CN102389449B - 一种灯盏细辛提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种灯盏细辛提取物及制备方法和应用。灯盏细辛提取物含有重量百分比的总黄酮1-40%、野黄芩苷0.1-5%、绿原酸0.05-3%、咖啡酸0.002-3%、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0.01-3%，其他成份2-98%，提取物为相对密度1.0-1.35g/ml的流浸膏或浸膏粉。生产操作简单、清洁无污染，比传统生产工艺相比更加减少成本、经济实际、环保安全；提取物中杂质少，对已知治疗心脑血管疾病起主要作用的有效成分如野黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸等成分含量均比传统工艺的高，范围明确，质量可控；剂型服用方便、吸收快，生物利用度高，携带方便，尤其适合老人、中风患者及吞服困难的患者服用在冠心病、心绞痛等的急性发作期服用可以迅速起效，有效地控制病情。

Description

一种灯盏细辛提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种灯盏细辛提取物及其制备方法和在制备心脑血管疾病防治药物和保健品中的应用。

背景技术

心脑血管疾病是严重影响人类健康的“第一杀手”，在我国位列疾病死因第一位，且发病率逐年上升。目前，我国有1.6亿人患高血压、动脉硬化等心脑血管疾病；40岁以上人群大约有57%左右的人患有不同程度的心脑血管疾病。城市死亡人数有近一半死于心脑血管疾病。我国心脑血管类的药物销售量居药品销售市场的第三位，仅次于感冒药与胃肠道药。

灯盏细辛始载于《滇南本草》，又名灯盏细辛、东菊，为菊科植物短葶飞蓬Eigeron breviscapus （vant）Hand—Mazz的干燥全草，主要分布于我国西南地区。本品辛、微苦，温，归心、肝经。具祛风散寒，活血通络止痛之功效，用于风寒湿痹痛，中风瘫痪，胸痹心痛，牙痛，感冒。民间应用其草本治疗半身不遂、关节活动不利、风湿等症。至今已从灯盏细辛中分离、鉴定出黄酮类化合物、咖啡酸酯类化合物、酚酸类、吡喃酮类、香豆素类、倍半萜化合物以及其它类化合物。现代药理研究表明：灯盏细辛有减慢心率、降低心肌收缩力、扩张冠脉血管和外周血管、降低外周血管阻力、减少心肌氧耗，增加心肌营养性血流、增强机体耐缺氧能力、降低血脂、血粘度，抑制血管内凝血和促进纤溶活性的功能。具有抗血栓、抗缺血，脑缺血再灌注神经损伤保护作用，防止急性心肌梗死再灌注损伤，保护微血管内皮细胞，改善血液流变学及高眼压的影响，抗肝纤维化和保护肝细胞，抗颊囊癌作用等广泛的药理作用。20世纪60年代末，以灯盏细辛制成肌内注射液用于临床治疗脑卒中后遗症、风湿性关节痛疗效较显著，90年代成功开发了静脉注射剂、片剂、颗粒剂等，其作为治疗和预防心血管等疾病具有特殊疗效的植物药材，市场前景广阔，经济价值很高。

近几十年在灯盏细辛的活血化瘀成分及其作用机理方面已经取得了很大进展，在众多的灯盏细辛化学成分中，黄酮类灯盏乙素(Scutellarin)含量最高(约1～2％)，被认为是灯盏细辛的主要活性成分，又名野黄芩苷(Scutellarin)，结构式为5，6，4 一三羟基黄酮一7一葡萄糖醛酸苷。目前，对灯盏花素的药理学活性研究主要是围绕其有效成分野黄芩苷进行。研究结果表明，野黄芩苷具有扩张血管、减少血小板计数和抑制血小板凝集等作用。临床主要用于脑梗死、中风后偏瘫、冠心病心绞痛及防治急性心肌梗死再灌注损伤等。

近代的研究也发现咖啡酰衍生物也是重要的活性成分，药理研究除扩张脑血管、降低脑血管阻力，增加脑血流量两，抗凝血作用外，又相继研究有防治微循障碍、抗心肌梗塞，增加冠动脉流量、耐缺氧作用，防止肾功能衰竭、抑制胆固醇合成、降低甘油三脂浓度、抑制15-脂氧酶、舒张平滑肌、抗血小板聚集、抑制组胺释放等活性，而且对乙肝病毒也有抑制作用。绿原酸具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚 （维生素E） 更强的自由基清除效果，可有效清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用。绿原酸的这种生物活性，对心血管系统能产生保护作用。

灯盏细辛提取物最常见的提取方法为用水或乙醇回流提取，合并提取液，浓缩。采用加入乙醇至一定浓度后，静置沉淀除去醇不溶性成分而达到澄清目的，醇沉过程中，有效物质极易被胶团包裹而造成有效成分的严重丢失，从而影响药物疗效，同时还需要耗用大量酒精。还有使用活性碳或硅藻土进行脱色过滤等常规方法，活性碳或硅藻土虽然对提取液的澄清作用明显，但是其吸附作用对有效成分野黄芩苷和咖啡酸类物质的损失影响较大。其他还有利用正丁醇进行萃取的方法，正丁醇为挥发性易燃易爆液体，对生产环境有一定的污染和危险，同时对人体有一定毒性。

发明内容

本发明的目的是提供一种含总黄酮（以芦丁计）、野黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸等成分明确，质量可控的灯盏细辛提取物及其制备方法。

本发明的另一目的是提供一种由灯盏细辛提取物制成的口服液（或合剂）、含片等。

本发明的灯盏细辛提取物含有重量百分比的总黄酮1-40%、野黄芩苷0.1-5%、绿原酸0.05-3%、咖啡酸0.002-3%、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0. 01-3%，其他成份2-98%，提取物为相对密度1.0—1.35（g/ml）的流浸膏或浸膏粉。

