CN110438157B - 肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肝前体样细胞系的构建方法以及保藏编号为CCTCC NO：C2019120的肝前体样细胞系。所述构建方法包括以原代肝细胞为种子细胞来构建所述肝前体样细胞系，结合对传代培养、再传代培养、病毒感染、扩增培养和汇合培养的工艺参数进行控制，并通过在永生化细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子FOXA3，使得到的所述肝前体样细胞系容易实现良好的肝向分化。本发明还提供了通过所述构建方法得到的肝前体样细胞系在生物人工肝领域的应用。

Description

肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用。
背景技术
肝衰竭是严重肝病的终末期表现，患者病死率为可高达50％～90％。肝移植是治疗肝衰竭的行之有效的手段，但由于费用昂贵、供体缺乏以及术后免疫排斥反应严重等问题而难以广泛开展。目前，对肝细胞移植和生物人工肝技术的研究取得了一定的进展和技术突破，有望成为治愈肝衰竭的有效治疗手段。
公开号为CN105521482A的中国发明专利申请公开了联合应用不同类型的肝细胞特异性转录因子，例如HNF1α、HNF4α或FOXA3来诱导分化肝癌细胞的方法，揭示了上述肝细胞特异性转录因子在肝癌分化治疗方面具有良好的应用前景。
公开号为CN103981147A的中国发明专利申请公开了一种制备类肝细胞的方法，该方法通过在成纤维细胞等体细胞中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成具有功能的肝实质细胞。然而该方法的种子细胞来源于非肝脏组织，仅通过谱系重编程并不能保证其能够完全实现肝向分化，从而增加了诱导分化的培养成本。
因此，有必要开发一种新型的肝前体样细胞系及其构建方法以避免现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供容易实现良好肝向分化的肝前体样细胞系及其构建方法以及在生物人工肝领域的应用，以降低培养成本。
为实现上述目的，本发明的所述肝前体样细胞系的构建方法，包括：
S1：提供原代肝细胞培养物，对所述原代肝细胞培养物进行增殖培养和传代培养，以得到待转染细胞培养物，所述传代培养的传代比例1:3-1:6，传代次数为2-30；
S2：将所述待转染细胞培养物以0.5×104-1×105个/平方厘米的接种密度进行汇合培养，以得到汇合率不低于80％的贴壁细胞；
S3：通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述贴壁细胞进行病毒感染，并在所述病毒感染的过程中进行培养基置换，所述慢病毒悬液中的慢病毒数量是所述贴壁细胞数量的0.5-50倍，所述病毒感染增强悬液的浓度为6-12微克/毫升；
S4：通过筛选剂和扩增培养基对经所述病毒转染后得到的细胞培养物进行扩增培养和再传代培养，得到永生化细胞系，所述扩增培养的时间为24-96小时，所述再传代培养的传代比例为1:3-1:6，传代次数为10-100；
S5：在所述永生化细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子，以得到所述肝前体样细胞系。
本发明还提供了由所述构建方法制备的一种肝前体样细胞系，所述肝前体样细胞系为保藏于中国典型培养位保藏中心的存活样品，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：C2019120，分类命名为ALI-CELL-85F。
本发明的所述构建方法的有益效果在于：由于所述原代肝细胞培养物来源于肝脏组织，以所述原代肝细胞培养物中的原代肝细胞为种子细胞来构建所述肝前体样细胞系，结合对所述传代培养、所述再传代培养、所述病毒转染、所述扩增培养和所述汇合培养的工艺参数进行控制，并通过在所述转染细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子，使得到的所述肝前体样细胞系容易实现良好的肝向分化。
优选的，所述步骤S5中，所述肝细胞特异性转录因子为FOXA3。
优选的，所述步骤S1中，采用胶原酶灌注法从正常肝组织中分离出所述原代肝细胞培养物。
优选的，所述步骤S1中，将所述原代肝细胞培养物以0.5×104-2×104个/平方厘米的接种密度进行6-12天的所述增殖培养。其有益效果在于：控制合适的接种密度，有利于在较短时间内促进初代细胞的生长和繁殖，为后续的所述传代培养创造良好的培养条件。
