CN1858067A - 自玉足海参中提取玉参多糖的方法,该玉参多糖及其药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供自玉足海参中提取玉参多糖的方法，该方法包括使玉足海参粉碱解、酶解、去除酸性蛋白、醇沉等步骤。所得的玉参多糖含有55％(重量)以上的玉足海参总多糖。所述的玉参多糖具有减少脑缺血、改善软脑膜微循环、防止血小板聚集及血栓形成和明显的抗凝作用，因而该玉参多糖可用于制备治疗缺血性脑中风及血液栓塞性疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及自玉足海参中提取玉参多糖的方法，该玉参多糖本身及该玉参多糖的药物用途。
背景技术
缺血性脑中风及血液栓塞性疾病是常见而多发的疾病，这类病严重地威胁着人类的健康。为防治这类疾病，人们开发了多种药物。中医药界为此做出了自己的贡献。按照中医理论，海参具有滋阴养血、活血通络、补肾益精的功效。然而简单地通过食用海参并不能有效地防治缺血性脑中风及血栓性疾病，其原因在于：1.不同种类的海参中所含的有效物质的量以及其组成有很大的差异；2.简单地食用海参无法准确地控制有效物质的摄入量。因此，选择适宜的海参，从中提出有效物质并将其用于制药是本发明的目的。
发明内容
本发明的自玉足海参中提取玉参多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将玉足海参破碎成粉；
(2)用NaHCO3将所得玉足海参粉碱解，然后再用木瓜蛋白酶使其酶解；
(3)将上述碱解、酶解产物经低温静置后取上清液；
(4)在PH值为2的条件下，去除所得上清液中的酸性蛋白后，将其浓缩至1.05-1.10的相对密度；
(5)往所得浓缩物中加入乙醇后，提取沉淀物；
(6)将所得沉淀物经溶解，脱色和低温处理后，提取上清液；
(7)往所得上清液加乙醇，使其产生沉淀，然后提取该沉淀物，即玉参多糖。
所述玉参多糖的用途为制造用于治疗缺血性脑中风及血液栓塞性疾病的药物。
本发明所用的玉足海参Holothuria(Mertensiothuria)Leucospilota(Brandt)是经本发明人多次筛选后发现的一适用的海参。所述的玉参多糖是本发明人定义的用本发明的方法自玉足海参中得到的提取物，它含有55％(重量)以上的玉足海参总多糖，其余主要是玉足海参蛋白、无机盐和水等非活性物质。所述的玉足海参多糖是有效物质，它具有延长凝血时间、推迟血栓形成、降低血粘度和血小板聚集率及改善软脑膜微循环和缩小脑梗塞面积的功效。玉参多糖中的玉足海参总多糖由占72％(重量，下同)的硫酸粘多糖和占28％的聚岩藻糖硫酸酯组成。所述的硫酸粘多糖是一种抗凝活性最强的一种多糖，但其提纯工艺十分复杂，而且成本高昂，而玉参多糖的提取工艺则相对简单，成本也低，尽管其中含有玉参蛋白等非有效物质，但用其制备用于口服的药物已足以达到发明目的了。
用本发明的方法提取的玉参多糖对治疗缺血性脑中风及血液栓塞性疾病的动物实验已经完成，结果表明：经灌服玉参多糖后，大鼠因三氯化铁所致大脑缺血的行为障碍得到明显改善，梗塞面积缩小，脑部血流量增加；小鼠灌服玉参多糖后，其凝血时间明显延长。
本发明药物的急毒性实验表明，该药基本无毒。小鼠的最大耐受量为109.2g/kg体重，相当于70kg体重成人日用量的471倍。长期毒性试验表明，实验动物的脏器系数与对照组比较无明显改变。系统尸检结果表明，全部实验动物均无异常，可见本发明的药品是安全可靠的。
本发明的药物的制备工艺由于只提取玉参多糖而相对简单，而用所得的玉参多糖来制备口服制剂其纯度已是足够的了。
按本发明的方法提取的玉参多糖可按需要制成适于口服的各种固体剂型，如胶囊、片剂或颗粒。
下面通过具体实施方式具体地说明本发明。
具体实施方式
实施例1，取玉足海参干品1000g，粉碎成粉(粒度在20目以下)，用10％的NaHCO3溶液8000ml，将其于55-60℃碱解8h；用60mol/L HCL将PH调至8，加木瓜蛋白酶10g于55-60℃酶解10h，95℃灭活30min，于0-5℃静置过夜，取清液，用6mol/L HCL调整PH至2.0后，静置1h，取清液，再用1mol/LNaOH调整PH至8.0后，清液于薄膜蒸发器中浓缩至相对密度1.05-1.10(室温)。浓缩液中加乙醇，调整到含醇为50％，静置过夜，收集沉淀物，即为粗品。