本发明的灯盏细辛提取物的制备方法如下：

取菊科植物灯盏细辛干燥全草，加入70%的乙醇溶液按药材量的8倍、6倍、6倍，回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，PH调节至6.5，浓缩液加1倍量的1.5%蛋白干溶液，搅拌混合均匀，然后加热煮沸，静置冷却至室温，冷却后药液冷藏24小时以上，过滤，浓缩成相对密度1.0—1.35（g/ml）的流浸膏或浓缩干燥成浸膏粉即得。

将上述流浸膏或浸膏粉加入辅料加工制成口服液（或合剂）、含片。具体为：

灯盏细辛提取物制备的口服液原料的重量配比为：

相对密度为1.0-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏 200-600g

矫味剂 0.2～300 g

防腐剂 0.1～7g

pH调节剂 适量

水 余量。

制备方法：取相对密度为1.0-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏，加入矫味剂、防腐剂及纯化水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7-8，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

所述的矫味剂是蔗糖、山梨醇、木糖醇、阿斯巴甜、甜菊素、甘露醇、甜蜜素、二氢查耳酮、甘草甜素其中的一种或几种。

所述的防腐剂是苯甲酸、苯甲酸钠、尼泊金乙酯、尼泊金甲酯、丙二醇中的一种或几种。

pH调节剂是氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或几种。

灯盏细辛提取物制备的含片原料的重量配比为：

相对密度为1.2-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏或浸膏粉 50-300g

填充及矫味剂 175～450g

润滑剂 1～25 g

薄荷脑 0.05～0.5g

润湿剂 适量

制备方法：取灯盏细辛提取物浸膏粉或流浸膏，加入填充剂、矫味剂混合均匀，加入润湿剂制软材，14目制粒，65-75℃干燥，12-24目整粒，加入润滑剂和薄荷脑，混合均匀压制成1000片，即得含片。

所述的填充剂及矫味剂是蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿斯巴甜、甜菊素、二氢查耳酮、甘草甜素、柠檬酸、苹果酸中的一种或几种。

所述的润湿剂是纯化水、乙醇中的一种或两种。

所述的润滑剂是硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅中的一种或几种。

本发明用蛋白质类的澄清剂（蛋白干、明胶、鸡蛋清）和壳聚糖都能取到除杂、澄清效果，其中蛋白干的处理后的提取物中主要有效成分野黄芩苷、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸的含量最高；生产过程中使用水，生产操作简单、清洁无污染，比传统生产工艺相比更加减少成本、经济实际、环保安全；提取物中杂质少，对已知治疗心脑血管疾病起主要作用的有效成分如野黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸等成分含量均比传统工艺的高，范围明确，质量可控；剂型服用方便、吸收快，生物利用度高，携带方便，尤其适合老人、中风患者及吞服困难的患者服用在冠心病、心绞痛等的急性发作期服用可以迅速起效，有效地控制病情。

以下为本发明提取方法的研究：

1、提取方法的比较

称取灯盏细辛干燥全草，分别按70%乙醇的浸渍法、渗漉法、回流法、超声提取法进行提取，提取液过滤，定容，测定总黄酮和野黄芩苷的含量，结果如表1：

表1 不同提取方法的比较

提取方法	得膏率（%）	野黄芩苷转移率（%）
			浸渍法	13.5	38.2
渗漉法	14.0	40.6
			回流法	21.3	82.5
索氏提取	18.9	40.9
			超声法	18.5	71.2

试验证明不同的提取方法直接影响着醇提工艺中野黄芩苷的测定结果。综合考虑，回流提取法是比较适合的方法。方法简单，提取时间短，提取过程中安全、环保、清洁。

2、提取条件的筛选

选择乙醇浓度、乙醇量、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素选择3个水平，因素水平表见表2：

表2 正交试验设计因素水平

取灯盏细辛干燥全草，按L₉（3⁴）正交实验表安排试验，每组两次平行试验，以总黄酮和野黄芩苷含量为评价指标，测定结果取平均值。结果见表3：

表3 正交试验方案与结果

表4 方差分析

F_0.05（2,2）=19.00，F_0.01（2,2）=99

以总黄酮提取率为考察指标，直观分析结果表明A2>D3>C1>B2; 以野黄芩苷提取率为考察指标，直观分析结果表明A2>D3>C3>B3;方差分析结果表明A因素醇浓度和D因素提取次数对总黄酮及野黄芩苷的提取均有显著性影响，而B因素乙醇量及C因素提取时间对提取结果没有影响，为节约时间和能源，第二、三次溶媒量可以适量减少，最终确定工艺条件为A2 B1 C1D3，即70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，醇用量为8倍、6倍、6倍。

2、与传统除杂工艺的比较，澄清剂的筛选

以乙醇提取的提取液除了含有有效成分外，还同时存有叶绿素、鞣质、树脂等杂志，若不将这些大分子物质除去，就会影响口服液、合剂的澄清度，还会造成含片中浸膏过多，辅料用料加大。因此需要对提取液进行除杂处理。

分别选用在中药澄清技术领域应用比较广泛的几种方法与传统的活性碳和硅藻土进行比较。

取灯盏细辛干燥全草，按70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，醇用量为8倍、6倍、6倍的工艺进行提取，回收乙醇，浓缩，PH值调节至6.5。浓缩液分为13组，每组300ml，每组分别加入下表中的方法进行试验，处理后的混合液静置24小时后，过滤，加水定容，摇匀，考察澄清效果。紫外分光光度法检测总黄酮含量，高效液相检测野黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量，计算收率。

