JP2003033179A - 可逆的遺伝子導入ベクター - Google Patents

可逆的遺伝子導入ベクター

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章 伊藤
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 哺乳動物細胞に導入した任意の遺伝子を、任
意の時期に低分子化合物を作用させ該遺伝子を該細胞か
ら取り除くことができる発現制御システムの提供。 【解決手段】 哺乳動物細胞中で、下記要件を満たす遺
伝子配列構造を与える単一遺伝子ベクター。 （１）：両方向性低分子化合物応答性プロモータの下流
の一方に低分子化合物制御性トランス活性化因子をコー
ドするDNA、他方に部位特異的リコンビナーゼをコード
するDNAおよびポリA付加配列を配置してなる構造、
（２）：上記部位特異的リコンビナーゼの２つの標的部
位の間に任意遺伝子を配置してなる構造、（３）：上記
任意遺伝子を、哺乳動物細胞で該遺伝子を発現し得るプ
ロモータの制御下に配置し、かつ転写産物がRNA二重鎖
を形成するように（１）記載の部位特異的リコンビナー
ゼをコードするDNAを配置してなる構造、および
（４）：上記転写産物にポリAを付加しうるポリA付加配
列を配置してなる構造。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、任意の遺伝子を哺
乳動物細胞のゲノム中に挿入して発現することが可能で
あり、必要時に低分子化合物の誘導によって該遺伝子を
削除することが可能な単一ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、発生工学、幹細胞生物学など基礎
科学の発展と遺伝子治療用ベクター技術などの進歩によ
り再生医学への関心が急速に高まり、皮膚、軟骨、骨、
血液、血管、神経、心筋、肝臓、膵島などの多岐にわた
る機能細胞、器官、臓器の体外および体内での増殖およ
び組織形成技術が研究されている。これらの詳細は「再
生医学と生命科学」蛋白質核酸酵素2000年9月号増刊
（共立出版社）、「再生医学」最新医学別冊（最新医学
社）、モレキュラー・メディシン38巻１号（中山書店）
などに記載されている。
【０００３】再生医学に共通の克服すべき点の一つに細
胞ソースがあり、それぞれのターゲットとなる細胞、器
官、臓器に必要な細胞機能を獲得する過程と十分な細胞
数を得る過程、すなわち機能性と増殖性の二点が要求さ
れる。これらの条件を満たす細胞ソースは、皮膚などの
単純な組織を除いて、現在の技術水準では十分に得られ
ていない。しかしながら、近年、胚性幹細胞（ES細胞）
の増殖・分化誘導、また成体幹細胞（新生児由来を含
む）の増殖・分化誘導、さらに終末分化した機能細胞を
一時的に不死化あるいは脱分化する方法などが注目され
ている。ES細胞は個体を生み出し得ることから全能性に
分化可能な細胞と考えられ、マウスでは実際に多様な細
胞に分化することが報告されており（前記「再生医学と
生命科学」丹羽の項）、近年ヒトES細胞が樹立されたこ
とから医療への応用が期待されている（前記「再生医学
と生命科学」中辻の項）。一方、成人の体内にも造血系
幹細胞、神経幹細胞、骨髄間葉系幹細胞などの各種幹細
胞の存在が確認され（前記「再生医学と生命科学」中
内、岡野、福田の項）、造血系幹細胞以外の幹細胞は体
外での増殖技術が可能な点、神経幹細胞はすべての胚葉
に分化可能な点（Clarkeら、Science、288巻、1660頁）
で、特に自己細胞移植のための細胞ソースとして注目を
集めている。また終末分化した機能細胞の不死化は、ヒ
ト肝細胞を不死化遺伝子の導入によって増殖可能にし、
がん化の危険性のある不死化遺伝子を削除することで本
来の肝細胞の機能が回復することが報告されている（小
林ら、Science、287巻1258頁）。
【０００４】これら細胞ソースの増殖性の獲得、特定系
統の細胞への分化誘導、分化・脱分化の制御、不死化・
脱不死化の制御などのために外来遺伝子を細胞に導入
し、発現を制御することが行われている。細胞に導入し
た外来遺伝子を任意に発現をコントロールする方法とし
ては、条件的発現制御システムを利用する方法、部位特
異的リコンビナーゼを利用する方法などが知られてい
る。
【０００５】哺乳動物細胞の条件的発現制御システムと
しては、１）温度感受性プロモータもしくは外来遺伝子
の温度感受性変異体の使用、２）重金属イオンによって
誘導されるプロモータの使用、３）ホルモンによって誘
導されるプロモータの使用、４）低酸素濃度によって誘
導されるプロモータの使用、５）サイトカインによって
誘導されるプロモータの使用、６）テトラサイクリンte
tracyclineによって誘導される制御システムの使用、
７）FK506（ラパマイシンrapamycinとも呼ばれる）によ
って誘導される制御システムの使用、８）RU486（ミフ
ェプリストンmifepristoneとも呼ばれる）によって誘導
される制御システムの使用、９）エクダイソンecdysone
によって誘導される制御システムの使用、10）ストレプ
トグラミンstreptograminによって誘導される制御シス
テムの使用、が知られている。１）〜５）の条件的発現
制御システムは古典的であり、基底状態での発現量が多
いこと、目的の遺伝子制御以外に細胞に多様な作用をも
たらすため、哺乳動物細胞での発現制御には適切でな
い。
【０００６】一方、近年に開発された６）〜10）の条件
的発現制御システムはこれらの問題を克服するために開
発され、６）についてはMolecular Cloning, Third Edi
tion, Cold Spring Harbor Laboratory Press、17.52-1
7.59頁 およびGossenら（Proc. Natl. Acad. Sci.USA、
89巻5547-5551頁およびScience、268巻1766-1769頁）
が、７）についてはMagariら（J. Clin. Invest. 100巻
2865-2872頁）およびClackson（Current Opinion in Ch
emical Biology、1巻210-218頁）が、８）についてはHa
rveyら（Current Opinion in Chemical Biology、２巻5
12-518頁）が、９）についてはMolecular Cloning, Thi
rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、1
7.71-17.74頁、 Saezら（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、87巻14512-14517頁）およびNoら（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、93巻3346-3351頁）が、10）についてはFu
sseneggerら（Nature Biotechnology、18巻1203-1208
頁）が各々の報告で詳細に解説している。
【０００７】これらの中では、テトラサイクリンによっ
て誘導される制御システムが最も一般的に用いられてい
る。このシステムはGossenら（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、89巻5547-5551頁およびScience、268巻1766-1769
頁）によって開発され、テトラサイクリンおよびドキシ
サイクリンなどその誘導体（集合的にTetと表記）の誘
導によって任意の遺伝子発現を開始（Tet-on）または停
止（Tet-off）させることが可能である。この機構はTet
-off制御システムを例にとって説明すると、Tetトラン
スアクチベータ（tTA）蛋白質が低分子化合物の抗生物
質Tetと複合体を形成し、この複合体が19merのDNA配列
であるTet応答エレメント（TetO）のタンデム配列に結
合することによって近傍の最小プロモータの活性を抑制
し、プロモータ下流の任意の遺伝子発現を抑制する。本
明細書中ではTetOタンデム配列と最小プロモータの組み
合わせを単にTet応答プロモータと表記する。
【０００８】テトラサイクリンによって誘導される制御
システムでは、Tet応答プロモータとは別に、tTA蛋白質
の発現系が必要であり、通常は別のベクター中の常時発
現プロモータ下流にtTA蛋白質をコードする遺伝子をつ
ないで発現させる。tTA蛋白質は、大腸菌トランスポゾ
ン10（Tn10）に由来し、Tet非存在下でTetOに結合するT
etリプレッサー（TetR）蛋白質と、ヘルペス単純ウィル
ス（HSV）に由来し、転写活性化作用を有するVP16の融
合蛋白質である。一方、Tet-on制御システムは、tTA蛋
白質の代わりにtTA蛋白質の４アミノ酸が変異した蛋白
質、リバースTetトランスアクチベータ（rtTA）蛋白質
を使用する。rtTA蛋白質は、Tet非存在下でTet応答プロ
モータの転写活性を抑制し、Tet存在下で活性化する作
用を有する。
【０００９】テトラサイクリン誘導制御システムは様々
な改良が行われている。すなわち単一のベクターに任意
遺伝子制御系と(r)tTA発現系を組み込んだベクターの作
製（Paulusら、J.Virol、70巻62-67頁）、(r)tTAとTetO
の変異体の作製とTet濃度変化によって２種類の遺伝子
の発現を切り替えるシステム（Baronら、Proc. Natl.Ac
ad. Sci. USA、96巻1013-1018頁）、Tetリプレッサーと
Tetアクチベータを組み合わせて、Tet濃度により厳密な
応答性を持たせたシステム（Rossiら、Molecular Cel
l、６巻、723-728頁）、TetOプロモータ制御下にレポー
ター遺伝子とtTAをコードするDNAをIRES（internal rib
