CN105147743A - 海带/海带多糖提取物在制备抗ev71药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海带/海带多糖提取物的一种新用途，即：海带/海带多糖提取物在制备抗EV71药物中的应用。所述海带多糖提取物的制备方法为以下方法之一：(1)海带水提取物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮沸，过滤获煮汁，离心得上清，即得；(2)海带水提醇沉物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至75～95％，离心，得沉淀，即得；(3)海带DEAE纤维素柱分离组分：将上述水提醇沉物用DEAE纤维素柱分离，用NaCl溶液洗脱，收集洗脱组分，即得。本发明为海带提取物用于临床治疗EV71感染性疾病提供实验依据，对研制抗EV71药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。

Description

海带/海带多糖提取物在制备抗EV71药物中的应用

技术领域

本发明涉及海带/海带多糖提取物在制备抗EV71药物中的应用。

背景技术

海带，别称江白菜、昆布，褐藻门游孢子纲海带目海带科海带属，藻体褐色，一般长2～4米，最长达7米。可分固着器、柄部和叶片三部分。固着器叉形分枝，用以附着海底岩石。柄部短粗，圆柱形。叶片狭长，带形。生长于水温较低的海中，分布于中国北部沿海及朝鲜、日本和苏联太平洋地区沿岩，素有“长寿菜”、“海上之蔬”、“含碘冠军”的美誉。海带是个体大、生长快、经济价值高的一种大型褐藻，我国北部及东南沿海均有大量养殖。

海带营养丰富，含有较多的碘质、钙质，有治疗甲状腺肿大之功效。海带可以冷拌食用，也可以做热炒菜。除食用外，海带还可以制海带酱油、海带酱、味粉，海带还可以加工成脆片，海带脆片成为新的海洋类休闲食品。日本人用海带磨成粉，作为红肠等食物的添加剂，把海带茶作为表示喜庆的高贵食品。工业上用海带提取钾盐、褐藻胶、甘露醇，用来代替面粉浆纱、浆布，制酒时用作澄清剂。除此之外，海带(昆布)还具有重要的药用价值，如：《嘉佑本草》记载海带具有催生，治妇人及疗风，亦可作下水药；《本草图经》记载海带“下水速于海藻”；《纲目》提到海带“治水病，瘿瘤，功同海藻”；《医林纂要》认为海带“补心，行水，消痰，软坚。消瘿瘤结核，攻寒热瘕疝，治脚气水肿，通噎膈。”

据有关文献(MutoS,NiimuraK,OoharaM,etal.Polysaccharidesfrommarinealgaeandantiviraldrugscontainingthesameasactiveingredients.Eur.PatentEP295956,1988,21.)报道，海带(昆布)多糖提取物具有抗病毒作用，但到目前为止，尚未见海带(昆布)多糖提取物抗EV71活性的资料报道。EV71(Enterovirus71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)，是引起婴幼儿手足口病(handfootandmouthdisease，HFMD)的主要病原。自1969年Schmidt等人在美国首次分离到EV71病毒，世界各国以及我国大陆及周边地区EV71感染爆发越来越多。到目前为止，EV71感染没有有效的治疗药物及疫苗。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了海带/海带多糖提取物的一种新用途，即：海带/海带多糖提取物在制备抗EV71药物中的应用。

具体应用方式为：将海带进行前处理，提取得到海带多糖提取物，用于制备抗EV71药物，如：可将海带多糖提取物与医学上可接受的辅料一起制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液制剂等，将海带多糖提取物进一步纯化也可以制成注射制剂。

所述“前处理、提取得到海带多糖提取物”为以下三种方式之一(即海带多糖提取物的制备方法)：

(1)海带(昆布)水提取物：取海带(昆布)，用PBS清洗后，加双蒸水煮沸0.1～3小时，过滤获煮汁，离心上清即海带(昆布)水提取物。

(2)海带(昆布)水提醇沉物：取海带(昆布)，用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，即为海带(昆布)水提醇沉物。