表5 不同澄清剂的除杂澄清效果比较

实验序号	名称	澄清剂用量	澄清效果	总黄酮收率（%）	野黄芩苷收率（%）	绿原酸收率（%）	咖啡酸收率（%）	1,3-O-二咖啡酰奎宁酸收率（%）
									1	活性碳	2%	+	36.8	59.2	65.2	40.2	40.23
2	硅藻土	2%	+	37.2	57.23	64.2	39.5	45.65
									3	ZTC-III天然澄清剂	（A2%,B4%）	±	72.6	63.1	71.2	77.6	75.3
4	ZTC-III天然澄清剂	（A4%,B8%）	+	53.11	59.3	68.6	72.5	71.4
									5	1.0%蛋白干溶液	1倍	±	85.14	80.21	78.24	75.21	74.21
6	1.5%蛋白干溶液	1倍	+	83.6	79.65	75.69	75.0	70.23
									7	2%明胶水溶液	1倍	+	78.5	49.2	78.7	50.1	68.2
8	5%明胶水溶液	1倍	+	71.11	40.5	75.0	49.3	65.8
									9	0.5%壳聚糖溶液	0.5倍	±	77.62	65.9	88.5	75.21	71.42
10	1.0%壳聚糖溶液	0.5倍	+	70.1	62.1	89.6	74.21	70.21
									11	30%新鲜鸡蛋清溶液	0.5倍	+	81.56	84.25	75.6	74.69	82.69
12	50%新鲜鸡蛋清溶液	0.5倍	+	79.58	82.56	70.23	72.51	80.51
									13	石灰乳		—	—	—	—	—	—

“+”：代表澄清，“—”：代表浑浊，“±”代表介于两者之间。

计算公式：

由实验结果可知：采用石灰乳进行处理得不到澄清效果；活性碳和硅藻土虽然脱色澄清效果好，其吸附作用对有效成分的损失影响较大；ZTC-III天然澄清剂两种不同浓度处理后的总黄酮收率都偏低；明胶水溶液处理后对野黄芩苷、咖啡酸的影响比较大，而且处理后的提取液颜色偏暗；壳聚糖虽然对绿原酸的影响较其他组小，但是对灯盏细辛提取物中的其主要药理作用的总黄酮影响偏大；蛋白干溶液、新鲜鸡蛋清溶液的处理效果比较接近，可能与两者之间都含有类似蛋白质成分有关，澄清作用原理类似。但新鲜鸡蛋清在操作时需要破碎大量鸡蛋并过滤蛋黄，相比蛋白干直接加水配液可用的操作来看过于复杂，成本也高。因此，从经济和操作方便的角度来看，用蛋白干澄清处理的方法比较符合实际生产要求，所得提取物中的野黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量均比传统工艺使用的活性碳和硅藻土高。

4、工艺优化

随着待处理液的PH值的升高，总黄酮的含量也随之增加，蛋白干在酸性条件下有较好的澄清作用，当PH大于等于7时，蛋白干加热变性凝聚，丧失澄清作用。根据这一特性，选择PH6.5工艺条件下进行筛选蛋白干溶液浓度、用量、静置时间等工艺参数。

表6 蛋白干溶液不同浓度、不用用量的澄清效果比较

从实验数据可知：蛋白干的加入量越多，总黄酮越低，蛋白干的加入量过少澄清作用又减弱。蛋白干1.0% 2倍和1.5% 1倍、2倍均能保证提取液澄清，澄清剂需要加水配成一定浓度，再加入到提取液中，如果加入量过多，提取液稀释后，如制成口服液，有效浓度过稀，需要增加浓缩、过滤等不必要的工序，如制成口含片，浓缩成稠浸膏又延长浓缩时间。因此，综合各成分的收率、生产成本和生产周期，选择蛋白干1.5% 1倍量比较符合生产操作。

5、验证

取灯盏细辛干燥全草，加入70%的乙醇溶液按药材量的8倍、6倍、6倍，提取3次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，PH调节至6.5，浓缩液加1倍量的1.5%蛋白干溶液，充分搅拌溶解，静置，然后加热煮沸，静置冷却，冷却后药液过滤，冷藏24小时，过滤即得。重复3次实验，测定含量。

表6 验证试验

三批处理提取液都可以达到澄清要求，各指标含量均可达到质量要求范围内：含有重量百分比的总黄酮1-40%、野黄芩苷0.1-5%、绿原酸0.05-3%、咖啡酸0.002-3%、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0. 01-3%，其他成份2-98%，提取物为相对密度1.02（g/ml）的流浸膏。

本发明的灯盏细辛提取物及其制剂具有以下优点：

1、有效成分的总黄酮、野黄芩苷含量较常规活性炭、硅藻土工艺分别提高近2倍、1倍。

2、相比传统工艺，生产工艺成本经济实际、操作简单、清洁、无污染更环保、安全。

3、疗效有所提高，纯度高、杂质少。

4、有效成分全面，疗效更确切，各主要有效成分含量都比常规工艺的高，且都在控制范围内，质量更可靠。

5、通过毒性试验，表明灯盏细辛提取物的制剂安全性更高。

6、剂型服用方便、吸收快，生物利用度高，携带方便，尤其适合老人、中风患者及吞服困难的患者服用 在冠心病、心绞痛等的急性发作期服用可以迅速起效，有效地控制病情。

附图说明

图1是本发明的灯盏细辛提取物中的绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、野黄芩苷的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本专利，但不限于实施例。

实施例1：

灯盏细辛提取物的制备方法如下：

取菊科植物灯盏细辛干燥全草，加入70%的乙醇溶液按药材量的8倍、6倍、6倍，回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，PH调节至6.5，浓缩液加1倍量的1.5%蛋白干溶液，搅拌混合均匀，然后加热煮沸，静置冷却至室温，冷却后药液冷藏24小时以上，过滤，浓缩成相对密度1.0—1.35（g/ml）的流浸膏或浓缩干燥成浸膏粉即得。

