CN102603909A

CN102603909A - 一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖及提取分离方法

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Publication number: CN102603909A
Application number: CN2012100170253A
Authority: CN
Inventors: 张其清; 刘敏; 彭臻菲; 方哲翔
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-01-19
Also published as: CN102603909B

Abstract

本发明涉及海带多糖技术领域，特别是涉及一种同时具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖及其提取分离方法。所述提取分离方法，包括粗多糖的提取、海带多糖的分离、海带多糖的纯化，得到具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖，所述的海带多糖在制备抗氧化或抗肿瘤药物中的应用。本发明以抗氧化或抗肿瘤活性为依据，采用离子交换法对粗多糖进一步分离纯化，经试验证明，所得到的海带多糖具有更好的抗氧化和抗肿瘤活性，为制备抗氧化或抗肿瘤药物提供新的选择。

Description

一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖及提取分离方法

技术领域

本发明涉及海带多糖技术领域，特别是涉及一种同时具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖及其提取分离方法。

背景技术

海带( Laminaria japonica)在我国产量极其丰富。其药用价值在《本草纲目》、《神农本草经》和《食物本草》等传统医书中都已有记载。现代科学研究证明，海带具有多方面的保健功能，如降血脂、降血糖、抗血栓、抗肿瘤、抗辐射等。而海带的多种生物功能大多与海带中的生理活性多糖有关。

目前，海带多糖的提取主要是先提取粗多糖，然后再进一步分离纯化，再进行活性检测。这种方法不确定因素较多，而且分离过程中容易导致活性成分丢失，且提取分离的海带多糖不一定具有抗氧化或抗肿瘤活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是以抗氧化或抗肿瘤活性为依据，获得一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖及其提取分离方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取了以下技术方案：

本发明涉及一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖的提取分离方法，该方法包括如下步骤：

一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖的提取分离方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

a、粗多糖的提取：取干海带，粉碎为粉状，经乙醇脱脂后再用沸水提取，提取液浓缩后加入乙醇和氯化钙以除去褐藻酸，过滤，滤液加入乙醇沉淀，过滤，沉淀用水溶解，冷冻干燥得粗多糖WPS；

b、海带多糖的分离：取上述粗多糖WPS，溶于pH值为7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液，上DEAE阴离子交换柱，用含0.6 mol/L NaCl的 pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱2-5个柱体积，该洗脱液弃去，然后再用含1 mol/L NaCl的pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱2-5个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，冷冻干燥，即得多糖WPS-2；

c、海带多糖的纯化：取所述多糖WPS-2，溶于pH值为7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液，上DEAE阴离子交换柱，用含≤0.7 mol/L NaCl的pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱1-4个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，冷冻干燥，即得所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖。

所述步骤a为：取干海带，粉碎为粉状，加入无水乙醇脱脂，60℃水浴3小时，并不断搅拌，脱脂后过滤，将滤渣烘干后，加入蒸馏水，沸水提取2次，每次3小时，合并提取液，浓缩后加入无水乙醇和CaCl₂，使溶液中无水乙醇体积比为20%，CaCl₂质量体积比为0.2%（w/v），除去褐藻酸，过滤后的滤液加入占滤液体积75%的无水乙醇，静置6小时，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，最后冷冻干燥得粗多糖WPS。

所述步骤b为：取所述粗多糖WPS，溶于pH值为7.4的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上离子交换柱，用含0.6 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液洗脱4个柱体积，洗脱液弃去；然后，再用含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液的洗脱5个柱体积，洗脱液经截留分子量≤ 7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，真空冷冻干燥，即得所述多糖WPS-2。

所述步骤c为：取所述多糖WPS-2，溶于pH值为7.4的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上DEAE阴离子离子交换柱，用含0.7 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液洗脱3个柱体积，洗脱液经截留分子量≤ 7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，真空冷冻干燥，即得所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖。

所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖的分子量为80KDa。

本发明还提供了一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖，该海带多糖由上述提取分离方法制备得到的，其分子量为80KDa。本发明还提供了所述的海带多糖在制备抗氧化或抗肿瘤药物中的应用。

本发明以抗氧化或抗肿瘤活性为依据，采用离子交换法对粗多糖进一步分离纯化，经试验证明，所得到的海带多糖具有更好的抗氧化和抗肿瘤活性，为制备抗氧化或抗肿瘤药物提供新的选择。

