CN103981147B - 一种新的制备肝实质细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的制备肝实质细胞的方法。通过在体细胞中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的肝实质细胞。所述细胞具有典型的上皮细胞形态，表达肝脏基因，并获得了多种肝实质细胞的功能。所述细胞可在肝脏中增殖，并重建肝脏功能。

Description

一种新的制备肝实质细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的制备肝实质细胞的方法。
背景技术
肝脏是人体最重要的器官之一，调控着多种生理功能。肝脏本身具有很强的再生能力，但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝纤维化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能的下降，最终危害着人们健康和生命。由于饮食、环境和遗传等因素的影响，中国是世界上终末期肝病和急性肝衰竭发病人数最多的国家。
对于终末期肝病以及急性肝衰竭的治疗，目前唯一有效手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞移植的技术受到广泛的关注。其中一个在临床上已经使用的方法是将供体肝脏消化后得到的肝细胞移植入病人，从而使得一个供体器官可以治疗若干个病人。然而该方法仍旧依赖于捐献的供体器官，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是一个非常好的药物肝脏代谢模型，被制药公司大量使用在药物开发早期检测代谢毒性实验中。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。随着对干细胞研究的深入和新技术的突破，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被普遍认为是未来的发展方向。从干细胞获得肝脏细胞主要有以下的一些方法：
方法一、从人胚胎干细胞(hES细胞)定向分化成肝细胞。最近的研究包括中国科学家在内的工作已经表明，在使用特定的培养基和细胞因子的条件下，hES细胞可以被定向的分化成具有肝细胞功能的细胞。并且利用这些分化的肝细胞，在动物实验也已经验证这些细胞在体内可以表现出功能。
方法二、利用来源于脐带中分离的间充质干细胞来获得肝细胞。现有的证据表明分离纯化的脐带间充质干细胞可以在体外分化成非常接近肝细胞的细胞，并且脐带间充质干细胞到注射肝脏内后可以分化表达许多肝细胞特异的功能蛋白。中国的科学家也发现用脐带间充质干细胞可以改善晚期肝硬化病人的肝功能。这些研究工作都指出脐带间充质干细胞极有可能是在体外大量获得肝细胞的另一个来源。
方法三、上述的方法都受到了取材的限制，特别是ES细胞的获得存在很大的伦理道德问题。此外这些干细胞并非来自病人自身，因而由其分化而来的肝细胞还是不能避免移植后免疫排斥的问题。因此有人提出用人类iPS全能干细胞定向分化成为肝细胞。将病人自身终末分化细胞诱导为iPS全能干细胞，再定向分化iPS全能干细胞为有肝细胞功能的细胞。目前中国和美国的科学家已经报道成功的把人类iPS细胞定向分化成了具有肝脏功能的细胞。
但是无论由ES干细胞，iPS干细胞还是脐带干细胞定向分化获得细胞，都不可能达到完全分化的效率，所以总有少量的干细胞存在于分化的细胞中。这些残存的干细胞注射入动物体内后可以形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。最近的研究表明，B淋巴细胞可以在体外直接转变为巨噬细胞，另外成纤维细胞可以在体外直接重编程为神经细胞。这些实验证据提出了这样一种可能性，即各种不同类型的终末分化的动物细胞之间是可以直接转化的。
在正常生理条件下，人们一般认为动物干细胞向终末分化细胞的分化过程是单向且不可逆的。但人们也发现在自然界存在少量已分化细胞转变为另一类型细胞的例子。最典型的例子包括蝾螈的断肢再生和果蝇成虫足原基转决定为翅膀。这说明已分化细胞依然能被重编程，具有可塑性。人工诱导细胞重编程最早成功于上世纪的五十年代。JohnGurdon用细胞核移植的方法诱导爪蟾成体细胞重编程并获得成功，从而证明脊椎动物终末分化细胞的细胞核也能被重编程到全能状态。2006年Shinya Yamanaga等发现的iPS技术，成功实现了成体细胞退分化为多能干细胞，从而开创了细胞重编程的新领域。
随着细胞核移植技术和iPS技术的发展，人们又开始关注不经历多能干细胞阶段的成体细胞之间的相互转化。早在上世纪八十年代，人们就发现小鼠的纤维细胞在用小分子化合物处理或表达某些外源基因时可转分化为成肌细胞和脂肪细胞。而近年来，通过过表达特定的基因，人们在体内和体外实现了亲缘关系较近的细胞之间的转化，如：通过在B细胞中过表达C/EBPalpha和C/EBPbeta转录因子将B细胞重编程为巨噬细胞。最近通过在小鼠胚胎纤维细胞中过表达Ascl1、Brn2和Myt1转录因子将其在体外重编程为神经细胞。这些研究说明成体细胞进行跨胚层的转化，即亲缘关系较远的细胞之间的转化是可以实现的。
关于从其他类型细胞转分化成肝细胞的研究已有近三十年的历史。早期人们发现在一些特殊的病理情况下可在胰腺组织内发现类似肝细胞的细胞。David Tosh等人通过过表达C/EBPbeta，实现了将与肝细胞在发育上亲缘关系非常接近的胰细胞在体外转分化为肝细胞类似细胞。然而由于该实验使用了永生化的胰细胞株AR42J-B13作为起始细胞，该细胞株是否在传代过程中产生遗传变化并不清楚，而且对于这些细胞的体内功能都不明确。更为重要的是，实验中使用了永生化的细胞系，无法了解原代培养的分化成体细胞是否可以在体外重编程获得肝细胞的功能。
本发明人的前期研究中，在抑制细胞衰老机制的前提条件下，转入3个转录因子Foxa3、Gata4、Hnf1a，成功将小鼠尾巴上的纤维细胞转化成了肝脏细胞。这种细胞具有和体内肝脏细胞类似的上皮细胞形态、基因表达谱，且获得了肝脏细胞的功能，如肝糖原积累、乙酰化低密度脂蛋白的转运、药物代谢和吲哚绿的吸收等。将转化型肝脏细胞在移植入模拟人类酪氨酸代谢缺陷疾病的小鼠后，可像正常肝细胞一样，在被移植的肝脏中增殖，重建受体小鼠的肝脏。小鼠的总胆红素、转氨酶、酪氨酸等肝功能指标均出现明显好转，濒临死亡的小鼠得以存活。
尽管本发明人上述工作对于研究促进肝脏再生的材料及方法具有重大意义，但是所采用的体细胞为小鼠尾巴的纤维细胞，不能直接应用到人类肝癌疾病的治疗中。因此，进一步开发能使人的体细胞直接转化为具有类似功能的肝实质细胞的方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的制备肝实质细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供一种肝实质细胞的分化诱导方法(优选体外方法)，所述方法包括：在细胞中过表达以下转录因子或其变异体：HNF4A；选自HNF1A或HNF1B的一个或多个；和选自FOXA1、FOXA2或FOXA3的一个或多个。
在一个优选例中，还在细胞中过表达选自以下的一种或多种转录因子或其变异体：C/EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4或PROX1。
在另一优选例中，在细胞中过表达以下转录因子或其变异体：HNF4A、HNF1A、FOXA3。
在另一优选例中，在细胞中过表达以下转录因子或其变异体：HNF4A、HNF1B、FOXA3。
在另一优选例中，所述的HNF4A或其变体是：(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b1)在(a1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽；或(c1)与(a1)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的HNF1A或其变体是：(a2)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b2)在(a2)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽；或(c2)与(a2)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的HNF1B或其变体是：(a3)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；或(b3)在(a3)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽；或(c3)与(a3)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的FOXA1或其变体是：(a4)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；或(b4)在(a4