CN103417653A - 一种治疗球虫的兽用复方纯中药及其口服液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗球虫的兽用复方纯中药及其口服液的制备方法。治疗球虫的兽用复方纯中药由常山、鸦胆子、苦参、何首乌、肉桂和白头翁六种原料药组成。本发明还提供该治疗球虫的兽用复方纯中药的口服液及其制备方法。本发明无耐药性、毒副作用小，对球虫有良好的治疗作用。且充分利用现代化的中药提取技术提取中药的活性成分，制成可以饮水的口服液剂型，既有利于中药药效的发挥，也便于临床的应用。避免了过去中药“粗、大、黑”的特点。将现代化的研究技术应用到传统中兽药的研究上来。

Description

一种治疗球虫的兽用复方纯中药及其口服液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗球虫的兽用复方纯中药及其口服液的制备方法，属于兽药研发技术领域。

背景技术

鸡球虫病是一种普遍发生、分布广泛、危害严重、又易产生耐药性的原虫病，严重威胁养鸡业的发展。尤其对15～30日龄的雏鸡危害严重，常造成毁灭性的损失。其发病率高达50％～70％，死亡率20％～30％，严重时高达80％。在鸡的各种疾病当中，球虫病的发生率相当高，占1/6-1/5。而由于球虫病造成的鸡发育滞缓、减重、产蛋减少、药物及饲料浪费带来的经济损失，往往比鸡死亡的后果更严重。据统计包括防治该病所花的药费在内全世界每年损失约80亿美元，仅美国一年损失就高达45亿美元。我国年养鸡量约为30亿只，按每只O.2元的抗球虫药支出计算，年支出的抗球虫药费为6亿元人民币。鸡球虫病给养禽业造成严重的经济损失，对全球家禽养殖业具有巨大的经济影响。

长期以来，控制鸡球虫病的主要手段是使用抗生素类和化学合成药物，这些药物对鸡球虫病的防治起了重要作用，但球虫耐药性的产生一直困扰着养殖户和兽医工作者，有些鸡群虽然使用抗球虫药，仍然面临球虫病的发生乃至暴发的威胁。随着集约化养鸡业的发展和鸡对化学疗法的抵抗力增强，本病的危害将更加日趋严重。目前，国内外对鸡球虫病疫苗的研究虽有进展，但由于商品化的鸡球虫疫苗均是活苗，是由几个虫种混合而成，本身具有致病性，若使用不当，有可能引起球虫病爆发，因此，在短期内还难以应用。如何克服耐药性和药物残留问题，开发低毒、高效、绿色无公害的中药新药已成为养殖行业和寄生虫学界的共识。中草药具有长期应用不易产生耐药性、毒副作用小和促生长等优点，具有很大的潜力和广阔的应用前景。

中国专利文献CN101697774A（申请号200910157328.3）公开了一种治疗鸡球虫病的中药饲料添加剂，选取的原料中药材及其重量组份分别是：升麻6份、黄芩5份、苦参6份、白头翁6份、鸦胆子3份、常山3份、青蒿6份、百部5份；其制备方法是：将上述原料药材混合后粉碎或分别粉碎后混合。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种治疗球虫的兽用复方纯中药及其口服液的制备方法。本发明还提供该复方中药口服液的制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种治疗球虫的兽用复方中药，由以下重量份的原料药组成：

常山1～50份，鸦胆子1～50份，苦参1～30份，何首乌1～30份，肉桂1～30份，白头翁1～20份；

所述原料药的来源为中药材或相当于上述中药材生药量的中药提取物。

根据本发明优选的，治疗球虫的兽用复方中药，由以下重量份的原料药组成：

常山20～30份，鸦胆子20～30份，苦参10～20份，何首乌10～20份，肉桂10～20份，白头翁5～15份；

根据本发明优选的，治疗球虫的兽用复方中药，由以下重量份的原料药组成：

常山30份，鸦胆子20份，苦参15份，何首乌15份，肉桂15份，白头翁10份。

一种治疗球虫的兽用复方中药的口服液，由上述治疗球虫的复方中药按现有药学上可接受的工艺制成口服液。

上述治疗球虫的兽用复方中药的口服液的制备方法，步骤如下：

a.将常山、鸦胆子、苦参、肉桂、何首乌粉碎，按重量比加入10～15倍纯化水，煎煮至沸腾；

b.再加入白头翁继续煎煮0.8～2小时，过滤，制得一次滤液，滤渣按重量比加10～15倍纯化水，煎煮至沸腾，继续煎煮0.75～1小时，过滤，制得二次滤液，合并一次滤液和二次滤液，制得药液；