附图说明

图1为粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1对超氧自由基的清除力示意图；

图2为粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1对羟自由基的清除力示意图；

图3为粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1对A375细胞的抑制率示意图；

图4为粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1对AGS细胞的抑制率示意图；

图5为粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1对正常血管平滑肌细胞毒性示意图；

图6为粗多糖WPS过离子交换柱示意图，第二个峰即为WPS-2；

图7为WPS-2过离子交换柱示意图。

具体实施方式

实施例 1：海带粉碎后，取海带干粉80g，加入1.6L无水乙醇脱脂，60℃水浴3小时，并不断搅拌。脱脂后过滤，滤渣烘干后称取60 g，加入3 L蒸馏水，沸水浴提取2次，每次3小时，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至2 L。缓慢加入500 mL无水乙醇和5 g CaCl₂，静置12小时以除去褐藻酸。过滤，加入占终体积75%的无水乙醇，静置6小时。过滤后的沉淀用蒸馏水溶解，真空冷冻干燥，即得粗多糖WPS。

取粗多糖WPS溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，配制成多糖含量10mg/mL的溶液70mL，上样于2.6×20cm DEAE A-25离子交换柱，用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的0.6 mol/L的NaCl洗脱4个柱体积，所得洗脱液弃去。然后再用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的1 mol/L的NaCl洗脱5个柱体积，洗脱液经截留分子量7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，真空冷冻干燥，即得多糖WPS-2。

取WPS-2，溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上样于2.6×20cm DEAE A-25离子交换柱，用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的0.7 mol/L的NaCl洗脱3个柱体积，洗脱液经截留分子量7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，低温真空冷冻干燥，即得多糖WPS-2-1。

取制得的海带多糖WPS-2-1，溶于水后，制成浓度为2 mg/mL的溶液，上样TSK-GEL G3000 PWXL柱（7.8 mm×300 mm)。流速0.5 mL/min，ELSD 800检测器检测发现为单一多糖峰，表明其为分子量均一的多糖。凝胶渗透色谱法测定多糖分子量为80 KDa，所用已知标准品为150 KDa，80 KDa，3 KDa，1.5 KDa。

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法：将多糖用蒸馏水稀释至适当浓度后取0.5 mL，加入0.8%苯酚溶液0.5 mL，然后加入浓硫酸2.5 mL，混匀后静置。待试管冷却后，于490 nm下测吸光度。

实施例2：海带粉碎后取海带干粉，加入体积为干粉质量20倍的无水乙醇脱脂，60℃水浴3小时，并不断搅拌。过滤，滤渣烘干，加入体积为其质量50倍的蒸馏水，沸水浴提取3次，每次2小时，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩后缓慢加入无水乙醇和CaCl₂，使溶液中无水乙醇所占体积比为20%，CaCl₂质量体积比为0.2%（W/V），静置16小时以除去褐藻酸。过滤，加入占终体积75%的无水乙醇，静置10小时。过滤后的沉淀用蒸馏水溶解，真空冷冻干燥，即得粗多糖WPS。

取粗多糖WPS溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，配制成多糖浓度为10 mg/mL的溶液70 mL，上样于2.6×20 cm DEAE A-25离子交换柱，用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的0.6 mol/L的NaCl洗脱4个柱体积，所得洗脱液弃去。然后再用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的1 mol/L的NaCl洗脱5个柱体积，洗脱液经截留分子量7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，低温真空冷冻干燥，即得多糖WPS-2。

取WPS-2，溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上样于1×15 cm DEAE A-25离子交换柱，用溶于pH值为7.4的浓度为0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液的0.7 mol/L的NaCl洗脱3个柱体积，洗脱液经截留分子量7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，低温真空冷冻干燥，即得多糖WPS-2-1。

WPS-2-1分子量测定如实施例1，测定多糖分子量为80 KDa。

实施例3：对上述实施例1和2所制得的粗多糖WPS和WPS-2及WPS-2-1的体外清除超氧自由基能力、体外清除羟自由基能力和体外抗肿瘤活性进行了测定：

1、样品：粗多糖WPS、WPS-2和WPS-2-1

2、实验方法：

2.1、超氧自由基清除力实验方法：采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产超氧阴离子自由基体系测定海带多糖对超氧自由基(O₂ ^-·)的清除力。各组依次加入75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)1 mL、样品0.2 mL（对照组用蒸馏水代替）、0.1 mol/L盐酸羟胺溶液0.1 mL、75 mmol/L黄嘌呤溶液0.1 mL和0.037 U/mL黄嘌呤氧化酶溶液0.1 mL，混匀后37℃孵育30 min。再加入2 mL显色剂（0.4 g /L甲萘胺+ 4 g/L对氨基苯磺酸），混匀后静置5 min，530 nm下测吸光度。根据公式计算出清除率。每个样品在同样条件下独立实验不少于3次，以保证实验可重复性。

2.2、羟自由基实验方法：采用Fenton反应原理产生羟自由基，用番红染料显色来测定海带多糖对羟自由基的清除力。各组依次加入0.15 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)1 mL、0.04 mg/mL番红溶液1 mL、蒸馏水1 mL、0.945 mmol/L的EDTANa-Fe²⁺溶液(pH 7.4)0.5 mL、样品0.5 mL和1%H₂O₂溶液0.5 mL，于37℃孵育30 min，对照组样品用蒸馏水代替，空白组EDTANa-Fe²⁺溶液和样品用蒸馏水代替。在520 nm下检测吸光度。根据公式计算出清除率。每个样品在同样条件下独立实验不少于3次，以保证实验可重复性。