进一步优选的，将包被液铺板于增殖培养容器后，在所述增殖培养容器中接种所述初代细胞培养物，然后利用TEM培养基进行增殖培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。
优选的，所述步骤S2中，将包被液铺板于汇合培养容器中，然后对所述待转染细胞培养物进行至少24小时的所述汇合培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。其有益效果在于：控制所述包被液的铺板密度，有利于增强待转染细胞的贴壁能力，促进所述待转染细胞在较短时间内达到良好的汇合率。
进一步优选的，所述步骤S3中，向装载有所述贴壁细胞的所述汇合培养容器中加入所述慢病毒悬液和所述病毒感染增强悬液的6-12小时后进行所述培养基置换。其有益效果在于：有利于进一步促进所述病毒感染的效果。
更进一步优选的，所述包被液置换完毕后，继续对所述贴壁细胞培养24-72小时，以完成所述病毒感染。
更进一步优选的，对经所述病毒感染后得到的细胞进行荧光分析以计算荧光率，当所述荧光率大于90％，执行所述步骤S4。其有益效果在于：确保经所述病毒感染后得到的细胞具有较高的感染效率，有利于为后续的建立所述永生化细胞系创造良好的培养条件。
进一步优选的，所述慢病毒的表达基因为SV40大T抗原、HPV E6E7基因、或端粒酶逆转录酶基因，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺悬液。其有益效果在于：能够有效提高所述病毒感染的效率。
优选的，将经所述病毒感染后得到的细胞培养物与所述筛选剂混合后转移至扩增培养基中进行所述扩增培养，所述筛选剂与所述扩增培养基的体积比为1:1000。其有益效果在于：通过所述筛选剂能够进一步筛选出成功进行所述病毒感染的细胞，有利于为后续的建立所述永生化细胞系创造良好的培养条件。
进一步优选的，所述筛选剂为嘌呤霉素、潮霉素或硫酸新霉素，所述扩增培养基为TEM培养基。
附图说明
图1为本发明的通过第一构建方法得到的肝前体样细胞系的形态图；
图2为本发明的对比细胞系与第一目标细胞系的不同功能基因的基因表达水平对比图；
图3为本发明的对比细胞系与第一目标细胞系的氨清除能力对比图；
图4为本发明的对比细胞系与第一目标细胞系的α1-抗胰蛋白酶水平对比图；
图5为本发明的对比细胞系与第二目标细胞系的蛋白印记对比图；
图6为本发明的对比细胞系与第三目标细胞系的尿素生成水平对比图；
图7为本发明的对比细胞系与第三目标细胞系的白蛋白水平对比图；
图8为本发明的对比细胞系与第一目标细胞系的增殖性能对比图；
图9为本发明的对比细胞系与第一目标细胞系的倍增时间对比图；
图10为本发明的生物人工肝反应器的结构示意图；
图11为本发明的第一目标细胞系在图10所示的生物人工肝反应器中进行气液交互培养的过程中，不同培养时间下负载在空白载体表面的肝细胞的增殖能力示意图。
图12为本发明的第一目标细胞系在图10所示的生物人工肝反应器中进行12天的气液交互培养后，负载在空白载体表面的肝细胞的不同功能基因的基因表达水平示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
具体实施方式中的主要试剂来源如下：
TEM培养基、SV40大T抗原悬液、表达HPV E6E7基因的慢病毒悬液和表达端粒酶逆转录酶基因的慢病毒悬液均来源于上海赛立维生物科技有限公司；基质胶产自美国康宁(Corning)公司，货号为356234；聚凝胺悬液和硫酸新霉素均产自上海翊圣生物科技有限公司，货号分别为40804ES76和60207ES25；嘌呤霉素产自上海碧云天生物技术有限公司，货号为ST551；胰酶消化液产自上海源培生物科技股份有限公司，货号为S310KJ；FOXA3来源于上海吉凯基因科技有限公司；潮霉素产自赛默飞世尔科技(Invitrogen)公司，货号为10687010。
具体实施方式中的主要仪器来源如下：
六孔板产自耐思科学有限公司(NEST Science Co.Ltd)，货号为703001；细胞培养孵箱购自新加坡艺思高科技有限公司(ESCO)，产品型号为CLL-170B-8；细胞倒置显微镜购自株式会社尼康(Nikon)，产品型号为Ta2-FL。
针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种肝前体样细胞系的构建方法，包括：
S1：提供原代肝细胞培养物，对所述原代肝细胞培养物进行增殖培养和传代培养，以得到待转染细胞培养物，所述传代培养的传代比例1:3-1:6，传代次数为2-30；