c.将步骤b制得的药液浓缩至相对密度≥1.05，然后加入乙醇溶液，使乙醇质量浓度为65%～70%，冷藏后，过滤，收集上清液，制得一次上清液和浓缩渣；

d.将步骤c制得的浓缩渣与其重量7～9倍的65%～70%的乙醇溶液混合，冷藏，过滤，收集上清液，制得二次上清液，合并步骤c制得的一次上清液和二次上清液，回收乙醇，加入山梨酸钾，灌装，灭菌，即得。

根据本发明优选的，所述步骤c中的浓缩步骤的条件为：相对压力-0.06～-0.09MPa，温度40～60℃。

根据本发明优选的，所述步骤c中的乙醇溶液为质量浓度95%的乙醇溶液。

根据本发明优选的，所述步骤c中的冷藏条件为4℃冷藏20～30小时。

根据本发明优选的，所述步骤d中的冷藏条件为4℃冷藏10～15小时。

根据本发明优选的，所述步骤d中的回收乙醇步骤如下：40℃蒸汽加热，真空度达到-0.06～-0.08MPa，乙醇蒸汽连续通过一级、二级冷凝器冷凝后，收集液体。回收乙醇浓度可达到85%以上。

根据本发明优选的，所述步骤d中的山梨酸钾按质量百分比为0.005～0.2%的加入量添加。山梨酸钾的加入可以有效延长产品的储存时间。

有益效果

本发明无耐药性、毒副作用小，对球虫有良好的治疗作用。且充分利用现代化的中药提取技术提取中药的活性成分，制成可以饮水的口服液剂型，既有利于中药药效的发挥，也便于临床的应用。避免了过去中药“粗、大、黑”的特点。将现代化的研究技术应用到传统中兽药的研究上来。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

原料均采用《中国兽药典》2010版中记载的药物，均为普通市售产品。

实施例1

一种治疗球虫的兽用复方中药，由以下重量份的原料药组成：

常山16kg、鸦胆子7kg、苦参30kg、何首乌5kg、肉桂5kg、白头翁3.5kg。

上述治疗球虫的兽用复方中药的口服液的制备方法，步骤如下：

a.将常山、鸦胆子、苦参、肉桂、何首乌粉碎，加纯化水500L浸润，煎煮至沸腾；

b.再加入白头翁继续煎煮1小时，过0.45μm微孔滤膜，制得一次滤液，然后将滤渣与400L纯化水混合，煎煮至沸腾，继续煎煮45分钟，过0.45μm微孔滤膜，制得二次滤液，合并一次滤液和二次滤液，制得药液；

c.将步骤b制得的药液浓缩至相对密度≥1.05，浓缩条件为：相对压力-0.06MPa，温度60℃，然后加入乙醇，使乙醇质量浓度为65%，4℃冷藏24小时后，过0.45μm微孔滤膜，收集上清液，制得一次上清液和浓缩渣；

d.将步骤c制得的浓缩渣与300L的质量浓度为65%的乙醇溶液混合，4℃冷藏12小时，过0.45μm微孔滤膜，收集上清液，制得二次上清液，合并步骤c制得的一次上清液和二次上清液，减压冷凝回收乙醇，按质量百分比为0.1%的量加入山梨酸钾，经自动定量灌装机按100ml/瓶灌装，封口，流通蒸汽灭菌器，121℃，灭菌20分钟，抽检，检验合格，即得。

