CN115386013A - 一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有强效抗凝活性的海带多糖，所述海带多糖0.6MNaCl洗脱组分峰值分子量(Mp)为130±10kDa，易溶于水，不溶于有机溶剂，其中，岩藻糖含量为10％～40％、硫酸酯基含量为5％～30％，蛋白质含量<1％，硫酸羧酸摩尔比为1.5～4.5。本发明采用上述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用，所得海带多糖具有强效的因子X酶抑制活性，与低分子量肝素活性相当，有望开发为新型的预防或治疗血栓性疾病的抗凝药物及功能性食品。

Description

一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品及医药技术领域，尤其是涉及一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用。
背景技术
血栓性疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一。预防和治疗这些疾病的主要手段是采用抗凝剂等药物治疗。未分级肝素和低分子肝素是目前临床广泛应用的抗凝药物，但其具有严重出血倾向及肝素引起的血小板减少等副作用。此外，由于它们主要是由牛或猪的粘膜组织制备的，因此也有被朊病毒等病毒污染的风险。这些问题激起了学者们从非动物组织来源探索肝素替代品的兴趣，如从植物组织中提取硫酸化多糖。一系列研究表明，抑制内源性凝血途径中的凝血因子如FIXa、FXase、FXIa、FXIIa等可以有效防止血栓形成；正在研发的内源性凝血因子抑制剂均表现出低出血风险的优良特征。
内源性因子X酶是由因子VIIIa(FVIIIa)、因子IXa(FIXa)、Ca2+和磷脂形成的酶复合物，是内源性凝血途径的限速酶复合物。从海参中提取的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖及其寡糖可作为一种新型抗凝剂，对因子X酶有强效的选择性抑制作用，且未见副作用，目前正处于临床研究阶段。
海带(Laminaria japonica)属于海带科(Laminariaceae)，是著名的海产品和传统药材，具有非常高的保健和药用价值。海带广泛分布在许多沿海国家，如中国和日本，并有广泛栽培，中国每年可收获海带数百万吨。大量研究表明，海带含有丰富的营养物质和生物活性分子，如蛋白质、多肽、脂类、维生素、多糖等，可治疗一些慢性疾病，如代谢综合征、糖尿病、肥胖、心血管疾病等。多糖作为海带主要活性成分之一，因具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血脂和抗凝血等多种生物活性而备受关注。众所周知，多糖的理化性质，如链长、单糖组成、电荷数、高级结构等与多糖的各种生物活性密切相关。然而，由于海带中含有不同结构组成的多糖，不同方法提取分离的海带多糖单糖组成等结构组成存在明显差异。
现有技术中，大多采用酶法、酸水解等方法从海带中获得硫酸化岩藻聚糖，体内外评价其抗凝血活性，即检测其对人血浆凝血时间如活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及凝血酶时间(TT)的影响，但基于抗凝血作用靶点如凝血因子等的海带多糖纯化组分研究不深入。
目前，中国专利(CN 103232552 B)公开了一种酶法制备褐藻岩藻聚糖的方法。而中国专利(CN 112592415 B)从昆布中提取并用柱层析收集0.2M NaCl洗脱组分制备了一种用于抗新冠病毒的聚甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的多糖。中国专利(CN 102603909 B)采用热水提取海带多糖，再用DEAE阴离子交换柱纯化海带多糖，弃去0.6M氯化钠洗脱组分，收集1.0M氯化钠洗脱组分，用于制备抗氧化抗肿瘤药物。中国专利(CN 102690367 B)采用超声提取法提取海带多糖用于制备抗动脉粥样硬化的药物。另外，中国专利(CN 105147743 B)提取分离海带多糖，用于制备抗EV71药物。
由此可知，不同制备方法制备得到的海带多糖结构组成不同，其功效应用也多种多样。即采用不同的提取及分离方法可得到不同种类及具有不同结构特征的海带多糖及其纯化组分。目前为止，鲜见海带多糖纯化组分作为因子X酶抑制剂治疗血栓性疾病的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用，得到的海带多糖具有强效的因子X酶抑制活性，与低分子量肝素活性相当，在制备预防或治疗血栓性心血管疾病相关药物及功能性食品中具有应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了一种具有强效抗凝活性的海带多糖，所述海带多糖0.6M NaCl洗脱组分峰值分子量(Mp)为130±10kDa，易溶于水，不溶于有机溶剂，其中，岩藻糖含量为10％～40％、硫酸酯基含量为5％～30％，蛋白质含量<1％，硫酸羧酸摩尔比为1.5～4.5。
优选的，海带多糖的硫酸羧酸摩尔比为2.5～3.5，海带多糖的峰值分子量为125～135kDa。
优选的，海带多糖中岩藻糖含量为12％～30％、硫酸基含量为5％～15％，蛋白质含量<1％。
优选的，海带多糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、岩藻糖，其摩尔百分比分别为10％～30％、30％～50％、5％～20％、1％～8％、10％～30％。