用上述方法制备的灯盏细辛提取物含有重量百分比的总黄酮1-40%、野黄芩苷0.1-5%、绿原酸0.05-3%、咖啡酸0.002-3%、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0. 01-3%，其他成份2-98%，提取物为相对密度1.0-1.35（g/ml）的流浸膏或浸膏粉。

实施例2：

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏400g，加入重量百分比为60%蔗糖溶液450mg、苯甲酸钠2g、尼泊金乙酯0.2 g、甜菊素0.6g及蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

实施例3

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏200g，加入山梨醇120g、苯甲酸钠2g、尼泊金乙酯0.2 g、阿斯巴甜0.4g、蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

实施例4

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏600g，加入木糖醇35g、苯甲酸钠1.5g、丙二醇5g、甜菊素0.55g、蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

实施例5

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏500g，加入木糖醇100g、苯甲酸钠2.1g、尼泊金乙酯0.2 g、二氢查耳酮0.2g、及蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每瓶灌装100ml，即得合剂。

实施例6

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏400g，加入重量百分比为60%蔗糖溶液、苯甲酸钠2.1g、尼泊金乙酯0.25 g、甘草甜素0.5g及蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每瓶灌装100ml，即得合剂。

实施例7

按实施例1制备的相对密度为1.02的灯盏细辛提取物浸膏400g，加入木糖醇45g、苯甲酸钠1.5g、丙二醇5g、甜菊素0.55g及蒸馏水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7.3，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

实施例8

按实施例1制备的灯盏细辛提取物浸膏粉50g，加入山梨醇200g、乳糖200g、甜菊素0.2g混合均匀，14目制粒，65℃干燥，14目整粒，加入硬脂酸镁0.3g、二氧化硅0.3g、薄荷脑0.05g，混匀均匀压制成1000片即得含片。

实施例9

按实施例1制备的相对密度为1.2的灯盏细辛提取物稠浸膏300g，加入甘露醇200g、乳糖200g、阿斯巴甜0.1g混合均匀，14目制粒，70℃干燥，24目整粒，加入硬脂酸镁0.3g、二氧化硅0.8g、薄荷脑0.1g，混匀均匀压制成1000片即得含片。

实施例10

按实施例1制备的相对密度为1.35的灯盏细辛提取物稠浸膏200g，加入甘露醇200g、蔗糖200g混合均匀，14目制粒，75℃干燥，14目整粒，加入硬脂酸镁0.5g、二氧化硅0.5g、薄荷脑0.06g，混匀均匀压制成1000片即得含片。

临床、药理、药效试验：

为便于理解本发明工艺制备的灯盏细辛提取物在治疗和预防心脑血管疾病方面的药用价值，以及与其他灯盏花制剂的比较，以下为用有效部位的提取物制成的口服液的药理和临床实验结果（系称灯盏细辛口服液）。

（一）治疗脑血管方面的药效学研究

1、 实验材料

灯盏细辛口服液，实施例2。阳性对照药益脉康片(灯盏花素片)，每片含总黄酮40mg。猫体重2 0～3．0kg，雌雄兼用。家兔体重2 0～2 5kg，雌雄各半。二磷酸腺甘(ADP)花生四烯酸(AA)。

2．实验方法与结果

2.1灯盏细辛口服液对猫脑缺血的改善作用

取2.0～3.0kg猫20只，雌雄兼用，随机分成4组，每组5只。用α一氯醛糖40mg/kg iv，动物麻醉后灌胃给药(ig)，空白对照组(c)给同体积常水，灯盏细辛口服液高剂量(H)组240 mg/kg，低剂量组(L)120 mg/kg，阳性对照药组（S）益脉康片240 mg/kg。把动物侧卧周定在手术台上，在瞳上方的角膜上切口至角膜边缘，从切口处把挖匙轻轻伸人瞳孔，沿瞳孔边缘转动挖匙一周，把游离晶装体和玻璃挖出并吸干净眼内容物。沿眶上边缘转从内眦上方做一切口，切口深至骨膜。眶上缘切口纯性分离眶内结缔组织，使眼眶上侧的骨面露出来，眼眶外上方连行几束肌肉影响视神经孔的暴露，用双极电凝器然其烧断，继续分离就可看到视神经，从神经孔穿过，用双极电凝器将神经周围小血管烧断，暴露出视神经孔。用扩拉器扩张手术切口，使眼眶上侧骨面各神经孔充分暴露。在视神经孔外上方约5mm处，用牙钻在骨面上开一小骨窗，深至脑膜，千万注意不要损伤脑膜，用止血钳将骨窗向下扩展与视神经相通，骨窗面积约为视神经孔的两倍。在手术显微镜下用针尖将骨窗处硬脑膜刺破，用双极电凝器灼断大脑中动脉约2mm长。由于整个实验5h左右，用链霉素生理盐水纱布盖住眼眶等手术创面即可。解上肢侧卧，仰面周定在保温手术台上，沿颈正中线切开皮肤，分离气管后，插入“Y”型气管插管，任其自然呼吸，分离两侧颈总动脉及其分支，保留颈内动脉，结扎其余分支，将电磁流量计探头与颈总动脉连接，测量ig受试药后1，2，3，4(h)的血流量(ml／min)。