osome entry site、脳心筋炎ウィルス由来）を介してバ
イシストロニックに発現させることにより自己制御が働
くシステムとし、基底時の発現レベルを低減したシステ
ム（Hofmannら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻518
5-5190頁）が報告されている。
【００１０】Tet以外の低分子化合物による発現制御シ
ステムもほぼ同様な機構で発現制御が行われる（Clacks
on、Current Opinion in Chemical Biology、1巻210-21
8頁）。上記の参考文献にも同様な機構による発現制御
が報告されている。なお本明細書中で用いられる低分子
化合物とは、テトラサイクリン、FK506、RU486、エクダ
イソン、ストレプトグラミン及びそれらの誘導体を含む
低分子の有機化合物を指す。
【００１１】部位特異的リコンビナーゼとして、Creリ
コンビナーゼ（Gormanら、Current Opinion in Biotech
nology 11巻、455-460頁）、FLPリコンビナーゼ（Buchh
olzら、Nature Biotechnology 16巻、657-662頁）を含
むいくつかの部位特異的リコンビナーゼが見いだされて
いる。これらのリコンビナーゼはインテグラーゼファミ
リーに属し、微生物由来ながら高等生物の細胞内および
個体中で作用することが報告されている（Sauerら、Cur
rent Opinion in Biotechnology ５巻、521-527頁）。
さらにトランスジェニックマウスで特定の臓器、あるい
は任意の時期に外来遺伝子を発現開始、あるいは停止さ
せるため、Creリコンビナーゼ遺伝子上流に臓器特異的
プロモータ、あるいはインデューシブル・プロモータを
接続したベクターを作製し、一方で２つのloxP配列に外
来遺伝子、あるいは外来遺伝子の発現を妨害するスタッ
ファー配列を挟む構造を有するベクターを作製し、これ
らのベクターをES細胞に導入してトランスジェニックマ
ウスを作製することが報告されている（Metzgerら、Cur
rent Opinion in Biotechnology 10巻、470-476頁）。F
LPリコンビナーゼとその認識配列であるFRTもCre/loxP
と同様な検討がなされている（下記Westermanらの参考
文献）。
【００１２】Westermanらは、シミアン・ウィルス由来
の不死化遺伝子SV40ラージＴ抗原を部位特異的リコンビ
ナーゼの２つの標的部位間に挟んだレトロウィルスベク
ターを作製し、このベクターを正常細胞に導入したとこ
ろ細胞増殖の向上と寿命の延長が観察され、次にこの細
胞にCreリコンビナーゼを発現可能なレトロウィルスベ
クターを導入することでSV40ラージＴ抗原遺伝子が削除
されることを報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、93巻、8971-8976頁）。不死化遺伝子が２つのリコ
ンビナーゼ標的部位の間に挟まれた構造をゲノム中に有
し、リコンビナーゼによって不死化遺伝子を切り出すこ
とができる細胞は、特表平11-507230に記載されてい
る。特表平11-507230に記載の方法は、そのFIG.3C、FI
G.6AおよびFIG.6B記載のベクターを用いる遺伝子の導入
方法であり、誘導プロモータ下流にリコンビナーゼ遺伝
子を配置し、同一ベクター中にその認識配列に挟まれた
不死化遺伝子を配置したベクターを使用する方法である
（図面の図1-1）。しかし、誘導プロモータとリコンビ
ナーゼ遺伝子の組み合わせは、上記した条件的発現制御
システム中の1）〜5）記載の古典的な発現制御システム
であって、基底時の発現量が多く（Saszら、Current Op
inion in Biotechnology、8巻608-616頁）、また6）〜1
0）記載の低分子化合物によって誘導される制御システ
ムでさえも基底時の発現制御が厳密ではないので、必要
時以外にリコンビナーゼの発現を止めておくことは容易
ではないと言う欠点を有する。
【００１３】テトラサイクリン誘導制御システムの例で
は、Werner Paulusらの報告（J. Biotechnology, 81巻1
59-165頁）によれば、発現on/offの発現比の平均はTet-
off制御では100倍程度、Tet-on制御では10倍程度でしか
ない。したがって基底時の微量の遺伝子発現が細胞に不
可逆的な影響を及ぼすような遺伝子への応用は困難であ
る。このような遺伝子には、細胞毒性を引き起こす遺伝
子、アポトーシスを誘導する遺伝子、細胞分化誘導遺伝
子、不死化遺伝子、がん化遺伝子、部位特異的リコンビ
ナーゼのような核酸配列の組換えを引き起こす蛋白質を
コードする遺伝子などが含まれる。実際にテトラサイク
リン発現システム制御下にCreリコンビナーゼを配置し
て、その動作を確かめた例（St-Ongeら、Nucleic Acids
Research、24巻3875-3877頁）では、基底時にCreリコ
ンビナーゼの発現漏れが生ずることが記載されている。
このような基底時の発現漏れは、低分子化合物によって
誘導される制御システムの最大の弱点であり、様々な検
討が試みられている（Molecular Cloning, Third Editi
on, Cold Spring Harbor Laboratory Press、17.56
頁）。また、レトロウィルスベクターLTRおよび内部プ
ロモータによる転写産物に対して転写産物がセンスもし
くはアンチセンスとなるように誘導プロモータ下流に分
泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子を配置し、アンチ
センス配置では微量の基底発現しか観察されないことが
報告されている（Pollockら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、97巻13221-13226頁）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、哺乳動物細胞に任意の遺伝子を導入するこ
とにより細胞の性質を変化させた後、任意の時期に低分
子化合物を該細胞へ作用させることにより該遺伝子を取
り除くことができる発現制御システムであって、基底時
の微量の遺伝子発現が細胞に不可逆的な影響を及ぼす遺
伝子の発現レベルを低減させ、特に部位特異的リコンビ
ナーゼ転写産物の発現漏れをなくすことができる発現制
御システムを提供することにある。部位特異的リコンビ
ナーゼを含む単一ベクターの場合には、極微量の発現漏
れでもベクターの組換えが起きるため最も厳しい条件が
求められ、発現は実質ゼロでなければならない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の課題は、任意の
遺伝子を哺乳動物細胞のゲノム中に組み込ませて発現す
ることが可能であるとともに、必要時に低分子化合物の
誘導による部位特異的リコンビナーゼの発現によって該
リコンビナーゼの標的部位に挟まれた該遺伝子の削除を
可能とする制御遺伝子群を全て内包する単一遺伝子ベク
ターによって解決される。
【００１６】すなわち、本発明は以下の発明を包含す
る。 （１）哺乳動物細胞のゲノム中に挿入したときに、下記
(i)〜（iv）すべての要件を満たす遺伝子配列構造を与
える単一遺伝子ベクター。 （i）：両方向性低分子化合物応答性プロモータの下流
の一方に低分子化合物制御性トランス活性化因子をコー
ドするDNAを配置し、もう一方のプロモータ下流に部位
特異的リコンビナーゼをコードするDNAおよびポリA付加
配列を配置してなる構造。 （ii）：（i）記載の部位特異的リコンビナーゼの２つ
の標的部位の間に任意遺伝子を配置してなる構造。 （iii）：（ii）記載の任意遺伝子を、哺乳動物細胞で
該遺伝子を発現し得るプロモータの制御下に配置し、か
つ該プロモータによる転写産物が部位特異的リコンビナ
ーゼDNAの転写産物を含む場合には、該転写物が（i）記
載の部位特異的リコンビナーゼDNAの転写産物とRNA二重
鎖を形成するように（i）記載の部位特異的リコンビナ
ーゼをコードするDNAを配置してなる構造。 （iv）：（i）記載の低分子化合物制御性トランス活性
化因子の転写産物および（iii）記載のプロモータによ
る転写産物にポリAを付加しうるポリA付加配列を配置し
てなる構造。
【００１７】（２） 以下の遺伝子配列構造を有する
（１）記載のベクター。５’−部位特異的リコンビナー
ゼの標的部位−哺乳動物細胞で発現し得るプロモータ−
任意遺伝子−逆向きに配置したポリA付加配列−部位特
異的リコンビナーゼを逆向きにコードするDNA−両方向
性低分子化合物応答性プロモータ−低分子化合物制御性
トランス活性化因子をコードするDNA−ポリA付加配列−
部位特異的リコンビナーゼの標的部位−３’
【００１８】（３）以下の遺伝子配列構造を有する
（１）記載のベクター。５’−哺乳動物細胞で発現し得
るプロモータ−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−
任意遺伝子−逆向きに配置したポリA付加配列−部位特
異的リコンビナーゼを逆向きにコードするDNA−両方向
性低分子化合物応答性プロモータ−低分子化合物制御性
トランス活性化因子をコードするDNA−部位特異的リコ
ンビナーゼの標的部位−ポリA付加配列−３’
【００１９】（４）以下の遺伝子配列構造を有する
（１）記載のベクター。５’−哺乳動物細胞で発現し得
るプロモータ−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−
任意遺伝子−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−逆