(3)海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分：将上述(2)中的水提醇沉物用DEAE纤维素柱分离，用浓度范围为0.05～2M的NaCl溶液洗脱，收集0.05～2MNaCl洗脱组分，即为海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分，将其溶于细胞维持液中备用于试验。

经实验证明，海带(昆布)的上述不同提取物对EV71均有显著的抑制作用：

a.海带(昆布)水提取物：抑制EV71在RD细胞出现CPE，TC为11.98±1.42ug/mL，IC50为520.28±10.34ng/mL，TI为23.03；抑制EV71在HEL发生CPE，TC为13.24±1.51ug/mL，IC50为601.25±9.84ng/mL，TI为22.02。

b.海带(昆布)水提醇沉物：抑制EV71在RD细胞出现CPE，TC为23.37±2.45ug/mL，IC50为310.15±12.12ng/mL，TI为75.35；抑制EV71在HEL发生CPE，TC为35.54±3.77ug/mL，IC50为299.97±1.14ng/mL，TI为118.48。

c.海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分：抑制EV71在RD细胞出现CPE，TC为32.57±3.04ug/mL，IC50为20.87±2.05ng/mL，TI为1560.61；抑制EV71在HEL出现CPE，TC为41.25±5.21ug/mL，IC50为22.68±3.22μg/mL，TI为1818.78。

为便于观察与比较，上述内容详见表1。

表1海带(昆布)多糖提取物抑毒试验结果

从表1可以看出，海带(昆布)各提取物对EV71均有显著的抑制作用，这提示海带不仅具有软坚、散结、消炎、平喘、通行利水、祛脂降压等功效，而且在治疗病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值，对EV71感染性疾病的治疗意义尤为重大。本发明为海带提取物用于临床治疗EV71感染性疾病提供实验依据，对研制抗EV71药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。

为了更好地理解本发明的实质，下面将结合实施例对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1为HEL细胞对照：未感染EV71的HEL细胞(200×)。

图2为HEL细胞感染E71病毒：HEL细胞出现完全CPE(200×)。

图3为RD细胞对照：未感染EV71的RD细胞(200×)。

图4为RD细胞感染E71病毒：RD细胞出现完全CPE(200×)。

图5为海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分抑制EV71感染HEL细胞的CPE：加入海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分后EV71在HEL细胞上的CPE明显减轻(200×)，其中，A为HEL细胞对照，B为多糖在HEL细胞上的毒性，C为多糖干预后，D为病毒对照。

图6为海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分抑制EV71感染RD细胞的CPE：加入海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分后EV71在RD细胞上的CPE明显减轻(200×)，其中，A为RD细胞对照，B为多糖在RD细胞上的毒性，C为多糖干预后，D为病毒对照。

图7为海带(昆布)DEAE纤维素柱分离多糖组分抑制EV71在RD细胞上的增殖能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：海带(昆布)多糖水提取物抗EV71的作用研究

(1)海带(昆布)多糖水提取物的制备：

取海带(昆布)200g，用PBS冲洗干净后，组织匀浆器匀浆，加500ml去离子水煮沸15min；纱布过滤出去固体组织后10000g离心10min，上清(435ml)即为海带(昆布)多糖水提取物。以葡萄糖为标准品，硫酸蒽酮法测定提取物中多糖含量为2.68mg/mL。

(2)细胞株与病毒株：

HEL(图1)为EV71敏感宿主细胞，由本实验室制备并保；EV71病毒由本实验室分离自济南市传染病医院手足口病患儿粪便标本，全序列已测定并提交NCBI(GenBank:JQ074187.1)，该病毒在HEL细胞上的病变见图2。