表7 灯盏细辛口服液对猫脑缺血的脑血流量的影响（n=5, x±s）

注： *P<0.05，与空白对照组同一时间进行比较t及矫正t检验。

2.2 赤血盐法测定血小板数

取家兔20只，体重2.0kg以上t雌雄各半。灌胃(ig)给药，空白对照组(c)给同体积常水，阳性对照药益脉康片组(s)240mg/kg。灯盏细辛口服液高剂量组(H)240 mg/kg，低剂量组(L)120 mg/kg。给药前每兔测血小板数1次。给药后l，2，3，4(h)，用赤血盐法测血小板数1次。取赤血盐液lml于小试管中，采兔耳缘静脉血0.1ml于上述小试管中，混匀，待红细胞溶解后，充分混匀，滴入计数池内，待5~8min，在高倍显微镜下调焦点计数。查400小格内血小板数乘1000，即得，见表8。

表8 灯盏细辛口服液对家兔血小板的影响（n=5, x±s）

注： *P<0.05，与空白对照组同一时间进行比较t及矫正t检验。灯盏细辛口服液高剂量组、低剂量组与益脉康片一样具有显著性意义（P<0.05）。

2.3对血小板的聚集与解聚作用

ig给药，空白对照组(C)ig给同体积的常水，灯盏细辛口服液高剂量组(H)给240 mg／kg，低剂量组(L)给120 mg／kg，阳性对照药益脉康片组(S)给240mg／kg，ig给药后2h取家兔血置硅化过的试管中，用3.8％枸缘酸钠9：1(V/V)抗凝，离心(1000r/min)离心15min，取上层血浆即为富血小板血浆(PRP)。余下血液再以3000n/min离心15 min，取上层液为贫血小板血浆(P P P)。实验中PRP血浆中血小板数调成约50—60万／mm³，血小板调整液0. 45ml中加入10μl（2ug／ml)ADP同10ul(100ug／ml)AA，轻摇匀于37℃预热2min，按Born氏法测定透光度(比浊法)，测定药物对血小板聚集的抑制率，按下式计算：

表9灯盏细辛口服液对家免体内血小板聚集的抑制作用（n=5, x±sD）

灯盏细辛口服液的高剂组与阳性药物对照组对家兔体内血小板ADP，AA诱导聚集的抑制与空白对照组比较有非常显著性意义(P<0.01)，低剂量组有显著性意义(P<0.05)。

2.4 灯盏细辛口服液对家兔凝血时间的影响

取家兔20只，体重2—2.5kg，雌雄各半，分成4组，每组5只，给药前测1次凝血时间，用玻片法测定。(1)自兔耳缘静脉取血2大滴，置于玻片两端，立即记录时间；(2)每5秒钟用针尖沿一定方向挑动血滴1次 直至针尖触使血滴内连续挑起纤维为止。另一滴血作为最后挑纤维丝的对照。灌胃给空白对照组(C)同体积的常水，灯盏细辛口服液高剂量(H)给240 mg／kg，低剂量组(L)给120 mg／kg，阳性对照药益脉康片组(s)给240 mg／kg。

表10灯盏细辛口服液对家兔血凝血时间的影响（n=5, x±s）

注： **P<0.01，*P<0.05与空白对照比较t检验。

3 小结

灯盏细辛口服液猫灌胃240 mg／kg，120mg／kg剂量组，阳性对照药益脉康片240 mg／kg与空白对照组比较，脑血流量增加1，2，3，4(h)内经t检验具有显著性意义(P<0.05)。

灯盏细辛口服液给家兔灌胃240 mg／kg ，120 mg／kg与益脉康片240 mg／kg一样，在1，2，3．4(h)内有抑制血小扳数的增加与空白对照组比较经t检验有显著性意义(P<0.05)；对家兔体内血小板ADP．AA诱导聚集有抑制作用，240 mg／kg与益脉康为240 mg／kg一样，与空白对照组比较经t检验有非常显著性意义(P<0.01)，120 mg／kg有显著性意义(P<0.05)；对家兔灌胃灯盏细辛口服液240 mg／kg，益脉康片240 mg／kg，在1，2，3，4(h)小时内凝血时间延长，与空白对照组比较，经t检验．有极显著性意义(P<0 .01)，120mg／kg在1，2，3．4(h)也有延长凝血时间的作用，具有显著性意义(P<0．05)。

（二）治疗冠心病的临床研究

1．1 一般资料 30例患者均符合WHO冠心病诊断标准，30例患者中，男12例，女18例，男：女=1：1．33，年龄50～75岁，平均(67.70±4.58)岁，冠心病病程1～3年5例，3～5年4例，5年以上21例，平均病程(9.30±7.75)年，其中合并有高血压的有17例，合并高脂血症有4例，合并糖尿病有1例，合并有心肌梗死的有2例。30例病人中稳定型心绞痛25例，不稳定型心绞痛5例；根据心绞痛程度，轻度21例，中度9例；中医辨证方面心血瘀阻27例，心血瘀阻并兼证4例。排除病例标准经检查证实为冠心病急性心肌梗死以及其它心脏疾患，重度神经官能症、更年期症候群及颈椎病所致胸痛者，合并中度以上高血压、重度心肺功能不全、重度心律失常、肝、肾、造血系统等严重原发性疾病、精神病患者。

1．2 治疗方法30例服用灯盏细辛口服液（实施例4）20ml/次，3次／日；疗程为28天为一个疗程，共观察一个疗程；研究期间心绞痛发作时可临时舌下含服硝酸甘油，治疗期间停服长效抗心绞痛药物、抗血小板聚集和抗凝药物。

1．3 观察指标 观察心绞痛发作诱因、次数、持续时间、伴随症状、硝酸甘油停减用量、心电图疗效、中医证候疗效、心肌耗氧量、血液流变学变化；血尿常规、心、肝、肾功能检查等。