向きに配置したポリA付加配列−部位特異的リコンビナ
ーゼを逆向きにコードするDNA−両方向性低分子化合物
応答性プロモータ−低分子化合物制御性トランス活性化
因子をコードするDNA−ポリA付加配列−３’
【００２０】（５）レトロウィルスベクターである
（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。 （６）低分子化合物がテトラサイクリンもしくはその誘
導体であり、かつ低分子化合物制御性トランス活性化因
子がリバーステトラサイクリントランスアクチベータで
ある（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。 （７）部位特異的リコンビナーゼがCreリコンビナーゼ
であり、かつ部位特異的リコンビナーゼの標的部位がlo
xPである（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。 （８）部位特異的リコンビナーゼがFLPリコンビナーゼ
であり、かつ部位特異的リコンビナーゼの標的部位がFR
Tである（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。
【００２１】（９）任意遺伝子がヒト・テロメラーゼ遺
伝子および／またはＢｍｉ−１遺伝子である（１）〜
（４）のいずれかに記載のベクター。 （１０）3’側の部位特異的リコンビナーゼ標的部位の
3’側に第二の任意遺伝子を配置してなる構造を有する
（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。 （１１）以下の遺伝子配列構造を有する（１０）記載の
ベクター。５’−LTR−部位特異的リコンビナーゼの標
的部位−任意遺伝子１−逆向きに配置したポリA付加配
列−部位特異的リコンビナーゼを逆向きにコードするDN
A−両方向性低分子化合物応答性プロモータ−低分子化
合物制御性トランス活性化因子をコードするDNA−部位
特異的リコンビナーゼの標的部位−任意遺伝子２−LTR
−３’
【００２２】（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記
載のベクターの哺乳動物細胞ゲノムへの遺伝子導入ベク
ターとしての使用。 （１３）（１）〜（１１）のいずれかに記載のベクター
により形質転換された哺乳動物細胞。 （１４）遺伝子治療用ベクターとしての（１）〜（１
１）のいずれかに記載のベクターの使用。 （１５）（１）〜（１１）のいずれかに記載のベクター
を導入して作製されたトランスジェニック動物。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明は、基底時の発現レベルを
低減するアンチセンスを利用し、rtTAをTet応答プロモ
ータ制御下に配置することにより自己制御システムに適
応し、さらに部位特異的リコンビナーゼ、任意遺伝子、
部位特異的リコンビナーゼの標的部位などのベクター構
成要素をコンパクトに配置させたことを特徴とし、特に
両方向性低分子化合物応答性プロモータを主要な構成要
素としてベクター中に含む。
【００２４】まず、本発明では、アンチセンスにより、
部位特異的リコンビナーゼ転写産物の発現漏れを中和す
る。図1-2Aに示すように、細胞のゲノム中に5'側から、
プロモータ活性を有するレトロウィルスベクターLTR（l
ong terminal repeat）の下流に任意の遺伝子を配置
し、次に常時活性型の内部プロモータ下流にrtTAをコー
ドする遺伝子を配置し、さらにTet応答プロモータ下流
にCreリコンビナーゼをコードする遺伝子を逆向きにな
るように配置するベクターを作製した。なお、図で示す
のは細胞のゲノムに取り込まれた時の状態である。すな
わち図1-2Bに示すようにCreリコンビナーゼ転写産物
が、LTRおよび内部プロモータによる転写産物に対して
アンチセンスとなるように配置した。これはTet非存在
下において、漏出程度のCreリコンビナーゼ転写産物は
十分にキャンセルされるとの仮説に基づくものである。
このベクターのプラスミドを作製し、レトロウィルスベ
クターを生産し、哺乳動物細胞を感染した。しかしなが
ら、この検討で得られた細胞のゲノムDNAのPCR（polyme
rase chain reaction）とDNAシーケンシングの結果か
ら、Tet添加前の細胞は、図1-2Aではなく図1-2Cに示すD
NA配列を有する。この原因はレトロウィルスベクターを
パッケージング細胞株で作製する段階、もしくは標的細
胞へ感染させた段階のいずれかでCreリコンビナーゼが
微量に発現し、loxPスタッファーが切り出されているこ
とが考えられる。このことから、アンチセンスの利用
は、通常の遺伝子発現では漏出防止に十分な効果がある
が、同一ベクター内のloxPサイトを触媒するCreリコン
ビナーゼへの応用には十分ではなく、さらに厳密な制御
が必要である。
【００２５】次に、本発明の特徴は、アンチセンスの利
用に加えて、rtTAをTet応答プロモータ制御下に配置す
ることによる自己制御システムの適応である。Tet応答
プロモータは、TetOタンデム配列にrtTA分子中のtetR
（Tetリプレッサー）変異体領域とTetとの複合体が結合
し、rtTA分子中のVP16領域が近傍の最小プロモータを活
性化することによって、はじめて発現がonになるが、Te
tの量を制限するだけでなく、転写活性化因子を含むrtT
Aの量もTet応答プロモータ依存的にすることで基底時の
発現レベルを低減できる。このシステムを利用して、Hof
mannらがTet応答プロモータ制御下にIRESを介してtTAを
コードするDNAを配置して、基底時の発現レベルを低減
した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻5185-5190
頁）。
【００２６】さらに、基底時の発現レベルを低減するア
ンチセンスの利用と自己制御システムの適応の二点の改
良に加えて、部位特異的リコンビナーゼ、任意遺伝子、
部位特異的リコンビナーゼの標的部位など、本発明のベ
クターの構成に必要な構成要素をコンパクトに配置す
る。ベクター骨格の一つとしてレトロウィルスベクター
を利用できるが、レトロウィルスベクターはそのサイズ
がおよそ10kbを越えると生産効率が低下することが知ら
れているので、ベクター構成要素のコンパクトな配置が
必要である。
【００２７】本発明のベクターは、広範な応用性を持っ
ており、様々な任意遺伝子の挿入を可能とするために、
システム制御部分のサイズは極力小さくするのが望まし
い。このようなベクターとして、図2-1に示す、両方向
性Tet応答プロモータ（図ではBIと表記）を採用したベ
クターを見出した。このベクターでは、１）rtTAをコー
ドするDNAを両方向性Tet応答プロモータ制御下の一方に
配置したポジティブフィードバックシステムの作動、
２）もう一方のTet応答プロモータ制御下に配置した部
位特異的リコンビナーゼ遺伝子から発現する基底時の微
量の転写産物が、別配置の常時発現プロモータで発現さ
れる過剰の転写産物とRNA二重鎖を形成することによる
アンチセンス作用、の２つの相乗効果により基底時の部
位特異的リコンビナーゼの蛋白質発現を実質上ゼロに
し、さらに３）制御システムにサイズが増大するIRESな
どの追加要素を用いず、二つの遺伝子の発現にTetO（Te
tオペレータ配列）を共有するコンパクトなベクター構
築を可能にするように単一ベクター中にすべての構成要
素が配置されている。
【００２８】図2-2Aに示すレトロウィルスベクターを用
いたシステムは、図2-2Bに示した転写産物を発現する。
すなわちプロモータ活性を有する5'側のLTRからpolyAシ
グナル付加活性を有する3'側のLTRまでの転写産物
（１）を発現し、この転写産物から開始コドンと終止コ
ドンを有する任意遺伝子１の蛋白質が翻訳され、Tet非
存在下では両方向性Tet応答プロモータによる発現漏れ
によって微量のrtTAを含む転写産物（3）とCreリコンビ
ナーゼを含む転写産物（2）が発現するが、（2）は
（1）とmRNA二重鎖を形成するのでCreリコンビナーゼ蛋
白質の翻訳が行われず、（3）は微量のrtTA蛋白質に翻
訳される。ここでTetが添加されると、微量に存在するr
tTA蛋白質と複合体を形成し、両方向性TetOに結合して
プロモータ活性を少し上げ、rtTAとCreリコンビナーゼ
の発現量が増加する。さらに正のフィードバックによっ
て、Creリコンビナーゼ蛋白質の翻訳がなされてloxP特
異的組換えが起こり、図2-2Cに示した構造となり、任意
遺伝子２が発現するようになる。このシステムの動作を
確認するために、任意遺伝子発現の検出を容易にする工
夫として、実施例１〜４記載のベクターは、任意遺伝子
１として583nmに蛍光極大を有する赤色蛍光蛋白質DsRed
（Matzら、Nature Biotechnology、17巻969-973頁）遺
伝子を、また任意遺伝子２として507nmに蛍光極大を有
する緑色蛍光蛋白質EGFP（Chalfieら、Science、263巻8
02-805）遺伝子を用いた。DsRedとEGFPを組み合わせて
使用することにより、このレトロウィルスベクターが感
染した細胞はDsRed由来の赤色蛍光を呈し、またTetの誘
導によりCreリコンビナーゼが発現し、DsRed遺伝子を含
むloxPスタッファーが抜けた細胞は、赤色蛍光が消えて
EGFP由来の緑色蛍光を呈する。
【００２９】実施例１〜３記載の方法に従って作製した
プラスミドベクターからレトロウィルスベクターを生産
し、マウスNIH3T3細胞への遺伝子導入実験を行った。結
果として、細胞はドキシサイクリン非存在下の条件でDs
Redによる赤色蛍光を呈し、この細胞にドキシサイクリ
ンを添加することにより緑色蛍光を呈することが確認さ