S2：将所述待转染细胞培养物以0.5×104-1×105个/平方厘米的接种密度进行汇合培养，以得到汇合率不低于80％的贴壁细胞；
S3：通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述贴壁细胞进行病毒感染，并在所述病毒感染的过程中进行培养基置换，所述慢病毒悬液中的慢病毒数量是所述贴壁细胞数量的0.5-50倍，所述病毒感染增强悬液的浓度为6-12微克/毫升；
S4：通过筛选剂和扩增培养基对经所述病毒转染后得到的细胞培养物进行扩增培养和再传代培养，得到永生化细胞系，所述扩增培养的时间为24-96小时，所述再传代培养的传代比例为1:3-1:6，传代次数为10-100；
S5：在所述永生化细胞系中过表达肝细胞特异性转录因子，以得到所述肝前体样细胞系。
其中，所述铺板密度定义为单位培养面积具有的包被液的体积。
所述接种密度定义为单位培养面积具有的细胞数目。
对同一组培养器中的培养物进行分隔，并重新接种至其他培养容器中进行下一次传代培养的过程中，分隔前的培养物份数与分隔后的培养物份数的比例定义为传代比例。
本发明一些实施例的所述步骤S5中，所述肝细胞特异性转录因子为FOXA3，FOXA3的序列参见序列表。
本发明另一些实施例中，所述肝细胞特异性转录因子为HNF1α或HNF4α。
本发明一些实施例的所述步骤S1中，所述原代肝细胞培养物为人原代肝细胞培养物。
本发明另一些实施例的所述步骤S1中，采用胶原酶灌注法从正常人供体的肝组织或者血管瘤旁正常肝组织分离出所述原代人肝细胞培养物。所述胶原酶灌注法和所述荧光激活细胞分选法的具体实施方式记载在2018年发表在Cell Research(细胞研究)第29卷第1期的“Expansion and differentiation ofhuman hepatocyte-derivedliverprogenitor-like cells forthe study ofhepatotropic pathogens”中，因此不做赘述。
本发明一些实施例的所述步骤S1中，将包被液铺板于增殖培养容器后，在所述增殖培养容器中以0.5×104-2×104个/平方厘米的接种密度接种所述初代细胞后，对所述初代细胞培养物进行6-12天的所述增殖培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。
本发明一些实施例的所述步骤S2中，将包被液铺板于汇合培养容器中，然后对所述待转染细胞培养物进行至少24小时的所述汇合培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。
本发明一些实施例的所述步骤S3中，向装载有所述贴壁细胞的所述汇合培养容器中加入所述慢病毒悬液和所述病毒感染增强悬液的6-12小时后进行所述培养基置换。所述培养基置换完毕后，继续对所述贴壁细胞培养24-72小时，以完成所述病毒感染。
本发明一些实施例的所述步骤S4中，将经所述病毒感染后得到的细胞培养物与所述筛选剂混合后转移至扩增培养基中进行所述扩增培养，所述筛选剂与所述扩增培养基的体积比为1:1000。
本发明一些具体的实施例中，所述包被液为基质胶(Matrigel)，所述增殖培养容器和所述汇合培养容器均为六孔培养板，所述扩增培养基为TEM培养基，所述慢病毒的表达基因为SV40大T抗原、HPV E6/7基因或端粒酶逆转录酶基因，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺悬液，所述筛选剂为嘌呤霉素、潮霉素或硫酸新霉素。
以下通过实施例1-3对所述肝前体样细胞系的构建方法和优点进行详细阐述。
实施例1
本实施例提供了第一构建方法。
本实施例涉及的培养板均为规格相同的六孔培养板，且均预先由基质胶进行铺板，基质胶的铺板密度为0.87微升/平方厘米。
本实施例涉及的细胞培养孵箱，内部为37℃恒温，饱和湿度，二氧化碳的浓度为5％。
所述第一构建方法中，在所述细胞培养孵箱内进行的过程除外，其他操作均在常温无菌操作台中进行。
所述第一构建方法具体为：
S11：将人原代肝细胞培养物以1×104个/平方厘米的接种密度接种于第一培养板中，在所述第一培养板的每个培养孔中加入2毫升TEM培养基后，将所述第一培养板放置在细胞培养孵箱内进行6天的所述增殖培养，使所述初代培养物中的初代细胞会逐渐发生分化转变，以获得增殖能力。
具体的，所述人原代肝细胞培养物来源于上海东方肝胆外科医院的废弃手术标本，术前征得患者本人同意并签署知情同意书。
S12：所述增殖培养结束后，去除所述第一培养板中的培养液体，通过胰酶消化液和TEM培养基对经所述增殖培养得到的细胞培养物进行传代次数为20，且传代比例为1:3的传代培养，以得到待转染细胞培养物。
