CN111187365B - 月季花多糖、提取方法及其在制备抗凝血药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种月季花多糖的提取方法：将干燥月季花在室温下依次用石油醚、90‑95%乙醇溶液浸提，浸提结束后过滤，残渣用蒸馏水提取，滤液减压浓缩，然后醇沉，收集沉淀，复溶后采用Sevage法除蛋白，上清液减压浓缩后再次醇沉，沉淀依次用乙醚、丙酮、乙醇淋洗后，沉淀冻干获得月季花粗多糖；月季花粗多糖经DEAE‑52阴离子交换柱层析纯化、DEAE‑Sepharose FF色谱柱纯化和Sephadex G‑100色谱柱进一步纯化获得月季花精多糖RCJ2‑Ⅰb。本发明通过测定RCJ2‑1b对急性血瘀模型大鼠各项生化指标的影响，来考察其抗凝血活性。试验结果证明：月季花多糖RCJ2‑Ⅰb的体内抗凝血效果显著，可作为一种潜在的抗凝血药物。

Description

月季花多糖、提取方法及其在制备抗凝血药物方面的应用
技术领域
本发明属于医药和/或保健品领域，具体涉及一种月季花多糖RCJ2-Ib、提取方法及其在制备抗凝血药物方面的应用。
背景技术
血栓性疾病是心脑血管疾病中发病率和死亡率较高的疾病，主要表现为心肌梗死，静脉血栓，缺血性脑梗死等。抗凝血药物是治疗血栓性疾病的三大药物之一，通过降低血液凝固性，组织血栓的延伸或扩大，通过自身的纤维蛋白系统溶解形成的血栓，使阻塞点血管再通。目前临床上所用的抗凝药仍为肝素和香豆素类口服抗凝剂。肝素包括普通肝素、低分子肝素；香豆素类抗凝剂就是华法林。虽然抗凝血药物在临床上的作用是有目共睹的，但存在着副作用，如抗凝药物肝素不能抑制与纤维蛋白结合凝血酶，出血风险相对较大，并伴有导致血小板减少的不良反应；治疗房颤及预防静脉血栓的主要药物华法林其不良反应是出血，需监测INR值；香豆素类药物会出现一定的过敏反应和胃肠道不适等症状。因此寻找一种新型的、无毒的抗凝血药物至关重要。
本发明从月季花中分离纯化的月季花多糖RCJ2-1b是以甘露糖醛酸为基本单元的聚甘露糖醛酸。目前关于RCJ2-1b的结构和抗凝血活性还未见报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种月季花多糖RCJ2-Ib，体内试验结果表明其抗凝血作用显著。
本发明还提供了上述月季花多糖的提取方法及其在制备抗凝血药物方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种月季花多糖的提取方法，其包括如下步骤：
1）将干燥月季花在室温下依次用石油醚、90-95%乙醇溶液浸提，浸提结束后过滤，残渣用蒸馏水提取，滤液减压浓缩，然后醇沉，收集沉淀，复溶后采用Sevage法除蛋白，上清液减压浓缩后再次醇沉，沉淀依次用乙醚、丙酮、乙醇淋洗后，冷冻干燥获得月季花粗多糖；
2）月季花粗多糖经DEAE-52阴离子交换柱层析纯化，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥，其中，0.1mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2；
3）将RCJ2经DEAE-Sepharose FF色谱柱纯化，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥，其中，0.2mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2-Ⅰ；
4）将RCJ2-Ⅰ上样到Sephadex G-100色谱柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，减压浓缩第2组洗脱峰，透析，冷冻干燥获得RCJ2-Ⅰb，即为月季花精多糖。
具体的，步骤1）中，残渣用蒸馏水于80±5℃提取3次，每次3h，合并滤液并减压浓缩获得浓缩液；然后向浓缩液中加入95%乙醇至终浓度为70±2%于4℃下醇沉静置24h，离心，收集沉淀，复溶后采用Sevage法除蛋白后醇沉。
本发明还提供了采用上述提取方法制备得到的月季花多糖。
本发明通过动物实验发现，月季花多糖RCJ2-Ⅰb的体内抗凝血效果显著。因此，本发明还提供了上述月季花多糖在制备抗凝血药物方面的应用。
月季花为蔷薇科蔷薇属植物月季（Rosa chinensis Jacq.）的干燥花，原产于中国，至今已有二千多年的栽培历史。《中国药典》2015版一部记载：月季花具有活血调经、疏肝解郁的功效，可用于气滞血瘀、月经不调、痛经、闭经和胸胁胀痛。目前有关月季花成分的报道主要集中在黄酮苷、五环三萜和酚酸等小分子化合物及抗氧化、免疫和抗肿瘤等药理活性。国内外文献调研未发现月季花多糖抗凝血生物活性的研究报道。和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从月季花中提取分离获得了月季花多糖RCJ2-Ⅰb，该提取分离方法简便、易得。本发明通过测定RCJ2-1b对急性血瘀模型大鼠各项生化指标的影响，来考察其抗凝血活性。体内试动物试验结果证明：与模型组相比，RCJ2-Ib高（150 mg/kg）、中（100 mg/kg）剂量组可以延长急性大鼠血瘀模型的APTT、PT、和TT，升高前列腺酮素（F1α6-Keto-PGF1α）、一氧化氮合酶（eNOS）的含量，降低FIB含量以及血栓烷B2（TXB2）、内皮素-1（ET-1）、血沉（ESR）、红细胞比容（Hct）、全血粘度（WBV）和血浆粘度（PV），表明RCJ2-Ib具有较好的抗凝血作用，可作为一种潜在的抗凝血药物。
