖胺聚糖混合物的范围内。一般地，本发明优选采用“步骤二”中的“方法1”或“方法2”制备本发明之低聚Fuc3S4S取代的糖胺聚糖混合物。
为此，本发明进一步提供式(VII)所示本发明所述低聚Fuc3S4S取代的糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法。所述制备方法中，采用前文所述“步骤二”之“方法1”的β-消除法，解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分。且“方法1”所述酯化反应步骤是将步骤一所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖转化为其季铵盐后，在非质子化溶剂系统中与卤代烃或卤代芳烃反应获得酯化程度约10%～50%的糖胺聚糖羧酸酯化物；而其β-消除反应步骤中，其非水溶剂任选自乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2Cl2、CHCl3或者它们的混合溶剂，所述碱性试剂任选自NaOH、KOH、C1-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶或者它们的混合物。通过“方法1”制备的解聚产物任选羧酸酯水解反应，任选进行羧基还原反应，还任选进行末端还原处理，将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-半乳糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。所述解聚产物及末端还原处理的解聚产物均任选采用乙醇和/或丙酮沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、透析法和/或超滤法纯化，并通过减压干燥和/或冷冻干燥法获Fuc3S4S取代的低聚同系糖胺聚糖混合物的固形物。
类似地，本发明还提供式(VIII)所示本发明之Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法。所述制备方法中，采用前文所述“步骤二”之“方法2”的脱酰脱氨基法，解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分。且“方法2”所述肼处理步骤是将所述糖胺聚糖混合物溶解于无水肼或水合肼溶液中，在有或无硫酸肼存在下反应。“方法2”所述亚硝酸处理是在冰浴至室温条件下将部分脱乙酰化产物加入pH2～5亚硝酸溶液中反应5min～60min，调溶液至碱性终止反应。通过“方法2”制备的解聚产物羧基还原反应将葡萄糖醛酸基还原为葡萄糖基；还任选进行末端还原处理，将其还原性末端的2,5-脱水塔罗糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。所述解聚产物及末端还原处理的解聚产物均任选采用乙醇和/或丙酮沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、透析法和/或超滤法纯化，并通过减压干燥和/或冷冻干燥法获Fuc3S4S取代的低聚同系糖胺聚糖混合物的固形物。
本发明人在对一系列各种海参来源的FGAG的进行的比较研究中发现，因为结构上的差异，不同物种来源的FGAG激活f.XII和血小板的活性存在一定差异，其中，糙海参FGAG对f.XII和血小板的激活活性相对较低或最低，但其抗凝活性却较强。本发明研究结果显示，不同海参来源的FGAG抗凝促凝活性差异并非简单和直接地与多糖硫酸酯基含量相关，糙海参来源的FGAG具有特殊和有利的抗凝活性特征，这种与其特殊的硫酸酯基的取代方式相关，特别是与Fuc3S4S为主的侧链硫酸酯基取代形式有关。
在海参来源的系列分子量的FGAG解聚产物的活性比较研究中，本发明人还惊奇发现，与此前报道的重均分子量(Mw)对梅花参FGAG解聚产物的抗凝活性的影响(赵金华等，CN101724086A)相比，Mw对糙海参FGAG解聚产物抗凝活性的影响规律有显著不同：
在Mw约65kD至约6.5kD的范围内，当Mw低至约10kD以下时，梅花参FGAG解聚产物对因子X酶(f.Xase)的抑制活性可随Mw降低而显著降低，在Mw约65～6.5kD范围内，其肝素辅酶II(HCII)依赖的抗凝血酶(f.IIa)活性基本稳定，只是在分子量约10～12kD时略有增强，而后又略有降低。
本发明研究发现，在约65kD至约3.5kD的Mw范围内，糙海参FGAG解聚产物在Mw低至约5～8kD时还可以呈现最强的f.Xase抑制活性，而其HCII依赖的抗f.IIa活性随分子量降低而有所增强，至Mw约5kD时呈现最强活性。
与梅花参FGAG解聚产物类似，糙海参FGAG解聚产物倍增人标准血浆部分凝血活酶时间(APTT)的活性也随Mw降低而减弱，但是，当Mw低于约10kD时，梅花参FGAG解聚产物倍增APTT所需的药物浓度即需达到6μg/ml以上，而当Mw低至约6kD时，糙海参FGAG解聚产物倍增APTT所需的药物浓度仍为6μg/ml以下。
显然，与梅花参等海参来源的FGAG解聚产物相比，糙海参FGAG解聚产物具有更好的抗凝药理药效学特征；或者说，侧链岩藻糖以Fuc3S4S为主的海参来源的FGAG解聚产物具有更好的抗凝药理药效学特征。由于主链结构类型近似，即梅花参和糙海参FGAG主链中的氨基己糖均主要为β-D-GlcNAc4S6S，因此解聚产物的药理学活性特点显然与其特殊的侧链岩藻糖的取代基形式相关。而与糙海参FGAG结构近似、岩藻糖侧链取代基以Fuc3S4S为主要类型的格皮氏海参来源的FGAG解聚产物具有类似糙海参FGAG解聚产物的优势抗凝药理药效学活性特征，由此进一步证明，Fuc3S4S侧链岩藻糖基的结构特征对于FGAG解聚产物的优势抗凝活性特征具有重要影响。
血栓性疾病目前仍然是人类主要的致死性病因，抗凝血药物在血栓性疾病的预防和临床治疗中具有重要作用。目前，肝素和低分子肝素类药物仍然是主要的临床用药，但存在严重出血倾向的缺陷。肝素和低分子肝素类药物的主要抗凝机制是抗凝血酶III(ATIII)依赖的抗凝f.IIa和抗活性因子X(f.Xa)活性。现有资料显示，抑制f.Xase和HCII依赖的抗f.IIa活性机制均有利于降低抗凝活性成分的出血倾向。因此糙海参等海参来源的、侧链Fuc3S4S为主的FGAG解聚产物具有重要的预防和临床治疗血栓性疾病的应用潜力。
为此，本发明提供一种含本发明所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物含有有效抗凝剂量的所述低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐以及药用赋形剂。
本发明所述药物组合物所含生物活性成分为低聚糖类化合物，由于其胃肠道给药的生物利用度有限，一般而言，其合适的系统用药的给药途径适宜选择胃肠外途径，例如静脉内给药、肌肉内注射、皮下注射等。
与系统给药的给药途径相对应的制剂形式可包括注射用水溶液、可临用前配制成水溶液冻干粉针剂等。因此，本发明优选的药物组合物为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
鉴于本发明所述低聚糖胺聚糖混合物一般具有良好的水溶性，其水溶液制备过程中，优选不含助溶剂和/或表面活性剂；可选择的药用赋形剂可包括调节溶液渗透压和/或pH值的无机盐如氯化钠、缓冲盐如磷酸盐等。