れた。さらに実施例４記載の方法により、遺伝子導入NI
H3T3細胞のゲノムDNAに組み込まれたベクター由来の遺
伝子配列を解読し、ドキシサイクリン非存在下で図2-2A
記載の遺伝子構成のDNA配列が確認され、ドキシサイク
リン添加後に図2-2C記載遺伝子構成のDNA配列が確認さ
れた。
【００３０】これらの結果より、本発明の課題である、
哺乳動物細胞に任意の遺伝子を導入することにより細胞
の性質を変化させ、任意の時期に低分子化合物を該細胞
へ作用させることにより該遺伝子を取り除くことができ
ることを確認して、本発明を完成するに至った。本発明
の単一遺伝子ベクターによれば、（１）任意の遺伝子を
哺乳動物細胞のゲノム中に組み込ませて発現することが
可能であり、（２）必要時に低分子化合物の誘導による
部位特異的リコンビナーゼの発現によって該リコンビナ
ーゼの標的部位に挟まれた当該遺伝子を削除することが
可能であり、（３）単一ベクターにこれらを制御する遺
伝子群をすべて内包する。低分子化合物の誘導によって
部位特異的リコンビナーゼを活性化し、任意の遺伝子を
削除する方法は、理想的なシステムながらこれまで成功
例の報告がなく、本発明により始めて完成されたもので
ある。
【００３１】すなわち、本発明は、哺乳動物細胞のゲノ
ム中に挿入したときに、下記（１）〜（４）すべての要
件を満たす遺伝子配列構造を与える単一遺伝子ベクター
に関する。 （１）：両方向性低分子化合物応答性プロモータの一方
の下流に低分子化合物制御性トランス活性化因子をコー
ドするDNAを配置し、もう一方のプロモータ下流に部位
特異的リコンビナーゼをコードするDNAおよびポリA付加
配列を配置してなる構造。 （２）：（１）記載の部位特異的リコンビナーゼの２つ
の標的部位の間に任意遺伝子を配置してなる構造。 （３）：（２）記載の任意遺伝子を哺乳動物細胞で発現
し得るプロモータの制御下に配置し、かつ該プロモータ
による転写産物が（１）記載の部位特異的リコンビナー
ゼDNAの転写産物に対するアンチセンス配列を含有し得
るように部位特異的リコンビナーゼをコードするDNAを
配置してなる配置構造。 （４）：（１）記載の低分子化合物制御性トランス活性
化因子の転写産物および（３）記載のプロモータによる
転写産物にポリAを付加しうるポリA付加配列を配置して
なる構造。
【００３２】本発明のベクター構造の１例を図３に示し
た。図３は該ベクターを標的となる細胞のゲノム中に挿
入したときの模式図であり、遺伝子導入の方法として
は、環状プラスミドを制限酵素で直鎖状にし、リン酸カ
ルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクシ
ョン法など、細胞へ遺伝子を導入する様々な方法が利用
可能であり、Sambrookらの著したMolecular Cloning第3
版（Cold Spring HarborPress）の16章に詳細に記載さ
れている。部位特異的リコンビナーゼの標的配列は任意
遺伝子を挟んでいればよく、図３のA、B、Cを例とする
バリエーションが可能である。なお、本発明のベクター
は、好ましくは、ベクター自身にゲノムに取り込まれる
（インテグレート）作用を有するベクターであり、この
種のベクターにはレトロウィルス科のウィルスを遺伝子
導入用に改良したレトロウィルスベクターが挙げられ
る。レトロウィルスベクターは5’側のLTR自身に強力な
エンハンサーおよびプロモータ活性を有し、図３で示し
たプロモータはLTRで代用できるので、必ずしも新たに
プロモータを配置する必要はなく、また3’側のLTRはポ
リA付加シグナル活性を有し、必ずしも新たにポリA付加
配列を配置する必要はなく、図4で例示する配置が可能
である。以下の実施例で用いたオンコウィルス属マウス
幹細胞ウィルス（MSCV）由来のベクターは、造血幹細胞
など一般に遺伝子導入効率の低い細胞にも比較的高率に
遺伝子導入することが可能である（Kanekoら、Human Ge
ne Therapy、12巻35-44頁）。また、レンチウィルス属
はレトロウィルス科に含まれウィルスゲノムは宿主ゲノ
ムに取り込まれる作用を有する。レンチウィルス由来の
レンチウィルスベクターは、本発明のレトロウィルスベ
クターの概念に含まれるが、このベクターは、非分裂細
胞にも遺伝子導入可能であり、遺伝子発現が長期間安定
している利点があるので（Vigna、The Journal of Gene
Medicine、2巻308-316頁）、本発明のベクターとして
好ましい。しかしながら、レンチウィルス属のLTRのプ
ロモータ活性はオンコウィルス属のそれに比べて低いの
で、図4Cで例示した内部プロモータを別に配置すること
が望ましい。なお、レンチウィルス属の中央DNAフラッ
プはベクター核移行作用を有し、一般に他のウィルスベ
クターでは感染しにくい細胞群に高率に遺伝子導入が可
能であるとの報告がなされており（Sirvenら、Blood、9
6巻4103-4110）、中央DNAフラップを本発明のベクター
に挿入することができる。さらに図4Dのようにレトロウ
ィルスのLTR中に部位特異的リコンビナーゼの標的配列
を挿入することも可能である（Cossuら、Human Gene Th
erapy 10巻1607-1617頁）。この場合、レトロウィルス
ベクタープラスミド作製時に3’側LTRのU3領域に部位特
異的リコンビナーゼの標的配列を挿入すれば、細胞ゲノ
ムに組み込まれた時点で両側のLTRは3’側LTR由来のU3
領域を含み、部位特異的リコンビナーゼの標的配列も同
時に挿入される（Coffinら、Retroviruses 438-439頁、
Cold Spring Harbor Laboratory Press）。またパルボ
ウィルス科に属するアデノ随伴ウィルス（AAV）も宿主
ゲノムに取り込まれる性質を有し、AAV由来のベクター
は非分裂細胞に遺伝子導入可能であり、安全性が高く
（Smith-Aricaら、Curr. Cardiol. Rep.、３巻43-49
頁）、本発明のベクターとして利用することができる。
【００３３】レトロウィルスベクター産生のためのパッ
ケージング細胞株は、特に限定されず、例えばJ. M. Co
ffin、S. H. Hughes、H. E. Varmusが編集したRetrovir
uses, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの第9章Ta
ble 1記載のパッケージング細胞株を用いることができ
る。同書のTable 2記載の宿主範囲を参照して、目的と
する動物種に適合した細胞株を選択すればよい。近年に
発表されたパッケージング細胞株であるBing（Thony
ら、Human Gene Therapy 7巻1587-1593）やPhoenix（Gr
ignariら、Cancer Research 58巻14-19頁）も利用可能
である。
【００３４】低分子化合物に応答するプロモータとして
は、テトラサイクリン、FK506、RU486、エクダイソン、
ストレプトグラミン及びそれらの誘導体による発現制御
を前述した。これらの発現制御の原理は、共通の機構を
有する。すなわち、トランスアクチベータの構成要素と
しては、低分子化合物との結合部位、DNAエレメントへ
の結合部位および転写活性化領域の三点であり、最小プ
ロモータ上流のDNAエレメントにトランスアクチベータ
蛋白質と低分子化合物の複合体が結合することにより、
トランスアクチベータ蛋白質内の転写活性化領域が近傍
にある最小プロモータを活性化もしくは抑制する。本発
明の単一遺伝子ベクターの主要な要素である両方向性低
分子化合物応答性プロモータは、DNAエレメントの両側
に最小プロモータを配置したものであり、テトラサイク
リン以外の低分子化合物応答プロモータにも応用するこ
とができる（図５参照）。
【００３５】トランスアクチベータ蛋白質をコードする
DNAを該両方向性誘導プロモータの片方の下流につな
ぎ、プロモータのもう片方の下流に部位特異的リコンビ
ナーゼをコードするDNAを連結する。トランスアクチベ
ータ蛋白質がDNAエレメントへの結合部位を有する蛋白
質と転写活性化領域を有する蛋白質のヘテロダイマーで
構成される場合には、そのいずれか一つの蛋白質サブユ
ニットをコードする遺伝子を連結するか、IRESを介して
複数もしくは全部の蛋白質サブユニットをコードする遺
伝子を連結してもよい。例えばFK506応答性プロモータ
の場合、トランスアクチベータ蛋白質は、FK506との結
合能を有するFK506-binding protein（FKBP）とDNAエレ
メント配列に結合するZFHD1蛋白質（Pomerantzら、Scie
nce 267巻93-96頁）の融合蛋白質と、FKBPと結合能を有
するFKBP12-rapamycin-binding（FRB）（Choiら、Scien
ce 273巻239-242頁）と転写活性化領域を有するNFκB p
65との融合蛋白質の２つの融合蛋白質から構成され、こ
の融合蛋白質がFK506を介して、ヘテロ２量体化するこ
とで、近傍の最小プロモータを活性化する（Riveraら、
Nature Medicine 2巻1028-1032）。この場合、２つの融
合蛋白質のいずれか一方、好ましくは転写活性化領域を
有するFRB-p65融合蛋白質、もしくはIRESを介して、両
方をコードするDNAを図５Bに示した両方向性FK506応答
プロモータの片方のプロモータ下流に連結すればよい。
【００３６】この他、RU486、エクダイソン、ストレプ
トグラミンのそれぞれのトランスアクチベータはそれぞ
れ、酵母GAL4-ヒトプロゲステロン受容体リガンド結合
領域-VP16の融合蛋白質、ヒトRXRαとVP16-エクダイソ
ンリセプター融合蛋白質のヘテロ２量体、ストレプトミ
セス菌Pip蛋白質-VP16の融合蛋白質である。なお、スト
レプトグラミン応答性プロモータは、この抗生物質の作