)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽；或(c4)与(a4)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的FOXA2或其变体是：(a5)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；或(b5)在(a5)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽；或(c5)与(a5)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的FOXA3或其变体是：(a6)SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；或(b6)在(a6)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽；或(c6)与(a6)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的C/EBPβ或其变体是：(a7)SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽；或(b7)在(a7)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽；或(c7)与(a7)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的GATA4或其变体是：(a8)SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽；或(b8)在(a8)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽；或(c8)与(a8)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的HHEX或其变体是：(a9)SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽；或(b9)在(a9)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽；或(c9)与(a9)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的KLF4或其变体是：(a10)SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽；或(b10)在(a10)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a10)多肽功能的由(a10)衍生的多肽；或(c10)与(a10)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a10)多肽功能的由(a10)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的PROX1或其变体是：(a11)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；或(b11)在(a11)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a11)多肽功能的由(a11)衍生的多肽；或(c11)与(a11)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a11)多肽功能的由(a11)衍生的多肽。
在另一优选例中，过表达转录因子或其变异体的细胞来源于成纤维细胞或上皮细胞。
在另一优选例中，过表达转录因子或其变异体的体细胞是：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，组织或器官来源的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞是衰老或凋亡途径被破坏(或抑制)的细胞(包括永生化的细胞)。
在另一优选例中，所述的细胞通过过表达SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途径被破坏。
在另一优选例中，在体细胞中过表达所述的转录因子和/或SV40大T抗原的方法是：(a)提供细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原的细胞，该细胞就是肝实质细胞。
在另一优选例中，(a)中，先将细胞进行体外培养若干代，较佳地为5-9代。
在另一优选例中，所述的表达载体是病毒。更佳地，所述的病毒是慢病毒。
在另一优选例中，首先将细胞培养于I型胶原上，将转录因子或其变异体转入细胞0.5-3天后，更换培养基为iHep培养基；更优选地，所述的iHep培养基为外加地塞米松、TGF-α、EGF、ITS、N2、B27、OSM和/或其他成分的Block’s培养基。
在另一优选例中，首先将细胞培养于I型胶原上，将转录因子或其变异体转入细胞0.5-2天后，将培养基换为含有2-巯基乙醇、MEM NEAA和bFGF的DMEM/F12培养基；继续培养0.5-2天后，将培养基换为含有地塞米松、TGF-α、EGF和ITS的改良Block’s培养基。
在另一优选例中，将转录因子或其变异体转入细胞中后，在第6-20天(较佳地第8-18天，更佳地10-16天，更佳地14天左右)富集具有上皮样形态的细胞。更佳地，用胰蛋白酶处理(每次处理2-10分钟，每隔1-3天处理一次)细胞以去除纤维细胞。
在另一优选例中，所述的肝实质细胞具有如下一种或多种性能：1)形成上皮样细胞克隆；2)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：ALBUMIN；3)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：CK8和CK18；4)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：AAT，TTR，ASGPR1，GJB1；5)积累肝糖原；6)转运乙酰化低密度脂蛋白；7)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：糖代谢、药物代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、胆汁酸代谢相关基因或蛋白、调控止血和纤维蛋白溶解的基因或蛋白、第I级和第II级异源物代谢基因、分泌性蛋白基因。
在另一优选例中，所述的细胞是哺乳动物细胞；更佳地，所述的细胞是人源的细胞。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括但不限于鼠、兔、狗、猴、猪、牛、羊、马、人等。
在本发明的另一方面，提供一种肝实质细胞，所述肝实质细胞由前面所述的方法分化诱导产生。
在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于制备促进肝脏再生或治疗(包括缓解)肝损伤的组合物。
在另一优选例中，所述的肝损伤包括(但不限于)：终末期肝病、肝硬化、酒精肝、糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纤维化、肝癌、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤。
在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究。
在一个优选例中，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物。
在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于产生Albumin蛋白。
在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于制备肝炎病毒(包括乙肝病毒、丙肝病毒等)感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于筛选抗肝炎病毒的药物。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物含有：(有效量的)所述的肝实质细胞；以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于促进肝脏再生；或治疗(包括缓解)肝损失相关疾病。
在本发明的另一方面，提供一种转录因子组合，包括以下转录因子或其变异体：HNF4A；选自HNF1A或HNF1B的一个或多个；和选自FOXA1、FOXA2或FOXA3的一个或多个。