实施例2

如实施例1所述的治疗球虫的兽用复方中药，不同之处在于，由以下重量份的原料药组成：

常山50kg、鸦胆子1kg、苦参30kg、何首乌30kg、肉桂1kg、白头翁20kg。

实施例3

如实施例1所述的治疗球虫的兽用复方中药，不同之处在于，由以下重量份的原料药组成：

常山1kg、鸦胆子50kg、苦参1kg、何首乌1kg、肉桂30kg、白头翁1kg。

实施例4

如实施例1所述的治疗球虫的兽用复方中药，不同之处在于，由以下重量份的原料药组成：

常山30份，鸦胆子20份，苦参15份，何首乌15份，肉桂15份，白头翁10份。

对比例1

如实施例1所述的治疗球虫的兽用复方中药，不同之处在于，由以下重量份的原料药组成：

常山16kg、鸦胆子7kg、苦参30kg、白头翁3.5kg。

临床效果试验

l.材料与方法

1.1虫种的来源及传代  试验用的球虫卵囊由金牧养殖有限公司发病鸡中通过单卵囊分离技术获得，单卵囊分离技术可采用《鸡球虫单卵囊分离技术与雏鸡感染试验》（《动物医学进展》2006年27卷03期，国际标准刊号：ISSN1007-5038）中记载的方法进行。经过滤、沉淀，2.5wt％重铬酸钾28℃保存，经3d孢子化后，经10日龄817肉鸡传代，再经孢子化后备用。

1.2药物来源及使用浓度

试验用药：根据实施例1制得的治疗球虫的兽用复方中药的口服液，治疗球虫的兽用复方中药的口服液分别以0.3wt%，0.4wt%，0.5wt%的比例兑水饲喂；对比例1以0.5wt%的比例兑水饲喂；

1.3试验动物  试验用动物为817肉鸡，购自聊城市畜牧兽医研究所孵化厂。

1.4试验动物的饲养及分组  1日龄817肉鸡饲养在消毒后的垫料上，饲喂聊城市康达饲料公司的肉雏鸡料。实验前显微镜检查粪便无球虫卵囊。于12日龄称重并随机分成6组，分别是：

Ⅰ组为服用实施例1治疗球虫的兽用复方中药的口服液高剂量组；

Ⅱ组为服用实施例1治疗球虫的兽用复方中药的口服液中剂量组；

Ⅲ组为服用实施例1治疗球虫的兽用复方中药的口服液低剂量组；

Ⅳ组为氨丙啉组；

Ⅴ组为感染对照组(攻虫)；

Ⅵ组为健康对照组；

Ⅶ组为服用对比例1制得的口服液。

Ⅷ组为服用按实施例2制得的口服液，以0.5wt%的比例兑水饲喂；

Ⅸ组为服用按实施例3制得的口服液，以0.5wt%的比例兑水饲喂；

Ⅹ为服用按实施例4制得的口服液，以0.5wt%的比例兑水饲喂；

每组15只，记录初始重。分组后各组分开饲养在消毒后的不同笼中。各组饮水器、料桶大小一致，便于观察各组饮水量、采食量。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别以0.5wt%（高剂量），0.4wt%（中剂量），0.3wt%（低剂量）的实施例1制得的治疗球虫的兽用复方中药的口服液兑水拌料；Ⅳ（氨丙啉组）0.01wt%氨丙啉饮水；Ⅴ组感染不给药组(感染对照组)和Ⅵ组不感染不给药组(健康对照组)，饲喂未加药的饲料。对每组饲料作称重记录，健康对照组一切用具和其他各组严格分开，以防止健康对照组被试验球虫感染。

1.5小肠球虫混合卵囊接种14日龄时，4个给药组、阴性对照组的每只鸡分别经口接种小肠球虫混合卵囊1.0×10⁵个。除健康对照组和感染对照组外，其余各组当天开始按照1.4的用量开始用药。直至8天结束。

1.6药效判定指标

1.6.1临床表现

试验期间观察和记录试验鸡的精神、食欲及粪便排出情况。感染后第5d开始每天检查粪便，记录血粪情况，直至扑杀。从感染后第5d开始每天进行粪便卵囊计数，连续三天，第8d剖检，重点检查肠道病变，根据Johnson的方法评分。

1.6.2相对增重率

14日龄早晨空腹称重，记为初重。试验结束时称末重，计算相对增重率。相对增重率(%)=(感染用药组的平均增重/健康对照组的平均增重)×100％。

1.6.3存活率

存活率=(存活只数/试验只数)×100％。

1.6.4血便记分

接种卵囊后第5、6、7、8d，参考Morehouse的方法，按以下标准记分：正常粪便0分；少量血便(1wt％～25wt％)1分；中等量血便(25wt％～50wt％)2分；许多血便(50wt％～75wt％)3分；无正常粪便4分。0分不作记录次数计。平均粪便记分=每组鸡粪便记分之和/记录次数。