将粗品溶于适量水中，用1mol/L NaOH调整PH至8-9，加NaHSO3及30％H2O2脱色，置于0-5℃冰箱中过夜。次日，取上清液加乙醇调整含醇量至50％，静置过夜。次日，收集沉淀物，用无水乙醇洗涤三次，干燥后即得40-50g玉参多糖粉末，其中，含玉足海参总多糖在55％以上。
实施例2，
1.受试药品及配置
(1)将得自实施例1的玉参多糖粉末用1％羟甲基纤维素钠(CMC-Na)配成的，10、20、40mg/ml的混悬液；
(2)阿司匹林：天津力生制药厂生产，批号971009，含量99.74％。
(3)红四氰唑(TTC)：上海试剂三厂，批号：970410。
(4)三氯化铁：天津化学试剂三厂，批号：920410。
(5)高分子右旋糖苷：中国医学科学院血液研究所提供，分子量：300,000，为10％的消毒生理盐水溶液，安瓶封装，每支10ml。
(6)天保宁银杏叶片：中国科学院药物研究所、浙江康恩贝制药有限公司生产，批号：980601，每片含银杏叶片精提物40mg。实验时以1％的羟甲基纤维素钠(CMC-Na)配成40mg/ml和5mg/ml的混悬液；
(7)人工脑脊液：葡萄糖0.67g，KCl 0.22g，NaCl 7.3g，NaHCO3 2.1g，CaCl2 0.28g，MgCl22H2O 0.24g，尿素0.36g，以蒸馏水溶解并配成1000ml的溶液。
(8)二磷酸腺苷(ADP)：SIGMA公司产品；
(9)花生四烯酸：SIGMA公司产品；
(10)胶原：称取大鼠腹部去毛皮肤1g，加入10ml生理盐水，于冰水浴中研磨成匀浆，3000rpm离心10min，取上清液，再以8000rpm离心10min，取上清液制得100mg/ml母液；
2.实验动物
(1)昆明种小鼠：动物合格证：津实动设施准第001号；
(2)Wistar大鼠：动物合格证：津实动设施准第001号；
3.实验方法与结果
一.对局灶性脑缺血影响的检测
Wistar雄性大鼠，体重278±13kg(250-300g)，按体重随机分为5组，每组10只，对照组每天灌服1％CMC-Na，给药组分别灌服玉参多糖50、100、200mg/kg，阳性对照组灌服阿斯匹林200mg/kg。给药体积均为0.5ml/100g，每天一次，连续7天，于末次给药后1h腹腔注射12％水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，侧卧位固定，在手术显微镜下，于外耳道与眼外眦连线中点切开皮肤，暴露额骨，铰断，于颅骨底处开约2mm直径小颅窗，暴露大脑中动脉，置一片塑料薄膜保护血管周围组织，将吸有10毫升50％三氯化铁的直径约2mm滤纸敷在该段动脉上，30分钟后去掉滤纸，用生理盐水棉球冲洗局部组织数次，逐层缝合后，回笼饲养。于术后4、8、12h进行动物行为评分，以此作为脑功能障碍的指标。评分采用盲法，即评分者不知道给药的情况，评分标准如下：(1)提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕、肘的屈曲又有肩内旋者，分别计为1、2、3和4分；(2)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力，如双侧阻力对等且有力者，记为0分；如向手术对侧推动阻力下降者，根据下降的程度不同分为轻、中、重3度，分别记为1、2、3分；(3)将动物置一金属网上，观察前两肢的张力，双侧肌力对等有力者计为0分；同样，根据手术对侧前肢张力的下降程度不同记为1-3分；(4)动物无转圈者计为0分，有向一侧转圈行为者计1分，向一侧不停转者计为2分，根据上述标准满分为12分，分数越高，表明动物行为障碍越严重。24小时评分结束后，断头取脑，肉眼观察对照组动物病灶侧脑表面苍白、无光，脑组织水肿明显，给药组大多数动物脑水肿较对照组轻，且病灶侧脑苍白无光不明显。而后将脑放入生理盐水中，保留双侧大脑半球称重，沿冠状面切成5片，将脑切片放入1％的TTC染液中，37℃避光温孵30min，正常组织呈玫瑰红色，梗塞区呈白色，将梗塞部位剪下称重，以“重量求面积法”计算梗塞组织重量占双侧大脑半球重的百分比作为梗塞范围。结果见表1、2。