在本发明的另一方面，提供所述的转录因子组合的用途，用于制备肝实质细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于分化诱导肝实质细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的转录因子组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自以下的一种或多种：用于过表达转录因子或其变异体的细胞；转录因子或其变异体的表达载体(如慢病毒载体)；胰蛋白酶；细胞培养基(如iHep培养基；I型胶原)。
在本发明的另一方面，提供一种促进肝脏再生或治疗(包括缓解)肝损伤的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的所述的肝实质细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、人iHep细胞的制备的流程示意图。
图1B、过表达8因子组合(8TF)的HFF细胞在转染12天后表达肝脏基因的情况；以及8因子减去1因子(8TF-1TF)后表达肝脏基因的情况。
图1C、过表达6因子组合(6TF)的HFF细胞在转染12天后表达肝脏基因的情况；以及6因子减去1因子(6TF-1TF)后表达肝脏基因的情况。
图1D、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞表达肝脏基因情况。
图1E、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞可积累肝糖原。
图1F、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞能将DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)转运到细胞内。
图1G、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞可分泌Albumin到培养基中，以HepG2细胞为阳性对照；已过表达GFP的HFF细胞作为阴性对照。
图2A、过表达5因子组合以及5因子减去1因子(5TF-1TF)诱导的HFF细胞表达肝脏基因的情况。
图2B、将转录因子HNF1B替换为HNF1A后诱导HFF细胞表达肝脏基因的情况。
图2C、撤除三因子FOXA3，HNF1A，HNF4A组合(3TF)中的任意一个因子后过表达诱导的HFF细胞表达肝脏基因的情况。
图3A、HFF过表达3因子后，第8天即有上皮样细胞形成。
图3B、RT-PCR分析HFF感染慢病毒(过表达3因子)之后不同时间点的基因表达情况。
图3C、ELISA分析表明hiHep细胞可分泌大量Albumin到培养基中。
图3D、ELISA分析表明hiHep细胞可分泌大量AAT到培养基中。
图3E、免疫荧光染色表明50％的3因子诱导的hiHep细胞能够共表达Albumin与AAT。
图3F、基因表达谱分析各种细胞之间的远近关系。
图3G、PAS染色表明hiHep细胞中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
图3H、DiI-ac-LDL吸收测试验证hiHep细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里。
图3I、Indocyanine green(ICG)吸收测试验证hiHep细胞可将ICG从培养基中转运到包浆里。
图3J、油红O染色验证hiHep细胞包浆中可以积累甘油三磷酸及脂滴。
图3L、hiHep细胞表达介导胆汁排泄的转运分子的基因情况。
图3K、M、hiHep细胞具有分泌排泄DPDPE、CLF、TCA等代谢功能。
图3N、hiHep细胞能够诱导表达药物代谢相关的CYP1A2。
图4a、全基因组表达谱分析结果表明，hiHep细胞表达了大量肝特异的分泌蛋白。
图4b、全基因组表达谱分析结果表明，hiHep细胞表达了大量肝特异的凝血因子。
图4c、全基因组表达谱分析结果表明，hiHep细胞表达了大量肝特异的CYP450代谢酶。
图5a、q-PCR分析表明另一株原代人胎儿纤维细胞HFF-2不表达胚肝特异的标志基因。
图5b、FACS分析表明原代人胎儿纤维细胞HFF-2不表达胚肝特异的标志基因CD133和EpCAM。
图5c、过表达3因子后，HFF-2可转化为上皮细胞样的hiHep细胞。
图5d、HFF-2来源的hiHep细胞表达大量肝特异表达基因。
图5e、PAS染色结果表明HFF-2来源的hiHep细胞也积累肝糖原。
图5f、HFF-2来源的hiHep细胞也能转运ac-LDL。
图6A、HAF过表达3因子后，第8天有上皮样细胞形成。
图6B、HAF(成年人纤维细胞，Human Adult Fibroblast)细胞中肝脏基因的表达情况。以肝细胞作为阳性对照；以过表达GFP的HAF细胞作为阴性对照；以β-Actin作为内参。
图6C、免疫荧光染色检测表明过表达3因子诱导的HAF细胞能够共表达Albumin与AAT。
图6D、PAS染色表明HAF细胞来源的hiHep细胞中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
图6E、DiI-ac-LDL吸收测试表明HAF细胞来源的hiHep细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里。
图7A、HFF过表达3因子后会有明显的细胞增殖阻滞和细胞死亡，而表达SV40大T抗原的hiHepLT细胞有很好的增殖能力。
图7B、通过shRNA抑制p53,RB和p21均不能让hiHep细胞获得增殖能力。
图7C、hiHepLT能够形成同时表达上皮样细胞标志基因ZO-1和肝脏标志基因ALB或ASPGR1的上皮样细胞。
图7D、培养3代hiHepLT、培养10代的hiHepLT，hiHep细胞中肝脏基因的表达情况。以肝细胞作为阳性对照；以过表达GFP的HFF细胞作为阴性对照；以β-Actin作为内参。
图7E、免疫荧光染色检测hiHepLT细胞中共表达ALB和AAT的情况。
图7F、PAS染色表明hiHepLT细胞以及培养10代hiHepLT细胞的中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
图7G、DiI-ac-LDL吸收测试验证hiHepLT细胞以及培养10代hiHepLT细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里。
图7H、ELISA分析表明hiHepLT细胞以及培养10代hiHepLT细胞可分泌大量Albumin到培养基中。
图7I、基因表达谱分析iHep、iHepLT、培养不同时间的iHepLT细胞之间的远近关系。
图8A、由HAF诱导的iHepLT细胞同样能够形成上皮样细胞。
图8B、由HAF诱导的iHepLT细胞能够表达肝脏功能基因。
图8C、免疫荧光染色表明由HAF诱导的iHepLT细胞能够表达Albumin(ALB)与AAT。
图8D、由HAF诱导的iHepLT细胞也能积累肝糖原(PAS染色为红色)。
图8E、由HAF诱导的iHepLT细胞也能转运ac-LDL。
图9A、hiHepLT细胞不表达胚肝细胞相关标志基因。
图9B、免疫荧光染色表明hiHepLT细胞不表达EpCAM。
图9C、hiHepLT细胞不表达胆管上皮细胞相关基因。
图9D、hiHepLT细胞经过3D培养不能形成胆管。
图10A、hiHepLT细胞经过长时间培养后仍具有正常的染色体数目。
图10B、hiHepLT细胞在裸鼠体内不能形成肿瘤。
图11A、移植hiHepLT细胞到Fah-/-Rag2-/-(F/R)小鼠的实验流程。
图11B、移植或不移植hiHepLT细胞的F/R小鼠的存活曲线。
图11C、移植或不移植hiHepLT细胞的F/R小鼠血清中ALT和AST的水平。
图11D、移植或不移植hiHepLT细胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN的水平。
图11E、免疫组化染色结果表明移植hiHepLT细胞的F/R小鼠肝脏切片中存在共染FAH和人AAT蛋白的细胞，而未移植hiHepLT细胞的F/R小鼠肝脏切片中则不存在。
图11F、免疫组化染色和H&E染色结果表明移植hiHepLT细胞的F/R小鼠肝脏中，共染FAH和人AAT蛋白的细胞具有正常的组织结构。
图11G、PCR结果分析表明移植hiHepLT细胞的F/R小鼠肝脏基因组DNA中存在人特异的ALU序列。
图11H、移植hiHepLT细胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN、ALT、AST和总胆红素的水平与外源hiHepLT细胞的整合效率匹配。
图12A、将用alginate-poly-L-lysine-alginate微胶囊包裹的hiHepLT细胞移植到ConA诱导的暴发性肝炎导致急性肝衰竭小鼠模型中的实验流程。
图12B、hiHepLT细胞包裹到alginate-poly-L-lysine-alginate微胶囊中的形态。
图12C、暴发性肝炎小鼠在移植或不移植微胶囊包裹的hiHepLT细胞情况下的存活曲线。