2.3、 MTT实验方法：样品对细胞株增殖的抑制活性按MTT法检测。处于对数生长期的细胞经0.25%胰酶处理后，用血球计数板计数，配成2.5×10⁵个/mL的细胞悬液。然后往96孔板各孔中加入0.2 mL混匀的细胞悬液，24小时后吸出溶液，加入不同浓度的多糖样品（用培养液稀释，对照组用培养液代替）0.1 mL孵育24小时，每个浓度做6个平行孔。然后加入MTT（0.1mg/孔），孵育4小时后吸出，加入0.2 mL/孔 DMSO溶解结晶紫，于578 nm下测吸光度。实验结果用SPSS 13.0软件分析。正常血管平滑肌细胞与癌细胞实验方法一致。

3、实验结果：

3.1、由图1、图2、表1和2可知，WPS-2在浓度为1mg/mL时，其对超氧自由基的清除率为36.23%，进一步分离后，WPS-2-1对超氧自由基的清除率上升为48.22%。海带多糖对羟自由基的清除力更高，在3 mg/mL时，WPS-2-1几乎达到100%。由图3、图4、表3和4可知，当浓度达到2 mg/mL时，WPS-2-1对A375细胞和AGS细胞的抑制率分别达到63.55%和61.98%。抗肿瘤实验进一步证明，单位质量样品多糖含量越高，样品抗肿瘤活性越高。由图5和表5说明，随着单位质量多糖含量的增高，其对正常的血管平滑肌细胞的毒性呈负相关。当浓度为2mg/mL时，WPS-2-1对血管平滑肌细胞的毒性低至11.73%。

表1海带粗多糖WPS、WPS-2及WPS-2-1对超氧自由基的清除率（%）

Figure 2012100170253100002DEST_PATH_IMAGE002

表2 海带粗多糖WPS、WPS-2及WPS-2-1对羟自由基的清除率（%）

表3 海带粗多糖WPS、WPS-2及WPS-2-1对A375细胞增殖的抑制率（%）

Figure 2012100170253100002DEST_PATH_IMAGE006

表4 海带粗多糖WPS、WPS-2及WPS-2-1对AGS细胞增殖的抑制率（%）

表5海带粗多糖WPS、WPS-2及WPS-2-1对正常血管平滑肌细胞毒性(%)

Figure 2012100170253100002DEST_PATH_IMAGE010

Claims

1.一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖的提取分离方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

b、海带多糖的分离：取上述粗多糖WPS，溶于pH值为7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液，上DEAE阴离子交换柱，用含0.6 mol/L NaCl的 pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱2～5个柱体积，该洗脱液弃去，然后再用含1 mol/L NaCl的pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱2～5个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，冷冻干燥，即得多糖WPS-2；

c、海带多糖的纯化：取所述多糖WPS-2，溶于pH值为7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液，上DEAE阴离子交换柱，用含≤0.7 mol/L NaCl的pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱1~4个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，冷冻干燥，即得所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖。

2.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于：所述步骤a为：取干海带，粉碎为粉状，加入无水乙醇脱脂，60℃水浴3小时，并不断搅拌，脱脂后过滤，将滤渣烘干后，加入蒸馏水，沸水提取2次，每次3小时，合并提取液，浓缩后加入无水乙醇和CaCl₂，使溶液中无水乙醇体积比为20%，CaCl₂质量体积比为0.2%（w/v），除去褐藻酸，过滤后的滤液加入占滤液体积75%的无水乙醇，静置6小时，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，最后冷冻干燥得粗多糖WPS。

3.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于：所述步骤b为：取所述粗多糖WPS，溶于pH值为7.4的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上离子交换柱，用含0.6 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液洗脱4个柱体积，洗脱液弃去；然后，再用含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液的洗脱5个柱体积，洗脱液经截留分子量≤ 7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，真空冷冻干燥，即得所述多糖WPS-2。

4.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于：所述步骤c为：取所述多糖WPS-2，溶于pH值为7.4的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，上DEAE阴离子离子交换柱，用含0.7 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液洗脱3个柱体积，洗脱液经截留分子量≤ 7000 MW透析袋透析除盐后浓缩，真空冷冻干燥，即得所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖。

5.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于：所述具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖的分子量为80KDa。

6.一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的海带多糖，其特征在于，该海带多糖是按权利要求1～4中任一项所述提取分离方法制备得到的，其分子量为80KDa。

7.如权利要求6所述的海带多糖在制备抗氧化或抗肿瘤药物中的应用。