表1玉参多糖对局部脑缺血大鼠行为的影响(X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 行为评分 | ||
| 4 | 6 | 24(h) | |||
| 假手术模型对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖阿斯匹林 | --0.5ml/100g50100200200 | 101010101010 | 0.5±0.47.8±4.1+++5.9±3.45.2±3.84.8±3.46.3±3.7 | 0.7±0.610.0±2.6+++6.3±3.6*5.5±4.0**4.1±3.5***5.0±2.8*** | 0.6±0.69.1±2.8+++5.2±2.8**3.2±3.0***2.8±1.5***2.9±2.0*** |
注：1.与假手术组比较：+++p＜0.01；
2.与对照组比较：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
3.与等剂量的阿斯匹林组比较无显著差异。
从表1的结果可以看出，假手术组动物行为无明显改变，给与1％CMC-Na模型组动物与假手术组动物的行为评分比较有明显的差异(p皆＜0.001)，大鼠灌服玉参多糖50、100、200mg/kg后，其行为变化与对照组比较有明显的改善，24h后行为评分分别降低了42.9％(p＜0.01)，64.8％(p＜0.001)、69.2％(p＜0.001)。阳性药阿斯匹林作用明显。
表2玉参多糖对局部脑缺血大鼠脑梗塞面积的影响(X±SD)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 梗塞范围(％) |
| 假手术模型对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖阿斯匹林 | ---0.5ml/100g50100200200 | 101010101010 | 0.011.1±6.45.7±4.1*3.5±3.3**2.1±1.4***2.8±2.4** |
注：与模型对照组比较：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
与等剂量的阿斯匹林组比较无显著差异。
表2结果表明，给予1％CMC-Na模型组动物与假手术组动物比较梗塞范围明显，灌服玉参多糖50、100、200mg/kg后可明显减少脑缺血大鼠脑梗塞面积。与对照组比较平均缩小了49.0％(p＜0.05)，68.5％(p＜0.01)、81.1％(p＜0.001)，且随剂量增高梗塞范围缩小，阳性药阿斯匹林作用明显。
二.对软脑膜微循环障碍大鼠局部血流量的影响
体重286±18g(260-310g)雄性Wistar大鼠，按体重随机分5组，每组10只，对照组每天灌服1％CMC-Na，给药组分别灌服玉参多糖50、100、200mg/kg，阳性药灌服天保宁200mg/kg，给药体积均为0.5ml/100g，每天一次，连续7天，于末次给药后30分钟腹腔注射12％水合氯醛350mg/kg麻醉，卧位固定于立体定位仪上，在大鼠左侧顶骨中央开一直径约5mm的颅窗，暴露软脑膜，37℃人工脑脊液间断滴注以保持脑膜表面湿润，用Jl-200A激光微循环动态分析仪测定软脑膜微血流量、流速激光多普勒值(laser Doppler，LD)，此为造型前值，而后给大鼠静脉快速推注分子量为30万的高分子右旋糖苷4ml/kg造成微循环障碍模型，观察造型后15、30、45、60min后流量与流速的变化，结果见表3、4。
表3玉参多糖对微循环障碍大鼠软脑膜局部血流量的影响(X±SD，n＝10)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 造型前 | 造型后 | |||
| 15min | 30min | 45min | 60min | |||