具体的，将0.5毫升胰酶消化液和2毫升经所述增殖培养得到的细胞培养物加入到第二培养板中的每个培养孔中，然后将所述第二培养板放置在细胞培养孵箱中静置3min以进行一次消化重悬处理。所述消化重悬处理结束后，向所述第二培养板的每个培养孔中加入2毫升TEM培养基，然后继续在所述细胞培养孵箱中进行培养。待观察到所述第二培养板的底部长满细胞，将所述第二培养板每个培养孔底部的细胞平均分成3份，分别用0.5毫升胰酶消化液进行所述消化重悬处理后传代入其他3个培养板中，以完成一次传代培养。所述传代培养的过程中，每24小时用2毫升新的TEM培养基更换每个培养孔中的TEM培养基，以提高传代培养的效率。
S21：所述传代培养结束后，将所述待转染细胞培养物以2×104个/平方厘米的接种密度接种于第三培养板中，将所述第三培养板放置在细胞培养孵箱中进行汇合培养，观察所述第三培养板中的贴壁细胞的汇合率为80％，停止所述汇合培养。
S31：将经所述汇合培养得到的细胞培养物用胰酶消化液参照所述步骤S13进行消化重悬处理，得到消化培养物；将所述消化培养物以2×104个/平方厘米的接种密度接种于第四培养板中，并将所述第四培养板放置在细胞培养孵箱内。24小时后，去除所述第四培养板的上清液后，向所述第四培养板中加入TEM培养基、SV40大T抗原悬液以及聚凝胺悬液后，在细胞培养孵箱中进行8小时的感染；所述感染结束后，用2毫升新的TEM培养基更换所述第四培养板的每个培养孔中的TEM培养基，然后将所述第四培养板放置在细胞培养孵箱内继续培养；在细胞培养孵箱内继续培养72小时后，取少量细胞悬液在荧光显微镜下进行荧光分析以计算荧光率，判断所述荧光率大于90％后，完成所述病毒感染。
具体的，所述第四培养板的每个培养孔中加入50微升所述SV40大T抗原悬液和10微升所述聚凝胺悬液，所述SV40大T抗原悬液中的SV40大T抗原与贴壁细胞的数量比为20:1，所述聚凝胺悬液的浓度为8微克/毫升。
S41：所述病毒感染结束后，将得到的细胞培养物加入到第五培养板中，并向所述第五培养板中加入TEM培养基和嘌呤霉素，然后将所述第五培养板放置在细胞培养孵箱中，以进行24小时的扩增培养。
所述扩增培养结束后，用新的TEM培养基替换所述第五培养板中的TEM培养基，然后对所述第五培养板中的细胞培养物进行传代次数为20，且传代比例为1:3的再传代培养，以得到永生化细胞系。
具体的，进行所述扩增培养前，所述第五培养板的每个培养孔的细胞培养物为0.5毫升，嘌呤霉素与TEM培养基的体积比为1:1000，TEM培养基为2毫升。
一次再传代培养过程具体为：观察到待传代细胞培养物长满培养孔的底部，将所述待传代细胞培养物平均分成3份后，分别传代入其他3个培养板中，且向每个培养孔中加入2毫升TEM培养基。
S51：在所述永生化细胞系中过表达FOXA3，得到存活的肝前体样细胞系，保藏于中国典型培养位保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019120，分类命名为ALI-CELL-85F。
具体的，所述过表达的实施方式记载在2018年发表在Cell Research(细胞研究)第29卷第1期的“Expansion and differentiation ofhuman hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells for the study ofhepatotropic pathogens”中，因此不做赘述。
实施例2
本实施例提供了第二构建方法，所述第二构建方法与实施例1的所述第一构建方法的区别在于：
所述基质胶的铺板密度为1.74微升/平方厘米。
所述步骤S11中，所述人原代肝细胞培养物的接种密度为2×104个/平方厘米。
所述步骤S12中，所述传代培养的传代次数为5，传代比例为1:4。
所述步骤S21中，所述待转染细胞培养物的接种密度为1×105个/平方厘米。
所述步骤S31中，所述慢病毒悬液中的慢病毒数目与所述贴壁细胞的数量比为50:1，所述感染结束后，在细胞培养孵箱中继续培养的时间为48小时。
所述步骤S41中，向所述第五培养板中加入TEM培养基和潮霉素，所述扩增培养的时间为2天，所述再传代培养的传代比例为1:4，传代次数为40。
实施例3
本实施例提供了第三构建方法，所述第三构建方法与实施例1的所述第一构建方法的区别在于：
所述基质胶的铺板密度为1微升/平方厘米。
所述步骤S11中，所述人原代肝细胞培养物的接种密度为0.5×104个/平方厘米，所述增殖培养的时间为3天。
所述步骤S12中，所述传代培养的传代次数为10，传代比例为1:6。
所述步骤S21中，所述待转染细胞培养物的接种密度为1.5×104个/平方厘米。