附图说明
图1为经Sephadex G-100色谱柱洗脱获得的月季花多糖RCJ2-Ⅰb的洗脱曲线图；
图2中，a为标准单糖混合衍生物，b为RCJ2-Ib的单糖组成分析；图中，鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖(Ara)、果糖(Fru)、木糖(Xyl)、核糖(Rib)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、内标（S）；由图2知，RCJ2-Ib的单糖组成为甘露糖；
图3为在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 1D NMR谱，1H NMR谱（600MHz）；
图4为在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 1D NMR谱，13C NMR谱（125MHz）；
图5为在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 2D NMR谱， 1H/1H COSY NMR谱；
图6为在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 2D NMR谱， 1H/13C HSQC NMR谱；
图7为在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 2D NMR谱， 1H/13C HMBC NMR谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明中，如无特殊说明，乙醇均指的是体积浓度。
实施例1：
一种月季花多糖的提取方法，其包括如下步骤：
1）将干燥月季花（2 kg）在室温下依次用10 L石油醚、10 L 95%乙醇溶液浸提48h以除去色素及小分子物质，浸提结束后过滤，残渣晾干，然后用蒸馏水（按料液比1g：25mL加入蒸馏水）于80℃提取3次，每次3h，合并滤液，减压浓缩至1000 mL获得浓缩液；然后向浓缩液中加入95%乙醇至终浓度为70%（约2.8L）于4℃下醇沉静置24h，离心，收集沉淀，蒸馏水复溶解后采用Sevage法除蛋白，上清液减压浓缩后再次醇沉，沉淀依次用乙醚、丙酮、乙醇淋洗后，冷冻干燥（-56℃、12h）获得月季花粗多糖；
2）取月季花粗多糖380mg，复溶于15ml蒸馏水中，经DEAE-52阴离子交换柱（2.6×40cm）层析纯化，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱（洗脱速度为25 rpm，），洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，4℃条件下透析12h（透析袋截留分子量8000～12000Da），冷冻干燥（-56℃、12h），其中，蒸馏水的洗脱峰组分为RCJW，0.05mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ1；0.1mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2；0.2mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ3；
3）将RCJ2经DEAE-Sepharose FF色谱柱纯化，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱（洗脱速度为30 rpm），洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，4℃条件下透析12h（透析袋截留分子量8000～12000Da），冷冻干燥（-56℃、12h），其中，0.2mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2-Ⅰ；
4）将RCJ2-Ⅰ上样到Sephadex G-100色谱柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱（洗脱速度为5 rpm），采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线得到两组洗脱峰（见图1），减压浓缩第2组洗脱峰，4℃条件下透析12h（透析袋截留分子量8000～12000Da），冷冻干燥（-56℃、12h），获得RCJ2-Ⅰb，即为月季花精多糖。