1.6.5病变计分

按Johnson等的方法，做鸡的肠道病变记分。病变值=每组平均病变记分×10。摘取肠道，剪开洗净。根据剖检后肠道病变的严重程度记分。无病变记0分；轻微病变者记1分；肠壁增厚，有小到中等出血记2分；内有很多出血块记3分；因球虫病而死亡记4分。

1.6.6卵囊值

感染后第5～7d，收集粪便，计算每克粪便中的卵囊数(O.P.G)。以第六天的卵囊数为标准，计算卵囊值，方法见角田清的标准换算。即感染后的O.P.G值与感染对照组的O.P.G值的比值小于1wt％，卵囊值为0；在1wt％～25wt％时，卵囊值为5；在25wt％～50wt％时，卵囊值为10；在50wt％～75wt％时，卵囊值为20；在75wt％～100wt％时，卵囊值为40。

1.6.7抗球虫指数(ACI)

按照美国默克(Merck)公司的计计算公式，ACI=(存活率+相对增重率)－(病变值+卵囊值+血便计分)。ACI≤120为无效，ACI=120～160为中等有效，ACI=160～180为良好，ACI>180为优秀。

1.6.8中药对球虫感染雏鸡血清乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶活性的影响

分别于感染后0，3，6，8d，每组随机抽取5只鸡，心脏采血，分离血清-20℃保存，用于血清LDH和ALP活性的测定。测定方法采用酶联免疫吸附实验（ELISA），试剂盒购自联星泰安生物技术有限公司。

2．结果

2.1临床症状

感染孢子化卵囊第4d，感染对照组有少部分雏鸡精神出现沉郁，两三成群聚堆，闭眼静立，地面上有零星白色或褐色的稀粪出现。用药组和正常对照组（Ⅵ组）精神要好于感染对照组（Ⅴ组），偶见个别闭眼静立的鸡。第5天，除正常对照组（Ⅵ组）外，所有组均能见到精神沉郁，闭眼呆立的鸡，鸡活动范围和食欲下降明显，特别是感染对照组（Ⅴ组）和低剂量组扎堆的鸡数量多，和正常对照组相比，食料与饮水剩余均明显增多，部分鸡表现为羽毛蓬乱，闭眼静立，地上见到咖啡色粘稠样稀粪。高剂量组无论在精神状态，还是采食量上，要比低剂量组（Ⅲ组）强。第六天，鸡的精神状态和采食量没有好转的变化，特别是感染对照组的部分鸡精神沉郁，不愿动，极个别的鸡喘气，卧在一隅，见人后也不动。而高剂量（Ⅰ组）和中剂量（Ⅱ组）的鸡精神状态明显好于其他组。各组差别最大的是地上血便的数量，感染对照组（Ⅴ组）最多，高剂量（Ⅰ组）和中剂量组（Ⅱ组）相对少一些。第7天，感染对照组（Ⅴ组）的鸡死亡2只，精神状态变化不大。低剂量组（Ⅲ组）的精神状态好于感染对照组（Ⅴ组），其他组的精神状态和采食量要有一定好转，地上的血便数量不如前一天多。

健康对照组（Ⅵ组）雏鸡精神状态、饮食欲、粪便状态一直正常。

2.2试验前后各试验组体重的变化

试验前后各试验组鸡体重的变化见表l，和健康对照组（Ⅵ组）相比，球虫感染后引起了试验鸡增重及增重率下降。高剂量组（Ⅰ组）、中剂量组（Ⅱ组）增重率及相对增重率明显高于感染对照组（Ⅴ组），特别是Ⅰ组。低剂量组（Ⅲ组）与感染对照组（Ⅴ组）相比，增重率及相对增重率也大于感染对照组（Ⅴ组）。而没有何首乌与肉桂的常鸦球净口服液（Ⅶ组）增重率不及低剂量组（Ⅲ组），其增重率只比感染对照组（Ⅴ组）略高一点。在用药组之间，高剂量组（Ⅰ组）数值最高，说明实施例1制得的治疗球虫的兽用复方中药的口服液和氨丙啉有防止感染球虫鸡体重下降的作用。并且何首乌与肉桂对机体增重有明显作用。

表l  各试验组增重情况及增重率

2.3血便计分

感染对照组（Ⅴ组）从感染后第4d开始见血便，一直持续到试验结束。其他组在感染后第五天开始零星出现血便。感染后6～7天，各组血便数量均很多，但感染对照组血便程度最严重。高剂量组（Ⅰ组）、中剂量组（Ⅱ组）血便数量要少于低剂量组（Ⅲ组），如表2所示。