| 溶剂对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖天保宁 | --50100200200 | 38.8±4.0△35.7±4.1△38.3±5.8△38.3±6.6△38.8±4.8△ | 31.0±10-7.8±8.7*37.8±4.42.1±3.836.5±6.4-1.8±6.737.5±7.3-0.8±5.233.6±7.5-3.7±5.9 | 24.1±9.1-14.1±7.4**34.3±5.7**-1.4±6.834.3±4.5**-4.0±8.836.0±8.4**-2.3±3.932.6±7.8*-4.2±5.9 | 22.8±7.0-16.0±5.431.5±5.2**-4.2±7.136.4±6.8***-1.9±7.335.9±7.8***-2.4±5.331.6±8.4*-4.4±8.3 | 21.4±5.7-17.4±4.331.6±7.2**-4.1±8.337.8±8.6***-0.5±8.636.4±7.2***-1.9±3.733.5±7.0***-3.3±6.1 |
注：溶剂对照组比较：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
△：造型前后差值。
表4玉参多糖对微循环障碍大鼠软脑膜局部血流速的影响(X±SD，n＝10)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 造型前 | 造型后 | |||
| 15 | 30 | 45 | 60min | |||
| 溶剂对照玉参多糖天保宁 | --50100200200 | 5.3±0.5△5.6±0.5△5.6±0.6△5.4±0.4△5.3±0.5△ | 5.1±0.7-0.2±0.55.7±0.70.1±0.46.0±0.6**0.3±0.65.9±0.6*0.6±0.7#5.2±0.6-0.1±0.4 | 4.8±0.5-0.4±0.25.7±0.7**0.1±0.95.6±0.8*-0.1±0.85.8±0.8*0.4±0.85.2±0.70.1±0.6 | 4.7±0.5-0.5±0.45.6±0.6**-0±0.85.5±0.9*-0.2±0.85.9±0.7***0.4±0.95.1±0.6-0.2±0.4 | 4.8±0.7-0.5±0.65.7±1.0*-0.1±1.15.8±0.9*-0.1±0.65.8±0.7**0.4±0.85.2±0.60±0.5 |
注：与造型前配对比较：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
△：造型前后差值；
与等剂量天保宁组比较：#p＜0.05。
结果表明，静脉推注高分子右旋糖苷15、30、45、60min后，对照组大鼠脑膜局部流量、流速明显减少(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，给药组流量、流速未见明显变化(p＞0.05)，其中高剂量组流速还有所增加(p＜0.05)，与对照组比较，给药组流量明显增加；流速明显加快(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，与等剂量天保宁组比较流速有所增加(P＜0.05)，流量亦无明显差异；灌服天保宁后大鼠流量、流速亦无明显减少，与对照组比较流量有明显增加(P＜0.05.P＜0.001)。
三.对微循环障碍大鼠血粘度的影响
待上述试验结束后，大鼠腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠与全血按体积1∶9混合抗凝，用锥板型血液粘度计，在不同切速下(7.5--75s-1)测定大鼠全血粘度；另取10只正常大鼠；麻醉后作同样处理直接取血测定全血粘度作为空白对照组(表5)
表5.玉参多糖对微循环障碍大鼠全血粘度的影响(X±SD，n＝10)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 全血粘度 | |||
| 7.5s-1 | 18.8s-1 | 37.5s-1 | 75s-1 | ||