对于临用前配制注射液的冻干粉针剂而言，除调节渗透压和pH值的药学上可接受的无机盐和/或缓冲盐外，还可以选择采用甘露糖等有助于制剂成型的药学上可接受的赋形剂。
本发明所述药物组合物中，所述低聚糖胺聚糖混合物的有效抗凝剂量是指单次和或连续用药后可使用药者的内源性凝血活性得到显著而适量的抑制。一般而言，是指能够使用药者的血浆APTT时间延长约0.5～1.5倍。为此，对于单次用药的制剂而言，其单位制剂中的本发明之低聚糖胺聚糖混合物的含量可以在约20mg至约100mg的范围内；而对于静脉滴注等则可根据实际情况适当调整。
鉴于本发明之Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物具有抗凝抗血栓活性，具有临床预防和治疗血栓性疾病的应用价值，本发明还提供所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖衍生物或其药学上可接受的盐在制备血栓性疾病的治疗和/或预防药物中的用途，所述血栓性疾病包括但不限于静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
进一步地，本发明还提供本所述含Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖的药物组合物在制备血栓性疾病的治疗和/或预防药物中的用途，所述血栓性疾病包括但不限于静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
附图说明
图1.含Fuc3S4S取代聚糖胺聚糖的糙海参多糖组分HPGPC谱图，HSG-1、
HSG-2、HSG-3的HPGPC图谱；
图2.Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物dHSG-1的1H/13C NMR谱图，A:1H
NMR谱；B:13C NMR谱；
图3.dHSG-1的1H-1H COSY(上)、ROESY(底)及TOCSY(中)图谱(局部)叠加
图4.Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物dHSG-3的1H/13C NMR谱图，dHSG-3的1H-NMR(A)13C-NMR(DEPT135,B)图谱；
图5.dHSG-3的1H-1H COSY、ROESY及TOCSY谱图(局部)叠加；
图6.不同海参来源的解聚dFGAG的1H-NMR图谱；
图7.不同物种来源FGAG及dFGAG对f.XII活性的影响；
图8.系列分子量HSG及dHSG对f.Xase活性的影响。
具体实施方式：
下文结合附图以特定的具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。
【实施例1】
提取与纯化含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖组分(HSG-1,HSG-1,HSG-3)
1.1材料
原料：糙海参Holothuria scabra干品，市售途径购买。
试剂：木瓜蛋白酶，8×105U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司。NaOH、KCOCH3、H2O2、乙醇等试剂均为市售分析纯试剂。
1.2提取纯化
提取：取干品糙海参1000g，机械切片、粉碎，置圆底烧瓶中，加纯水10L浸泡过夜，水浴升温至50℃后，加入5g木瓜蛋白酶并搅拌混匀，50℃下搅拌酶解6h。随后，加入固体氢氧化钠至浓度约0.5M，60℃下碱解处理2h。其后，6N盐酸调pH值为6～7，水浴冷却至室温，4000rpm×15min离心去沉淀，所得上清液中加乙醇使其终浓度达到70%(v/v)，4℃下静置过夜，离心得沉淀(糙海参粗多糖)。
纯化：所得糙海参粗多糖以2L纯水复溶，4000rpm×15min离心去不溶物，上清液以2N NaOH调pH值约9.5，加H2O2至终浓度约3%(v/v)，50℃下搅拌反应2h脱色。向脱色反应溶液中加醋酸钾至最终浓度约0.5M后，加乙醇使溶液醇终浓度达到约40%(v/v)，室温静置4h，4000rpm×15min离心得沉淀。所得沉淀以1L纯水复溶，向所得溶液加醋酸钾至最终浓度约0.5M后，加乙醇使溶液醇终浓度达到约40%(v/v)，室温静置4h，4000rpm×15min离心得沉淀。所得沉淀以200mL80%乙醇(v/v)洗涤两遍后，减压干燥得含Fuc3S4S取代的 糖胺聚糖的糙海参多糖组分1(HSG-1)约13.26g。
取糙海参多糖组分1(HSG-1)约6.0g，500mL纯水溶解，采用Minipole超滤设备，以100kD超滤包超滤得滤过液，所得滤过液在相同设备上以30kD超滤包超滤，所得截留液冷冻干燥，获得含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖 组分2(HSG-2)约5.33g。
另取糙海参多糖组分1(HSG-1)约4.0g，50mL纯水溶解，上样于DEAE-纤维素层析柱(Φ,5cm,柱床体积400mL)柱，400mL水洗(流速4ml/min)，0.5M～2M NaCl水溶液梯度洗脱，自动收集仪按10ml/流份收集洗脱液，天青溶液异染性检测法监测含酸性粘多糖的流份，合并含得酸性粘多糖的流份经30kD透析膜透析后，冷干得到含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖组分3(HSG-3)约3.25g。
1.3检测分析
(1)高效凝胶色谱(HPGPC)分析：含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖组分HSG-1、HSG-2及HSG-3以纯净水配制成5mg/ml样品溶液；HPGPC分析条件为，Agilent1200高效液相色谱仪；Shodex SB-804HQ(8.0mm ID×300mm)色谱柱，柱温35℃；进样量20μl；流动相为0.1M NaCl溶液，流速0.5ml/min；RID检测器和DAD检测器检测。
糙海参多糖组分HSG-1、HSG-2及HSG-3的HPGPC分析图谱见附图1。由附图1可见：HSG-2仅含保留时间(RT)约19min的多糖组分(主要为FGAG)；除主峰外，HSG-1另含保留时间(RT)约14min色谱峰(主要为FS)和RT约22min色谱峰(主要为肽类成分)；除主峰外，HSG-3中的RT约14min色谱峰和RT约22min色谱峰均较HSG-1有所降低。
(2)分子量检测：HSG-1、HSG-2及HSG-3及系列分子量FGAG对照品(中科院昆明植物研究所制备，HPLC-LALLS法标定)以纯净水配制成10mg/ml样品溶液，检测HPGPC色谱图。
HPGPC检测的色谱条件是，Agilent1200高效液相色谱仪；Shodex SB-804HQ(8.0mm ID×300mm)色谱柱，柱温35℃；进样量20μl；流动相为0.1M NaCl溶液，流速0.5ml/min；RID检测器和DAD检测器检测。
HPGPC检测结果显示，HSG-1、HSG-2及HSG-3的含FGAG的主峰多糖组分的重均分子量(Mw)分别为约63.2kD、63.5kD和64.2kD，数均分子量(Mn)分别为约56.5kD、59.7kD和58.9kD；多分散系数(PDI)分别为约1.12、1.06和1.09。结果表明，HSG-1、HSG-2及HSG-3多糖组分中的FGAG组分(主要色谱峰)呈现良好的均一性。