(3)细胞毒性测定：

参照金富军等报道方法(金富军，陈茂芸，马凯琦，王怀玲，任哲，王一飞.麒麟菜多糖提取物体外抗单纯疱疹病毒I型活性及作用机制研究.中国卫生检验杂志.2014,24(16):2288-2290)。将海带(昆布)多糖水提取物过滤除菌，维持液(含2％新生牛血清RPMI-1640培养基)稀释，从2mg/mL浓度开始做2倍比系列稀释，然后按稀释顺序依次接种于96板孔中长满单层的HEL细胞上，每孔100μL，每稀释度重复3孔，设细胞对照，37℃、5％CO₂培养，显微镜下每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算药物半数毒性浓度(TC50)。

(4)抑毒试验：

参照汪受传等报道的方法(汪受传，王霖，陈超，廖辉.清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27.)，将海带(昆布)多糖水提取物从60ug/mL开始2倍比系列稀释，按稀释顺序依次加入96板孔中的单层细胞上，每孔50μL，每稀释度纵向重复3孔，病毒对照及细胞对照加50μL/孔维持液各重复6孔。实验孔及病毒对加50μL(100个TCID50的EV71病毒)/孔病毒液，细胞对照加50μL/孔维持液。37℃、5％CO₂培养，每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算半数抑制浓度(IC50)。TC50和IC50相比获得抑毒指数(TI)。

(5)结果：海带(昆布)多糖水提取物能显著抑制EV71在HEL细胞出现CPE。计算TC为13.24±1.51ug/mL，IC50为601.25±9.84ng/mL，TI为22.02。

实施例2：海带(昆布)多糖水提醇沉物抗EV71的作用研究

(1)海带(昆布)多糖水提醇沉物的制备：

取海带(昆布)200g，用PBS冲洗干净后，组织匀浆器匀浆，加500ml去离子水煮沸15min；纱布过滤出去固体组织后10000g离心10min，上清加入无水乙醇至终浓度为85％，室温静置20min后即10000g离心10min，得到0.758克沉淀，即为海带(昆布)多糖水提醇沉物，50ml去离子水溶解沉淀后以葡萄糖为标准品，硫酸蒽酮法测定多糖浓度为7.21mg/mL。

(2)细胞株与病毒株：

RD(图3)为EV71敏感宿主细胞，引自中国CDC病毒病研究所；EV71病毒由本实验室分离自济南市传染病医院手足口病患儿粪便标本，全序列已测定并提交NCBI(GenBank:JQ074187.1)，该病毒在RD细胞上的病变见图4。

(3)细胞毒性测定：

参照金富军等报道方法(金富军，陈茂芸，马凯琦，王怀玲，任哲，王一飞.麒麟菜多糖提取物体外抗单纯疱疹病毒I型活性及作用机制研究.中国卫生检验杂志.2014,24(16):2288-2290)。将海带(昆布)多糖水提醇沉物过滤除菌。用维持液(含2％新生牛血清RPMI-1640培养基)从200ug/mL浓度开始，2倍比做系列稀释，然后按稀释顺序依次接种于96板孔中长满单层的RD细胞上，每孔100μL，每稀释度重复3孔，设细胞对照，37℃、5％CO₂培养，显微镜下每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算药物TC50。

(4)抑毒试验：

参照汪受传等报道的方法(汪受传，王霖，陈超，廖辉.清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27.)，将海带(昆布)水提醇沉取物从100ug/mL开始2倍比系列稀释，按稀释顺序依次加入96板孔中的单层细胞上，每孔50μL，每稀释度纵向重复3孔，病毒对照及细胞对照加50μL/孔维持液各重复6孔。实验孔及病毒对加50μL(100个TCID50的EV71病毒)/孔病毒液，细胞对照加50μL/孔维持液。37℃、5％CO₂培养，每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算IC50。TC50和IC50相比获得TI。

(5)结果：海带(昆布)水提醇沉物能显著抑制EV71在RD细胞出现CPE。计算TC为23.37±2.45ug/mL，IC50为310.15±12.12ng/mL，TI为75.35。