| 空白对照模型对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖天保宁 | ----50100200200 | 4.77±1.5012.42±2.9+++9.42±2.23*7.56±1.10***7.08±1.01***#8.40±1.41*** | 4.21±0.947.01±1.51+++6.05±1.585.47±0.82*5.59±1.10**#6.84±1.49 | 3.91±0.996.12±1.14+++5.64±1.135.20±0.72*5.11±0.78**#6.18±1.14 | 3.42±0.855.45±0.97+++5.05±1.014.82±.574.72±0.925.45±1.02 |
注：1.与空白对照组比较：+++P＜0.001；
2.与模型对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；
3.与等剂量天保宁组比较：#P＜0.05。
结果表明，玉参多糖明显降低血粘度；与空白对照组比较，造型组大鼠在静脉推注高分子右旋糖苷后，在不同切速下血粘度明显高于正常大鼠；给与玉参多糖50、100、200mg/kg后再切速为7.5-37.5s-1时大鼠血粘度均明显低于模型对照组(P＜0.05；P＜0.001)，且有一定的剂量相关性；在切速为75-1时，玉参多糖仍有降低血粘度的趋势，但无统计学差异，200mg/kg玉参多糖降低血粘度作用强于等剂量天保宁(P＜0.05)。
四.对大鼠试验性动脉血栓形成的影响
体重291±14g(270-320g)雄性Wister大鼠，按体重随机分为5组，每组10只，对照组大鼠每天灌服1％CMC-Na；给药组分别灌服玉参多糖50、100、200mg/kg；阳性对照组灌服阿司匹林200mg/kg，给药体积均为0.5ml/100g，每天一次；连续7天；于末次给药后1h腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，分离颈总动脉，将BT87-2型实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度探头挂于颈总动脉上，刺激强度为2mA，刺激5分钟后，关闭刺激开关，取下刺激电极，3分钟后，调节温控表至零位，记录动脉血栓形成时间，结果见表6。
表6玉参多糖对大鼠实验性动脉血栓形成的影响(X±SD)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 血栓形成时间(s) |
| 溶剂对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖阿斯匹林 | --50100200200 | 1010101010 | 666±106758±133793±122*828±132**831±142** |
注：与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01；
与等计量阿司匹林组比较无显著差异。
结果表明，大鼠口服玉参多糖50、100、200mg/kg后，与对照组比较，动脉血栓形成时间分别推迟14％(P＞0.05)、19％(P＜0.05)、24％(P＜0.01)，表明玉参多糖中高剂量能明显推迟大鼠试验性动脉血栓形成时间，阳性药物阿司匹林抗血栓形成作用明显。
五.抗大鼠血小板聚集作用
待上述试验结束后，大鼠主动脉取血，3.8％枸橼酸钠与全血按1∶9混合抗凝，1000rpm离心7min制备富血小板血浆(PRP)，3000rpm离心10min制备品血小板血浆(PPP)，应用SPA-3型PPP自动平衡血小板聚集仪，将生理盐水组各诱导剂诱导的血小板聚集百分数调至60％左右，诱导剂ADP、花生四烯酸、胶原终浓度分别为4μmol/L，2mmol/L，20mg/ml，观察对给药组大鼠血小板聚集作用的影响。结果见表7。
表7玉参多糖对大鼠血小板聚集功能的影响(n＝10，X±SD)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 血小板凝聚百分率(％) | ||
| ADP | 花生四烯酸 | 胶原 | |||
| 溶剂对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖阿斯匹林 | --50100200200 | 1010101010 | 51±1343±1535±15**32±9***39±11* | 64±1544±15**41±15***33±9***###10±5*** | 61±1050±9*49±18*38±12***45±14** |