(3)单糖组成分析：HSG-1、HSG-2及HSG-3的单糖组成检测中，分别采用Elson-Morgon法、间羟联苯法和半胱氨酸苯酚法(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江大学出版社，1999)检测所述多糖组分中的乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖含量。HSG-1、HSG-2及HSG-3的单糖组成检测结果如表1所示。结果显示，三种单糖组分所含己糖醛酸、氨基己糖及岩藻糖的摩尔比均在1:(1±0.3):(1±0.5)的范围内。相对来说，HSG-1中有相对较高的岩藻糖摩尔比，此与其残留较多的FS类多糖(RT～14min)的色谱峰相关；而HSG-2和HSG-3的己糖醛酸、氨基己糖含量均相对较高，此与进一步纯化的效果一致。
如附图1所示，尽管HSG-2基本不含Rt～14min的色谱峰，但其Fuc摩尔含量仍略高于GlcUA和GalNAc，甚至其Fuc相对于GlcUA的摩尔比略高于HSG-3，此与后述发现这些多糖组分中存在分子量分布近似于FGAG的FS一致。
表1.含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖组分的单糖组成分析
【实施例2】
过氧化解聚法解聚糙海参多糖组分制备含Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-1)
2.1材料
HSG-2：实施例1提取纯化的干品糙海参Holothuria scabra来源的含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的多糖组分。Mw,～63.5kD;PDI,～1.06。
试剂：NaCl、CH3COONa、NaOH、H2O2、Cu(CH3COO)2等试剂均为市售分析纯试剂。
2.2制备
取实施例1中HSG-2100.3mg，置于10mL反应试管中，加3mL水溶解，加入87.2mg NaCl使其浓度为0.5M，加入204.1mg三水合乙酸钠使乙酸钠的浓度为0.5M，加入乙酸铜2.4mg使其浓度为4.01nM，加入0.4mL10%的H2O2。反应溶液用0.1M的NaOH调pH至7.5左右，于35℃下进行解聚。每隔40min取样10μL经醇沉水溶后进行HPGPC检测以确定反应终点，解聚3h后终止反应。向反应溶液中加入10mg的乙二胺四乙酸二钠，加入7.5mL无水乙醇，静置离心(3000rpm×15min)，弃上清，所得沉淀加3mL水复溶后，联用OH-型DEAE阴离子交换树脂层析柱和H+型阳离子交换树脂柱纯化，收集含酸性粘多糖的流份，以0.1M的NaOH溶液调至中性，用1kD透析袋透析48h，透析截留液冷冻干燥，获得Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖产物1(dHSG-1)75mg。
2.3检测
方法：HPGPC法检测分子量及分布；Elson-Morgon法检测乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)含量，咔唑法检测葡萄糖醛酸(D-GlcUA)含量，1HNMR甲基峰积分面积法计算D-GalNAc/L-Fuc摩尔比。瑞士Bruker公司AVANCE AV500超导核磁共振仪(500MHz)检测NMR谱图。
结果：HSG-2及其过氧化解聚产物dHSG-1的理化性质及单糖组成检测结果见表1。与HSG-2相比，dHSG-1的Mw显著降低7倍以上。单糖组成检测显示，HSG-2和dHSG-1的氨基己糖、己糖醛酸的组成比例基本保持稳定，脱氧己糖(Fuc)组成比例有所降低，此与FS类杂质含量减少相关。
表2.糙海参来源的HSG-2及dHSG-1的理化参数、单糖组成检测结果
dHSG-1核磁波谱检测的部分图谱见附图2～3。附图2A1H NMR谱图显示5.0-5.7ppm区段内的主要有一个位于5.32ppm处的α-L-Fuc端基信号峰；根据1H-1H COSY相关信号可知其C2、C3、C4位上的质子信号分别位于约3.96、4.53、4.96ppm处；而其C6位甲基信号位于约1.2-1.4ppm，其C5位质子信号位于约4.88ppm处。与未取代Fuc的相应的质子信号相比，因为质子信号较向低场位移达0.6ppm以上，所以判断其C3、C4上存在硫酸酯基取代，显然，dHSG-1所含Fuc主要为α-L-Fuc3S4S。结合附图2～3可以判断，dHSG-1含有少量α-L-Fuc4S和-2S4S。根据1H NMR谱显示的α-L-Fuc端基氢积分比例判断，dHSG-1所含侧链岩藻糖中，Fuc3S4S、Fuc4S、Fuc2S4S所占比例分别为约82%、12%和6%。
13C NMR谱图(附图2B)显示，α-L-Fuc3S4S的端基信号位于约102ppm，甲基信号位于约18.6ppm，其糖环上的其它C信号可由1H-13C HSQC相关信号清楚归属。其中，与未取代Fuc相应位置的C信号相比，C3和C4为C信号峰显著向低场位移，表明这些位置上存在硫酸酯基取代。
β-D-GlcUA端基C信号位于约105.6ppm(附图2B)，HSQC谱显示其端基氢信号位于约4.48ppm，1H-1H COSY谱显示其C2-C5位质子信号分别位于约3.62、3.66、3.94和3.70ppm处。与未取代α-D-GlcUA的相应位置的质子信号相比，C3、C2位上质子信号向低场位移了约0.3-0.5ppm，根据1H-1H ROESY信号(附图3)可知，HSG所含α-L-Fuc3S4S通过α1-3糖苷键连接于β-D-GlcUA。
β-D-GlcUA上的C6信号与β-D-GalNAc的C7信号重叠，糖环上的其它13C信号由1H-13C HSQC谱归属。其C3信号位于约82ppm，较未取代的C3信号向低场位移约3-4ppm，进一步证实该位置存在岩藻糖侧链取代。
结合β-D-GalNAc的端基13C信号(约102ppm,附图2B)及1H-13C HSQC图谱判断端基质子信号位于约4.58ppm，根据1H-1H COSY谱可推断其C2-C5位质子信号分别位于约4.05、3.92、4.79和4.01ppm处，而C6位质子信号位于约4.23和4.31ppm。与未取代β-D-GalNAc的相应质子信号相比，其C4、C6位上的质子信号向低场位移约0.5～0.7ppm，由此判断dHSG-1所含氨基己糖主要为β-D-GalNAc4S6S。β-D-GalNAc乙酰基上特征性的甲基质子信号位于约2.04ppm。
表3.dHSG-1的1H/13CNMR信号归属
根据13C NMR及DEPT135谱图显示的C6位亚甲基峰位于约69.6ppm，其较未取代β-D-GlcUA的C6峰向低场位移约6ppm，进一步证明，其C6存在硫酸酯基取代。β-D-GalNAc中的特征性的C2和C8信号位于约54ppm和约25ppm处，与乙酰氨基半乳糖的结构特征相符。而C3-C5位13C信号可通过1H-13CHSQC图谱逐一归属如表3所示。其C7信号与β-D-GlcUA的C6信号重叠。
综合化学结构解析可知，dHSG-1是一种以α-L-Fuc3S4S侧链取代为主(约82%)的糖胺聚糖衍生物，其基本结构单元如下：
{-4)-[L-Fuc3S4S-(α1-]-3)-D-GlcUA-(β1-3)-D-GalNAc4S6S-(β-}n