1．4 统计学方法中医症状疗效采用百分比，计量资料采用t检验，等级资料采用Ridit分析。

2 结果

2．1临床疗效心绞痛治疗后显效7例，有效17例，无效6例，缓解心绞痛有效率达80％。中医证候有明显改善，其中显效4例，有效22例，无效4例，总有效率为86．67％。治疗前积分17.07±4.27，治疗后积分值为9.13±3.15，治疗前后比较差异有非常显著性(P<0．01)。治疗前病人每周硝酸甘油用量(1.23±0.73)片，治疗后的硝酸甘油用量明显降低(0.67±0.61)片(P<0.01)，治疗前病人心肌耗氧量112.35±18.44，治疗后的心肌耗氧量明显降低103.14±17.31(P<0.05)。

2．3 心电图疗效心电图疗效治疗后显效3例，有效13例，总有效率达53.33％。2．4 血液流变学变化见表1。

表11 两组患者治疗前后血液流变学指标比较（x±s）

项目	例数	治疗前	治疗后
				高切变率	30	6.2±1.86	5.46±1.70*
低切变率	30	10.34±2.28	9.25±1.93*
				血浆粘度	30	2.3±0.81	1.98±0.62*
红细胞压积	30	47.85±1.92	46.2±1.96*
				纤维蛋白原	30	4.2±0.62	3.28±0.70**

注：治疗前后比较*P<0.05，**P<0.01

2．5 安全性指标血常规、肝、肾功能治疗前后无明显异常。

3 讨论

从临床上选择冠心病心绞痛，辨证属心血瘀阻证病例，观察灯盏细辛口服液的临床疗效，结果显示对神经功能缺损程度评分临床疗效，灯盏细辛口服液治疗心绞痛疗效总有效率为80.0％ ，中医证候疗效总有效率为86.67％，心电图疗效总有效率为53.3％，灯盏细辛口服液能减少心绞痛发作次数、持续时间、发作程度和硝酸甘油用量，降低血压和心肌耗氧量；能显著降低全血比粘度下低切变率、高切变率、血浆粘度，对血常规、肝、肾功能治疗前后无明显异常。临床应用中未发现不良反应。可见，灯盏细辛口服液是一种疗效确切而安全的治疗胸痹(冠心病、心绞痛)的有效药物。

（三）灯盏细辛口服液治疗色素性紫癜性皮肤病的临床研究

1 临床资料

将本组60例患者随机分成治疗组和对照组。治疗组男13例，女17例；年龄19～55岁，平均(49.36±10.12)岁；病程半个月～12个月，平均(6.55±1.35)个月。对照组男16例，女14例；年龄23～60岁，平均(52.48±14.55)岁；病程1—12个月，平均(7.32±1.26)个月。两组在性别、年龄、病程及症状体征严重程度上无显著性差异(P >0．05)，具有可比性。诊断标准：西医参照《现代皮肤病学》中关于色素性紫癜性皮肤病的诊断标准。中医证型诊断选择血瘀证患者，皮损表现为出血性(离经之血)，常伴皮肤粗糙、增厚(肌肤甲错)、遗留色素沉着(皮色黧黑)、舌下静脉青紫曲张，下肢静脉曲张，舌质黯或有瘀斑，舌苔正常或黄腻。

2 治疗方法

治疗组：口服灯盏细辛口服液（实施例2），每日3次，每次12mL。对照组：口服维生素C 0.2g和芦丁40mg，每日3次。28天(4周)为1个疗程。两组用药期间都停用其他类似治疗药和对症治疗药，28天(4周)后判断疗效。统计学方法：计数资料采用x ²检验，计数等级资料采用Ridit分析，计量资料采用t检验。

3 结果

3．1 疗效判定标准

根据皮损(红斑、瘀斑、紫癜、色素沉着)的面积大小，分别按无、轻、中、重，四级评分：无皮损(无)为0分；直径2cm 以内(轻)为1分；直径3～4cm(中)为2分；5 cm 以上(重)为3分。舌质采用二级评分：正常淡红0分；舌质黯红或瘀斑1分。症状积分为皮损和舌质评分的总和。疗效指数=(治疗前总积分一治疗后总积分)／治疗前总积分× 100％ 。疗效评估分为四级。痊愈：皮损等症状消退、疗效指数95％ 以上；显效：皮损等症状消退、疗效指数70％~94％ ；有效：皮损等症状消退或减轻、疗效指数30％~69％ ；无效：为皮损等症状均无改善或加重、疗效指数29%以下。以“显效”以上为“愈显”。

安全性观察指标包括血常规和肝肾功能，并观察服药期间有无不良反应。

3．2 治疗组与对照组的疗效和愈显率比较 结果见表5。

表12 两组间的疗效比较

n

痊愈％

显效％

有效％

无效％

愈显％

治疗组

30

2（6.66）

14（46.67）

12（40.00）

2（6.66）

16（53.33）

对照组

30

1（3.33）

5（16.67）

22（73.33）

2（6.66）

6（20.00）

注：治疗组与对照组比较，*P<0.01

3．3 治疗组和对照组治疗前后皮损等级评分的比较结果见表13。

表13 两组治疗前后皮损等级评分的比较(x±s)

注：与治疗组相比， *P<0.01。

治疗组经治疗后，红斑、瘀斑、紫癜面积有明显缩小，而对照组则无明显变化。

3．4 灯盏细辛口服液对血液流变学的影响结果见表14。

表14 灯盏细辛口服液对血液流变学的影响(x±s)

	治疗前	治疗后
			全血黏度高切（mPaּs）	5.722±1.591	4.947±0.502*
全血黏度低切（mPaּs）	8.537±2.464	7.711±1.116*
			血液黏度（mPaּs）	1.922±0.680	1.625±0.063*
红血球压积	43.533±5.251	44.633±6.578
			红血球沉降率	28.300±14.037	26.700±15.345
血沉K值	97.747±46.221	101.927±46.721
			纤维蛋白元（%）	2.840±0.490	2.673±0.317