图12D、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiHepLT细胞后不同时间点的血清中ALT和AST的水平。
图12E、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiHepLT细胞后不同时间点的血清中人ALBUMIN的水平。
图12F、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiHepLT细胞后不同时间点的肝脏情况。
图12G、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiHepLT细胞后不同时间点的肝脏切片的H&E染色情况。
图13A、丙肝病毒的受体CD81、SRB1、CLDN1和Occludin。
图13B、hiHep细胞也和经典的丙肝病毒感染模型Huh7.5.1细胞一样，可被携带萤光素酶的丙肝假病毒感染。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，通过在体细胞(较佳地为人的体细胞)中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的肝实质细胞(hiHep细胞)。所述细胞具有典型的上皮细胞形态，表达肝脏基因，并获得了多种肝实质细胞的功能。所述细胞可在肝脏中增殖，并重建肝脏功能。
术语
如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“用于过表达转录因子的细胞”是指多种类的细胞，只要其能够在转入所述的转录因子后形成肝实质细胞。较佳地，所述的细胞是哺乳动物体细胞；更佳地，所述的细胞是上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、血液细胞，神经细胞，组织或器官来源的细胞。所述的细胞可以是已经分化或未分化的。相对于同一个体，尽管有不同的体细胞种类，但各种体细胞的基因组序列均是相同的、其主要组成部分也基本相同，因此易于理解各种体细胞均可用于本申请，只要其能够在转入所述的转录因子后形成肝实质细胞。
高等动物的动物体内有大约300种不同的分化细胞。大部分的成体分化细胞与全能干细胞一样，携带有完整的遗传信息。造成不同分化细胞之间的主要区别是细胞的表观遗传修饰的不同，导致细胞特异基因表达的不同。成体细胞的表观遗传修饰是可以被修饰的，从而实现不同细胞间的转化。比如成体细胞已被证明可以被重编程到全能干细胞，最近一些研究发现通过过表达某些基因，也可以实现将小鼠胚胎纤维细胞直接重编程为神经细胞。
如本文所用，所述的“肝实质细胞”是指能形成上皮样细胞克隆，能够表达肝脏基因(如：ALBUMIN、CK8、CK18、AAT、ASGR1、CLDN2等)，并可在肝脏中增殖，具有重建肝脏功能。
如本文所用，所述的“过表达”是指细胞内转录因子的含量(如表达量)超过初始细胞(未转入该外源基因的细胞)的水平；如与初始细胞相比，其含量高20％，较佳地高50％；更佳地高100％以上，如高200％，300％...500％或更高。一种“过表达”的情形是将外源的转录因子的编码基因转入细胞中且发生表达。
如本文所用，所述的“低表达”是指细胞中某一基因含量(如表达量)显著低于其正常水平(如与野生型细胞相比，其表达量低20％，较佳地低50％；更佳地低100％以上，如低200％，300％...500％或更低)，所述的低表达还包括不表达的情况。低表达可通过基因敲除、基因沉默、蛋白抑制等本领域熟知的技术来实现。
如本文所用，所述的“哺乳动物”是脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Mammalia)的动物。本发明所述的哺乳动物包括人，也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、猪、牛、羊、马等等。不管是非人哺乳动物还是人，在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面都非常接近。在进化过程中，一些关键的细胞功能或者调控通路在不同的物种之间是非常保守的。比如细胞增殖、凋亡的信号通路在哺乳动物中基本一致。细胞的衰老途径也是一个非常保守的调控机制。
转录因子及用途
本发明人选定了9种转录因子，发现这9种转录因子在导入细胞中过表达后，可以使非肝细胞形成肝实质细胞。所述的9种转录因子以及它们的GenBank登录号如表1。
表1
基于以上9种转录因子，本发明人进行了深入的研究，提出了一种较佳的转录因子组合，从而有效地提高了使非肝细胞形成肝实质细胞的效率。
因此，本发明提供了一种转录因子组合，其包括转录因子或其变异体：HNF4A；选自HNF1A或HNF1B的一个或多个；和选自FOXA1、FOXA2或FOXA3的一个或多个。较佳地，所述的转录因子组合还包括选自以下的一种或多种转录因子或其变异体：C/EBPβ、GATA4、HHEX、KLF4或PROX1。
作为本发明的优选方式，所述的转录因子组合包括三个转录因子：FOXA3、HNF1A和HNF4A。它们在转入细胞后可产生大量的肝实质细胞，这些细胞表达肝脏基因，可在肝脏中增殖，并重建肝脏功能。
在本发明中，术语“转录因子”指具有表1中所示序列的多肽。该术语还包括具有与表1中所示序列的多肽相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(如1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括表1中所示序列的多肽的活性片段和活性衍生物。所述变异形式的具备一个前提，即它们保留了全长的表1所示转录因子的功能。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体等。本发明还提供了其他多肽，如包含表1中所示序列的多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了表1中所示序列的多肽的可溶性片段，只要它们保留了全长的表1所示转录因子的功能。
发明还提供表1所示转录因子的类似物。这些类似物与天然转录因子的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
编码所述转录因子的基因可以是包括编码此转录因子的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的转录因子编码基因杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％，更佳地至少95％，更佳地至少98％相同性的变异体。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述转录因子多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
在本发明的提示下，所述的转录因子或其编码基因的变异体或衍生物是本领域人员易于获得和应用的。
编码所述的转录因子的基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒，其中含有制备本发明所述的肝实质细胞的原料或试剂。
作为本发明的一种实施方式，提供一种用于分化诱导肝实质细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有以上所述的转录因子组合。
作为本发明的一种实施方式，提供一种用于分化诱导肝实质细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有一种或多种表达载体(如病毒)，所述的表达载体可分别或同时表达以上转录因子组合中的转录因子。
更优选的，所述的试剂盒中还含有选自以下的一种或多种：用于过表达转录因子的细胞；胰蛋白酶；细胞培养基(如I型胶原)等。
更优选的，所述的试剂盒中还含有使用说明书。
肝实质细胞
基于本发明的新发现，提供了一种肝实质细胞，其通过在细胞内过表达转录因子或其变异体而获得，所述的转录因子为：HNF4A；选自HNF1A或HNF1B的一个或多个；和选自FOXA1(GenBank登录号NM_004496)、FOXA2(GenBank登录号NM_021784)或FOXA3的一个或多个。较佳地，还在所述细胞中过表达选自以下的一种或多种转录因子或其变异体：PROX1、C/EBPβ。
作为本发明的优选方式，在所述的细胞中过表达转录因子FOXA3、HNF1A、HNF4A。
由于每一个体中不同种类的细胞具有相同的基因组。因此，任何种类的细胞均具有形成肝实质细胞的潜能，从而可被用于本发明中制备肝实质细胞。较佳地，所述的细胞是哺乳动物体细胞。更佳地，比较容易获得的成体细胞，比如皮肤成纤维细胞等。
使细胞过表达外源基因(在本发明中为转录因子)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码转录因子的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的病毒(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。包含编码转录因子的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化细胞，以使其能够表达所述的转录因子。