所述步骤S31中，所述慢病毒悬液为表达端粒酶逆转录酶基因的慢病毒悬液，所述消化培养物的接种密度为1×104个/平方厘米，所述感染的时长为10小时，所述慢病毒与贴壁细胞的数量比为40:1，所述聚凝胺悬液的浓度为10微克/毫升。
所述步骤S41中，向所述第五培养板中加入TEM培养基和硫酸新霉素，所述扩增培养的时间为4天，所述再传代培养的传代比例为1:6，传代次数为30。
本发明实施例1-3提供的第一构建方法、第二构建方法和第三构建方法具有良好的实验重现性。
在细胞倒置显微镜下以100倍的放大倍数观察通过所述第一构建方法得到的肝前体样细胞系的形态，得到图1所示的形态结构示意图。具体的制样和观察方法为本领域的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图1，所述肝前体样细胞系具有较规则的形态结构，有利于发挥良好的细胞功能。
以所述第一构建方法得到的转染细胞系为对比细胞系，以所述第一构建方法得到的肝前体样细胞系为第一目标细胞系，所述第二构建方法得到的肝前体样细胞系为第二目标细胞系，所述第三构建方法得到的肝前体样细胞系为第三目标细胞系，对所述对比细胞系和各目标细胞系在不同功能基因的基因表达水平、蛋白水平、尿素生成能力、氨清除能力、白蛋白合成能力以及α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin，AAT)合成能力方面进行分析表征。
具体的，采用上海飞捷生物技术有限公司生产的货号为220010的RNAfast200试剂盒分别抽提所述对比细胞系和所述第一目标细胞系的RNA，然后采用赛默飞世尔科技(Invitrogen)公司生产的货号为18064014的反转录醇将得到的RNA分别反转录为cDNA，最后通过荧光定量PCR分别表达肝细胞的相关功能基因，得到图2所示的所述对比细胞系与所述第一目标细胞系的不同功能基因的基因表达水平对比图。所述荧光定量PCR的具体表达方法为本领域技术人员的常规手段，在此不做赘述。
相关功能基因分别为白蛋白(Albumin，Alb)、AAT、转铁蛋白(Transferrin，TRF)、氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamoylphosphate synthetase 1，CPS1)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(Ornithine transcarbamylase，OTC)、精氨酸琥珀酸合成酶1(Arginino succinatesynthetase，ASS1)、精氨酸酶-1(Arginase-1，ARG1)、精氨酸酶-2(Arginase-2，ARG2)、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D Glucosaminidase，NAG)以及5种药物代谢I相酶。5种药物代谢I相酶分别为CYP3A4、CYP2D6、CYP2B6、CYP1A2以及CYP2C9。
参照图2，所述第一目标细胞系的Alb、AAT和TAT的基因水平均高于所述对比细胞系的相关基因水平，可见，经过FOAX3过表达后的所述第一目标细胞系具有优良的蛋白合成功能；所述第一目标细胞系的CPS1、OTC、ASS1、NAG和ARG1的基因水平均高于所述对比细胞系的相关基因水平，而ARG2的基因水平与所述对比细胞系相比基本持平，表明所述第一目标细胞系的尿素合成能力优于所述对比细胞系，良好的尿素生成能力则表明了所述第一目标细胞系具有优良的解毒功能；所述第一目标细胞系的CYP3A4、CYP1A2以及CYP2C9的基因水平均高于所述对比细胞系的相关基因水平，而CYP2D6和CYP2B6的基因水平与所述对比细胞系相比差别很小，表明所述第一目标细胞系的药物代谢能力优于所述对比细胞系。
进一步的，采用Megazyme公司生产货号为K-AMIAR07/14的快速试剂盒分别对所述第一目标细胞系和所述对比细胞系的氨清除能力进行表征，得到图3所示的氨清除能力对比图。
参照图3，氨清除水平的物理意义为每106个细胞每天消耗的氨气的微克质量，所述对比细胞系的氨清除水平约为5.9，而所述第一目标细胞系的氨清除水平可高达34.4，是所述对比细胞系的尿素生成水平的6倍。可见，所述第一目标细胞系具有优良的解毒功能。
更进一步的，采用Bethyl公司生产货号为E88-122的人AAT ELISA试剂盒分别检测所述对比细胞系和所述第一目标细胞系的α1-抗胰蛋白酶水平，得到如图4所示的α1-抗胰蛋白酶水平对比图。