优选的，海带多糖的单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、岩藻糖，摩尔百分比分别为15％～25％、35％～45％、8％～15％、1％～5％、15％～25％。
优选的，海带多糖显著延长人标准血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，并能够显著抑制内源性因子X酶活性，抑制内源性因子X酶活性的EC50为10～50ng/mL，与低分子量肝素活性相当，从而表现出强效的抗凝血抗血栓活性。
一种具有强效抗凝活性的海带多糖的制备方法，步骤如下：
S1、提取：取干燥的海带，粉碎，按料液质量体积比为1:20～1:40加蒸馏水提取；提取液调pH值至2.5～3.5，4℃静置4～8h，离心得上清液；上清液过大孔树脂脱色，收集多糖溶液，采用截留分子量为3000～10000Da的透析袋或超滤膜除去小分子杂质，最后浓缩、冻干得到海带总多糖；
S2、分离：将海带总多糖溶解于适量的超纯水，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离，洗脱后，苯酚硫酸法检测490nm吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集0.6M NaCl水溶液洗脱组分，透析、浓缩、冻干，制得海带多糖0.6M NaCl洗脱组分。
优选的，步骤S1中，取海带过60目的干粉，沸水提取2～3h，料液比为1:20～1:30；提取次数2～3次，离心、合并海带多糖提取液。
优选的，步骤S2中，不同浓度的NaCl水溶液洗脱，海带总多糖上样后可分别用超纯水、0.4、0.6、0.8M NaCl水溶液洗脱，收集0.6M NaCl组分，透析、浓缩、冻干，最终制得海带多糖0.6M NaCl洗脱组分。
一种具有强效抗凝活性的海带多糖作为新型内源性因子X酶抑制剂在制备抗凝血抗血栓药物、食品添加剂或功能性食品中的应用。
优选的，所述海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的红外光谱包括以下伸缩振动峰：3446±20cm-1、2938±10cm-1、1731±20cm-1、1623±20cm-1、1429±10cm-1、1259±10cm-1、1054±20cm-1、852±20cm-1、581±10cm-1。
优选的，所述海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的1H NMR谱包括以下信号峰：5.54±0.03ppm、5.38±0.03ppm、5.25±0.03ppm、5.19±0.03ppm、5.08±0.03ppm、5.04±0.03ppm、4.92±0.03ppm、4.66±0.03ppm、4.59±0.03ppm、4.42±0.03ppm、4.19±0.03ppm、4.07±0.03ppm、3.99±0.03ppm、3.96±0.03ppm、3.90±0.03ppm、3.85±0.03ppm、3.81±0.03ppm、3.77±0.03ppm、3.66±0.03ppm、3.53±0.03ppm、3.42±0.03ppm、3.32±0.03ppm、2.22±0.03ppm、2.15±0.03ppm、2.11±0.03ppm、2.08±0.03ppm、1.48±0.03ppm、1.34±0.03ppm、1.23±0.03ppm、1.13±0.03ppm。
优选的，所述海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的13C NMR谱包括以下信号峰：178.7±0.05ppm、178.1±0.05ppm、177.5±0.05ppm、176.3±0.05ppm、106.4±0.05ppm、105.4±0.05ppm、104.2±0.05ppm、103.0±0.05ppm、102.0±0.05ppm、100.9±0.05ppm、96.7±0.05ppm、86.3±0.05ppm、83.3±0.05ppm、80.6±0.05ppm、79.3±0.05ppm、78.7±0.05ppm、77.9±0.05ppm、76.5±0.05ppm、75.8±0.05ppm、75.1±0.05ppm、73.9±0.05ppm、73.3±0.05ppm、72.5±0.05ppm、71.0±0.05ppm、70.4±0.05ppm、69.5±0.05ppm、68.9±0.05ppm、64.1±0.05ppm、63.3±0.05ppm、28.3±0.05ppm、23.9±0.05ppm、23.4±0.05ppm、18.5±0.05ppm。
因此，本发明采用上述一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用，具体技术效果如下：
(1)本发明制备的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分为结构组成新颖的多糖，该多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、岩藻糖组成，分离的组分其理化性质及结构组成明显不同于已公开制备的海带多糖。