用により抑制がかかるPipOFFと活性化されるPipONの二
通りの制御が報告されているが（Fusseneggerら、Natur
e Biotechnology 18巻1203-1208頁）、PipONでは転写活
性化領域を有するトランスアクチベータを用いない制御
方式であるため、本発明を応用できない。
【００３７】低分子化合物応答プロモータ中の最小プロ
モータとしては、最小プロモータとしての機能を有する
ものであればどのようなものでもよく、例えばCMV超急
性期プロモータ（DeptoらJ. Virol. 63巻1232-1238
頁）、昆虫熱ショックプロモータ（Pellicerら、J. Bio
l. Chem. 259巻14812-14817）、インターロイキン２プ
ロモータ（Riveraら、Nature Medicine 2巻1028-103
2）、ヘルペス単純ウィルス・チミジンキナーゼプロモ
ータ（Abruzzeseら、Molecular Therapy 2巻276-287
頁）など、少なくともエンハンサー領域を欠き、TATA配
列を有しRNAポリメラーゼIIが作用可能な条件を満たし
ていればよく、さらに詳細な最小プロモータの要件は、
細胞の分子生物学第3版、421-423頁、ニュートンプレス
に記載されている。
【００３８】部位特異的リコンビナーゼについてはCre
リコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼを含むインテグラ
ーゼファミリーついて前述した。Cre、FLP各リコンビナ
ーゼはその標的配列であるloxPもしくはFRTとの組み合
わせにおいて同等の目的で利用可能であり、本発明の部
位特異的リコンビナーゼとしていずれも使用可能であ
る。Westermanらの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、93巻、8971-8976頁）では、両方の部位特異的リコン
ビナーゼを検討しており、いずれも目的の部位特異的組
み換えが可能なことを記載しているが、Creリコンビナ
ーゼの方がより効率が高いことも記載されている。本発
明の単一遺伝子ベクターは、部位特異的リコンビナーゼ
遺伝子とその標的配列を同一ベクター内に内在してお
り、標的配列が遺伝子導入された細胞は、同時に部位特
異的リコンビナーゼ遺伝子も導入されているとの観点か
ら、標的配列と部位特異的リコンビナーゼを独立したベ
クターで導入するよりも、組み換え効率の影響を受けに
くい。したがって、いずれの部位特異的リコンビナーゼ
も使用可能であるが、反応の鋭敏性の点で好ましくはCr
eリコンビナーゼとその標的配列のloxPとを組み合わせ
て使用するのが望ましい。
【００３９】FLPリコンビナーゼの酵素活性の至適温度
は30℃付近にあり、特にStratagene社もしくはInvitrog
en社から入手可能なプラスミドｐOG44由来のリコンビナ
ーゼ（FLP−F70L)は、アミノ酸点変異を有するため、哺
乳動物細胞の一般的な培養温度である37℃における酵素
活性が明らかに低いことが報告された(Buchholzら、Nuc
leic Acids Research、24巻、4256−4262頁）。したが
って、使用する細胞や遺伝子の条件によってCreリコン
ビナーゼの活性が鋭敏すぎて、不本意にloxPスタッファ
−が脱落する場合には、変異型FLPとFRTの組み合わせを
採用し、FLPリコンビナーゼ活性が低い温度、すなわち3
7℃近辺を維持しての細胞培養が好ましく、FRTスタッフ
ァ−を削除したい時点で、低分子化合物を作用させると
共に温度を30℃付近にシフトすることも可能である。な
お、ここでスタッファーとは、部位特異的リコンビナー
ゼの２つの標識部位に挟まれた核酸配列をいう。
【００４０】一方で、Cre/loxPシステムは応用性の広い
技術であり、例えばレトロウィルスベクターのパッケー
ジング細胞の作製に効果的に用いられており（Araiら、
J. Virol. 72巻1115-1121頁）、このようなCre/loxP含
有ベクターと本発明のベクターとを組み合わせて利用し
たい場合には、本発明のベクターの構成要素にFLP/FRT
システム、もしくは他のインテグラーゼファミリー分子
を選択すればよい。
【００４１】本発明の特徴として、ベクター中、3’側
の部位特異的リコンビナーゼ標的部位の3’側に第二の
任意遺伝子を配置することにより、第一の任意遺伝子を
削除した後に第二の任意遺伝子を発現させることが可能
である。このため、第一の任意遺伝子が削除されたこと
の確認のためのマーカー遺伝子、あるいは選択圧をかけ
るための薬剤耐性遺伝子を配置することが可能である。
実施例では第一任意遺伝子のDsRed遺伝子が削除された
後に第二任意遺伝子のEGFP遺伝子の発現を確認し、この
システムの動作を実証している。すなわち、本発明のベ
クターは、スイッチングベクターとしての利用が可能で
ある。また再生医療や細胞移植療法での利用を考えた場
合、体内に移植あるいは混入した細胞に何らかの問題が
生じた時に、この細胞を選択的に死滅させるための自殺
遺伝子を配置することが可能である。自殺遺伝子の例と
しては、アポトーシスを誘導するFas遺伝子やヘルペス
単純ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子などが挙げられ
る。また、遺伝子治療用のベクターとして低分子化合物
の誘導により、治療用酵素遺伝子や抗腫瘍蛋白質をコー
ドする遺伝子を発現させることも可能である。この利用
法の例として、第一任意遺伝子として腫瘍細胞を認識す
る蛋白質、例えばErbBに対する一本鎖化抗体やリガンド
であるEGFをコードする遺伝子を配置し、第二任意遺伝
子としてTNFやサイトカイン遺伝子を配置できる。
【００４２】なお、第一任意遺伝子、第二任意遺伝子と
は別に、部位特異的リコンビナーゼ標的部位スタッファ
ー削除前後に、第三の任意遺伝子を常時発現させること
も可能である。これは図６に示した遺伝子の配置を使用
すれば、スタッファー削除前には第三任意遺伝子と第一
任意遺伝子が、スタッファー削除後には第三任意遺伝子
と第二任意遺伝子が発現する。第三任意遺伝子の一例と
してヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子を配
置すれば、第一、第二遺伝子の発現に関係なく、抗ウィ
ルス薬のガンシクロビル投与によって該ベクターが遺伝
子導入された細胞をすべて自殺させることが可能にな
る。
【００４３】任意遺伝子は、特に限定されるものではな
く、あらゆるDNA配列を選択することが可能である。ま
た、実施例５に記載した態様によれば、複数の遺伝子を
IRESを介して同時発現させることが可能である。また、
実施例６に記載した態様によれば、遺伝子導入された細
胞の検出を容易にする目的、あるいは様々な目的で融合
蛋白質をコードするDNA配列を選択することが可能であ
る。
【００４４】細胞を可逆的に不死化させるための任意遺
伝子の例として、ヒト・テロメラーゼ遺伝子（hTERT）
とBmi−１遺伝子の組み合わせが挙げられる（Salmon
ら、Molecular Therapy、2巻、404-414頁）。ヒト筋芽
細胞にこの2つの遺伝子を遺伝子導入することによって
細胞増殖が可能になり、その核型（karyotype ）は正常
性を保つことが示されている（Cudre-Maurouxら、 Mole
cular Therapy 、3 巻、S280頁、 795 番）。一方でhTE
RTと SV40ラージT抗原遺伝子の組み合わせでは、細胞増
殖は可能になるが核型は異常を示す（Cudre-Mauroux
ら、同文献）。したがって、細胞を一時的に増殖させる
目的では、本発明のベクターに組み込む第一任意遺伝子
は、 hTERTと Bmi-1の両方が好ましく、 IRESを介して
二つの遺伝子を同時に発現させることが可能である。
【００４５】さらに、本発明のベクターを実施例５およ
び６に記載した肝細胞および臍帯血CD34陽性細胞へ応用
し、本発明のベクターが様々な細胞種に利用可能である
ことを明らかにした。すなわち、本発明のベクターは皮
膚、軟骨、骨、血液、血管、神経、心筋、肝臓、膵島な
どの多岐にわたる機能細胞、器官、臓器の体外および体
内での増殖性の獲得、特定系統の細胞への分化誘導、分
化・脱分化の制御、不死化・脱不死化の制御および組織
形成に応用することが可能である。また細胞としては、
胚性幹細胞、成体幹細胞、分化途上あるいは最終分化し
た体細胞を用いることができる。また本発明によるベク
ターは、治療目的で体外及び体内で細胞に所望の遺伝子
を導入することが可能であり、いわゆる遺伝子治療に用
いることができる。また本発明のベクターをトランスジ
ェニック動物あるいはノックアウト動物の作製に用いる
ことが可能であり、低分子化合物の動物への投与により
任意の遺伝子を削除あるいは別の遺伝子発現にスイッチ
ングすることができ、条件的トランスジェニック動物、
条件的ノックアウト動物の作製に極めて有用である。こ
れらの動物は遺伝子のin vivo解析に有用であり、特に
発生期に作用する遺伝子の成体での機能解析に有用であ
る。本発明によるベクターを用いて遺伝子導入した細胞
および動物も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。以下の実施例において、遺伝子操作技術は当業者間
で通常行われているものであり、実験書としては、例え
ば、J. SambrookとD. W. Russelらが編集したMolecular
Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, 200
1, Cold Spring HarborLaboratory Press、またレトロ
ウィルスベクターは、J. M. Coffin、S. H. Hughes、H.