如前所述，可将所述的转录因子的编码基因引入到细胞中，使得细胞内过表达所述的转录因子。另外，也可将转录因子蛋白外源表达后，与细胞共培养而使得转录因子蛋白进入到细胞内。一种可选择的方式例如：将转录因子蛋白与细胞穿透肽融合，由细胞穿透肽介导进入到细胞中。所述的“细胞穿透肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的细胞穿透肽包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic modelpeptide和Arg9等。
作为本发明的一个优选方式，在细胞中过表达所述的转录因子或其变异体的方法是：(a)提供用于过表达转录因子或其变异体的细胞(较佳地，先将细胞进行体外培养若干代，如5-9代)；(b)用表达载体(如病毒)将所述的转录因子或其变异体转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子或其变异体的细胞，该细胞就是肝实质细胞。
培养细胞的方法可参照本领域已知的技术，多种培养基都是可用的，例如一些常规的利于细胞生长的培养基，优选的是那些有利于肝细胞生长的培养基(如Block’smedium等)。此外可在这些培养基中加入一些生长因子以促进细胞生长分裂。此外，培养基也可视起始细胞的种类以及培养状况来适当调整。本领域人员了解哪些培养基是适合于肝细胞的培养的。
作为本发明的一种实施方式，首先将细胞培养于I型胶原上，将转录因子或其变异体转入细胞1-3天后，更换培养基为iHep medium；更优选为，iHep medium外加地塞米松、TGF-α、EGF、ITS、N2、B27、OSM和/或其他成分。将转录因子或其变异体转入细胞中后，在第6-20天(较佳地第8-18天，更佳地10-16天，更佳地14天左右)富集具有上皮样形态的细胞。更佳地，用胰蛋白酶处理(每次处理2-10分钟，每隔1-3天处理一次)细胞以去除纤维细胞。
富集(或分离纯化)细胞的方法也是本领域人员熟知的，例如可基于肝实质细胞的上皮样形态特征来进行富集；或基于肝实质细胞所表达的特殊蛋白(如Albumin等)或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。另外，通过去除(如消化、裂解)非上皮样形态的其它细胞来富集肝实质细胞也是一种可行的方法。
作为一种可选的实施方式，可利用流式细胞分选技术，通过肝实质细胞表面的分子标记，如：E-cadherin，Tjp1等，将表达iHep细胞表面分子标记的细胞分离纯化出来。
由于成体细胞在体外不能够增殖，因此通过重编程获得的成体细胞在体外很可能不可以增殖。细胞的衰老是抑制细胞增殖的主要原因。当哺乳动物的成体细胞被分离到体外培养时，其经过几轮复制后会停留在复制型衰老状态，这些细胞被不可逆的阻滞在细胞周期G1期，并且不再对生长因子的刺激敏感。p19ARF，p53，p16INK4a，pRb是主要的调节细胞衰老途径的信号通路(Collado，M.，Blasco，M.A.，and Serrano，M；2007，Cell 130，223-233)。在一个实施方式中，本发明人利用过表达SV40大T抗原(LT)的人胎儿和成体纤维细胞，重编程获得的肝实质细胞由于抑制Rb和p53而获得体外增殖的能力。
在进化过程中，一些关键的细胞功能或者调控通路在不同的物种之间是非常保守的。比如细胞增殖、凋亡的信号通路在哺乳动物中基本一致。细胞的衰老途径也是一个非常保守的调控机制，在从小鼠到人类的细胞中，都受p19ARF，pRB，p53等基因调控。
在体外培养肝实质细胞过程中，为使细胞在体外培养条件下保持增殖能力，选用衰老或凋亡途径被破坏(或抑制)的细胞，本发明采用的人胎儿和成体纤维细胞。p53、Rb是一种细胞衰老信号通路相关的基因，其存在可使得细胞在体外培养条件下无法增殖，从而导致细胞向肝实质细胞转化后失去了增殖能力。LT能够抑制p53、Rb的活性，因此，较佳地，所述的细胞是低表达p53、Rb(或不表达)或者高表达LT的细胞。
使得细胞低表达p53、Rb(或不表达)或者高表达LT的方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于基因沉默(如通过siRNA在mRNA水平上使得基因不表达)或基因敲除(如通过基因打靶在基因组水平上使得基因不表达)，蛋白水平抑制(如通过特异性结合蛋白的抗体或配体)其它使细胞中基因(如p53、Rb)低表达或不表达，高表达LT的方法是本领域人员熟知的，均可被应用于本申请。
本发明的肝实质细胞有着多方面的用途。包括但不限于：用于制备促进肝脏再生的组合物(药物组合物)；用于制备治疗肝损伤(包括但不限于：终末期肝病、肝硬化、酒精肝、糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纤维化、肝癌、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤)的组合物(药物组合物)；用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物疗效的研究，例如用于研究药物运输、药物代谢、肝形成，肝再生，用于肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物，用于产生Albumin蛋白等。
本发明的肝实质细胞可用于肝毒理研究，作为本发明的一种方案，肝脏细胞的毒理实验主要依赖于Cyp450酶的活性，本发明的肝实质细胞也表达了大量Cyp450酶(包括Cyp1a1、Cyp27a1、Cyp2a4、Cyp2b10、Cyp2c29、Cyp2d9、Cyp2s1等等)。可基于Cyp450酶的活性确定肝实质细胞的外源毒物降解能力。例如，通过将本发明的肝实质细胞体外培养于诱导表达Cyp450酶的反应体系中。反应时，将细胞培养于加入底物(如咖啡因)的培养基中，分析反应产物(如副黄嘌呤)的含量，从而确定Cyp450酶的活性。
组合物
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：有效量的所述的肝实质细胞(如1×104-1×1012个；较佳的1×105-1×1010个)；以及药学上可接受的载体。其含有有效量的所述的肝实质细胞以及药学上可接受的载体。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
本发明还提供了一种促进肝脏再生的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的本发明所述的肝实质细胞。
所述组合物在用于给药时，通常1×102-1×1010个细胞/kg体重，较佳的1×103-1×108个细胞/kg体重是适合的，这还取决于临床医师的诊断以及患者的症状轻重。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明揭示了一种全新的获得肝实质细胞的方法，对人工肝脏以及再生医学的应用具有重要作用；
(2)本发明还优化了制备肝实质细胞的方法，找到了较佳的转录因子组合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I.材料和方法
分子克隆和慢病毒制备
pWPI质粒改造：慢病毒表达质粒pWPI购自Addgene，质粒改造见参考文献5，具体为将一段多克隆位点序列(CGGGATCCCGGCGCGCCGACTAGTCGACGCGTCGAGGTAACCTACGGACCGGTTT)插入pWPI的PmeI酶切位点。
将候选基因(各转录因子)的全长编码序列(cDNA序列，即文中所列转录因子相应GenBank登录号中的全长编码序列)分别克隆到经上述改造的pWPI质粒的中。其中，GATA4克隆到pWPI质粒的SpeI/MluI位点，FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A、HNF6和LAP克隆到pWPI质粒的BamHI/MluI位点。
HNF1B、HHEX、PROX1克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的XbaI/EcoRI位点。KLF4克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的XbaI/NotI位点。其中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP购于System Bioscience，转录因子克隆的多克隆位点中，酶切位点依次为XbaI、NHeI、EcoRI、BstBI、SwaI、BamHI、NotI。
SV40大T抗原(LT)克隆到pWPI质粒的BamHI/MluI位点。