(2)本发明一种海带多糖0.6M NaCl洗脱组分具有强效的因子X酶抑制活性，抑制因子X酶的EC50为10-50ng/mL，与低分子量肝素活性相当。由于寻找新型因子X酶抑制剂已成为低出血倾向的抗血栓药物研发的重点方向，因此，本发明一种海带多糖0.6M NaCl洗脱组分对于研制新型抗凝血抗血栓药物及功能性食品等具有重要应用价值。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱分离海带多糖的洗脱曲线；
图2是海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的高效液相色谱图；
图3是海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的单糖组成分析的色谱图；
图4是海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的红外光谱图；
图5是海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的氢谱；
图6是海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的碳谱。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％，±40％，±30％，±20％，±10％，±5％或±1％范围内。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
实施例一
一种海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)热水浸提：取粉碎并过60目筛的海带干粉100g，加入蒸馏水3L，90℃提取3h，4700rpm离心15min，收集上清液。残液加入2L蒸馏水，于90℃下再次提取3h。上清液加入3倍体积的食用酒精，4℃静置过夜，4700rpm离心15min，取沉淀溶于蒸馏水，采用等电点法除蛋白，即多糖提取溶液加入6M盐酸调节pH值至2-3，4℃冰箱静置4h，并于4700rpm离心20min除掉蛋白沉淀。得到的上清液用6M NaOH调节pH值至7.0，用大孔树脂进行脱色，再用截留分子量为3500Da的透析袋透析3d。最后，将多糖溶液减压浓缩、冻干，得到海带总多糖。
(2)取海带总多糖300mg，用20mL超纯水溶解，8000rpm离心10min除杂质，上清用DEAE Sepharose FF阴离子交换柱(1.2cm×30cm)分离纯化，分别用超纯水、0.2、0.4、0.6、0.8M NaCl洗脱，流速为2mL/min，约10mL每管收集洗脱流份。采用苯酚硫酸法检测各梯度流份在490nm处的吸光度，根据洗脱曲线合并各梯度洗脱的流份。减压浓缩收集的各梯度组分，采用3500Da透析袋透析。最后将透析袋内的透析液浓缩、冻干，最终得到纯化后的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分。
实施例二
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的结构组成及理化性质分析
采用半胱氨酸-苯酚-硫酸法(Honda et al.Anal.Chim.Acta 1981,131,205–211)测定岩藻糖含量；采用经典的浊度法(Dodgson and Price,Biochem.J.1962,84,106–110)测定硫酸酯基的含量；采用电导法(Zhao et al.Carbohydr.Polym.2013,98,1514–1523)测定硫酸羧酸摩尔比；采用考马斯亮蓝法(Bradford.Anal.Biochem.1976,72,248–254)测定蛋白质含量。
采用高效凝胶渗透色谱法测定(HPGPC)海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的分子量，高效液相色谱仪型号为：LC-2030C 3D HPLC(日本岛津公司集团，日本京都)，检测器为示差折光检测器，色谱柱为：Shodex OHpak SB-804HQ柱(7μm,8×300mm)。色谱条件：流速为0.5mL/min，流动相为0.1M NaCl水溶液，柱温为35℃。标准品为普鲁兰标准品，分子量分别为344.0、107.0、47.1、21.1和9.6kDa。
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的单糖组成分析采用配有DAD检测器的高效液相色谱(HPLC)，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，检测波长为245nm，柱温为30℃，流动相为乙腈和20mM乙酸铵溶液(17:83，v/v)，pH为6.7，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。标准单糖及多糖样品分析前采用4.0M三氟乙酸于120℃水解2h，所得水解样品进行PMP衍生，PMP衍生物采用HPLC分析。色谱峰采用手动积分，线性回归拟合并计算各种单糖摩尔百分比。
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分红外光谱采用Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)分析，样品采用KBr颗粒压片，波长扫描范围为4000-400cm-1。
1H和13C核磁共振谱采用Bruker Avance 600MHz核磁共振仪测定，检测温度为298.1K。将干燥后的样品溶于重水(D2O,99.9％D)中，浓度为10～20mg/mL。