注：与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；
与等剂量阿司匹林组比较###P＜0.001。
结果表明，大鼠灌服玉参多糖50、100、200mg/kg后，明显抑制ADP、花生四烯酸及胶原诱导的血小板聚集，与对照组比较对ADP、诱导的血小板聚集抑制率分别为16％(P＞0.05)、31％(P＜0.01)、37％(P＜0.001)；对花生四烯酸诱导的血小板聚集抑制率分别为31％(P＜0.01)、36％(P＜0.001)、48％(P＜0.001)、对胶原诱导的血小板聚集抑制率分别为18％(P＜0.05)、20％(P＜0.05)、38％(P＜0.001)；阳性药物阿司匹林抑制作用明显。
六.对小鼠凝血时间的影响
昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(1％CMC-Na)、玉参多糖200、400、800mg/kg组，阿司匹林200mg/kg组及天保宁200mg/kg，组，每鼠给药体积均为0.2ml/10g，连续灌胃7天，于末次给药后1小时分别剪断小鼠尾尖3mm，待血液自行溢出开始计时，每隔30秒用滤纸吸去血滴一次，直至血液自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为该鼠的凝血时间。结果见表8。
表8玉参多糖对小鼠凝血时间的影响(X±SD)
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 鼠数(只) | 凝血时间(min) |
| 溶剂对照玉参多糖玉参多糖玉参多糖阿斯匹林天保宁 | --200400800200200 | 101010101010 | 15′11″±7′24″20′37″±87′7″24′57″±11′3″*28′55″±10′42″**27′5″±12′9″*26′31″±11′29″* |
注：与对照组比较：*p＜0.05 **p＜0.01；
与等剂量阿司匹林组比较无显著差异
结果表明，小鼠灌服玉参多糖400、800mg/kg后，与对照组比对，明显延长小鼠凝血时间(p＜0.05，p＜0.01)，与等剂量天保宁组比较作用相似，阳性药物阿司匹林作用明显。
结论：
1.大鼠分别灌服玉参多糖50、100、200mg/kg，每天一次，连续7天可明显减少FeCl3引起的模型鼠脑缺血面积，并可明显改善其行为障碍。
2.大鼠灌服玉参多糖50、100、200mg/kg，每天一次，连续7天可对静脉推注高分子右旋糖苷所致的软脑膜微循环障碍有明显改善作用，与对照组比较血流量增加；血流速度加快，血黏度下降，说明该药具有改善脑部微循环的作用。
3.大鼠灌服玉参多糖50、100、200mg/kg，每天一次；连续7天能明显延迟大鼠试验性动脉血栓形成时间；并能明显抑制ADP、花生四烯酸、胶原诱导的血小板聚集、表明玉参多糖有一定的抗血小板聚集及血栓形成作用。
4.小鼠灌服玉参多糖400、800mg/kg后，能明显延长凝血时间，说明其有明显的抗凝作用。
Claims (3)
1.自玉足海参中提取玉参多糖的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将玉足海参破碎成粉；
(2)用NaHCO3将所得玉足海参粉碱解，然后再用木瓜蛋白酶使其酶解；
(3)将上述碱解、酶解产物经低温静置后取上清液；
(4)在PH值为2的条件下，去除所得上清液中的酸性蛋白后，将其浓缩至1.05-1.10的相对密度；
(5)往所得浓缩物中加入乙醇后，提取沉淀物；
(6)将所得沉淀物经溶解，脱色和低温处理后，提取上清液；
(7)往所得上清液加乙醇，使其产生沉淀，然后提取该沉淀物，即玉参多糖。
2.按权利要求1所述方法得到的玉参多糖。
3.权利要求2所述的玉参多糖在制造用于治疗缺血性脑中风及血液栓塞性疾病的药物中的应用。
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