注：与治疗前比较，*P <0．05。

全血黏度高切和低切以及血浆黏度经灯盏细辛口服液治疗4周以后，有明显改善。而对照组治疗前后血液流变学各项指标均无明显变化。

3．5 灯盏细辛口服液副作用观察

本组病例在临床治疗过程，灯盏细辛口服液对血瘀证皮肤病患者没有出现过敏性或毒性反应，如全身过敏性皮疹，全身不适(发热、头痛、恶心、呕吐)等等不良反应。实验室检查亦未发现该药对血常规和肝肾功能有不良影响。实验室检测情况见表15。

表15 治疗组安全性指标检测

治疗组的安全性检测中，30例患者治疗前血常规有1例白细胞计数增高(11×10⁹ ／L)，治疗前1例肝功能表现为谷丙转氨酶轻度增高(65U／L)，治疗后检测为正常。

4 讨论

下肢色素性紫癜型皮肤病的临床表现为色素、紫癜、红斑、结节、瘀斑和舌质瘀斑，虽有“血风疮”、“血疳”、“血瘙”等不同名称，实际上统属紫癜的范畴，血瘀为本病的重要病因病机。现代医学认为血瘀证与循环障碍关系密切，活血化瘀类药物有治疗作用 。

本研究中，灯盏细辛口服液治疗色素性紫癜性皮肤病的临床愈显率53.33％ ，显著高于对照组(20.00％ )； 治疗组经治疗前后对照，其红斑、瘀斑、紫癜明显缩小，等级评分经统计学处理有差异统计学意义(P<0．05)。表明灯盏细辛口服液对色素性紫癜性皮肤病的红斑、瘀斑、紫癜具有明显改善作用，但对色素、舌质的治疗效果不明显。治疗组的全血黏度高切、全血黏度低切、血浆黏度治疗后较治疗前有明显改善(P <0．05)，提示灯盏细辛口服液对皮肤血瘀证的血液黏度有改善作用。

治疗组在临床观察中，经血常规、肝功能、肾功能的安全性指标检查，未发现药物对血常规、肝、肾正常功能有明显的影响；未发现有明显毒副作用和其它不良反应。

口服灯盏细辛口服液4周具有明显减轻红斑、瘀斑、紫癜的疗效，推测其疗效机理在于活血化瘀。

（四）灯盏细辛口服液治疗痹病（风湿性关节炎）的临床研究

1、 临床资料

将本组60例患者随机分成低剂量组和高剂量组。每组30人。低剂量组男6例，女24例；年龄22～64岁，平均46岁；病程2月～15年，平均4.6个月。高剂量组男8例，女22例；年龄29～65岁，平均48岁；病程2月～20年，平均5.4个月。两组在性别、年龄、病程及症状体征严重程度上无显著性差异(P >0.05)，具有可比性。诊断标准：西医诊断标准：多有链球菌感染史，缓慢过程，反复发作，为多发性，四肢大关节疼痛。中医证型诊断选择风湿淤阻症（即风湿淤血阻络证），肌肉、关节疼痛剧烈，多呈刺痛感，部位固定不移，痛处拒按，局部肿胀可有硬结瘀斑，或面色暗黑，肌肤干燥无光泽，口干不欲饮，舌质紫暗，有瘀斑，脉沉细涩。

2、治疗方法

口服灯盏细辛口服液（实施例4）。高剂量组（H）：每日3次，每次20mL。低剂量组(L)：每日3次，每次12mL。疗程28天。统计学方法：计数资料采用x ²检验，计数等级资料采用Ridit分析，计量资料采用t检验。

3． 结果

3．1 临床症状疗效观察

表16 临床症状疗效观察对照表

表17 临床总疗效观察对照表

症状

例数

治愈%

显效%

有效%

无效%

总有效率%

统计学处理

低剂量组

30

0（0）

13（43.3）

15（50）

2（6.7）

28（93.3）

X2=2.4

高剂量组

30

0（0）

8（26.7）

21（70）

1（1.33）

29（96.7）

P>0.05

4 讨论

灯盏细辛口服液的临床结果表明二组无显著性差异，均对关节疼痛、关节压痛、关节肿胀、关节活动等方面有较好的疗效。低剂量组显效率和总有效率分别为43.3%和93.3%；高剂量组显效率和总有效率分别为26.7%和96.7%，表明灯盏细辛口服液对治疗痹症（风湿性关节炎）兼淤血阻络症均有比较好的临床疗效。

（五）灯盏细辛口服液动物实验长期毒性试验

1、实验材料

灯盏细辛提取浸膏，健康wister大鼠72只。雌雄各半，体重148±15.2g 。

2、试验方法

因急性毒性试验未见毒性反应，测不出LD_{50 ，}故仅设高低两个剂量组，给药剂量组按总黄酮420mg/kg、120mg/kg，分别为60kg体重成人每日推荐用药剂量的60倍和20倍，另设一个空白对照；大鼠分笼饲养。每笼6只，观察5天后，按性别随机分组。对照组每日用冷开水按1.0ml/100g灌胃，高剂量组按总黄酮浓度为42mg/ml的1.0ml/100g灌胃，低剂量组按总黄酮浓度为14mg/ml的1.0ml/100g灌胃。每周称重一次，并根据动物体重的增长调整给药量。连续给药90天。

3、实验结果

3.1一般状况：各组试验期间一般情况良好，行为活动自如，毛色光亮，进食量与体重同步增长。整个实验期间，动物无一死亡，进食量各组间无明显差异。体重也逐周增加，且增长速度接近。

