CN107652369B

CN107652369B - 一种抗凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用

Info

Publication number: CN107652369B
Application number: CN201710834929.8A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 尹震花; 辛昕; 张娟娟
Original assignee: Huanghe Science and Technology College
Current assignee: Huanghe Science and Technology College
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107652369A

Abstract

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用。该提取分离方法是将女贞花经脱脂、水提醇沉获得粗多糖，然后将除蛋白、脱色后的粗多糖用DEAE‑52纤维素色谱柱、Sephadex G‑100凝胶色谱柱进一步纯化而得。本发明对该多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明该多糖有良好的抗凝血作用，可用于制备抗凝血药物。

Description

一种抗凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法、应用。

背景技术

女贞Ligustrum lucidum Ait.为木犀科女贞属植物，产于长江以南至华南、西南各省区，向西北分布至陕西、甘肃。朝鲜也有分布，印度、尼泊尔有栽培。其干燥果实为女贞子，有滋肝补肾、乌发明目的功效。目前，国内外一些研究者对女贞子的炮制方法、药理作用、化学成分等有深入的研究，化学研究表明其含有多糖类、有机酸、萜类、甾体类和黄酮类等活性成分，具有抗炎、降血糖、提高机体免疫力和保肝等作用，而对女贞花的研究则仅限于提取工艺、挥发油、黄酮类、萜类等，而关于女贞花多糖的研究未见报道，因此这不仅是在多糖领域的进步，同时也为女贞花的进一步开发利用提供了广阔的前景。

凝血实质上是水溶性的纤维蛋白原转变为水不溶性的固态纤维蛋白的过程，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。血浆凝血酶原时间（PT）主要反映的是外源性凝血途径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；部分活化凝血活酶时间（APTT）主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、XII等内源性凝血因子活性有关；凝血酶时间（TT）值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要指标；血浆纤维蛋白原（FIB）主要反映纤维蛋白原的含量。

抗凝血药可用于防治血管内栓塞或血栓形成的疾病，预防中风或其它血栓性疾病，是通过影响凝血过程中的某些凝血因子阻止凝血过程的药物。正常人由于有完整的血液凝固系统和抗凝及纤溶系统，所以血液在血管内既不凝固也不出血，始终自由流动完成其功能，但当机体处于高凝状态或抗凝及纤溶减弱时，则发生血栓栓塞性疾病。血栓的形成常常会引起血管系统的局部血液凝固，通常导致严重损害健康的相关疾病，如心脏病发作、中风。引起血栓形成的危险因素由异常高脂血症、高血糖症、血浆纤维蛋白原升高、血压升高和癌症等，这些血栓性疾病已成为死亡的主要原因，因此迫切需要有效的抗凝血药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从女贞花中提取分离得到具有抗凝血作用的女贞花多糖，同时提供了该女贞花多糖的提取分离方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗凝血女贞花多糖的提取分离方法，其包括以下步骤：

（1）新鲜的女贞花，阴干、粉碎，用石油醚回流脱脂，残渣挥干石油醚后，用乙醇浸提，所得残渣挥发至无醇味，用超纯水加热提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩至原体积的1/4左右，再向浓缩液中加入乙醇，静置、离心，得到的沉淀加超纯水溶解透析以除去小分子杂质，透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖；

（2）取除蛋白、脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤后加入到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，0.1 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-1，0.2 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-2，0.3 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-3；

（3）组分LL-1用超纯水溶解、过滤后加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱，用超纯水洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第1组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为LLp-1a；

（4）组分LL-3采用步骤（3）组分LL-1相同的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为LLp-3；

LLp-1a和/或LLp-3即为抗凝血女贞花多糖。

其中，DEAE-52纤维素是一种弱酸性阴离子交换剂，主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的，常用于多糖的纯化。

其中，SephadexG-100凝胶是一种半合成的凝胶，具有一定大小的孔径，不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速度不同，从而使大分子多糖与小分子化合物，如盐类、色素、蛋白、小分子多糖等分离开，既可起到纯化多糖的目的，又可以用来鉴定多糖的纯度。

利用上述的提取分离方法制备得到的抗凝血女贞花多糖。

上述的抗凝血女贞花多糖在制备抗凝血药物方面的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用特殊的提取分离方法从女贞花中分离得到多糖LLp-1a和LLp-3，并对该多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明该多糖有良好的抗凝血作用，可用于制备抗凝血药物，如抗凝血剂。