E. Varmusが編集したRetroviruses、 Cold Spring Har
bor LaboratoryPressの特に第9章に従えば設計可能であ
る。
【００４７】［実施例１］ プラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPの構
築 （１）Creリコンビナーゼ遺伝子のpolyAシグナル配列へ
の結合 （イ）プラスミドpMC-Cre（コロン大学Klaus Rajewsky
博士より譲与可能、Cell 73巻1155頁、1993年）を制限
酵素NotIおよびAor51HIで消化して得られるCreリコンビ
ナーゼ（Cre）をコードする遺伝子を含む約1.0キロ塩基
対（kb）のDNA断片、（ロ）プラスミドpEGFP-1（Clonte
ch社より入手可能）を制限酵素DraIおよびAflIIで消化
して得られるウィルスSV40由来のpolyAシグナル領域を
含む約180塩基対（bp）のDNA断片、（ハ）プラスミドpc
DNA3.1（Invitrogen社より入手可能）を制限酵素AflII
およびNotIで消化して得られる約5.4kbのDNA断片を作製
し、次に（イ）〜（ハ）の３つのDNA断片をライゲーシ
ョン処理する。こうして得られたプラスミドは、制限酵
素AflIIおよびNotIで消化すると約1.2kbおよび約5.4kb
のDNA断片から構成される。すなわちCreリコンビナーゼ
遺伝子にpolyAシグナル配列が結合されたDNA配列を含む
DNA断片がプラスミドpcDNA3.1のマルチクローニングサ
イト中のAflII-NotI制限酵素認識サイトに挿入されたプ
ラスミド構成であること確認し、このプラスミドをpcDN
A/CrepAと命名する。
【００４８】（２）両方向性テトラサイクリン応答エレ
メント・プロモーター（BI）とリバース・テトラサイク
リン調節性活性化因子（rtTA）遺伝子の結合 （イ）プラスミドpRevTet-On（Clontech社より入手可
能）をテンプレートとし、合成オリゴDNAのRTTA1Sおよ
びRTTA2AをPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーと
し、PCRを実施して約1.1kbのPCR産物を得、このPCR産物
をプラスミドpCR2.1（Invitrogen社より入手可能）にラ
イゲーション処理してプラスミドpCR/rtTAを得、このプ
ラスミドを制限酵素BglIおよびXhoIで消化して得られる
リバース・テトラサイクリン調節性活性化因子（rtTA）
をコードする遺伝子を含む約1.0kbのDNA断片、（ロ）プ
ラスミドpBI（Clontech社より入手可能）を制限酵素Not
Iで消化し、さらに制限酵素BglIで部分消化して得られ
る両方向性テトラサイクリン応答エレメント・プロモー
ター（BI）を含む約560bpのDNA断片、（ハ）プラスミド
pBluescript II KS(+)（Stratagene社より入手可能）を
制限酵素NotIおよびXhoIで消化して得られる約2.9kbのD
NA断片を作製し、次に（イ）〜（ハ）の３つのDNA断片
をライゲーション処理する。こうして得られるプラスミ
ドは制限酵素NotIおよびXhoIで消化すると約1.6kおよび
約2.9kbのDNA断片が得られることから、BIとrtTA遺伝子
が連結したDNA配列を含むDNA断片がプラスミドpBluescr
ipt II KS(+)のマルチクローニングサイト中の制限酵素
NotI-XhoI認識サイトに挿入されたプラスミド構成であ
ることを確認し、このプラスミドをpBS/BI-rtTAと命名
する。
【００４９】（３）DNAユニットCre-BI-rtTA構成の作製
と制限酵素NotI-EcoRI認識サイトの削除 （１）で構築したプラスミドpcDNA/CrepAを制限酵素Not
IおよびXhoIで消化して得られる約6.6kbのDNA断片と
（２）で構築したプラスミドpBS/BI-rtTAを制限酵素Not
IおよびXhoIで消化して得られる約1.6kbのDNA断片をラ
イゲーション処理する。こうして得られるプラスミド
は、制限酵素AflIIおよびXhoIで消化すると、約2.8kbお
よび約5.4kbのDNA断片が得られるので、Cre-BI-rtTAのD
NAユニット構成がプラスミドpcDNA3.1(+)のマルチクロ
ーニングサイト中の制限酵素AflII-XhoI認識サイトに挿
入されたプラスミド構成であることを確認し、このプラ
スミドをpcDNA/Cre-BI-rtTAと命名する。さらに、pcDNA
/Cre-BI-rtTAを制限酵素NotIおよびEcoRIで消化し、T4
DNAポリメラーゼによって末端平滑処理を行い、セルフ
ライゲーション処理する。この結果、CreとBIの間に存
在した制限酵素NotI, PstI, EcoRIの各認識サイトは削
除され、このプラスミドをpcDNA/Cre-BI-rtTA(ΔNE)と
命名する。
【００５０】（４）緑色蛍光蛋白質EGFPをコードするDN
AのloxP配列、制限酵素認識サイトの付加 プラスミドpEGFP-1（Clontech社より入手可能）をテン
プレートに合成オリゴDNAのLOXEGFP1SとEGFPHIND2AをPC
RプライマーとしてPCRを実施して約790bpのPCR産物を
得、このPCR産物をプラスミドpCR2.1にライゲーション
処理を行い、プラスミドpCR/loxEGFPを得る。
【００５１】（５）赤色蛍光蛋白質DsRedをコードするD
NAのloxP配列、制限酵素認識サイトの付加 プラスミドpDsRed1-N1（Clontech社より入手可能）をテ
ンプレートに合成オリゴDNAのLOXRED1SとRED2AMODをPCR
プライマーとしてPCRを実施して約740bpのPCR産物を
得、このPCR産物をプラスミドpCR2.1にライゲーション
処理を行い、プラスミドpCR/loxRedを得る。
【００５２】（６）プラスミドpMSCVneoへのDNA断片lox
EGFPの組み込み プラスミドpMSCVneo（Clontech社より入手可能）は制限
酵素XhoIおよびHindIIIによって消化して得られるマウ
ス幹細胞ウィルスMSCVレトロウィルスベクターの5'LT
R、パッケージングシグナル(Ψ)、3'LTRを含む約5.2kb
のDNA断片と（４）で得られるプラスミドpCR/loxEGFPの
制限酵素XhoIおよびHindIIIによる消化で得られる約790
bpのDNA断片とをライゲーション処理し、プラスミドpMS
CV/loxEGFPを作製する。
【００５３】（７）プラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI
-rtTA-lox-EGFPの作製 （イ）（６）で作製したプラスミドpMSCV/loxEGFPを制
限酵素EcoRIおよびXhoIで消化して得られる約6.0kbのDN
A断片、（ロ）（５）で作製したプラスミドpCR/loxRed
を制限酵素EcoRIおよびAflIIで消化して得られる約740b
pのDNA断片、（ハ）（３）で作製したプラスミドpcDNA/
Cre-BI-rtTA（ΔNE）を制限酵素AflIIおよびXhoIで消化
して得られる約2.8kbのDNA断片からなる、３つのDNA断
片をライゲーション処理する。こうして得られるプラス
ミドは、制限酵素EcoRIおよびNotIで消化して得られる
約4.3kbおよび約5.2kbのDNA断片から構成され、またDNA
シークエンサーにより塩基配列を解読し、5’LTR、Ψ
（パッケージングシグナル）、loxP、DsRed、Cre、BI、
rtTA、loxP、EGFP、3’LTRの順で各DNAユニットがつな
がった構成を有することを確認し、このプラスミドをpM
SCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPと命名する。
【００５４】（８）コントロールプラスミドの作製 EGFP発現のためのプラスミドとして（６）で作製したプ
ラスミドpMSCV/loxEGFPを用いた。DsRed発現のためのプ
ラスミドとして、プラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-r
tTA-lox-EGFPを制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化して得
られる約1.6kbのDNA断片とプラスミドpMSCVneoを同じ制
限酵素で消化して得られる約5.2kbのDNA断片とをライゲ
ーション処理し、プラスミドpMSCV/loxDsRedを作製す
る。
【００５５】［実施例２］レトロウィルスベクターの生
産 実施例１で作製したプラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI
-rtTA-lox-EGFPおよびコントロールプラスミドをパッケ
ージング細胞株BOSC23（カリフォルニア工科大学David
Baltimore博士より譲与可能、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90巻8392頁、1993年）に遺伝子導入し、レトロウ
ィルスベクターを生産する。2×106cells/dishのBOSC23
細胞は、10%FCS（ウシ胎仔血清）を含むダルベッコ改変
イーグル培地（DME）４mlで60mmφの培養皿（Falcon 30
02）に18-24時間、37℃、5% CO2インキュベータで培養
する。トランスフェクションの直前に培地を25μMのク
ロロキンを含む10% FCS含有DME、４mlに交換する。トラ
ンスフェクションはTransfection MBS Mammalian Trans
fection Kit（Stratagene社）を用いて、添付のプロト
コールの指示通り行う。
【００５６】すなわち、８μgの上記プラスミドDNAは5m
lのポリスチレンチューブ（Falcon2054）に最終450μl
となるように蒸留水で希釈し、次に50μlの2.5M CaCl2
および500μlの２倍濃縮BBS（緩衝剤N,N-bis(2-hydroxy
ethyl)-2-aminoethanesulfonic acidを含む生理食塩
水）（pH6.95）を加え混合し、室温で15分間放置する。
この間に培養細胞は培養上清を吸引して除き、PBS（リ
ン酸緩衝剤を含む生理食塩水）で２回洗浄し、5mlの5％
FCS含有DMEを加える。次に500μlのDNA懸濁液を培養細
胞に加え、渦巻くように混合し、37℃、5% CO2インキュ
ベータで３時間インキュベートする。培養上清を除き、
PBSで３回洗浄し、5mlの10% FCS含有DMEを加え、37℃、
5% CO2インキュベータで培養し、48時間後、60時間後、
72時間後の３回、レトロウィルスベクターを含む培養上
清を回収する。培養上清は0.45μmのディスクフィルタ
ー（Acrodisc、GelmanSciences社）で混入した細胞を除
き、ドライアイスで冷却したチューブ（Falcon 2070）
に入れ、-70℃ディープフリーザーで保存する。
【００５７】プラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-
lox-EGFP、pMSCV/loxEGFP、pMSCV/loxDsRedをそれぞれB
OSC23細胞に遺伝子導入して得られるレトロウィルスベ
クターはMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFP、MSCV/
loxEGFP、MSCV/loxDsRedと命名する。
【００５８】［実施例３］細胞へのレトロウィルスベク