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的理化性质测定结果如表1。分离的洗脱曲线及高效液相凝胶色谱图见附图1和2。
表1海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的理化性质
Figure BDA0003604047740000091
如图1所示，LJP0为海带多糖超纯水洗脱组分，LJP04为海带多糖0.4M NaCl洗脱组分，LJP06为海带多糖0.6M NaCl洗脱组分，LJP08为海带多糖0.8M NaCl洗脱组分。热水提取，去除蛋白质、色素等小分子后，海带总多糖的得率按干重计为5.0％。采用DEAESepharose FF柱分离纯化海带总多糖制备的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分，按海带总多糖干重计，得率为8.9％。LJP06具有较对称的单一色谱峰，峰值分子量为129.5Da。纯化后的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分未检测到蛋白质。海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的硫酸酯基含量为9.5％，硫酸羧酸摩尔比为3.25，与不同品种海参的岩藻糖化糖胺聚糖的相近(Luo etal.Mar.Drugs 2013,11,399-417)。
如图3所示，单糖组成分析中，海带多糖0.6M NaCl洗脱组分主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和岩藻糖组成，摩尔百分含量分别为18.9％、43.4％、13.2％、3.8％、20.8％。文献中(Wang et al.Int.J.Biol.Macromol.,2010,46,6–12)制备的各种海带岩藻聚糖组分均含有较高含量的岩藻糖42％～81％，半乳糖含量低于岩藻糖，约为32％，而且不含葡萄糖醛酸。而本发明制备的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分葡萄糖醛酸含量最高，其次为岩藻糖和甘露糖，因此该组分结构组成明显不同于已有文献报道。
红外光谱如图4所示，3446cm-1处宽而强的吸收峰可归属于糖环OH基的伸缩振动；2938cm-1处的吸收峰可以归属于岩藻糖-CH3的C-H伸缩振动；1731cm-1附近的吸收峰为乙酰基的伸缩振动；1623cm-1处的吸收峰为葡萄糖醛酸C＝O的非对称伸缩振动；1429cm-1处的吸收峰为葡萄糖醛酸COO-非对称伸缩振动；1259和852cm-1处的吸收峰分别来自硫酸基S＝O的伸缩振动和C-O-S的轴向弯曲振动；1054cm-1处的吸收峰为糖环上C-O的伸缩振动。
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的1H NMR谱如图5所示。在1H NMR谱中，δ4.9～5.6ppm和δ4.4～4.7ppm的信号可分别归属于α和β构型糖残基的异头氢。δ3.3～4.2ppm区域的重叠信号来源于糖环上的质子信号。δ2.0～2.2ppm的信号来自于多糖中乙酰基的甲基质子信号，表明部分糖残基被O-乙酰化。在δ1.1～1.5ppm的信号可归属于岩藻糖残基的甲基质子信号。氢谱中未见有杂质信号，表明纯化后的海带多糖0.6M NaCl洗脱组分纯度较高。
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分的13C NMR谱如图6所示。δ176～179ppm的信号可归属于葡萄糖醛酸的羰基信号，δ96～107ppm的信号可归因于糖残基的异头碳信号。在δ69～86ppm处的化学位移显示出宽而重叠的峰，可以归属为糖环的碳信号。δ63～64ppm的化学位移为半乳糖和甘露糖未被取代的C-6信号。位于δ28/23和δ18ppm高场区的信号分别来自乙酰基和岩藻糖的甲基碳信号。
实施例三
海带多糖0.6M NaCl洗脱组分抗凝血活性
样品的活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)检测：海带多糖各组分的TT、APTT和PT活性检测采用标准的人血浆和TT/APTT/PT试剂盒和凝血仪(TECO MC-2000，德国)分析。
TT测定：取10μL样品溶液或空白对照溶液(Tris-HCl缓冲液)，加入到37℃预热的检测管中，然后加入90μL标准人血浆，于37℃孵育2min。最后，用力加入50μL 37℃预热的TT试剂，开始计时，记录凝血时间。APTT测定：5μL样品溶液或Tris-HCl缓冲液加入到37℃预热的检测管中，加入45μL标准人血浆，37℃孵育2min。最后加入50μL 37℃预热的APTT试剂，于37℃孵育3min。最后，用力加入37℃预热的0.02M CaCl2溶液50μL并开始计时，记录凝血时间。PT测定：5μL样品溶液或Tris-HCl缓冲液加入到检测管中，加入45μL标准人血浆，于37℃孵育2min。最后，用力加入100μL37℃预热的PT试剂，开始记录血液凝固时间。