实施例3：海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分抗EV71的作用研究

(1)海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分的制备：

取海带(昆布)200g，用PBS冲洗干净后组织匀浆器匀浆，加500ml去离子水煮沸15min；纱布过滤出去固体组织后10000g离心10min；过DEAE纤维素柱，3倍柱体积0.3MNaCl洗脱后，用0.4MNaCl洗脱并收集0.4MNaCl洗脱组分，即为海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分，超滤管离心法除盐并浓缩至25ml，硫酸蒽酮法测定洗脱组分的多糖含量为1.55mg/mL。

(2)细胞株与病毒株：

HEL为EV71敏感宿主细胞，由本实验室制备并保存；RD为EV71敏感宿主细胞，引自中国CDC病毒病研究所；EV71病毒由本实验室分离自济南市传染病医院手足口病患儿粪便标本，全序列已测定并提交NCBI(GenBank:JQ074187.1)。

(3)细胞毒性测定：

参照金富军等方法(金富军，陈茂芸，马凯琦，王怀玲，任哲，王一飞.麒麟菜多糖提取物体外抗单纯疱疹病毒I型活性及作用机制研究.中国卫生检验杂志.2014,24(16):2288-2290)。将海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分过滤除菌后用维持液稀释至终浓度为100ug/mL，过滤除菌。维持液2倍比做系列稀释，然后按稀释顺序依次接种于96板孔中长满单层的RD和HEL细胞上，每孔100μL，每稀释度重复3孔，设细胞对照，37℃、5％CO₂培养，显微镜下每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算药物TC50。

(4)抑毒试验：

参照汪受传等报道的方法(汪受传，王霖，陈超，廖辉.清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27.)，将海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分从100ug/mL开始2倍比系列稀释，按稀释顺序依次加入96板孔中的单层细胞上，每孔50μL，每稀释度纵向重复3孔，病毒对照及细胞对照加50μL/孔维持液各重复6孔。实验孔及病毒对照加50μL(100个TCID50的EV71病毒)/孔病毒液，细胞对照加50μL/孔维持液。37℃、5％CO₂培养，每日观察CPE，72h后每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h，小心吸弃上清，每孔加入DMSO100μL，37℃避光孵育1h，酶标仪570nm读取A570值，计算IC50。TC50和IC50相比获得TI。

(5)病毒增殖曲线改变：

参照Lui等报道的方法(LuiYL,TimmsP,HafnerLM,TanTL,TanKH,TanEL.Characterisationofenterovirus71replicationkineticsinhumancolorectalcellline,HT29.Springerplus.2013,2(1):267.)，将海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分以20ng/mL及100ng/mL终浓度在24细胞培养板培养的RD细胞上做抑毒实验，病毒用量为1000TCID50/孔。同时设病毒对照和细胞对照。37℃、5％CO₂培养，感染后2h吸弃上清，用PBS洗细胞两次，加入维持液继续培养。于感染后2h、4h、8h、16h、24h分别提取病毒对照及抑毒实验组总RNA，在24h提取细胞对照总RNA。随机引物反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，EV71特异引物(q1：5-GAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTG-3；q2：5-GCTGTACTGTGCGAGTTAAGAACA-3)荧光定量PCR检测EV71基因组拷贝数。同时以pET30a-VP1(本实验室构建，论文已发表)为标准品，NanoDrop2000定量后根据公式(样本拷贝数＝OD₂₆₀×40×稀释倍数×6×10¹⁴/(碱基数×324))换算成拷贝数绘制标准曲线。根据标准曲线计算得到各个时间点的EV71基因组拷贝数，绘制病毒增殖曲线。

(6)结果：海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分能显著抑制EV71在RD细胞出现CPE。计算TC为32.57±3.04ug/mL，IC50为20.87±2.05ng/mL，TI为1560.61；抑制EV71在HEL发生CPE，TC50为41.25±5.21ug/mL，IC为22.68±3.22ng/mL，TI为1818.78。在RD细胞上，终浓度为20ug/mL及100ng/mL的海带(昆布)多糖DEAE纤维素柱分离组分能显著抑制EV71病毒的增殖，处理后增殖曲线明显变缓，并且有剂量依赖性。