根据以上化学结构解析可知，相对于已报道的FGAG类成分而言，dHSG-1的特点在于：(1)侧链岩藻糖基主要为α-L-Fuc3S4S；(2)主链GalNAc存在4,6-二硫酸取代。相对于文献报道的刺参、梅花参、巴西海参来源的FGAG，dHSG-1的侧链取代基类型单一(主要是α-L-Fuc3S4S)，其主链氨基己糖的C6位全部被硫酸酯基取代(主要是β-D-GalNAc4S6S)，因此其化学结构具有更好的均一性。
【实施例3】
脱酰脱氨基解聚法解聚糙海参多糖组分制备含Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-2)
3.1材料
HSG-3：实施例1提取纯化的干品糙海参Holothuria scabra来源的含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的多糖组分。Mw,～64.2kD;PDI,～1.09。
试剂：水合肼、硫酸肼、无水乙醇、硼氢化钠等均为市售分析纯试剂。
3.2制备
(1)部分脱乙酰化产物的制备：取实施例1所述含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的糙海参多糖组分HSG-360mg并置于反应管，加入14.5mg催化剂硫酸肼，然后加入水合肼1.45mL，氮气保护下，250rpm转速下搅拌，70℃下加热反应12hr。反应结束后，向反应液中加入乙醇使乙醇终浓度达到80%(v/v)，3000rpm×15min离心得沉淀。所得沉淀以5ml80%(v/v)乙醇水溶液洗涤3遍，然后以去离子水溶解后用3.5kD透析袋于纯水中透析3d，透析截留液冻干，得HSG-3部分脱乙酰化产物53.0mg。1H NMR检测所得产物的脱乙酰化程度约12%。
(2)脱氨基解聚产物dHSG-2的制备：精确称取步骤(1)所述HSG-3部分脱乙酰化产物40mg于反应烧瓶中，加2mL水溶解，在冰浴条件下，加入5.5M的亚硝酸溶液(pH4)4mL，冰浴条件下反应解聚10min，然后加0.5M NaOH溶液调pH9～10终止反应。
(3)端基还原与产物纯化：步骤(2)所述反应溶液中加入含0.5mol/L硼氢化钠的0.1mol/L氢氧化钠溶液2mL，50℃下加热40min将亚硝酸解聚产物的醛基还原，反应后冷却至室温，滴加0.5M H2SO4除去过量的硼氢化钠，最后用0.5M NaOH溶液中和所得反应溶液，1.0kDa透析袋透析于纯水中24h后，所得透析截留液上G50凝胶色谱柱，异染性检测，分段收集并合并含酸性粘多糖的洗脱液，将所得洗脱溶液冷冻干燥，获得脱氨基解聚产物dHSG-2约38.5mg。
3.3检测
检测方法同实施例2。HPGPC过程监测结果显示，脱酰脱氨基解聚后，所得产物中仍含有少量Mw约60kD的多糖组分(包括FS和中性葡聚糖)，该高分子量组分可以容易地通过G50凝胶色谱层析去除。G50凝胶色谱纯化后的HSG-3的脱氨基解聚产物dHSG-2的Mw约7.83kD，其多分散系数(PDI)为约1.38。
dHSG-2的单糖组成包括GlcUA、GalNAc和Fuc以摩尔比计，三种单糖的组成比例为约1.00:0.89:1.02。比较而言，dHSG-2产物中GalNAc含量较dHSG-1略有降低，此与其1HNMR谱图显示的约2.02ppm处的GalNAc的乙酰基中的甲基信号峰及约1.23～1.36ppm处的Fuc甲基信号峰积分面积比基本一致，也与部分脱乙酰化过程中的脱乙酰化程度基本一致。
1H、13C NMR及其2D相关谱显示，dHSG-2的主要1H、13C信号峰及其2D相关谱显示的主要相关峰均相同或类似于dHSG-1。但是，dHSG-2显示出不同于dHSG-1的归属于2,5-脱水塔罗糖醇基(AnTol)的碳、氢信号。
根据1H-1H COSY谱显示的自旋耦合系统可以容易地归属AnTol的糖环氢，其C1上的两个H信号分别位于约3.68(H1)和3.80ppm(H1’)，C2至C5位上的H信号分别位于约4.13(H2)、4.54(H3)、5.04(H4)和4.51ppm(H5)，而C6上的两个H信号分别位于约4.35(H6)和4.18ppm(H6’)。根据1H-13C HSQC谱图显示的异核相关信号可以容易归属AnTol所属碳信号，其C1至C6信号分别位于约63.8、83.9、78.9、80.4、80.3和约71.0ppm。
与未取代的AnTol相应位置上的碳氢信号相比，dHSG-2末端AnTol的C4和C6位信号均显著向低场区位移，因此判断其存在4,6-二硫酸酯基取代，即所述末端AnTol基为AnTol4S6S，此与dHSG-1的主链含β-D-GalNAc4S6S结构一致，同时也说明在脱酰脱氨基反应过程中硫酸酯基基本不受影响。
根据1H NMR谱显示的α-L-Fuc端基氢积分比例判断，dHSG-2所含侧链岩藻糖也包括Fuc3S4S、Fuc4S、Fuc2S4S，其中Fuc3S4S所占比例为约83%。
此外，本发明平行制备的末端(2,5-脱水塔罗糖,AnTal)未还原的脱酰脱氨基解聚产物的NMR谱图检测发现，其末端AnTal的C1位羰基易于结合一分子水形成二醇(-diol)式水合物结构。
【实施例4】
β-消除解聚法解聚糙海参多糖组分制备Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-3)
4.1材料
HSG-1：实施例1提取纯化的干品糙海参Holothuria scabra来源的含Fuc3S4S取代糖胺聚糖的多糖组分；Mw,～63.2kD；PDI,1.09。
试剂：苄索氯铵、氯化苄、无水乙醇、硫酸、氢氧化钠、金属钠等均为市售分析纯试剂。
4.2制备
(1)HSG季铵盐的制备：取HSG-1样品200.4mg，溶于8mL去离子水中，另取苄索氯铵500mg，溶于8mL去离子水中，用苄索氯铵溶液滴入HSG-1溶液中且不断振荡，溶液出现白色沉淀，4000rpm×20min离心取沉淀。沉淀用100mL水振荡洗涤三次。所得沉淀于真空干燥箱内常温减压干燥24hr，得到HSG-1季铵盐490mg。
(2)HSG-1季铵盐的羧基部分苄酯化产物制备：取步骤(1)所得490mgHSG-1季铵盐置于50mL圆底烧瓶中，加入二甲基甲酰胺(DMF)13.2mL。待样品溶解后，加入氯化苄6.6mL，35℃下、500r/min搅拌中密闭反应2hr。反应结束后加饱和NaCl20mL、无水乙醇160mL。反应溶液经离心(4000rpm×15min)，沉淀以氯化钠饱和的80%乙醇洗涤三次。所得沉淀以10mL去离子水溶解，用截留分子量为3.5kD的透析袋进行透析(自来水透析12hr，去离子水透析36hr)。减压浓缩透析截留液至5mL，取少量冻干，检测其1HNMR谱图。1H NMR谱图检测结果显示其羧基酯化程度为26.9%。其余透析浓缩液经阳离子交换树脂(H+型，45cm×5cm柱床)交换成氢型，收集含酸性粘多糖的洗脱流份，在电导率仪监控下，用0.4M四丁基氢氧化铵将洗脱液滴定至pH为8，然后将所得溶液冻干，获得HSG-1部分苄酯化产物的TBA型季铵盐245.5mg。
(3)β-消除法解聚：将步骤(2)所得245.5mg羧基苄酯化产物的TBA型季铵盐置于50mL圆底烧瓶中，加DMF4.9mL以及临用前配制的0.04M EtONa/EtOH4.9mL，在25℃和氮气保护下，以500r/min转速搅拌反应4hr。反应结束后，向反应溶液中顺次加入饱和NaCl溶液9.8mL、无水乙醇至100mL，4000rpm×15min离心，所得沉淀即为部分苄酯化的HSG-1的β消除解聚产物 (dHSG-3-0)。