样品抑制内源性因子X酶活性的检测：采用BIOPHEN FVIII:C试剂盒检测样品对内源性因子X酶的抑制活性。分别吸取30μL浓度梯度的多糖溶液和空白对照溶液(Tris-HCl缓冲液)，加入到96孔板上，然后加入30μL的FVIII溶液(2IU/mL)，30μL的R2溶液(60nM含FIIa、Ca2+和PC/PS的IXa溶液)。96孔板于酶标仪中37℃振荡孵育2min，然后加入30μL含50nM FX及FIIa抑制剂的R1溶液，于37℃振荡孵育1min。最后，加入在37℃下预热的含有8.4mM FXa特异性显色底物SXA-11的R3溶液，连续读取405nm处的吸光度(OD405)。
结果发现，海带总多糖、海带多糖0.6M NaCl洗脱组分和海带多糖0.8M NaCl洗脱组分均具有较强的抗凝活性，可剂量依赖地延长APTT(表2)，对内源性凝血途径有明显的抑制活性。抑制内源性凝血途径中的凝血因子如FIXa、FXase、FXIa、FXIIa，可以有效防止血栓形成，且出血风险小。其中，内源性FXase是由因子VIIIa(FVIIIa)、因子IXa(FIXa)、Ca2+和磷脂形成的酶复合物，是内源性凝血途径中最末端的限速酶复合物。海带多糖0.6M NaCl洗脱组分对FXase抑制的选择性较海带总多糖和海带多糖0.8M NaCl洗脱组分更高，且出血倾向等副作用可能更小。
表2海带多糖各组分的抗凝血活性
Figure BDA0003604047740000121
a,代表延长APTT,TT、PT二倍时所需的药物浓度。
b,EC50,抑制因子X酶活性50％时所需的药物浓度。
c,未检测到。
因此，本发明采用上述一种具有强效抗凝活性的海带多糖及其制备方法和应用，得到的海带多糖具有强效的因子X酶抑制活性，与低分子量肝素活性相当，在制备预防或治疗血栓性心血管疾病相关药物及功能性食品中具有应用前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：所述海带多糖0.6MNaCl洗脱组分峰值分子量(Mp)为130±10kDa，其中，岩藻糖含量为10％～40％、硫酸酯基含量为5％～30％，蛋白质含量<1％，硫酸羧酸摩尔比为1.5～4.5。
2.根据权利要求1所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：海带多糖的硫酸羧酸摩尔比为2.5～3.5，海带多糖的峰值分子量为125～135kDa。
3.根据权利要求1所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：海带多糖中岩藻糖含量为12％～30％、硫酸基含量为5％～15％，蛋白质含量<1％。
4.根据权利要求1所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：海带多糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、岩藻糖，其摩尔百分比分别为10％～30％、30％～50％、5％～20％、1％～8％、10％～30％。
5.根据权利要求1所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：海带多糖的单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、岩藻糖，摩尔百分比分别为15％～25％、35％～45％、8％～15％、1％～5％、15％～25％。
6.根据权利要求1所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖，其特征在于：海带多糖显著延长人标准血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，并能够显著抑制内源性因子X酶活性，抑制内源性因子X酶活性的EC50为10～50ng/mL，与低分子量肝素活性相当，从而表现出强效的抗凝血抗血栓活性。
7.一种具有强效抗凝活性的海带多糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1、提取：取干燥的海带，粉碎，按料液质量体积比为1:20～1:40加蒸馏水提取；提取液调pH值至2.5～3.5，4℃静置4～8h，离心得上清液；上清液过大孔树脂脱色，收集多糖溶液，采用截留分子量为3000～10000Da的透析袋或超滤膜除去小分子杂质，最后浓缩、冻干得到海带总多糖；
S2、分离：将海带总多糖溶解于适量的超纯水，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离，洗脱后，苯酚硫酸法检测490nm吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集0.6MNaCl水溶液洗脱组分，透析、浓缩、冻干，制得海带多糖0.6M NaCl洗脱组分。
8.根据权利要求7所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，取海带过60目的干粉，沸水提取2～3h，料液比为1:20～1:30；提取次数2～3次，离心、合并海带多糖提取液。
9.根据权利要求7所述的一种具有强效抗凝活性的海带多糖的制备方法，其特征在于：步骤S2中，不同浓度的NaCl水溶液洗脱，海带总多糖上样后可分别用超纯水、0.4、0.6、0.8MNaCl水溶液洗脱，收集0.6M NaCl组分，透析、浓缩、冻干，最终制得海带多糖0.6M NaCl洗脱组分。
10.一种具有强效抗凝活性的海带多糖作为新型内源性因子X酶抑制剂在制备抗凝血抗血栓药物、食品添加剂或功能性食品中的应用。
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