参照图4，α1-抗胰蛋白酶水平的物理意义是每106个细胞每天合成ATT的纳克质量。所述对比细胞系的α1-抗胰蛋白酶水平约为29.2，而所述第一目标细胞系的α1-抗胰蛋白酶水平可达58.5，是所述对比细胞系的α1-抗胰蛋白酶水平的2倍。可见，所述第一目标细胞系具有良好的ATT合成能力。
以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为参比，采用蛋白质印迹法分别对所述第二目标细胞系和所述对比细胞系的Alb和CPS1进行蛋白水平表征，得到如图5所示的蛋白印记对比图。
具体的，所述蛋白质印迹法的具体实施方式记载在2018年发表在Cell Reports(细胞通讯)第25卷第1期的“Aggregation Culture Induces FunctionalDifferentiation of Induced Hepatocyte-like Cells through Activation of HippoSignaling”上。
参照图5，由于所述第二目标细胞系和所述对比细胞系的GAPDH蛋白印记相差不大，在GAPDH蛋白印记的参比对照下，所述第二目标细胞系的Alb蛋白印记比所述对比细胞系的Alb蛋白印记显著，表明所述第二目标细胞系相比所述对比细胞系具有更好的白蛋白合成功能；另外，所述第二目标细胞系的CPS1蛋白印记比所述对比细胞系的CPS1蛋白印记显著，表明所述第二目标细胞系相比所述对比细胞系具有更好的尿素生成能力。
采用Bioassay system公司生产的货号为DIUR-500的QuantiChromTM Urea AssayKit试剂盒分别对所述第三目标细胞系和所述目标细胞系的尿素生成能力进行表征，得到如图6所示的尿素生成水平对比图。图6中的尿素生成水平的物理意义为每106个细胞每天生成的尿素的毫克数。
参照图6，所述对比细胞系的尿素生成水平约为1.6，而所述第三目标细胞系的尿素生成水平可达7.3，是所述对比细胞系的尿素生成水平的5倍。可见，所述第三目标细胞系具有优良的解毒功能。
进一步的，采用Bethyl公司生产的货号为E88-129的人白蛋白ELISA试剂盒分别检测所述第三目标细胞系和所述对比细胞系的白蛋白水平，得到如图7所示的白蛋白水平对比图。
参照图7，白蛋白水平的物理意义为每106个细胞每天生成的Alb的纳克数。所述对比细胞系的白蛋白水平约为5.0，而所述第三目标细胞系的白蛋白水平可高达24.2，是所述对比细胞系的白蛋白水平的5倍。可见，所述第三目标细胞系具有优良的白蛋白合成功能。
本发明实施例对所述第一目标细胞系和所述对比细胞系的增殖性能进行了表征，得到如图8所示的增殖性能对比图和图9所示的倍增时间对比图。
具体的，所述增殖性能的具体表征方法记载在2018年发表在Cell Research(细胞研究)第29卷第1期的“Expansion and differentiation of human hepatocyte-derivedliverprogenitor-like cells forthe study ofhepatotropic pathogens”中。
参照图8，在21天的增殖生长时间内，所述第一目标细胞系和所述对比细胞系增殖的细胞个数以及增殖速率均相差不大；参照图9，所述第一目标细胞系的倍增时间约为48小时，和所述对比细胞系的倍增时间43小时相差不大。可见，经过FOAX3过表达后形成的所述第一目标细胞系的生长特征基本不受影响。
本发明实施例还提供了通过所述构建方法得到的肝前体样细胞系在生物人工肝领域的应用。
首先，提供生物人工肝反应器，参考公开号为CN106620916A的中国发明专利申请的实施例2在空白载体上接种肝细胞。具体的肝细胞接种过程与CN106620916A的实施例2公开的具体过程的区别在于：本申请使用的肝细胞为实施例1的所述第一构建方法得到的肝前体样细胞系，即所述第一目标细胞系；空白载体的质量为11克；每克空白载体接种的肝细胞数目为1×106个。
然后在所述生物人工肝反应器中对接种有肝细胞的载体进行12天的气液交互培养，以促进肝细胞的增殖生长。
图10为本发明一些实施例的生物人工肝反应器的结构示意图。
参照图10，生物人工肝反应器10具有相互固定连接的容器本体101和波纹管102，以及均贯穿所述容器本体101的进液管103和出液管104。所述容器本体101的顶部设置有透气通孔以及阻菌透气膜，以保证所述波纹管102的平稳升降以及阻隔空气中的微生物。
所述容器本体101底部具有气液通道(图中未标示)，以便于通过所述进液管103向所述波纹管102内部输送500毫升DMEM培养基。将接种有肝细胞的载体密封在所述容器本体101内，关闭所述进液管103和所述出液管104，通过设置在所述生物人工肝反应器10外部的驱动装置(图中未标示)带动所述波纹管102进行周期性的升降运动，进而带动DMEM培养基通过所述气液通道(图中未标示)进入所述容器本体101内部，以对接种有肝细胞的载体进行气液交互培养。