将编码人p53shRNA的DNA寡核苷酸序列(GACTCCAGTGGTAATCTAC)插入pLKO.1质粒(购自Addgene)AgeI和EcoRI间，表达shRNA。
将编码人RB1shRNA的DNA寡核苷酸序列(CAGAGATCGTGTATTGA GATT)插入pLKO.1质粒AgeI和EcoRI间，表达shRNA。
将编码人p21shRNA的DNA寡核苷酸序列(CGCTCTACATCTTCTGC CTTA)插入pLKO.1质粒AgeI和EcoRI间，表达shRNA。
然后将构建好的含目的基因序列的pWPI质粒、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP或pLKO.1质粒分别与包装质粒psPAX2(购自Addgene)和pMD2.G(购自Addgene)利用磷酸钙转染的方法共转到293FT细胞(购自Invitrogen)。转染48小时后，收集包含病毒的上清并用0.45μm的滤膜过滤备用。
细胞培养
人原代肝细胞在37℃，5％CO2条件下培养。培养基为改良的Block’s培养基(另补加0.1mM的地塞米松、20mg/L的TGF、20mg/L EGF和1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS，购自Sigma-Aldrich))。人原代肝细胞购自Invitrogen Gibco(Carlsbad，CA)和Celsis InVitro Technologies(Blatimore，MD)。
人胎儿成纤维细胞(HFF)和人成年成纤维细胞(HAF)在37℃，5％CO2条件下培养。培养基为含有0.1mM的2-巯基乙醇(购自Sigma-Aldrich)、1×MEM NEAA(购自Gibco)和4ng/mL bFGF(购自Peprotech)的DMEM/F12培养基(购自Hyclone)。HFF获自中国福利会妇婴保健医院；HAF获自上海交通大学仁济医院。
第5-9代的HFF和HAF细胞用于hiHep的诱导。hiHep的诱导过程为：在I型胶原包被的6cm培养皿中接种1.75×105个人成纤维细胞。培养24h后，用含4μg/mL聚凝胺的指定病毒感染细胞(感染复数为1)。24小时后，将培养基换为含有0.1mM 2-巯基乙醇、1×MEM NEAA和4ng/mL bFGF(购自Peprotech)的DMEM/F12培养基。继续培养24小时后，将培养基换为含有0.1M地塞米松、20g/L的TGF-α、10g/L EGF和1×ITS的改良Block’s培养基。人iHep细胞的制备的流程示意图如图1A。
三维培养hiHep细胞分化成胆管：用400μL 5×DMEM/F12培养基和1.6mL的新鲜配制的1mg/mL中性胶原蛋白凝胶溶液将1×104个hiHep细胞重悬后，倒入一个35mm培养皿中培养。待凝胶凝固后，加入1.5mL含10％FBS、1×ITS和20ng/mL的HGF的DMEM/F12培养基对细胞进行培养。胆道分支管道在第3天开始出现。
PCR
用Trizol试剂(购自Invitrogen)从细胞中分离总RNA。首先按照试剂盒上的说明，利用M-MLV反转录酶(购自Promega)将1μg RNA反转录成cDNA。然后再用高保真的Taq的聚合酶(购自TransGen)对cDNA进行PCR扩增。最后用试剂盒SYBR Premix Ex Taq(购自TaKaRa)和ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems)进行实时定量PCR。引物序列如表2。
表2
Albumin、AAT ELISA
为了确定人类Albumin和AAT的分泌情况，收集培养48小时后的细胞培养上清液及移植实验中的动物血清。按照生产商的说明书，使用人类Albumin ELISA试剂盒(购自BETHYL Laboratory)和人类AAT的ELISA试剂盒(购自BETHYL Laboratory)来测定人类Albumin和AAT的分泌水平。
免疫荧光染色和流式细胞分析
免疫荧光染色时，先将细胞用4％多聚甲醛室温下固定15分钟，然后用含有0.2％(v/v)Triton X-100(购自Sigma)PBS处理15分钟。将细胞用PBS洗涤三次。用3％(w/v)BSA/PBS室温下封闭60分钟后，一抗(山羊抗人Albumin抗体(购自Bethyl Laboratories，1:100)、兔抗人α-1-antitrypsin抗体(购自NeoMarkers，1:200)、鼠抗人ZO1(购自Invitrogen，1:500))4℃孵育过夜。再用PBS洗涤三次，然后用合适的荧光标记的二抗Cy3-偶联的驴抗山羊IgG(购自Jackson Lab，1:1000)、Cy5-偶联的驴抗兔购自(Jackson Lab，1:500)和Cy5-偶联的驴抗鼠(Jackson Lab，1:1000)孵育60分钟(室温，避光)。最后对细胞核进行DAPI(购自Sigma)染色。实验中使用的一抗和二抗均用3％BSA的PBS进行稀释。
流式细胞分析时，先收集细胞，用0.1％BSA的HBSS溶液(购自Sigma-Aldrich)洗涤两次，然后与0.1％BSA HBSS溶液稀释的抗体在4℃孵育30分钟(避光)。后用孵育缓冲液洗涤两次，用Calibur Flow Cytometer(Becton Dickinson)分析。流式细胞检测实验中所用抗体如下：EpCAM-FITC(购自Miltenyi Biotec，1:11)和CD133-PE(购自Miltenyi Biotec，1:11)。流式细胞数据用FlowJo软件(Tree Star)分析。
各蛋白的检测抗体来源如表3。
表3
基因芯片分析
用于基因芯片分析的总RNA样品来自如下样品：两株HFFs，两株体外培养7天的人原代肝细胞，三次独立实验分别获得的hiHep细胞，三次独立实验分别获得的第10代hiHepLT细胞(表达SV40大T抗原的hiHep细胞)。总RNA按生产商(购自Agilent)的操作步骤杂交于人类全基因表达芯片，杂交信号用Gene-Spring进行标准化。基因芯片杂交和分析由ShanghaiBio Cooperation(上海，中国)完成。3526个在人类肝细胞，hiHep的细胞或hiHepLT细胞中表达差异2.5倍以上的基因被选中进行聚类分析。聚类分析采用cluster 3.0软件用Hierarchical分类。
PAS染色，DiI-ac-LDL吸收实验和ICG、Oil Red O染色
PAS染色采用Periodic-Acid-Schiff(PAS)试剂盒，并按生产商(购自Sigma)的操作步骤操作。DiI-ac-LDL染色按生产商(购自Invitrogen)的操作步骤完成。ICG(购自Sigma)吸收实验时，吸除培养基，加入1mg/mL ICG 37℃孵育1小时，PBS洗涤三次即可。OilRed O染色时，细胞用改良的Block’s培养基培养，4天后，将细胞用PBS(购自Hyclone)洗涤两次，用4％福尔马林固定30分钟后，PBS洗涤，然后用Oil Red O(购自Sigma-Aldrich)染色10分钟，后70％乙醇洗涤两次5分钟，最后用苏木精(购自Sigma-Aldrich)染色5分钟。
夹层培养和胆汁排泄检测
夹层培养：将1×105hiHep细胞、原代人肝细胞和HFF细胞接种到I型胶原包被的24孔板中。然后在细胞上倒入200L 1.5mg/mL新鲜配制的中和胶原蛋白凝胶溶液。待其凝固后，让细胞在含5％FBS、10M TCA和2M cAMP的Williams’E培养基中培养4天。胆汁排泄指数分析：首先将细胞洗涤一次，然后在HBSS缓冲液或无Ca2+HBSS缓冲液37℃孵育10分钟。吸除缓冲液，让细胞与测试化合物溶液(含5M DPDPE、2.5M CLF和5M D8-TCA的HBSS缓冲液)再孵育10分钟。接着用预冷HBSS洗涤三次，终止累积摄取。CLF和D8-TCA采用LC/MS/MS分析(PU-1580型，Jasco Inc.，Easton，MA)。通过NOVOstar酶标仪(BMG-Labtech，Offenburg，Germany)测量485nm和520nm激发光下的荧光强度对CLF进行定量。胆汁排泄指数(BEI)的计算公式为：BEI＝(AHBSS-AHBSS(无Ca2+))/AHBSS×100％。
动物
Fah-/-Rag2-/-(F/R)小鼠用7.5mg/L NTBC水饲养。Fah-/-Rag2-/-为C57Bl6/J与129Sv混合背景。C57Bl6/J小鼠购于南京大学模式动物研究中心(中国江苏南京)。F/R小鼠饲养在SPF级动物房。
F/R小鼠hiHepLT细胞移植
hiHepLT细胞移植的前六天开始，将F/R小鼠饮用水中的NTBC浓度降到3.75mg/L，持续三天。细胞移植前3天，将NTBC从小鼠饮用水中完全撤除。1×107hiHepLT细胞用200μL PBS垂悬后，通过脾脏注射移植到F/R小鼠肝脏中。为了清除F/R小鼠体内的自然杀伤细胞，在细胞移植1天前和移植7天后，每只小鼠腹腔注射40μg anti-mouse asialo-GM1(溶解在200μL的生理盐水中)。细胞移植后，按每克体重1μg FK506剂量每天给小鼠打药，体重监测每周两次。细胞移植8-10周后，处死存活的移植hiHepLT细胞的F/R小鼠并采集外周血和肝脏样品。对照组的F/R小鼠血液和肝脏样品在撤除NTBC后小鼠体重减轻30％时采集。