3.2 对血液学指标的影响

血液学检查各项指标：红细胞（RBC）、血红蛋白（HB）、白细胞（WBC）及其分类中性白细胞（N）、淋巴细胞（L）、单核细胞（M）、嗜酸白细胞（E）。用药各组与对照组相比无先显著性差异。

表18 灯盏细辛提取浸膏连续给药90天对大鼠血液学指标的影响（n=16, x±sD）

注：与对照各组相比，各组P>0.05，差异无显著性意义。

3.3对血液生化指标的影响

检查测定了肝肾各2项指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Crea）

表19 灯盏细辛提取浸膏连续给药90天对大鼠肝肾功能的的影响（x±sD）

注：与对照各组相比，*P<0.05，差异有显著性意义。本项检测中用药组个别指标略高于或低于对照组，但均在正常值范围内。

3.4对脏器组织的影响：对各组动物进行尸体解剖，肉眼观察均为发现异常，准确称量心、肝、脾、肺、肾、脑，计算脏器系数。

表20 灯盏细辛提取浸膏连续给药90天对大鼠脏器系数的影响（x±sD，g/100g）

注：与对照各组相比，各组P>0.05，差异无显著性意义。

病理组织学检查：取称重后的对照组及高剂量组动物的心、肝、脾、肺、肾、脑，常规固定、包埋、切片、染色，作光镜观察。结果表明，灯盏细辛口服液长期给药对大白鼠主要脏器未见明显毒性。

3.5 恢复期观察

每组余下动物，在停药后2周内，每周测体重及进食量1次，二周末取血检测血液学及血液生化指标，项目同前，并于2周后处死再观察脏器，称重并计算脏器指数。结果表明：灯盏细辛口服液对大鼠长期毒性未见延迟中毒改变。

表21 灯盏细辛提取浸膏对大鼠血液学指标的影响（恢复期观察，n=8 , x±sD）

注：与对照组相比，各组P>0.05，差异无显著性意义。

表22 灯盏细辛提取浸膏对大鼠肝肾功能的的影响（恢复期观察，n=8 ，x±sD）

注：与对照组相比，各组P>0.05，差异无显著性意义。

表23 灯盏细辛提取浸膏对大鼠脏器系数的影响（恢复期观察，x±sD，g/100g）

注：与对照各组相比，各组P>0.05，差异无显著性意义。

3.6 讨论

实验结果显示：该药用临床推荐剂量的20倍及60倍连续90天灌胃给药，未见动物外观、体重增长、血像、肝肾功能及6种主要脏器组织的毒性变化。

说明灯盏细辛口服液服用3个月是安全的，停药2周未见后遗效应。

Claims (10)

1.一种灯盏细辛提取物，其特征在于所述灯盏细辛提取物含有重量百分比的总黄酮1-40%、野黄芩苷0.1-5%、绿原酸0.05-3%、咖啡酸0.002-3%、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0. 01-3%，其他成份2-98%，提取物为相对密度1.0-1.35 g/ml的流浸膏或浸膏粉。

2.权利要求1所述的灯盏细辛提取物的制备方法，其特征在于取菊科植物灯盏细辛干燥全草，加入70%的乙醇溶液按药材量的8倍、6倍、6倍，回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩，PH调节至6.5，浓缩液加1倍量的质量浓度1.5%蛋白干溶液，搅拌混合均匀，然后加热煮沸，静置冷却至室温，冷却后药液冷藏24小时以上，过滤，浓缩成相对密度1.0-1.35 g/ml的流浸膏或浓缩干燥成浸膏粉。

3.用权利要求1所述灯盏细辛提取物制备的口服液，其特征在于其原料的重量配比为：

相对密度为1.0-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏 200-600g

矫味剂 0.2～300 g

防腐剂 0.1～7 g

pH调节剂 适量

水 余量

制备方法：取相对密度为1.0-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏，加入矫味剂、防腐剂及纯化水混合，加水至900ml,用10%NaOH溶液调节PH至7-8，定容至1000ml，滤过，灌装，灭菌，每支灌装10ml，即得口服液。

4.根据权利要求3所述的灯盏细辛提取物制备的口服液，其特征在于所述的矫味剂是蔗糖、山梨醇、木糖醇、阿斯巴甜、甜菊素、甘露醇、甜蜜素、二氢查耳酮、甘草甜素其中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的灯盏细辛提取物制备的口服液，其特征在于所述的防腐剂是苯甲酸、苯甲酸钠、尼泊金乙酯、尼泊金甲酯、丙二醇中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的灯盏细辛提取物制备的口服液，其特征在于pH调节剂是氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或几种。

7.用权利要求1所述的灯盏细辛提取物制备的含片，其特征在于：其原料的重量配比为：

相对密度为1.2-1.35g/ml的灯盏细辛提取物流浸膏或浸膏粉 50～300g

填充及矫味剂 175～450g

润滑剂 1～25 g

薄荷脑 0.05～0.5g

润湿剂 适量

制备方法：取灯盏细辛提取物浸膏粉或流浸膏，加入填充剂、矫味剂混合均匀，加入润湿剂制软材，14目制粒，65-75℃干燥，12-24目整粒，加入润滑剂和薄荷脑，混合均匀压制成1000片，即得含片。

8.根据权利要求7所述的灯盏细辛提取物制备的含片，其特征在于所述的填充剂及矫味剂是蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿斯巴甜、甜菊素、二氢查耳酮、甘草甜素、柠檬酸、苹果酸中的一种或几种。

9.根据权利要求7所述的灯盏细辛提取物制备的含片，其特征在于所述的润湿剂是纯化水、乙醇中的一种或两种。

10.根据权利要求7所述的灯盏细辛提取物制备的含片，其特征在于所述的润滑剂是硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅中的一种或几种。

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