(4)去苄基：向步骤(3)所得沉淀dHSG-3-0中加10mL0.1M NaOH使之完全溶解，于35℃下碱解1h后，1M HCl调溶液pH至中性，加无水乙醇至醇浓度约80%(v/v)，4000rpm×15min离心取沉淀。所得沉淀加纯水溶解后，使用截留分子量为30kDa的超滤离心管超滤(研究显示，此超滤步骤可以有效除去不能被β-消除法解聚的多糖类成分，包括与糙海参原型FGAG分子量分布接近或重叠的岩藻聚糖FS及中性多糖NP)，将所得分子量小于30kDa的滤过液转移至1kD的透析袋中，用去离子水透析36 hr。将所得透析截留液冷冻干燥，获得Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物产物(dHSG-3)约114mg。
4.3检测
dHSG-3的理化性质检测及波谱分析方法同实施例2。
HSG-1及其解聚产物dHSG-3理化性质及单糖组成检测结果见表4。检测结果显示，与HSG-1相比，dHSG-3的分子量显著降低。单糖组成检测结果显示，与HSG-1相比，以相对于GlcUA的摩尔比计，GalNAc组成比例有所提高，而Fuc的组成比例则有所降低，前者与部分GlcUA发生β-消除反应相关，后者则与HSG-1多糖组分中的FS杂质成分被进一步去除相关，而dHSG-3所含组成单糖GalNAc与Fuc的摩尔比与1H NMR显示的两种糖基所含甲基信号峰的积分比例一致。
表4.糙海参来源的HSG-1及dHSG-3的理化参数、单糖组成检测结果
UV分光光度计在190nm～400nm波长范围内扫描，dHSG-3存在最大紫外吸收λmax232nm，其与ΔUA不饱和键的存在相符。
NMR谱图检测结果显示，与化合物dHSG-1谱图相比，dHSG-3的1H NMR的谱图中在约5.76和5.82ppm出现了新的信号峰，根据其1H NMR相关谱可以将这些信号归属为β-D-GlcUA的β-消除产物4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸-1-基(ΔUA)的4位H特征信号(表5，附图4)。
dHSG-3的1H-1HCOSY谱和TOCSY谱清楚显示ΔUA的H4、H3、H2和H1质子信号间的耦合相关(附图5)。ROESY谱显示，L-Fuc侧链以α(1-3)糖苷键连接于β-D-GlcUA或ΔUA(附图5)。与连接β-D-GlcUA的L-Fuc的端基氢信号相比，连接于ΔUA的同类型Fuc端基氢信号明显出现在较低场处(附图4)。
13C-NMR谱中，β-D-GlcUA与β-D-GalNAc的C1峰出现在约97～104ppm，而ΔUA的C1峰出现在约103.5ppm，其C4的化学位移为106.8ppm，C5的化学位移约为148.5ppm(附图4)。
表5.化合物dHSG-3的1H/13C NMR信号归属(δ[ppm])
综合氢谱、碳谱及其相关谱，dHSG-3主要组成单糖中，D-GlcUA与D-GalNAc通过β(1→3)和β(1→4)糖苷键交互连接组成聚糖主链，并由此形成主链二糖结构单元。根据GlcUA的H2、H3化学位移并结合1H-1H ROESY、1H-13C HMBC可以判断，L-Fuc以α(1→3)糖苷键连接于β-D-GlcUA，且侧链L-Fuc的类型主要为L-Fuc3S4S。显然，dHSG-3中，非还原端的己糖醛酸主要为ΔUA。
根据1H NMR谱显示的α-L-Fuc端基氢积分比例判断，dHSG-3所含侧链岩藻糖包括α-L-Fuc3S4S、α-L-Fuc4S、α-L-Fuc2S4S等结构类型，其主要类型为α-L-Fuc3S4S。以摩尔比计，α-L-Fuc3S4S约占全部岩藻糖基的约82%。
【实施例5】
Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-3)的羧基还原与还原性末端羰基的还原氨基化
5.1材料
dHSG-3：实施例4所得含Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物。
试剂：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、盐酸酪胺、氰基硼氢化钠、硼氢化钠、HCl、NaCl等均为市售分析纯试剂。
5.2制备
(1)羧基还原衍生物制备：取30mgdHSG-3溶解于5ml纯水，0.1N HCl调pH至4.75。5min内加入90mgEDC后，以0.1N HCl调pH保持4.75。搅拌中缓慢加入360mgNaBH4，反应溶液在50℃下水浴2h。滴加少量乙酸去除过量NaBH4，去离子水中，3.5kD透析袋透析，透析截留液经冷冻干燥到羧基还原的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-3a)约24.6mg(得率78.3%)。
(2)末端还原氨基化衍生物制备：取dHSG-330mg溶解于2.5ml0.2mM磷酸缓冲液(PBS,pH8.0)中，搅拌中顺次加入盐酸酪胺24mg和氰基硼氢化钠9mg，35℃恒温水浴孵育5d后，加95%乙醇7.5ml，离心(3000rpm×15min)，所得沉淀以95%乙醇3ml洗涤两遍，减压挥干乙醇。所得沉淀以2ml0.1%NaCl复溶，3000rpm×15min离心去不溶物，上清液转移至3.5kD透析袋，去离子水(100ml×3)透析36h，透析截留液经冷冻干燥到末端还原氨基化的Fuc3S4S 取代的低聚糖胺聚糖混合物(dHSG-3b)约20.5mg(得率68%)。
5.3检测
(1)dHSG-3a检测：参考文献(Carbohydr.Res.,1978,63:13-27)采用液体池检测法检测dHSG-3a的IR光谱；电导率滴定法检测-OSO3 -/-COO-摩尔比(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江大学出版社，1999,409-410)。结果显示，dHSG-3a的液体池IR谱图中未见β-D-GlcUA的羰基信号，提示β-D-GlcUA已被还原为β-D-Glc；电导率法检测结果显示，电导率滴定曲线只存在一个拐点，此拐点源于硫酸酯基，由于没有羧基所致电导率变化的曲线拐点，说明dHSG-3中β-D-GlcUA上的羧基已被还原。
(2)dHSG-3b检测：同实施例1方法检测dHSG-3b单糖组成及核磁波谱，结果显示，dHSG-3b单糖组成中D-GalNAc:D-GlcUA:L-Fuc的摩尔比为约1.00:1.02:1.11此与dHSG-3b结构单元的理论计算结果基本一致；1HNMR(D2O,δ[ppm]):7.25(2’,6’H);6.91(3’,5’H);5.74(ΔUA,4H),5.32,5.25(L-Fucα1H);3.38(8’H);2.82(7’H);2.02(D-GalNAc,CH3)；1.26～1.36(L-Fuc,CH3)。L-Fuc甲基氢与苯环氢积分比约11，表明所得产物还原性末端均被还原酪氨化。
【实施例6】
侧链Fuc硫酸酯化形式不同的天然FGAG及其解聚产物的抗凝活性比较
6.1材料
(1)FGAGs：AJG、TAG、IBG、LGG、HSG及PGG，采用实施例1所述HSG-2的制备方法从市售干品仿刺参(Apostichopus japonicus)、梅花参(Thelenota ananas)、南美产海参Isostichopus badionotus、巴西产海参Ludwigothurea grisea、糙海参(Holothuria scabra)及格皮氏海参(Pearsonothuriagraeffei)提取制备。
(2)dFGAGs：dAJG、dTAG、dIBG、dLGG、dHSG及dPGG，采用类似于实施例2述dHSG-1的制备方法，以AJG、TAG、IBG、LGG、HSG及PGG为起始原料采用过氧化解聚法解聚并纯化制备。