微囊包被的细胞
通过静电滴注技术将HFFs，hiHepLT细胞分别包被到藻酸盐-聚-L-赖氨酸海藻酸钠(APA)微囊中。简要地说，收集增殖的细胞然后将其悬浮在含有1.5％(w/v)过滤灭菌的藻酸钠溶液(Sigma)中(1.5×107细胞/mL)。将细胞悬浮液通过一个0.4毫米的针挤出进入100mM的CaCl2溶液中，用静电液滴发生器使其形成褐藻酸钙凝胶珠。洗涤后，将凝胶珠与0.05％(w/v)的聚-L-赖氨酸(PLL)(分子量21900，Sigma)进行孵育，以在凝胶珠表面形成海藻酸钠-聚-L-赖氨酸膜。用生理盐水洗涤凝胶珠，然后将其悬浮在0.15％(w/v的)藻酸盐5分钟从而在凝胶珠表面进一步包被藻酸盐。接着将膜封闭的凝胶珠悬浮于55mM柠檬酸钠溶液中以液化藻酸盐凝胶芯。结果形成直径约500μm的APA的微胶囊，而且只有分子量小于100KD的化合物能够渗透到微胶囊中。在移植到小鼠体内以前，包被于微囊中的HFFs和hiHepLT细胞保存在Block’s培养基中。
刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝功能衰竭小鼠hiHepLT细胞移植
按小鼠体重每公斤37.5mg的剂量给C57BL6/J小鼠尾静脉注射Concanavalin A(ConA，购自Sigma-Aldrich)。Con A在数小时内即可引起急性肝炎，24小时内几乎可以导致全部小鼠急性肝功能衰竭而死亡。Con A处理8小时后，将1.5×107个包被好的HFFs或hiHepLT细胞注射到急性肝功能衰竭的小鼠腹腔中。在小鼠注射Con A后的第一天每3个小时观察小鼠的存活情况，接下来的一周内每天观察3次。幸存下来的小鼠每隔24小时收集血液样本，处死后收集肝脏组织进行检测。
组织学和免疫组化
组织切片用4％中性福尔马林固定过夜，HE染色的组织切片用于病理分析。免疫组织化学染色时，将石蜡切片(3-4μm厚)在3％过氧化氢处理15分钟，后用含5％正常山羊或马血清的1％BSA-PBS封闭20分钟。一抗(兔抗FAH(AbboMax，San Jose，CA，1:3000))和兔抗人AAT(NeoMarkers，1:100))孵育过夜。按照VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories)说明加上二抗。最后用DAB染色(DAKO)。
统计分析
以上所有数据都以均数±标准差呈现。在这项研究中，大多数的统计评价都采用unpaired Student’s t test进行分析。采用Mantel-Cox log-rank test对小鼠生存情况进行分析。使用社会科学版软件(SPSS，IBM)的统计方案进行统计计算。所有统计分析的数据都来自于至少3个独立的样品或重复实验。
II、实施例
实施例1、三因子诱导的hiHep细胞
本实施例中，为了验证是否有可能通过过表达特定的转录因子将人胎儿成纤维细胞(HFF)转化为肝实质细胞，本发明人选择了8个转录因子(表1)，并将这些转录因子的cDNA克隆到了慢病毒表达质粒中。在初步实验中，本发明人在人胎儿成纤维细胞中利用慢病毒同时过表达8个转录因子。慢病毒感染12天后，这种细胞均被诱导表达了肝脏的标志基因ALBUMIN(ALB)、CK18、TTR、TRANSFERIN(图1B)，验证8个候选转录因子中哪些转录因子是诱导肝向转化所必须的。本发明人首先将候选转录因子缩小到了6因子(FOXA3、HNF1B、HNF4A、GATA4、HHEX、PROX1)和8因子(前述6因子加上C/EBPβ、KL4)。
采用了表达肝脏基因确认是否有肝向转化。无论过表达6因子组合(6TF)还是8因子组合(8TF)，HFF细胞在慢病毒感染14天后均可被诱导表达肝脏基因(ALBUMIN、TTR和TRANSTHYRETIN)、细胞角蛋白基因(CK18)(图1B、1C)。这些结果表明，C/EBPβ和KL4在HFF的肝向转化过程中不是必须的。
为了进一步缩减候选转录因子的数目，本发明人从6因子组合中逐个减少单个转录因子。本发明人发现去掉HHEX和GATA4以后ALBUMIN和其他肝脏基因的表达出现了显著上调或者没有显著变化(图1C)。因此本发明人将HHEX和GATA4从6因子组合剔除。因为有报道显示C/EBPβ对于肝脏功能具有重要影响。本发明人将其补充到剩余的4因子中，这样经过5因子诱导后，HFF细胞能够显著诱导表达ALBUMIN、CK18、TTR等肝脏基因(图1D)，在表达肝细胞基因的同时，HFF细胞也获得了一些肝细胞功能。特别的是，PAS染色表明5因子诱导的HFF细胞可积累肝糖原(图1E)，能将DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)转运到细胞内(图1F)，也能分泌大量的Albumin到培养基中(图1G)。
剩下的5个因子中，撤除PROX1或C/EBPβ或者将转录因子HNF1B与HNF1A相互替换后均使肝脏表达基因上调，其中HNF1A比HNF1B略好(图2A、2B)，而撤除FOXA3、HNF1A和HNF4A其中任何一个转录因子后，HFF细胞都会降低肝脏基因的表达(图2C)，这说明在本发明人的实验中，3TF(FOXA3、HNF1A和HNF4A)中任何一个因子均是诱导HFF的肝向转化所必需的。
实施例2、hiHep细胞的体外功能验证
本实施例中，将从HFF中过表达FOXA3，HNF1A，HNF4A转化过来的hiHep细胞进行了体外和体内肝功能验证。
TTF过表达3因子后，最早在第14天即有上皮样细胞形成(图3A)。为了确定HFF的肝向转化时间点，本发明人用RT-PCR分析了HFF感染慢病毒之后不同时间点的基因表达情况。与HFF向上皮细胞转化的过程一致，许多肝脏基因如：ALBUMIN、CK18、TTR、TRANSFERIN、AAT、CLDN2、GJB1、HNF1B均在第4天即开始表达(图3B)。这些基因的表达随时间而增强，说明重编程的程度随时间而增强。另外，ELISA与免疫荧光染色也说明Albumin和TTA不仅在RNA水平，也在蛋白水平上有表达，而且能大量分泌到培养基内(图3C，D，E)。
为了研究hiHep细胞的基因表达谱，本发明人用DNA芯片分析以下细胞：三个iHep单克隆(hiHep-1、hiHep-2、hiHep-3)，HFF，两个正常人的肝脏细胞(Hu Hep-1、Hu Hep-2)，通过Pearson相关性聚类分析，hiHep-1、hiHep-2和hiHep-3细胞的基因表达谱与正常人的肝实质细胞聚为一类，而与HFF细胞关系较远(图3F)，说明hiHep细胞具有和人肝实质细胞类似的基因表达谱。
总而言之，这些结果说明HFF的肝向转化过程中整个基因表达谱都从纤维细胞状态转变成了肝细胞状态。
为了进一步验证iHep细胞中的基因表达，本发明人在体外验证了hiHep细胞的功能。PAS染色表明hiHep细胞中有大量的可被染成红色的颗粒，说明这些细胞可积累糖原(图3G)。
在DiI-ac-LDL吸收测试中，iHep细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里(图3H)。
Indocyanine green(ICG)吸收测试验证hiHep细胞可将ICG从培养基中转运到包浆里(图3I)。
油红O染色验证hiHep细胞包浆中可以积累甘油三磷酸及脂滴(图3J)。
hiHep细胞能够大量表达分泌排泄胆汁的转运蛋白(图3L)，并具有代谢DPDPE、CLF、TCA等药物的功能(图3K，M)，能高表达CYP1A2药物代谢相关的酶(图3N)。
全基因组表达谱的分析也发现，hiHep细胞能够表达大量肝特异的分泌蛋白(图4a)、凝血因子(图4b)和CYP450代谢酶(图4c)。这些结果说明，hiHep细胞在体外培养环境下获得了大量肝实质细胞的功能。
hiHep细胞表达了调控糖代谢、脂类代谢、胆汁生成相关的基因，异源物代谢基因等相关肝实质细胞功能基因，以及hiHep细胞产生的肝实质细胞功能，如积累糖原、转运LDL、分泌Albumin，说明hiHep细胞可用来研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生。
实施例3、人原代纤维细胞HFF-2诱导获得hiHep细胞
为了确认3因子诱导获得hiHep细胞不是细胞株特异的，本发明人选择了另一株人原代胎儿成纤维细胞(HFF-2)进行诱导hiHep细胞。HFF-2不表达胚肝特异表达的基因(图5a、b)，说明HFF-2没有胚胎肝细胞的污染。
通过过表达FOXA3，HNF1A，HNF4A这3种因子，HFF-2细胞也可被诱导成上皮样的hiHep细胞(图5c)。
这种HFF-2来源的hiHep细胞也表达大量肝脏特异的基因(图5d)，并且可以积累肝糖原(图5e)，转运ac-LDL(图5f)。
实施例4、诱导成年人成纤维细胞为hiHep细胞
为验证3因子(FOXA3，HNF1A，HNF4A)可诱导成年人成纤维细胞(HAF)为hiHep细胞，本发明人在HAF细胞中过表达3因子，过表达方法(病毒转染)如前。
结果显示，过表达3因子的HAF细胞能形成上皮样细胞(图6A)，被诱导表达了调控糖代谢、脂类代谢、胆汁生成相关的基因(图6B-C)。同时过表达3因子的HAF细胞也具有肝实质细胞功能，能积累肝糖原(图6D)，转运ac-LDL(图6E)。