图5A为HEL细胞对照，B为多糖在HEL细胞上的毒性，C为多糖干预后，D为病毒对照。由图可见：高浓度多糖对细胞有一定毒性，表现为细胞颗粒增多、遮光性增强、有肿胀现象；在多糖干预后HEL细胞上EV71病变与病毒对照比较，CPE显著减轻，表明该多糖能显著抑制EV71在HEL细胞上的CPE。

图6A为RD细胞对照，B为多糖在RD细胞上的毒性，C为多糖干预后，D为病毒对照。由图可见：高浓度多糖对细胞有一定毒性，表现为细胞颗粒增多、遮光性增强、部分细胞变圆死亡；在多糖干预后RD细胞上EV71病变与病毒对照比较，CPE显著减轻，表明该多糖能显著抑制EV71在RD细胞上的CPE。

图7为海带(昆布)DEAE纤维素柱分离多糖组分抑制EV71在RD细胞上的增殖能力：图中对照为未用药物干预的EV71增殖曲线，治疗A为20ng/mL浓度的提取多糖干预后EV71的增殖曲线，治疗B为100ng/mL浓度的提取多糖干预后EV71的增殖曲线。由图可见，加入海带(昆布)DEAE纤维素柱分离组分后EV71在RD细胞上的增殖曲线与病毒对照比较明显变得平缓，表明病毒增殖能力受到抑制，扩增效率降低，并且多糖对EV71的抑制效果有剂量依赖性。

Claims (6)

1.海带/海带多糖提取物在制备抗EV71药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将海带进行前处理，提取得到海带多糖提取物，用于制备抗EV71药物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：将海带多糖提取物与医学上可接受的辅料一起制成胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液制剂；或：将海带多糖提取物进一步纯化制成注射制剂。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述海带多糖提取物的制备方法为以下方法之一：

(1)海带水提取物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮沸0.1～3小时，过滤获煮汁，离心得上清，即海带水提取物；

(2)海带水提醇沉物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，即为海带水提醇沉物；

(3)海带DEAE纤维素柱分离组分：用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，为海带水提醇沉物；将水提醇沉物用DEAE纤维素柱分离，用浓度范围为0.05～2M的NaCl溶液洗脱，收集0.05～2MNaCl洗脱组分，即为海带DEAE纤维素柱分离组分。

5.用于抗EV71病毒的海带多糖提取物，其特征在于：所述海带多糖提取物是通过以下方法之一制备得到的：

(1)海带水提取物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮沸0.1～3小时，过滤获煮汁，离心得上清，即海带水提取物；

(2)海带水提醇沉物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，即为海带水提醇沉物；

(3)海带DEAE纤维素柱分离组分：用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，为海带水提醇沉物；将水提醇沉物用DEAE纤维素柱分离，用浓度范围为0.05～2M的NaCl溶液洗脱，收集0.05～2MNaCl洗脱组分，即为海带DEAE纤维素柱分离组分。

6.权利要求5所述的抗EV71病毒的海带多糖提取物的制备方法，其特征在于：为以下三种方法之一：

(1)海带水提取物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮沸0.1～3小时，过滤获煮汁，离心得上清，即海带水提取物；

(2)海带水提醇沉物：取海带，用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，即为海带水提醇沉物；

(3)海带DEAE纤维素柱分离组分：用PBS清洗后，加双蒸水煮开，过滤获煮汁，加入无水乙醇至乙醇含量为75～95％(体积百分数)，离心，得沉淀，为海带水提醇沉物；将水提醇沉物用DEAE纤维素柱分离，用浓度范围为0.05～2M的NaCl溶液洗脱，收集0.05～2MNaCl洗脱组分，即为海带DEAE纤维素柱分离组分。