ター感染と蛍光蛋白質の検出 5×105cellsのNIH3T3細胞（理研ジーンバンクより分譲
可能）は10% FCS含有DMEで100mmφの培養皿（Falcon 30
03）に一晩培養する。培養上清を除き、実施例２で得ら
れるレトロウィルスベクターを含む上清1ml、5mg/mlポ
リブレン溶液10μl、新鮮培地2mlの混合液を加えて、３
時間インキュベートし、さらに新鮮培地7mlを加えて9時
間培養することによってレトロウィルスベクターを感染
する。この後同様に感染操作を３回繰り返し、さらに48
時間培養する。得られた細胞は蛍光顕微鏡（オリンパス
IX-70）で観察し、レトロウィルスベクターMSCV/lox-Ds
Red-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPまたはMSCV/loxDsRedを感染
した細胞の約60%がDsRedによる赤色蛍光を発し、またレ
トロウィルスベクターMSCV/loxEGFPを感染した細胞の約
60%がEGFPによる緑色蛍光を発し、各々残りの約40%は蛍
光を発しない細胞、すなわちレトロウィルスベクターが
感染していない細胞である。
【００５９】これらの細胞はドキシサイクリン1μg/ml
を含む新鮮な培地に交換し、さらに48時間培養し、顕微
鏡観察する。レトロウィルスベクターMSCV/lox-DsRed-C
re-BI-rtTA-lox-EGFPを感染した細胞の約60%が緑色蛍光
を発し、赤色蛍光を発する細胞は見られない。レトロウ
ィルスベクターMSCV/loxDsRedを感染した細胞の約60%は
赤色蛍光を発するままである。この結果から、ドキシサ
イクリンによりCreリコンビナーゼの発現が誘導され、l
oxPスタッファーが切り出されていることが確認され
る。
【００６０】［実施例４］ゲノムDNAのPCRによるスタッ
ファー切り出し部位の確認 Creリコンビナーゼによるスタッファー切り出しがloxP
配列特異的になされているか確認するため、ドキシサイ
クリン誘導前後の細胞からゲノムDNAを抽出し、スタッ
ファーの外側のDNA配列に対するPCRプライマーを作製
し、PCRを行う。100mmφの培養皿の細胞からQIAGEN Blo
od & Cell Culture DNA kit（キアゲン社）を用いて、
製品に添付のプロトコールに従ってゲノムDNAの抽出を
行う。得られるゲノムDNAは制限酵素EcoRIおよびNotIで
消化する。PCRプライマーとしてフォワード側がΨ配列
の一部、リバース側がEGFPをコードするDNA配列の相補
的配列の一部を含むオリゴDNAを作製し、制限酵素で消
化したゲノムDNAをテンプレートにPCRを行う。PCR産物
をアガロースゲル電気泳動にてサイズの確認を行い、ド
キシサイクリン誘導前後のサンプルはそれぞれ約4.1k
b、約500bpであり、loxPスタッファーの約3.6kb分が短
くなることが確認される。さらにPCR産物はプラスミドp
CR2.1にサブクローニングし、DNAシーケンサーでDNA配
列を解読し、ドキシサイクリン誘導によってloxP配列特
異的にスタッファー配列が切り出されていることが確認
される。
【００６１】［実施例５］マウス肝実質細胞の可逆的不
死化 プラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPはDs
Red遺伝子下流、Cre遺伝子上流の間にIVS（合成イント
ロン）のついたIRES（internal ribosome entrysite、
脳心筋炎ウィルス由来）およびSV40 largeT遺伝子を挿
入することにより、DsRedとバイシストロニックにSV40
largeTを発現できるようにする。すなわちプラスミドpI
RESneo（クロンテック社より入手可能）を制限酵素BamH
IおよびSmaIで消化して得られる約940bpのDNA断片、SV4
0 largeT遺伝子（理研ジーンバンクから入手可能）を制
限酵素EcoRVおよびNotIで消化して得られる約2.3kbのDN
A断片、プラスミドpBluescript KSII(+)を制限酵素BamH
IおよびNotIで消化して得られる約2.9kbのDNA断片をラ
イゲーションし、得られたプラスミドを制限酵素BamHI
およびNotIで消化して得られる約3.2kbのDNA断片を末端
平滑化し、制限酵素EcoT22Iで消化し末端平滑化し脱燐
酸化処理を行ったプラスミドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-r
tTA-lox-EGFPとライゲーション処理しプラスミドを得
る。このプラスミドをDNAシーケンサーで配列を解読
し、5'LTR、Ψ、loxP、DsRed、IRES、SV40 largeT、Cr
e、BI、rtTA、loxP、EGFP、3'LTRの順で各DNAユニット
がつながった構成を有することを確認した。
【００６２】このプラスミドをpMSCV/lox-DsRed-IRES-S
V40T-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPと命名する。このプラスミ
ドは実施例２記載の方法でBOSC23細胞に遺伝子導入し、
レトロウィルスベクターMSCV/lox-DsRed-IRES-SV40T-Cr
e-BI-rtTA-lox-EGFPを得る。BALB/cマウスをネンブター
ル麻酔下に開腹し、門脈にカニュレーションする。PBS
にて脱血し、0.05%コラゲナーゼを含むハンクス溶液を
灌流してから、肝臓を摘出する。細切した後、ボルテッ
クスミキサーにて分散させ、さらに低速遠心(50G)をか
けて得られる細胞を懸濁し、150μmのナイロンフィルタ
ーでろ過し、マウス肝細胞を得る。この細胞は10%FCSを
加えたDMEを用い、コラーゲンでコートした24穴プレー
ト上で一晩培養する。細胞は培養上清を除いた後、レト
ロウィルスベクターMSCV/lox-DsRed-IRES-SV40T-Cre-BI
-rtTA-lox-EGFPを含むBOSC23培養上清1mlおよび5mg/ml
ポリブレン溶液1μlを加えて12時間培養し、さらにこの
操作を３回繰り返した。
【００６３】次に、新鮮な10%FCSを加えたDMEに培地交
換し48時間培養する。細胞は蛍光顕微鏡で観察し、約60
％の細胞がDsRed由来の赤色蛍光を呈することを観察す
る。並行してコントロールのレトロウィルスベクターMS
CV/loxDsRedを感染した肝細胞も約60％の細胞が赤色蛍
光を呈する。さらにこれらの肝細胞は２日毎に培地交換
を行って、さらに1週間培養する。
【００６４】レトロウィルスベクターMSCV/lox-DsRed-I
RES-SV40T-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPを感染したマウス肝細
胞は蛍光顕微鏡観察で、24穴プレートの細胞接着面をす
べて覆うほど増殖し、ほぼ100％の細胞が赤色蛍光を呈
する。一方で、コントロールベクターを感染した肝細胞
はトリパンブルー染色による観察で生細胞が確認できな
い。
【００６５】レトロウィルスベクターMSCV/lox-DsRed-I
RES-SV40T-Cre-BI-rtTA-lox-EGFP感染により不死化した
肝細胞株をmHep1と命名する。mHep1はコラゲナーゼ処理
で細胞を分散させ、60mm培養皿に継代し、2日毎の培地
交換を行い、平均倍加時間約48時間で増殖することが観
察される。mHep1細胞株の一部を60mm培養皿に播種し、
コンフルエントな状態まで培養し、蛍光顕微鏡でほぼ10
0％の細胞が赤色蛍光を呈することを観察し、この細胞
をドキシサイクリン1μg/mlを含む新鮮な培地に交換
し、さらに48時間培養して顕微鏡観察すると、赤色蛍光
を呈する細胞は見られず、すべての細胞が緑色蛍光を呈
している。これらの細胞をmHep1-doxと命名し、さらに
２日毎培地交換して１週間培養するが、増殖しないこと
が確認される。
【００６６】mHep1-dox細胞は、 Quick Prep Micro mRN
A Purification Kit（アマシャムファルマシア製）を用
いて mRNA を抽出し、First-Strand cDNA Synthsis Kit
（アマシャムファルマシア製）を用いて、一本鎖 cDNA
を作製する。このcDNAを用いてマウス血清アルブミン
（ Genbank 登録番号MMU011418）およびマウス血液凝固
第Ｘ因子（Genbank登録番号BC003877）のDNA配列の一部
を RT-PCRで検出し、検出が認められるが、一方で SV40
large Tは検出が認められない。したがって、レトロウ
ィルスベクターMSCV/lox-DsRed-IRES-SV40T-Cre-BI-rtT
A-lox-EGFPにより肝実質細胞が可逆的に不死化されるこ
とが確認できる。
【００６７】［実施例６］臍帯血CD34陽性細胞の可逆的
分化制御 臍帯血CD34陽性細胞のex vivo増幅のため、造血細胞の
分化抑制作用を有するドミナントネガティブ型レチノイ
ン酸リセプターα（RARα）遺伝子（Tsaiら、Gene & De
velopment、６巻2258-2269）を臍帯血CD34陽性細胞に遺
伝子導入し、一時的に分化抑制した状態で増殖させ、そ
の後低分子化合物での誘導で該遺伝子を削除することに
より、正常な造血機能を有する細胞へ回復させる。
【００６８】RARα（ソーク研究所Ronald Evans博士よ
り譲与可能、Genbank登録番号：HSRRA）のアミノ末端か
ら第403番目までのアミノ酸をコードするDNAをプラスミ
ドpMSCV/lox-DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPのlox-DsRed
間に挿入し、該プラスミドのDsRed遺伝子の代わりにRAR
αのtruncated formとDsRedが連結された融合蛋白質を
コードするDNAを含有するプラスミドpMSCV/lox-RARA403
DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFPを作製する。
【００６９】このプラスミドは実施例２記載の方法でア
ンフォトロピックなパッケージング細胞株Bing（Americ
an Type Culture Collectionより入手可能）に遺伝子導
入することにより、レトロウィルスベクターMSCV/lox-R
ARA403DsRed-Cre-BI-rtTA-lox-EGFP（MSCV/RA403と略
記）を得る。臍帯血はフィコールパックプラス（アマシ
ャムファルマシア社製）にて単核球画分を得、CD34造血
前駆細胞分離システム（Dynal社製）によりCD34陽性画
分を得る。方法はそれぞれの製品に添付の説明書に従
う。
【００７０】８μgレトロネクチン（宝酒造社製）で培
養面をコーティングした24穴プレートにCD34陽性細胞1
×104をレトロウィルスベクターMSCV/RA403もしくはコ
ントロールベクターを含むBing培養上清１mlに懸濁して
注入する。1μg/mlのヒト・インターロイキン３（IL-
3、ペプロテック社製）、10μg/mlのヒト・インターロ
イキン６（IL-6、ペプロテック社製）と100μg/mlのヒ
ト・ステムセルファクター（SCF、ペプロテック社製）
を含むサイトカインカクテル1μlおよび5mg/mlポリブレ
ン溶液1μlを加えて12時間培養し、さらにこの操作を３
回繰り返す。次に、新鮮な10%FCSおよびサイトカインカ
クテル1μlを加えたDME 1mlに培地交換して48時間培養
する。蛍光顕微鏡観察により、レトロウィルスベクター