实施例5、过表达LT的hiHep细胞具有肝实质细胞特性，并且能够持续传代
HFF细胞过表达3因子组合7天后会有明显的细胞增殖阻滞和细胞死亡(图7A)，本发明人认为这是因为HFF和HAF细胞并不具备体外增殖能力，导致成纤维细胞向肝实质细胞转化后失去了增殖能力。
为了克服这个障碍，本发明人在hiHep细胞中过表达LT，构建能够增殖的hiHepLT。LT抑制p53、Rb等活性，可致细胞衰老信号通路失活，从而hiHep细胞可获得体外增殖能力而不影响遗传稳定性。相比较于在hiHep细胞中抑制p53、Rb蛋白水平，hiHepLT表现出很好的增殖能力(图7A，B)，hiHepLT细胞能形成上皮样细胞并表达上皮细胞的标志基因ZO-1(图7C)，hiHepLT、培养10代的hiHepLT不仅能够表达肝脏相关基因、蛋白(图7C-E)，也具有肝实质细胞功能，如积累糖原(图7F)、转运LDL(图7G)，分泌Albumin(图7H)。而且进一步的Array芯片分析显示：三个过表达LT的hiHep单克隆(hiHep-1LT、hiHep-2LT、hiHep-3LT)与3个hiHep单克隆以及正常render肝实质细胞聚为一类而与HFF细胞关系较远(图7I)，说明hiHepLT细胞具有和hiHep细胞及人肝实质细胞类似的基因表达谱。
同时，本发明人通过实验证明，HAF在过表达LT的基础上同样能通过3因子诱导，成为一种能增殖的同时具有肝实质细胞特性的细胞(图8A-E)。
实施例6、hiHepLT不具有hepatoblast的特性，在体内不能形成肿瘤
当hiHep细胞过表达LT具有增殖能力时，本发明人要确定它不是胚肝细胞(hepatoblast)。结果显示，hiHepLT不表达hepatoblast相关标志基因Lin28b，IGF2，Dlk1和EpCAM(图9A、9B)，不表达胆管上皮的标志基因(图9C)，3D培养情况下也不能形成胆管(图9D)。这些结果排除了在hiHepLT为hepatoblast的可能性。
为了分析把具有增殖能力的hiHepLT细胞移植到体内的成瘤性。本发明人进行了核型分析，结果确定了hiHepLT细胞在培养很多代后仍然具有正常的染色体数目(图10A)。同时将hiHepLT细胞移植到皮下时，其不能像PLC/RPF/5细胞那样形成肿瘤(图10B)，进而排除其成瘤特性。
实施例7、hiHep细胞的体内功能验证
为了研究hiHep细胞是否能重建肝脏，并在体内获得正常的肝脏功能，本发明人将这些细胞移植到Fah基因缺失的小鼠肝脏中。Fah缺失小鼠(Fah-/-)在正常饲养条件下需喂食加有NTBC的水。在撤掉NTBC之后(NTBC-off)，Fah-/-小鼠血清中酪氨酸等氨基酸水平均会上调，此外肝功能的重要指标如ALT和AST也会有明显上调。最后NTBC-off的Fah-/-小鼠会因严重的肝脏损伤导致肝衰竭而死亡。通过脾脏注射移植肝实质细胞，外源的肝实质细胞可在NTBC-off的Fah-/-小鼠肝脏中增殖并重建其肝脏功能，从而救活小鼠。
本发明人将1×107iHepLT细胞通过脾脏注射移植到7只8-12周大小的NTBC-offFah-/-Rag2-/-(F/R)小鼠中(图11A)。F/R小鼠因Rag2基因缺失而导致T细胞和B细胞无法成熟，同时用免疫抑制剂FK506和anti-asialo GM1，可尽量降低移植iHep细胞后产生的免疫排斥。对照组的NTBC-off F/R小鼠未移植iHep细胞。所有的7对照小鼠均在撤除NTBC水后4周内死亡(图11B)。在这段时间里，对照组小鼠因肝脏损伤而体重逐渐减轻。与此相对，7只移植hiHepLT细胞的F/R小鼠中有4只在移植9周后仍然存活(图11B)。在这些存活小鼠血液内检测到人源的Albumin(图11D，11H)，而且ALT和AST都有了非常显著的下调(图11C，H)。而且进一步的免疫组化实验以及人源Alu重复序列的检测显示hiHepLT细胞进入并重构了肝脏(图11E-G)。这些结果说明，hiHepLT细胞对撤除NTBC后的F/R小鼠有明显治疗作用。
刀豆蛋白A(ConA)诱发的小鼠急性肝损伤是T淋巴细胞介导的肝损害模型之一，很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病。其特征是在很短时间内小鼠肝脏有大量中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等炎症性细胞浸润，同时血液中转氨酶水平大量升高。本发明人通过具有半通透性的alginate-poly-L-lysine-alginate微胶囊将hiHepLT细胞包裹起来(图12A，B)，避免其被免疫系统所识别、吞噬。同时由于微胶囊具有半通透性，因此包裹在微胶囊内部的hiHepLT细胞能够分泌的Albumin进入到血液(图11E)。将1.5×107个微胶囊包裹的HFF、hiHepLT细胞通过尾静脉注射到Con A诱导急性肝损伤的小鼠体内。结果11只ConA诱导急性肝损伤的小鼠在注射微胶囊包裹的hiHepLT细胞48后，有6只仍然存活，4天后其中的4只小鼠完全康复，而在注射微胶囊包裹的HFF细胞后，所有的小鼠在24h后全部死亡(图12C)。而进一步的组织学检测，发现微胶囊包裹的hiHepLT细胞显著降低了由Con A诱导的肝损伤(图12D-G)。
实施例8、hiHep细胞感染肝炎病毒的能力
人的肝实质细胞与小鼠的肝实质细胞或人的其他组织的细胞不同，可特异性地被肝炎病毒感染。肝炎病毒感染人的肝实质细胞是依赖肝特异表达的受体。为了研究本发明的hiHep细胞是否也具有被肝炎病毒感染的能力，本发明人检测了hiHep细胞中肝炎病毒受体的表达。
结果发现，hiHep细胞表达乙肝病毒的受体NTCP(图3L)和丙肝病毒的受体CD81、SRB1、CLDN1和Occludin(图13A)。此外，hiHep细胞也和经典的丙肝病毒感染模型Huh7.5.1细胞一样，可被携带萤光素酶的丙肝假病毒感染(图13B)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种肝实质细胞的分化诱导方法，其特征在于，所述方法包括：在细胞中过表达以下转录因子：
HNF4A；
HNF1A；和
FOXA3；
其中，所述的细胞是人源的成纤维细胞或上皮细胞，且是衰老或凋亡途径被破坏的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞通过过表达SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途径被破坏。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，过表达所述的转录因子和/或SV40大T抗原的方法是：
(a)提供细胞；
(b)用表达载体将所述的转录因子和/或SV40大T抗原转入(a)的细胞中；
(c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子和/或SV40大T抗原的细胞，该细胞就是肝实质细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肝实质细胞具有如下一种或多种性能：
1)形成上皮样细胞克隆；
2)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：ALBUMIN；
3)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：CK8和CK18；
4)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：AAT，TTR，ASGPR1，GJB1；
5)积累肝糖原；
6)转运乙酰化低密度脂蛋白；
7)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白：糖代谢、药物代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、胆汁酸代谢相关基因或蛋白、调控止血和纤维蛋白溶解的基因或蛋白、第I级和第II级异源物代谢基因、分泌性蛋白基因。
5.一种肝实质细胞，其特征在于，所述肝实质细胞由权利要求1-4任一所述的方法分化诱导产生。
6.权利要求5所述的肝实质细胞的用途，用于制备促进肝脏再生或治疗肝损伤的组合物。
7.权利要求5所述的肝实质细胞的用途，用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物。
10.权利要求5所述的肝实质细胞的用途，用于产生Albumin蛋白。
11.权利要求5所述的肝实质细胞的用途，用于制备肝炎病毒感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于筛选抗肝炎病毒的药物。
12.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有：
权利要求5所述的肝实质细胞；以及药学上可接受的载体。
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