(3)试剂及仪器：人质控血浆、活化部分凝血时间(APTT)试剂盒、凝血酶原时间(PT)试剂盒均为Teco Medical(德)产品；低分子量肝素(LMWH),依诺肝素钠)，Sanafi Aventis公司(法)产品；前激肽释放酶(PK)、激肽释放酶底物、凝血酶(IIa)100NIHU/mg、凝血酶生色底物(CS-0138)25mg/vial、肝素辅因子II(HC-II)100μg/vial、f.VIII检测试剂盒均为HYPHEN BioMed公司(法)产品；因子VIII(f.VIII)200IU/支，上海莱士血液制品公司产品；硫酸皮肤素(DS)，Sigma公司(美)产品，过硫酸软骨素(OSCS)，Serva Electro-phoresis GmbH公司(德)产品；酶标仪，Bio Tek公司(美)产品；Chronolog-700型血小板聚集仪(美)。
6.2方法
(1)抗凝活性检测：将所述FGAGs、dFGAGs样品及对照品用生理盐水溶解配制成系列浓度，采用质控血浆、检测试剂盒及MC-4000血凝仪，按照试剂盒说明书方法检测样品溶液对人质控血浆APTT、PT时间的影响。
(2)内源性因子X酶(f.Xase)抑制活性检测：系列浓度的FGAGs及dFGAGs溶液30μL与30μL f.VIII(2IU/mL)混合后，按照f.VIII检测试剂盒说明书方法顺次加入f.IXa试剂、f.Xa试剂及f.Xa底物(SXa-11)后检测OD405nm。文献(Blood,2006,107:3876-3882)方法计算各样品抑制f.Xase的EC50值。
(3)HCII依赖的抗凝血酶(f.IIa)活性检测：96孔板中分别加入系列浓度样品溶液，然后顺次加入30μLHC-II(1μM)、f.IIa(10U/mL)及CS-0138(4.5mM,生色底物)，37℃孵育2min，检测OD405nm并计算各样品抑制IIa的EC50值。
(4)f.XII激活活性检测：96孔板中分别加入系列浓度的样品及对照品溶液30μL，然后顺次加入30μL f.XII(25μg/mL)，30μL PK(620nM)及30μL显色底物，37℃孵育1min，检测OD405nm。
(5)血小板激活活性检测：采集健康志愿者抗凝血制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，使用Chronolog-700型血小板聚集仪,以比浊法检测生理盐水溶解配制的系列浓度所述FGAG、dFGAG样品溶液的血小板诱导聚集活性。
6.3结果
(1)抗凝活性：所述FGAGs、dFGAGs及对照品抗凝活性如表6所示。
不同物种来源的FGAG及dFGAGs所含岩藻糖侧链的不同硫酸酯化形式及其组成比例根据dFGAGs的1H NMR谱图积分计算(附图6)。由表6所示数据可见，原型FGAGs倍增人质控血浆APTT所需药物浓度约2.2～3.3μg/ml，不同FGAG影响APTT的活性差异不大；解聚后的dFGAG活性差异有所增加，其中主要含Fuc2S4S侧链的dIBG活性最强，dHSG与之接近，dLGG活性最弱。
几种FGAGs抑制f.Xase的IC50值在约12.2～19.4ng/ml之间，其相互之间的活性强度差异也不大；解聚后，除dAJG和dLGG活性较原型物有所减弱外，其它dFGAGs活性均较原型物有所增强，而这些dFGAGs抑制f.Xase的活性强度差异增大，其中，dIBG活性最强，而dHSG的活性相对较强，dLGG活性最弱。
几种FGAGs中，其依赖HCII的抗f.IIa活性的IC50值在约300～400ng/ml之间；解聚后，几种dFGAGs活性均较原型物有所增强，IC50值在约130～250ng/ml之间，相对而言，HSG和dHSG的活性最强，而IBG和dIBG活性最弱。
显然，PGG/dPGG与HSG/dHSG的L-Fuc硫酸酯化特征近似；与此相应的是，其抗凝活性及凝血因子活性抑制的活性强度也基本一致。
表6.FGAGs及其解聚产物dFGAGs的抗凝活性
a,摩尔百分比或摩尔比；b,使APTT延长一倍所需的药物浓度；c,以EC50计；
(2)f.XII激活活性检测：不同物种来源的FGAGs及其解聚产物dFGAGs对f.XII的激活活性见附图7所示。与其它FGAG相比，侧链岩藻糖以Fuc3S4S为主的HSG与PGG对f.XII的激活活性明显较弱，其相应的解聚产物也具有类似的特性。相对而言，HSG主侧链上的硫酸酯基含量均高于LGG，而略高于TAG，接近AJG，略低于IBG，而其f.XII激活活性均明显较低，说明FGAG类成分对f.XII的激活作用并不只是取决于其负电荷载量，而与侧链硫酸酯化的类型相关。
(3)血小板激活活性检测：FGAGs和dFGAGs对血小板活性的影响见表7。
表7.FGAGs及其解聚产物dFGAGs健康志愿者血小板聚集的影响(n=3)
由表7所示结果可见，侧链岩藻糖以Fuc3S4S为主的HSG与PGG对健康志愿者血小板的激活活性也明显较弱，其相应的解聚产物也具有类似的特征。相对于其它几种dFGAG，dIBG血小板激活活性最强，而负电荷载量较低的dLGG仍具有一定的血小板激活活性。结果表明，FGAG及dFGAG的血小板激活活性同样与侧链岩藻糖的硫酸酯化形式相关。
本实施例实验结果显示，侧链岩藻糖以Fuc3S4S为主的FGAG类成分具有更为优势的抗凝抗血栓活性特征，其具有强效f.Xase抑制活性和HCII依赖的抗f.IIa活性的强效抗凝活性，而没有对f.XII及血小板的激活活性或活性较弱。
【实施例7】
不同解聚方法所得dHSG产物的抗凝活性比较
7.1材料
(1)Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物样品：
HSG-2(Mw63.5kD,PDI1.06),实施例2所得样品；
dHSG-4(Mw10.9kD,PDI1.35)，过氧化解聚法制备；
dHSG-5(Mw7.5kD,PDI1.28)，脱氨基解聚法制备(末端还原)；
dHSG-6(Mw8.4kD,PDI1.33)，β-消除解聚法制备(末端酪胺还原氨基化)。
(2)试剂及仪器：同实施例6。
7.2方法同实施例6。
7.3结果dHSG-4～-6的抗凝活性见表8。
表8.HSG及其解聚产物的抗凝血活性
a同表6标注；b药物浓度16μg/mL的凝血时间(对照组PT、TT值为14.0s和13.6s)；
结果显示，不同方法解聚HSG所得产物均具有强效抗凝、抑制f.Xase及依赖HCII的抗凝血酶活性。其中，抗凝活性主要表现为抑制内源性凝血(显著延长APTT)，基本不影响外源性凝血(不延长PT)，原型HSG-2对凝血共同途径影响较大(延长TT，HSG-2具有ATIII依赖的抗凝血酶活性)，而解聚样品则对TT影响较弱。
【实施例8】
不同分子量的dHSGs的抗凝活性
8.1材料
(1)样品：
HSG-a，Mw63.6kD，类似实施例1所述HSG-2制备方法由市售干品糙海参经提取纯化制备，并经离子交换柱层析进一步纯化和被转化为Na+盐。
dHSG-1a，Mw49.0kD；dHSG-2a，Mw27.8kD；dHSG-3a：Mw14.9kD；dHSG-4a：Mw8.24kD；dHSG-5a：Mw5.30kD；dHSG-6a：Mw3.12kD。dHSG-1a～-6a均为HSG-a解聚产物，解聚方法类似实施例1所述β-消除法解聚制备，且其还原性末端均被还原成糖醇基。
(2)试剂及仪器：同实施例6。
8.2方法同实施例6。
8.3结果dHSG-1a～-6a的抗凝活性见表9和附图8。