附图说明

图1女贞花粗多糖DEAE-52纤维素柱色谱洗脱曲线；

图2组分LL-1经SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；

图3组分LL-3经SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；

图4女贞花多糖LLp-1a和LLp-3紫外-可见光谱全波长扫描；

图5标准单糖混合物的GC色谱图；

图6为LLp-1a的水解物GC色谱图；

图7为LLp-3的水解物GC色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式，对本发明的技术内容再做进一步的详细说明，但是本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，所用的材料女贞花采集于贵州省贵阳市花溪区湿地公园，为木犀科女贞属植物女贞Ligustrum lucidum Ait的花。

本文中的乙醇浓度均为体积浓度。

1、抗凝血女贞花多糖的提取分离方法，包括以下步骤：

（1）新鲜的女贞花在阴凉处阴干、粉碎（475 g），用石油醚回流脱脂2次，每次2 h，残渣挥干石油醚后，用70%乙醇室温浸提3次，每次3 d，回收女贞花残渣，在通风橱中放置待其挥发至无醇味，然后用超纯水（料液比 1g：12mL）于85℃加热提取2次，第一次5 h、第二次4 h。趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，向浓缩后的溶液中加入无水乙醇至终浓度为70%，4℃静置12h，离心（6000 r/min，10 min）取其沉淀，沉淀干燥后加入超纯水溶解透析（装于透析袋中，36h，每2-4h换一次超纯水），透析时磁力搅拌以除去小分子杂质，然后透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖。

（2）将女贞花粗多糖用适量超纯水完全溶解获得粗多糖水溶液，按照粗多糖水溶液1/4体积的量加入Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4:1，体积比），磁力搅拌震荡30 min，放置使其自然分层，将最下层的溶剂和夹杂在上清液和溶剂之间的变性蛋白质清除，得到上清液，重复上述操作若干次直至没有变性蛋白层出现。将上清液减压浓缩后加入无水乙醇至终浓度为70%，4℃静置12h，离心后取其沉淀物干燥，即得除去蛋白的女贞花粗多糖。

（3）步骤（2）所得除去蛋白的女贞花粗糖用适量超纯水完全溶解，向溶液中加入一定量的D101大孔树脂，在 25℃、磁力搅拌器震荡24 h，过滤，洗涤树脂，合并滤液，加入95%乙醇至终浓度为70%，4℃静置 24 h，离心后取其沉淀物干燥，即得脱色的女贞花粗多糖。

（4）取步骤（3）脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤，加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用超纯水、0.1mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速控制在1.0 mL/min，BSZ-100自动部分收集器收集洗脱样品，每8 min收集一管，采取苯酚-硫酸法进行多糖检测，在490 nm处测定其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（如图1所示），合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥，其中，0.1mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-1，0.2 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-2，0.3mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL-3。

（5）取组分LL-1用超纯水溶解、过滤后，用Sephadex G-100凝胶柱色谱 (1.5×100cm) 进一步分离纯化，用超纯水洗脱，流速控制在0.5 mL/min，BSZ-100自动部分收集器收集洗脱样品，每5 min收集一管，采用苯酚-硫酸法进行多糖检测，在490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线（如图2所示），得到两组洗脱峰，浓缩第1组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为冷冻干燥得到的多糖命名为LLp-1a；

（6）组分LL-3采用步骤（5）组分LL-1相同的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰（如图3所示），冷冻干燥得到的多糖命名为LLp-3；

LLp-1a和/或LLp-3即为抗凝血女贞花多糖。

2、抗凝血女贞花多糖LLp-1a和LLp-3的紫外-可见光谱分析、分子量测定和组分分析。

2.1 紫外-可见光谱分析

对 LLp-1a和LLp-3的紫外-可见全波长扫描，分析结果如图4所示。从图中可以看出，LLp-1a和LLp-3在260 nm和 280 nm处均没有明显的吸收峰，说明这LLp-1a和LLp-3均不含蛋白质和核酸。

2.2 分子量测定

以4万、6.4万、15万、25万和50万的葡聚糖为对照品，采用配有折射率检测器的液相色谱仪进行多糖分子量的测定。结果显示：LLp-1a和LLp-3的平均分子量（Average Mw）分别为25912和2975091 g/mol。

2.3 单糖组成分析。

2.3.1多糖的水解

准确称取多糖LLp-1a和LLp-3各10 mg，加入5 mL安瓿瓶中，加入 2 mL 2 mol/L的三氟乙酸，氮气封管。在 110℃下水解3 h，旋转蒸发除去三氟乙酸溶液，加入少量甲醇溶解残渣，旋转蒸发至干燥，如此重复 3次，得到的水解物备用。

2.3.2单糖的衍生化

向水解产物中加入盐酸羟胺10 mg和吡啶0.5 mL，振荡混匀，放入90 ℃水浴中加热反应30 min。取出冷却至室温，加入醋酸酐0.5 mL，在 90 ℃下继续反应30 min以进行乙酰化，反应产物经0.22 μm滤膜过滤后注入气相色谱进行分析；用相同方法处理标准单糖，并制成标准单糖衍生物混合液。