上述制备获得的月季花多糖RCJ2-1b，常温下为白色粉末，经测定分子量3304Da。
图2给出了标准单糖混合衍生物（a）、RCJ2-Ib（b）的单糖组成分析；图中，鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖(Ara)、果糖(Fru)、木糖(Xyl)、核糖(Rib)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、内标（S）；由图2可知，RCJ2-Ib的单糖组成为甘露糖。
图3至图7给出了在25℃记录的月季花多糖RCJ2-Ib 的1H NMR谱（600MHz）、13C NMR谱（125MHz）、1H/1H COSY NMR谱、1H/13C HSQC NMR谱和1H/13C HMBC NMR谱。
通过单糖组成、NMR光谱分析与文献比对，推断RCJ2-Ib的部分结构如下：
Figure 532206DEST_PATH_IMAGE001
。
下述以实施例1制备获得的月季花多糖RCJ2-Ⅰb进行相关的抗凝血试验。
应用试验
一、试验动物
雌雄SD大鼠(190～220 g)购买于郑州动物实验中心，许可证号为：SCXK (豫)2017-0001。适应性饲养1周，光照12小时/天，25℃，湿度45%～60%，自由摄食饮水。
二、仪器和材料
月季花购买于河北楚风中药饮片有限公司（生产批号：B611141），由国家食用菌加工技术研发专业中心李昌勤教授鉴定为蔷薇科植物月季(Rosa chinensis Jacq.)的花蕾，标本存放于河南省国家食用菌加工技术研发专业中心实验室；
Multiskan Mk3酶标仪（美国Thermo Electron公司）；旋转蒸发仪（东京理化器材独资公司）；LL-1500型冷冻干燥仪器（Thermo公司）；TRACE 1310气相色谱仪（美国Thermo公司）；UV-2600型紫外光谱仪（日本岛津）；傅里叶变换红外光谱仪FT-IP（日本岛津）；电子天平（美国Mettler-Toledo公司）；6890-5975型GC-MS联用仪（美国安捷伦科技公司）；气相色谱HP-5（AglientTechnologies,Inc）;CBS-B自动收集器（上海泸西仪器厂）；HL-1D恒流泵（上海青浦沪西仪西仪器厂）；
Buker-AV-500核磁共振仪（Buker德国）；RAC-030全自动凝血分析仪（美国Rayto）；DEAE纤维素-52（Whatman Ltd.）；DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100凝胶（GEHealthcare Bio-Sciences AB）；
标准单糖（Dr. EhrenstorferGmnH）；TFA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
灯盏花素（云南生物谷药业公司）；盐酸肾上腺素（天津药业集团新郑股份有限公司）；
凝血酶原时间（PT)测定试剂盒(20181225)；活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒(20190307)；凝血酶时间(TT)测定试剂盒(2019010702)；纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒(2019010702)均由上海太阳生物技术有限公司生产；
大鼠6-酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)酶联免疫分析试剂盒(201908)；大鼠血栓素B2 (TXB2)酶联免疫分析试剂盒(201908)；大鼠内皮型一氧化氮合成酶 (e NOS)酶联免疫分析试剂盒(201908)；大鼠内皮素1(ET-1)酶联免疫分析试剂盒(201908)，均由南京森贝伽生物科技有限公司生产。
三、统计学处理
采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)对数据进行统计处理。
四、大鼠急性血瘀模型的建立
SD雄性大鼠36只，随机分成6组，每组6只，分别为空白组、模型组、阳性对照组和月季花多糖RCJ2-Ib高、中、低剂量组。连续灌胃给药7次，给药间隔为24小时。模型组和空白组给予生理盐水，阳性对照组给予灯盏花素（40 mg/mL），月季花多糖RCJ2-Ib高、中、低剂量组给药剂量分别为150、100和50 mg/kg。于第5次给药后对大鼠造模。
大鼠皮下注射盐酸肾上腺素（0.8 mg/kg）2次，间隔时间为4 h，第一次皮下注射盐酸肾上腺素后2h，将大鼠置于0～2℃冰水浴中游泳5 min，造成大鼠急性血瘀模型。第二次注射盐酸肾上腺素后，大鼠保持进水不进食养，在相应的时间给予第6次给药。末次给药30min后，用10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，然后腹主动脉取血进行相关指标测定。