表2  试验鸡只的血便记分

2.4卵囊数

感染后5～7d各组卵囊计数结果见表3。从表3可知，感染后第6天，卵囊排出数量最多，第7天开始下降。高剂量组（Ⅰ组）卵囊排出数量一直低于其他试验组，感染对照组（Ⅴ组）卵囊排出数量一直高于其他试验组。第6天，氨丙啉组（Ⅳ组）排出的卵囊数量接近于中剂量组（Ⅱ组），低于低剂量组（Ⅲ组）；但是到第7天氨丙啉组（Ⅳ组）排出的卵囊数量接近于低剂量组（Ⅲ组），而高于中剂量组（Ⅱ组）。

表3  感染后不同天数各试验组卵囊计数结果

组别	感染后第5d	感染后第6d	感染后第7d
				Ⅰ组	2.30×104	8.70×104	2.02×104
Ⅱ组	4.03×104	3.50×105	5.19×104
				Ⅲ组	1.40×105	4.63×105	6.45×104

Ⅳ组	1.32×105	3.55×105	8.81×104
				Ⅴ组	6.10×105	8.61×105	3.50×105
Ⅶ组	2.32×104	8.73×104	2.06×104

2.5病理变化

试验结束时(22日龄)处死各组试验鸡进行剖检。感染鸡球虫的主要病变分布在小肠和盲肠。从小肠外观看，在小肠前端和中段的浆膜面都有弥漫性出血点、出血斑和白色斑，部分肠段外观肿胀，颜色变红。从盲肠外边看，盲肠两侧或一侧肿胀或鼓气，部分盲肠空虚。剖解开小肠后，可以见到肠粘膜肿胀，内容物呈糜烂样的食糜状，用剪刀刮去，可看到肠壁变薄，有出血点。剖解开盲肠后，可以看到盲肠内的红色粪便。用药组肠道病变的程度从轻到重的顺序依次是高剂量组（Ⅰ组）、中剂量组（Ⅱ组）、低剂量组（Ⅲ组），其中高剂量组（Ⅰ组）、中剂量组（Ⅱ组）的病变较轻，氨丙啉组（Ⅳ组）的病变较重。

2.6抗球虫药效综合判定结果

4种抗球虫药试验组的存活率、相对增重率、卵囊值、病变值和抗球虫指数结果见表4。可以看出，高剂量组（Ⅰ组）抗球虫指数大于160，达到良好。中剂量组（Ⅱ组）、低剂量组（Ⅲ组）和氨丙啉组（Ⅳ组）的抗球虫指数均小于160，但大于120，属于有效范围。未加何首乌与肉桂组（Ⅶ组）的相对增重率明显低于加入组。但从数值上看，抗球虫指数从大到小分别是高剂量组（Ⅰ组）、未加何首乌与肉桂组（Ⅶ组）、中剂量组（Ⅱ组）、氨丙啉组（Ⅳ组）和低剂量组（Ⅲ组）。而实施例2（Ⅷ组）、实施例3（Ⅸ组）、实施例4（Ⅹ组）的抗球虫指数与相对存活率都低于实施例1（Ⅰ组），而其卵囊值、病变值与血便计分都高于实施例1（Ⅰ组）。说明实施例1（Ⅰ组）组分比例为最优组合。

表4  4种抗球虫药的抗球虫效果

2.7试验药物对血清乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响

LDH广泛存在于机体的组织器官中，各组织器官病变都可释放LDH至血液中，使其活性增强。在感染后3d，6d，感染对照组鸡的血清LDH活性比正常组鸡的LDH分别提高了50.26%和83.47%，差异均达到极显著（p＜0.01）；Ⅰ组鸡的血清LDH活性与Ⅵ组鸡相比，Ⅰ组鸡的血清LDH活性在感染后3，6d分别升高了7%和19.62%，差异不显著（p＞0.05）；Ⅱ组鸡的血清LDH活性与Ⅵ组鸡相比，Ⅱ组鸡的血清LDH活性在感染后3d，6d分别提高了8.50%和28.79%，差异不显著（p＞0.05）；Ⅲ组鸡的血清LDH活性与Ⅵ组鸡相比，Ⅲ组鸡的血清LDH活性在感染后3d，6d分别提高了8.38%和40.75%，第六天差异显著（p＜0.05）；Ⅳ组鸡的血清LDH活性与Ⅵ组鸡相比，Ⅳ组鸡的血清LDH活性在感染后3d，6d分别提高了21.76%和60.64%，第六天差异显著（p＜0.05）。到第8天时，各组的LDH活性均开始下降（见表5）。