在单位周期内，DMEM培养基浸没接种有肝细胞的载体后维持液面位置不变，使肝细胞与培养基进行时长60s的液相物质交换；所述液相物质交换完毕后，DMEM培养基液面下降，以使肝细胞与空气中的氧气进行气相物质交换。
所述气液交互培养结束后，打开所述出液管104，通过所述波纹管102的压缩以及所述出液管104排出所述波纹管102中的培养基。
在所述气液交互培养的过程中，每天从所述容器本体101内取出3片接种有肝细胞的载体以检测肝细胞数量，得到图11所示的增殖曲线示意图。图11所示的纵坐标代表单位质量接种有肝细胞的载体上负载的肝细胞数目。
参照图11，在12天的气液交互培养过程中，肝细胞个数与培养时间的线性关系明显，肝细胞细胞个数显著且增长趋势稳定。
参照前述的对应表征方法分别对所述气液交互培养结束后得到的载体上负载的肝细胞在不同功能基因的基因表达水平进行分析表征，得到如图12所示的不同功能基因的基因表达水平示意图。
参照图12，通过所述第一构建方法得到的肝前体样细胞系在相关功能基因，即Alb、AAT、CPS1、OTC、ASS1、ARG1、ARG2、NAG、CYP3A4、CYP2D6、CYP2B6、CYP1A2、CYP2C9以及人免疫缺陷缺陷病毒1型的复制受反式激活蛋白(Trans-activating Protein，TAT)方面得到了显著的表达。
参照前述的对应表征方法对所述气液交互培养结束后得到的载体上负载的肝细胞的白蛋白合成能力、AAT合成能力、尿素生成能力以及氨清除能力方面进行了表征，结果表明，对于所述气液交互培养结束后得到的载体上负载的每106个肝细胞而言，每天生成的Alb的质量为71.7纳克，每天生成的α1-抗胰蛋白酶为163.9纳克，每天消耗的氨气的质量为69.7微克，每天生成的尿素质量为25.2毫克。
从上述分析可知，通过所述第一构建方法得到的肝前体样细胞系，经在所述生物人工肝反应器10中进行气液交互培养后，得到的肝细胞具有良好的白蛋白合成功能、尿素合成功能、AAT合成功能、解毒功能以及药物代谢功能。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
序列表
<110> 上海赛立维生物科技有限公司
<120> 肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 869
<212> DNA
<213> human
<400> 1
ggatcccgta accgaaatcg gttgaaccga aaccggttag tataaaagca gacattttat 60
gcaccaaaaa agaactgcaa tgtttcagga cccacaggag cgacccagaa agttaccaca 120
gttatgcaca gagctgcaaa caactataca tgatataata ttagaatgtg tgtactgcaa 180
gcaacagtta ctgcgacgtg aggtatatga ctttgctttt cgggatttat gcatagtata 240
tagagatggg aatccatatg ctgtatgtga taaatgttta aagttttatt ctaaaattag 300
tgagtataga cattattgtt atagtttgta tggaacaaca ttagaacagc aatacaacaa 360
accgttgtgt gatttgttaa ttaggtgtat taactgtcaa aagccactgt gtcctgaaga 420
aaagcaaaga catctggaca aaaagcaaag attccataat ataaggggtc ggtggaccgg 480
tcgatgtatg tcttgttgca gatcatcaag aacacgtaga gaaacccagc tgtaatcatg 540
catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagatt tgcaaccaga gacaactgat 600
ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca 660
gctggacaag cagaaccgga cagagcccat tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt 720
gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc acacacgtag acattcgtac tttggaagac 780
ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc cccatctgtt ctcagaaacc ataatctacc 840
atggctgatc ctgcaggtac cgcggccgc 869

Claims (13)

1.一种肝前体样细胞系的构建方法，其特征在于，包括：
S1：提供原代肝细胞培养物，对所述原代肝细胞培养物进行增殖培养和传代培养，以得到待转染细胞培养物，所述传代培养的传代比例1:3-1:6，传代次数为2-30；
S2：将所述待转染细胞培养物以0.5×104-1×105个/平方厘米的接种密度进行汇合培养，以得到汇合率不低于80%的贴壁细胞；
S3：通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述贴壁细胞进行病毒感染，并在所述病毒感染的过程中进行培养基置换，所述慢病毒悬液中的慢病毒数量是所述贴壁细胞数量的0.5-50倍，所述病毒感染增强悬液的浓度为6-12微克/毫升；
S4：通过筛选剂和扩增培养基对经所述病毒转染后得到的细胞培养物进行扩增培养和再传代培养，得到永生化细胞系，所述扩增培养的时间为24-96小时，所述再传代培养的传代比例为1:3-1:6，传代次数为10-100；
S5：在所述永生化细胞系中过表达FOXA3，以得到所述肝前体样细胞系。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用胶原酶灌注法从正常肝组织中分离出所述原代肝细胞培养物。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，将所述原代肝细胞培养物以0.5×104-2×104个/平方厘米的接种密度进行6-12天的所述增殖培养。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在预先用包被液铺板的增殖培养容器中进行所述增殖培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，在预先用包被液铺板的汇合培养容器对所述待转染细胞培养物进行至少24小时的所述汇合培养，所述包被液的铺板密度为0.87-1.74微升/平方厘米。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，向装载有所述贴壁细胞的所述汇合培养容器中加入所述慢病毒悬液和所述病毒感染增强悬液的6-12小时后，进行所述包被液置换。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述包被液置换完毕后，继续对所述贴壁细胞培养24-72小时，以完成所述病毒感染。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，对经所述病毒感染后得到的细胞培养物进行荧光分析以计算荧光率，当所述荧光率大于90%，执行所述步骤S4。
9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述慢病毒的表达基因为SV40大T抗原、HPV E6E7基因或端粒酶逆转录酶基因，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺悬液。
10.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，将经所述病毒感染后得到的细胞培养物与所述筛选剂混合后转移至扩增培养基中进行所述扩增培养，所述筛选剂与所述扩增培养基的体积比为1:1000。
11.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述筛选剂为嘌呤霉素、潮霉素或硫酸新霉素，所述扩增培养基为TEM培养基。
12.一种如权利要求1-11中的任意一项所述的构建方法制备的肝前体样细胞系，其特征在于，所述肝前体样细胞系为保藏于中国典型培养位保藏中心的存活样品，所述肝前体样细胞系的保藏编号为CCTCCNO：C2019120，分类命名为ALI-CELL-85F。
13.一种如权利要求1-11中的任意一项所述的构建方法制备的肝前体样细胞系在生物人工肝反应器领域的应用。
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