末次给药30 min后，用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射，麻醉大鼠，腹主动脉取血。用含枸橼酸钠(1:9)的真空负压管采集血液5 mL，倒入10 mL的EP管中，然后在3000 r/min下离心15 min，收集上清液，一部分按ELISA试剂盒说明测量eNOS、ET-1、6-keto-PGF1α和TXB2，另一部分用全自动凝血分析仪测定凝血四项PT、APTT、TT、FIB指标；用含EDTAK2的真空负压管采集血液2 mL，用来测定全血粘度（WBV）和血浆黏度（PV）；用含枸橼酸钠(1:4)的真空负压管采集血液1.6 mL，用来检测红细胞比积（ESR）和红细胞比容（Hct）。
五、多糖RCJ2-1b抗凝血活性
由表1可以看出，与空白组相比，模型组大鼠APTT、PT和TT均极显著缩短（P＜0.001），而FIB极显著升高（P＜0.001），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，月季花多糖RCJ2-Ib高剂量组极显著延长急性血瘀大鼠APTT和PT（P＜0.001）；中剂量组极显著延长急性血瘀大鼠TT和PT（P＜0.001），非常显著延长APTT（P＜0.01）；高剂量和中剂量组可极显著降低急性血瘀大鼠FIB含量（P＜0.001）。
表1 月季花多糖RCJ2-Ib体内凝血四项的结果(`X±SD, n=6)
Figure 403210DEST_PATH_IMAGE002
注：与空白组比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与模型组比：# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；
表2 给出了月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响。由表2可以看出，与空白组相比，模型组大鼠血清中6-keto-PGF1α的含量极显著地降低（P<0.001)，TXB2的含量极显著地升高(P<0.001)，说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组均可极显著升高急性血瘀模型大鼠6-keto-PGF1α含量（P<0.001)，低剂量组升高急性血瘀模型大鼠血清中6-keto-PGF1α含量的效果与模型组无显著性差别（P＞0.5）。月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组均极显著降低急性血瘀模型大鼠TXB2的含量（P<0.001)，低剂量组降低急性血瘀模型大鼠血清中TXB2含量的效果与模型组无显著性差别（P＞0.5）。月季花多糖RCJ2-Ib高剂量组能极显著地降低6-Keto-PGF1α/TXB2（P<0.001)，中剂量组能显著地降低6-Keto-PGF1α/TXB2（P<0.01)。表明月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组具有较好的抗凝血效果。
表2 月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响 (`X±SD,n=6)
Figure 256110DEST_PATH_IMAGE003
注：与空白组比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与模型组比：# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；
表3给出了月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内eNOS和ET-1含量的影响。由表3可知，与空白组相比，模型组大鼠血清中eNOS的含量极显著地升高（P<0.001)，而ET-1的含量极显著的升高(P<0.001)，说明大鼠的急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组均极显著性降低急性血瘀模型大鼠ET-1的含量（P<0.001)，低剂量组显著降低急性血瘀模型大鼠ET-1的含量（P<0.01)；月季花多糖RCJ2-Ib中剂量组极显著升高急性血瘀大鼠eNOS的含量（P<0.001)，高剂量组显著升高急性血瘀模型大鼠eNOS的含量（P<0.01)，低剂量组显著升高急性血瘀模型大鼠eNOS的含量（P<0.05)。表明月季花多糖RCJ2-Ib中剂量升高大鼠的急性血瘀模型eNOS和降低ET-1作用效果更显著。
表3 月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内eNOS和ET-1含量的影响(`X±SD，n=6)
Figure 187157DEST_PATH_IMAGE004
注：与空白组比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与模型组比：# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；