表5  试验药物对LDH活性的影响

2.8试验药物对血清碱性磷酸酶（ALP）活性的影响

在试验期间，除Ⅵ、Ⅶ组外，其他各组的血清ALP活性都明显提高，特别是在感染后第6天，ALP活性提高到最高值，Ⅰ组升高的幅度最大，达到初始量的165.39%。在第6天，Ⅱ组、Ⅲ组分别比Ⅵ组提高了41.01%（p＜0.05）、15.55%（p>0.05）。第8天，血清碱性磷酸酶的活性开始下降，说明肠道修复完成。

表6  试验药物对ALP活性的影响

由上述实验结果可以发现，在添加了何首乌和肉桂后，在抗球虫指数上无明显区别，但是在肠道修复及机体增重率上有明显的作用。肉桂在药理上具有温经通脉，助阳化气，散寒止痛的作用，而球虫在中医辨证上可以认为是外感瘟疫，伤及肺腑，使寒气阻滞于营血，导致津液损耗，阳气内陷而出现腹痛、下痢、便血的症状。所以，肉桂的温经散寒，解肌发表可以导致寒邪外出，而散寒止痛也可以缓解病鸡的肠道症状，在治疗球虫中可以作为辅助用药，但是肉桂辛、温，易伤阴动血，作为辅助用药时不可剂量过大。特别是对于球虫后期，由于病鸡血出耗阴，导致出现阴虚阳盛的体征，因此加入何首乌与肉桂配合使用发挥滋阴潜阳的功效。

Claims (10)

1.一种治疗球虫的兽用复方中药，由以下重量份的原料药组成：

常山1～50份，鸦胆子1～50份，苦参1～30份，何首乌1～30份，肉桂1～30份，白头翁1～20份；

所述原料药的来源为中药材或相当于上述中药材生药量的中药提取物。

2.如权利要求1所述的兽用复方中药，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：

常山20～30份，鸦胆子20～30份，苦参10～20份，何首乌10～20份，肉桂10～20份，白头翁5～15份。

3.如权利要求1所述的兽用复方中药，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：

常山30份，鸦胆子20份，苦参15份，何首乌15份，肉桂15份，白头翁10份。

4.一种治疗球虫的兽用复方中药的口服液，由权利要求1所述的兽用复方中药按现有药学上可接受的工艺制成口服液。

5.一种权利要求4所述治疗球虫的兽用复方中药的口服液的制备方法，其特征在于，步骤如下：

a.将常山、鸦胆子、苦参、肉桂、何首乌粉碎，按重量比加入10～15倍纯化水，煎煮至沸腾；

b.再加入白头翁继续煎煮0.8～2小时，过滤，制得一次滤液，滤渣按重量比加10～15倍纯化水，煎煮至沸腾，继续煎煮0.75～1小时，过滤，制得二次滤液，合并一次滤液和二次滤液，制得药液；

c.将步骤b制得的药液浓缩至相对密度≥1.05，然后加入乙醇溶液，使乙醇质量浓度为65%～70%，冷藏后，过滤，收集上清液，制得一次上清液和浓缩渣；

d.将步骤c制得的浓缩渣与其重量7～9倍的65%～70%的乙醇溶液混合，冷藏，过滤，收集上清液，制得二次上清液，合并步骤c制得的一次上清液和二次上清液，回收乙醇，加入山梨酸钾，灌装，灭菌，即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中的浓缩步骤的条件为：相对压力-0.06～-0.09MPa，温度40～60℃。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中的冷藏条件为4℃冷藏20～30小时。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中的冷藏条件为4℃冷藏10～15小时。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中的回收乙醇步骤如下：40℃蒸汽加热，真空度达到-0.06～-0.08MPa，乙醇蒸汽连续通过一级、二级冷凝器冷凝后，收集液体。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中的山梨酸钾按质量百分比为0.005～0.2%的加入量添加。