2.3.3气相色谱条件

色谱柱：HP（30 m×0.35 mm，0.25 μm)；进样温度：250 ℃；检测器温度：280 ℃；色谱柱升温程序：初始温度100 ℃保持 1 min，然后以 4 ℃/min 的速度由 100 ℃升至 240℃，保持10 min；载气：高纯氮气，流速2 mL/min；进样量为2 µL。

2.3.4单糖组成分析结果

标准单糖混合物的GC色谱图见图5（1. L-鼠李糖；2. L-阿拉伯糖3. D-木糖；4.D-甘露糖；5.D-葡萄糖；6.D-半乳糖），图6和图7分别为LLp-1a和LLp-3经水解后的单糖GC色谱图，通过和标准单糖图谱中保留时间的比较可以确定样品的单糖构成。由图6可知，LLp-1a 为杂多糖，至少由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成，其摩尔比为3.16：2.46：1.00 ：7.27：4.22；由图7可知，LLp-3至少由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成，其摩尔比为5.85：2.21：2.23：1.00：2.25。

3、抗凝血女贞花多糖LLp-1a和LLp-3的活性分析

方法：采用家兔体外血浆凝血四项对女贞花多糖进行凝血活性检测。

3.1仪器和材料

TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司，1603311336）；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液（自制）、云南白药（云南白药集团股份有限公司，ZGA1604）；注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，15141005）；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105295）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（1121911）；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121168）；纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（132107）均由上海太阳生物技术有限公司生产。

3.2实验动物

獭兔，雄性，体重2.0～2.5 kg。

3.3样品溶液配制

LLp-1a和LLp-3各1 mg，用200 μL溶剂溶解制5 mg/mL溶液。取灯盏花素8 mg用600μL溶剂制得13.33 mg/mL，取云南白药1 mg用25 μL溶剂制得40 mg/mL溶液。溶剂（也作为空白溶剂）为：无水乙醇:1,2-丙二醇:生理盐水=1:1:3（体积比）。

3.4实验方法。

3.4.1对APTT影响的检测方法

血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6 mL，置于含有0.109 mol/L枸橼酸钠400 μL的4 mL离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。

分别在不同测试杯中加入50 μL各个样品溶液，再加入100 μL血浆和37 ℃预温的APTT试剂100 μL，37 ℃孵育5 min后加入37℃预温的0.025 mol/L CaCl₂溶液100 μL，记录凝固时间。

3.4.2对PT影响的检测方法

血浆制备方法同3.4.1，分别在不同测试杯中加入50 μL各个样品溶液，再加入100μL的血浆，37℃孵育3 min后加入37℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。

3.4.3对TT影响的检测方法

血浆制备方法同3.4.1，分别在不同测试杯中加入50 μL各个样品溶液和200 μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间。

3.4.4对FIB影响的检测方法

血浆制备方法同3.4.1，按照试剂说明书定标准曲线。取200 μL血浆和200 μL样品，然后加入700 μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200μL，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100 μL，记录纤维蛋白原的含量。

3.5数据处理

结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。测定结果见表1。

表1 LLp-1a和LLp-3体外凝血结果

注：与空白比较，^*** p<0.001< ^** p<0.01< ^* p<0.05；

与云南白药比较，^### p<0.001< ^## p<0.01< ^# p<0.05；

与灯盏花素比较，^△△△ p<0.001< ^△△ p <0.01< ^△ p <0.05。

由表1可知，与空白组相比，LLp-1a和LLp-3均可以显著性的延长APTT，PT和TT（p<0.001或p<0.05）；LLp-1a可以显著的降低FIB，而LLp-3可以显著的增加FIB，与阳性对照灯盏花素相比，LLp-1a延长APTT，PT和TT的效果不具有著性差异（P>0.05），LLp-3延长APTT，PT和TT的效果具有著性差异（p<0.001）。综合上述数据分析可以得出，LLp-1a和LLp-3在体外具有一定的抗凝血作用。

Claims

1.抗凝血女贞花多糖在制备抗凝血药物方面的应用，其特征在于，抗凝血女贞花多糖经以下步骤提取分离获得：

（1）新鲜的女贞花，阴干、粉碎，用石油醚回流脱脂，残渣挥干石油醚后，用乙醇浸提，所得残渣挥发至无醇味，用超纯水加热提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩至原体积的1/4，再向浓缩液中加入乙醇，静置、离心，得到的沉淀加超纯水溶解透析以除去小分子杂质，透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖；

LLp-1a和/或LLp-3即为抗凝血女贞花多糖；

LLp-1a 为杂多糖，至少由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成；LLp-3至少由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成。