表9.HSG及其解聚产物的抗凝血活性
a同表6标注；
由表9可见，HSG及其解聚产物在60kD～3kD范围内，以质量浓度计，其解聚产物的f.Xase抑制活性及HCII依赖的抗凝血酶活性均呈现随分子量降低而逐渐增强而后又有所减弱的现象，其f.Xase抑制活性在Mw约8kD时最强，而其HCII依赖的抗凝血酶活性在Mw低至约5kD时最强。
此前，关于TAG解聚产物抗凝活性与分子量相关性的研究中已发现，TAG解聚产物在Mw低于约10～12kD时，其f.Xase抑制活性即逐渐减弱，而其HCII依赖的抗凝血酶活性在Mw约8kD时基本近似，其后逐渐减弱。显然，从分子量-抗凝活性的相关性可见，较低分子量的HSG解聚产物的抗凝活性优势特点更为显著。
从多糖类化合物的理化性质、药理学活性及安全性角度考虑，适宜的HSG以及结构近似的侧链岩藻糖基以Fuc3S4S为主的FGAG解聚产物的重均分子量范围可在约3kD～10kD之间；而更适宜的重均分子量可选择在约4.5kD～9kD之间。
【实施例9】
低分子量岩藻糖化糖胺聚糖冻干粉针的制备：
9.1材料
dHSG：类似实施例4和5所述dHSG-3a制备方法制备，Mw～5.5kDa，PDI～1.20。
9.2处方
9.3制备工艺
称取处方量的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖钠盐加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.6％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。测中间体含量。合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；分装于管制西林瓶中，每瓶0.5mL，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，包装得成品。
冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持8h，真空保持200～300μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
Claims (15)
1.一种Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，所述Fuc3S4S是指3,4-二硫酸酯化-L-岩藻糖-1-基，所述取代的低聚糖胺聚糖混合物是具有式(I)所示结构的低聚同系糖胺聚糖类化合物的混合物，
式(I)中：
A环为β-D-葡萄糖醛酸基或β-D-葡萄糖基，其中，R1为-COO-、-CH2OH、–COR10，其R10为相互独立的直链或支链的取代或未取代的C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基；
B环为β-D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖基，其中，R2为-COCH3或-H；R3和R4为相互独立的-H或-SO3 -；
C环α-L-岩藻糖基，其中，R5、R6和R7是相互独立的-H或-SO3 -，并且以摩尔比计，R5为-H、R6和R7为-SO3 -的α-L-岩藻糖基，即3,4-二硫酸酯化-L-岩藻糖-1-基，占全部α-L-岩藻糖基的比例不低于75%；
R8是式(II)或式(III)所示结构：
式(II)和式(III)中：
A环为β-D-葡萄糖醛酸基或β-D-葡萄糖基，A’环为4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基，式中的R1同前文定义；
C环为α-L-岩藻糖基，其中，R5、R6和R7同前文定义；
R9是式(IV)、式(V)或式(VI)所示结构：
式(IV)、(V)和(VI)中，
B环为取代的α或β-D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖基，B’为取代的2-氨基-2-脱氧-半乳糖醇、糖胺或N取代的糖胺，B”为取代的2,5-脱水塔罗糖基或其糖醇、糖胺或N取代的糖胺，其中，R3和R4同前文定义；R11为羟基、氨基、C1-C6烷基氨基、C7-C12芳基氨基；R12为羰基、羟基、双羟基、氨基、C1-C6烷基氨基、C7-C12芳基氨基；
当R8为式(III)所示结构时，R9具有式(IV)或式(V)所示结构；当R9为式(VI)所示结构时，R8具有式(II)所示结构；
n为2～20的整数；以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD，且所述低聚糖混合物的多分散系数(PDI)值小于或等于1.6。
2.如权利要求1所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(VII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(VII)中：
化学结构片段A、A’、B、B’、C同权利要求1所述定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R11均同权利要求1所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(VII)化合物中，L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部α-L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD。
3.如权利要求1所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(VIII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(VIII)中：
化学结构片段A、B、B”、C同权利要求1所述定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R12均同权利要求1所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(VIII)化合物中，L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部α-L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD。
4.如权利要求1所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(IX)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
式(IX)中：
化学结构片段A、B、B’、C同权利要求1所述定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R11均同权利要求1所述定义；
n为3～15的整数，以摩尔比计，n为4～9的化合物占全部化合物的比例不低于75%；
以摩尔比计，式(XI)化合物中，L-岩藻糖-3,4-二硫酸酯基，即α-L-Fuc3S4S基团，占全部α-L-岩藻糖基的比例不低于75%；
且所述低聚同系糖胺聚糖混合物的重均分子量(Mw)范围是4.5～9kD。