表4给出了月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内WBV、PV的影响。由表4可知，与空白组相比，模型组大鼠的PV以及在200s、30s和3s频率下的WBV均显著提高（P＜0.001），说明大鼠的急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，月季花多糖RCJ2-Ib高剂量、中剂量组均极显著降低急性血瘀大鼠PV（P＜0.001），低剂量组显著降低急性血瘀大鼠PV（P＜0.01）。月季花多糖RCJ2-Ib高剂量组极显著降低急性血瘀大鼠在各切变频率下的WBV（P＜0.001）；中剂量组显著降低急性血瘀大鼠高切变频率和低切变频率下的WBV（P＜0.01），极显著降低中切变频率下的WBV（P＜0.001）；低剂量组降低急性血瘀模型大鼠WBV的效果与模型组无显著区别（P＞0.05）。说明月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组可显著降低急性血瘀模型大鼠的WBV、PV。
表4 月季花多糖RCJ2-Ib对大鼠体内WBV、PV的影响 (`X±SD,n=6)
Figure 394016DEST_PATH_IMAGE005
注：与空白组比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与模型组比：# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；
表5给出了月季花多糖RCJ2-Ib对ESR和Hct的影响。表5的结果显示，与空白组相比，模型组大鼠ESR和Hct均极显著提高（P＜0.001），说明大鼠的急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组均极显著降低急性血瘀大鼠ESR和Hct（P＜0.001），低剂量组显著降低急性血瘀大鼠Hct（P＜0.01），而低剂量组降低急性血瘀模型大鼠ESR的效果与模型组无显著性差别（P＞0.05）。表明月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量具有显著的降低急性血瘀模型大鼠ESR和Hct的效果，而低剂量组无效。
表5 月季花多糖RCJ2-Ib对ESR和Hct的影响(`X±SD,n=6)
Figure DEST_PATH_IMAGE006
注：与空白组比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与模型组比：# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；
综上可以看出：月季花多糖RCJ2-Ib高、中剂量组对凝血具有显著的治疗作用，具备开发成抗凝血药物的潜在价值，可用于制备抗凝血药物。

Claims (4)

1.一种月季花多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将干燥月季花在室温下依次用石油醚、90-95%乙醇溶液浸提，浸提结束后过滤，残渣用蒸馏水提取，滤液减压浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入95%乙醇至终浓度为70±2%进行醇沉，收集沉淀，复溶后采用Sevage法除蛋白，上清液减压浓缩后再次醇沉，沉淀依次用乙醚、丙酮、乙醇淋洗后，冷冻干燥获得月季花粗多糖；
2）月季花粗多糖经DEAE-52阴离子交换柱层析纯化，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥，其中，0.1mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2；
3）将RCJ2经DEAE-Sepharose FF色谱柱纯化，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥，其中，0.2mol/L NaCl溶液的洗脱峰组分为RCJ2-Ⅰ；
4）将RCJ2-Ⅰ上样到Sephadex G-100色谱柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，减压浓缩第2组洗脱峰，透析，冷冻干燥获得RCJ2-Ⅰb，即为月季花多糖。
2.如权利要求1所述月季花多糖的提取方法，其特征在于，步骤1）中，残渣用蒸馏水于80±5℃提取3次，每次3h，合并滤液并减压浓缩获得浓缩液；于4℃下醇沉静置，离心，收集沉淀，复溶后采用Sevage法除蛋白。
3.采用权利要求1或2所述提取方法制备得到的月季花多糖。
4.权利要求3所述月季花多糖在制备抗凝血药物方面的应用。
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