MSCV/RA403およびMSCV/loxDsRedを感染させた細胞の約3
0%がDsRed陽性が観察される。この後２日毎に培地交換
し、サイトカイン存在下で14日間培養する。細胞はドキ
シサイクリン1μg/mlを含む新鮮な培地に交換して48時
間培養し、これらの細胞は血球コロニーアッセイ培地
（Methocult-GF、StemCell Technologies社製）にて２
週間の血球コロニーアッセイを行う。
【００７１】レトロウィルスベクターMSCV/RA403を感染
させた細胞の血球コロニーは、すべてEGFP陽性であり、
多数の幼若なMixコロニーを含むことが観察される。一
方で、コントロールベクターを感染させた細胞は幼若な
Mixコロニーを検出することができない。これらの結果
から、ドミナントネガティブ型レチノイン酸リセプター
α遺伝子を一時的に臍帯血CD34陽性細胞に導入すること
により、造血未分化細胞の分化を抑制しつつ増殖を可能
にし、該遺伝子削除後に本来の造血未分化細胞の機能で
ある血球コロニー形成能を保持していることが確認され
る。
【００７２】図中での略号は、それぞれ以下を意味す
る。 SS-Rec: 部位特異的リコンビナーゼ遺伝子 TS: 部位特異的リコンビナーゼの標的DNA配列 Pro: 常時発現型プロモータ LTR: レトロウィルスベクターのlong terminal repeat lox: loxP配列 誘導Pro: 誘導型プロモータ Cre: Creリコンビナーゼ遺伝子 pA: ポリA付加配列 Tet Pro: Tet応答性プロモータ rtTA: リバースTetトランスアクチベータ IRES-Neo: 脳心筋炎ウィルスのInternal Ribosome Entr
y Siteとネオマイシン耐性遺伝子 BI: 両方向性低分子化合物応答性プロモータ TA: トランスアクチベータ遺伝子 Pmin: 最小プロモータ TetO: Tetオペレータ配列 (r)tetR: （リバース）Tetリプレッサー遺伝子 VP16: ヘルペス単純ウィルス由来VP16遺伝子 ZFHD1: ZFHD1蛋白質の結合DNA配列 GAL4: 酵母GAL4遺伝子 HPR-LBD: ヒト・プロゲステロン受容体リガンド結合領
域 EcR: エクダイソン受容体 Pip: ストレプトミセス菌Pip遺伝子 PPTR: Pip蛋白質の結合DNA配列
【００７３】
【発明の効果】哺乳動物のゲノム中に導入された本発明
の単一遺伝子ベクターは、細胞への任意の遺伝子の導入
により、該細胞の性質を変化させるとともに、任意の時
期に低分子化合物を該哺乳動物に投与して、該細胞へ作
用させることにより、該遺伝子を除去できるので、遺伝
子治療等に極めて有用である。また、幹細胞や前駆細胞
への分化抑制遺伝子の導入およびその削除によって、細
胞の未分化状態を維持しつつこれら細胞を増殖可能に
し、さらに終末分化した機能細胞への不死化遺伝子の導
入およびその削除によって、細胞の機能を維持しつつ増
殖可能にし、得られた細胞は細胞・再生医療に有用であ
る。また、本発明の単一遺伝子ベクターは、条件的トラ
ンスジェニックおよびノックアウト動物の作出に極めて
有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１−１は、誘導プロモータ下流にリコンビナ
ーゼ遺伝子を配置し、同一ベクター中にその認識配列に
挟まれた不死化遺伝子を配置したベクターの構成を表
す。図１−２Ａは、アンチセンスによる部位特異的リコ
ンビナーゼ転写産物の発現漏れを中和するためのベクタ
ーの構成を示す。図１−２Ｂは、図１−２Ａのベクター
が、細胞に取り込まれたときの状態を示す。図１−２Ｃ
は、図１−２Ａのベクターが、細胞に取り込まれ、テト
ラサイクリン添加前のときに細胞が実際に有するDNA配
列を示す。
【図２】図２−１は、双方向性Tet応答プロモータによ
る任意遺伝子の発現制御に用いた本発明のベクターの構
成（A)、該ベクターが導入されたテトラサイクリン非存
在下での細胞内でのDNA配列（B)およびテトラサイクリ
ン存在下での細胞内でのDNA配列（C)を示す。図２−２
は、図２−１は、双方向性Tet応答プロモータによる任
意遺伝子の発現制御に用いた本発明のレトロウイルスベ
クターの構成（A)、該ベクターが導入されたドキシサイ
クリン非存在下での細胞内でのDNA配列（B)およびドキ
シサイクリン添加後の細胞内でのDNA配列（C)を示す。
【図３】双方向性低分子化合物応答プロモータによる任
意遺伝子の発現制御に使用される本発明の改良レトロウ
イルスベクターの構成を例示する。
【図４】プロモータとしてLTRを使用した本発明のレト
ロウイルスベクターの構成を例示する。
【図５】本発明のベクターの構成要素である両方向性低
分子化合物応答性プロモータの例を示す。Aはテトラサ
イクリン、BはFK506、CはRU486、Dはエクダイソン、Eは
ストレプトグラミンのトランスアクチベータである。
【図６】第一任意遺伝子、第二任意遺伝子とは別に、部
位特異的リコンビナーゼ標的部位スタッファー削除前後
に、第三任意遺伝子を常時発現させるために使用される
本発明のレトロウイルスベクターの構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小澤 敬也 栃木県河内郡南河内町祇園３−１−３ Ｃ −201 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 FA06 FA07 GA11 HA17 4B065 AA90X AB01 BA02 CA44 4C084 AA02 AA13 BA35 CA62 MA05 NA13 ZC802

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物細胞のゲノム中に挿入したとき
    に、下記（１）〜（４）すべての要件を満たす遺伝子配
    列構造を与える単一遺伝子ベクター。 （１）：両方向性低分子化合物応答性プロモータの下流
    の一方に低分子化合物制御性トランス活性化因子をコー
    ドするDNAを配置し、もう一方のプロモータ下流に部位
    特異的リコンビナーゼをコードするDNAおよびポリA付加
    配列を配置してなる構造。 （２）：（１）記載の部位特異的リコンビナーゼの２つ
    の標的部位の間に任意遺伝子を配置してなる構造。 （３）：（２）記載の任意遺伝子を、哺乳動物細胞で該
    遺伝子を発現し得るプロモータの制御下に配置し、かつ
    該プロモータによる転写産物が部位特異的リコンビナー
    ゼDNAの転写産物を含む場合には、該転写物が（１）記
    載の部位特異的リコンビナーゼDNAの転写産物とRNA二重
    鎖を形成するように（１）記載の部位特異的リコンビナ
    ーゼをコードするDNAを配置してなる構造。 （４）：（１）記載の低分子化合物制御性トランス活性
    化因子の転写産物および（３）記載のプロモータによる
    転写産物にポリAを付加しうるポリA付加配列を配置して
    なる構造。
  2. 【請求項２】 以下の遺伝子配列構造を有する請求項１
    記載のベクター。５’−部位特異的リコンビナーゼの標
    的部位−哺乳動物細胞で発現し得るプロモータ−任意遺
    伝子−逆向きに配置したポリA付加配列−部位特異的リ
    コンビナーゼを逆向きにコードするDNA−両方向性低分
    子化合物応答性プロモータ−低分子化合物制御性トラン
    ス活性化因子をコードするDNA−ポリA付加配列−部位特
    異的リコンビナーゼの標的部位−３’
  3. 【請求項３】 以下の遺伝子配列構造を有する請求項１
    記載のベクター。５’−哺乳動物細胞で発現し得るプロ
    モータ−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−任意遺
    伝子−逆向きに配置したポリA付加配列−部位特異的リ
    コンビナーゼを逆向きにコードするDNA−両方向性低分
    子化合物応答性プロモータ−低分子化合物制御性トラン
    ス活性化因子をコードするDNA−部位特異的リコンビナ
    ーゼの標的部位−ポリA付加配列−３’
  4. 【請求項４】 以下の遺伝子配列構造を有する請求項１
    記載のベクター。５’−哺乳動物細胞で発現し得るプロ
    モータ−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−任意遺
    伝子−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−逆向きに
    配置したポリA付加配列−部位特異的リコンビナーゼを
    逆向きにコードするDNA−両方向性低分子化合物応答性
    プロモータ−低分子化合物制御性トランス活性化因子を
    コードするDNA−ポリA付加配列−３’
  5. 【請求項５】 レトロウィルスベクターである請求項１
    〜４のいずれかに記載のベクター。
  6. 【請求項６】 低分子化合物がテトラサイクリンもしく
    はその誘導体であり、かつ低分子化合物制御性トランス
    活性化因子がリバーステトラサイクリントランスアクチ
    ベータである請求項１〜４のいずれかに記載のベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】 部位特異的リコンビナーゼがCreリコン
    ビナーゼであり、かつ部位特異的リコンビナーゼの標的
    部位がloxPである請求項１〜４のいずれかに記載のベク
    ター。
  8. 【請求項８】 部位特異的リコンビナーゼがFLPリコン
    ビナーゼであり、かつ部位特異的リコンビナーゼの標的
    部位がFRTである請求項１〜４のいずれかに記載のベク
    ター。
  9. 【請求項９】 任意遺伝子がヒト・テロメラーゼ遺伝子
    および／またはＢｍｉ−１遺伝子である請求項１〜４の
    いずれかに記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 3’側の部位特異的リコンビナーゼ標
    的部位の3’側に第二の任意遺伝子を配置してなる構造
    を有する請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 以下の遺伝子配列構造を有する請求項
    １０記載のベクター。５’−LTR−部位特異的リコンビ
    ナーゼの標的部位−任意遺伝子１−逆向きに配置したポ
    リA付加配列−部位特異的リコンビナーゼを逆向きにコ
    ードするDNA−両方向性低分子化合物応答性プロモータ
    −低分子化合物制御性トランス活性化因子をコードする
    DNA−部位特異的リコンビナーゼの標的部位−任意遺伝
    子２−LTR−３’
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターの哺乳動物細胞ゲノムへの遺伝子導入ベクターと
    しての使用。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターにより形質転換された哺乳動物細胞。
  14. 【請求項１４】 遺伝子治療用ベクターとしての請求項
    １〜１１のいずれかに記載のベクターの使用。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターを導入して作製されたトランスジェニック動物。
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