5.如权利要求1～4之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述低聚糖胺聚糖混合物由海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖经化学解聚制备而得，其中，所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖具有如下特征：单糖组成包括摩尔比在1:(1±0.3):(1±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；以摩尔比计，其所含α-L-岩藻糖基中，3,4-二硫酸酯化-α-L-岩藻糖基所占比例不低于75%。
6.如权利要求5所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖从新鲜或干燥的糙海参Holothuria scabra或格皮氏海参Pearsonothuriagraeffei体壁和或内脏经提取纯化获得。
7.如权利要求1～6之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的药学上可接受的盐是Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物的钠盐、钾盐或钙盐。
8.权利要求1～7之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：从新鲜或干燥的糙海参H.scabra或格皮氏海参P.graeffei中提取、纯化获得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分；
所述含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分是指多糖组分具有均一性分子量，即主要组分在凝胶色谱柱上呈单一多糖色谱峰，且多分散系数(PDI)在1～1.5之间；以质量百分比计，Fuc3S4S取代的糖胺聚糖在多糖组分中的含量不低于80%；
所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖是指一种岩藻糖化糖胺聚糖，其组成单糖包括摩尔比在1:(1±0.3):(1±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；并且，以摩尔比计，其所含α-L-岩藻糖基中，3,4-二硫酸酯化-α-L-岩藻糖基所占比例不低于75%；
步骤二：将“步骤一”所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖解聚至重均分子量(Mw)4.5kD～9kD的低聚同系糖胺聚糖混合物，所述解聚方法任选自：
方法1、β-消除解聚法，所述方法包括通过季铵盐化和酯化反应将“步骤一”所得多糖组分中的糖胺聚糖中的10%～50%己糖醛酸转化为己糖醛酸羧酸酯；继而在非水溶剂中，碱处理所得糖胺聚糖羧酸酯，使之发生β-消除反应，由此获得目标分子量范围内的、非还原端为4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基的解聚产物；
方法2、脱酰脱氨基解聚法，所述方法包括在有或无硫酸肼存在下，肼处理“步骤一”所得多糖组分，使其所含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖中的10%～35%的D-乙酰氨基半乳糖发生脱乙酰化反应，继而以亚硝酸处理所得部分脱乙酰化产物，使发生脱氨基反应并解聚，获得目标分子量范围内的、还原性末端为2,5-脱水塔罗糖基的低聚同系糖胺聚糖混合物；
方法3、过氧化解聚法，所述方法包括在铜离子存在下，采用终浓度3%～10%的H2O2处理“步骤一”所得多糖组分，获得目标分子量范围内的低聚同系糖胺聚糖混合物；
通过方法1～3之任一方法制备的解聚产物均任选进行羧基还原反应和/或末端还原处理，将己糖醛酸还原成相应的己糖和/或将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-半乳糖基和/或2,5-脱水塔罗糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。所述解聚产物及羧基和/或末端还原的解聚产物均任选采用沉淀法、离子交换层析、凝胶过滤层析、透析法和/或超滤法纯化，并通过减压干燥和/或冷冻干燥法获得Fuc3S4S取代的低聚同系糖胺聚糖混合物的固形物。
9.权利要求8所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，采用“步骤二”所述“方法1”的β-消除法解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分，其所述酯化反应步骤是将“步骤一”所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖转化为其季铵盐后，在非质子化溶剂系统中与卤代烃或卤代芳烃反应获得酯化程度约10%～50%的所述糖胺聚糖的羧酸酯化产物；其“β-消除反应”步骤中，所述非水溶剂任选自乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2Cl2、CHCl3或者它们的混合溶剂，所述碱性试剂任选自NaOH、KOH、C1-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶或者它们的混合物。
10.权利要求8所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，采用“步骤二”所述“方法2”的脱酰脱氨基法解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分，“方法2”所述肼处理步骤是将所述糖胺聚糖混合物溶解于无水肼或水合肼溶液中，在有或无硫酸肼存在下反应；所述亚硝酸处理是在冰浴至室温条件下将部分脱乙酰化产物加入pH2～5亚硝酸溶液中反应5min～60min，调溶液至碱性终止反应。
11.一种含有权利要求1至7之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有有效抗凝血剂量的所述低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐以及药用赋形剂。
12.权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
13.权利要求11和12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物所含的药用辅料为药学上可接受的氯化钠、磷酸缓冲盐。
14.权利要求1至7之任一项所述的低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐在制备血栓性疾病的治疗或预防药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
15.权利要求11至13之任一项所述的药物组合物在制备血栓性疾病的治疗或预防药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
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