CN115105531A - 细胞治疗剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞治疗剂及其制备方法，以及在制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物方面的应用。本发明所述细胞治疗剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞的产生。

Description

细胞治疗剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及细胞治疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前最常见的慢性肝脏疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的炎性亚型，在组织学上表现为：肝脂肪变性、小叶炎症、肝细胞球囊增生以及其他肝细胞受损，伴有或不伴有纤维化。在没有过量饮酒的情况下，发生与酒精性脂肪性肝炎(ASH)相似的组织学变化，并有可能发展为肝硬化及其并发症。
大量的实验和临床数据支持巨噬细胞在NAFLD和NASH的发生和发展中的核心作用。通常，巨噬细胞的活化通过在宿主免疫的早期吞噬病原体并分泌细胞因子或介体来起到保护作用。然而，持续刺激会导致细胞死亡，肝损伤和相关疾病。
目前尚无批准的NASH治疗方法。在NASH的所有方面中，尽管在了解疾病流行病学，病理生理学和确定治疗目标方面取得了稳步进展，但在治疗领域进展最为缓慢。即使在全球进行了多年的深入研究之后，目前也没有批准的药物可用于其治疗。
因此，有必要开发新型的细胞治疗剂以解决现有技术中存在的上问题。
发明内容
本发明的目的在于一种细胞治疗剂及其制备方法和应用，以能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应对NASH起到治疗作用。
为实现上述目的，本发明的细胞治疗剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞的产生。
优选的，所述肝源细胞阳性表达CD24和EpCAM。
进一步优选的，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
优选的，所述肝源细胞在体外培养基诱导下分泌能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞产生的分泌成分。
进一步优选的，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为HepX培养基、DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
优选的，所述细胞治疗剂还包括重悬成分和辅助成分的至少一种，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种，所述辅助成分包括免疫抑制剂。
本发明所述细胞治疗剂的制备方法包括：使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养，得到具有前体细胞特征的肝源细胞。
优选的，所述肝细胞增殖培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂。
进一步优选的，所述肝细胞增殖培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
进一步优选的，所述肝细胞增殖培养基由所述血清类物质，HepX Basal培养基、无血清添加剂、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂和青霉素-链霉素双抗组成。
进一步优选的，以占HepX Basal培养基的含量计，无血清添加剂的体积含量不超过2％，丙酮酸钠含量为0.5-1.5毫摩尔/升，肝细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，表皮细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，成纤维细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，N-乙酰-L-半胱氨酸的含量为0.5-10微摩尔/升，抗坏血酸的含量为5-50微克/毫升、TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-10微摩尔/升，Wnt信号通路激动剂的含量为1-5微摩尔/升，ROCK激酶抑制剂的含量为5-20微摩尔/升，青霉素-链霉素双抗的体积含量为1-3％，所述血清类物质的体积含量为3-15％。
本发明的所述细胞治疗剂在制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物方面的应用包括：使用所述细胞治疗剂干预体内动物模型后获取离体样本；通过所述离体样本考察所述细胞治疗剂对肝巨噬细胞的作用。
优选的，所述体内动物模型为哺乳动物非酒精性脂肪性肝炎模型。
附图说明
图1为实施例1的各肝前体相关标志物在HepLPCs细胞中的表达情况对比图；
图2为实施例1的经TEM培养基培养10天后得到的细胞进行明场拍照得到的HepLPCs的明场照片；
图3为实施例2的早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋、切片制样和H&E染色后得到的染色照片；
图4为实施例2的对照组小鼠的肝脏组织进行石蜡包埋、切片制样和H&E染色后得到的染色照片；
图5为实施例2的早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后进行Masson染色后得到的染色照片；
图6为实施例2的早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后进行油红O染色后得到的染色照片；
图7为实施例2对对早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后进行M1型巨噬细胞特异性标志物CD68的免疫组化染色得到的染色照片；
图8为实施例2对早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后进行M2型巨噬细胞特异性标志物CD163的免疫组化染色后得到的染色照片；
图9为实施例2的早期NASH小鼠模型和对照组的血生化及TC、TG含量对比图；
图10为实施例3的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏H&E染色照片和油红O染色照片对比图；
图11为实施例3对假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组的NAS评分对比图；
图12为实施例3对假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏切片的Masson染色照片；
图13为实施例3对图11的各组染色照片的肝纤维化区域统计结果对比图；
图14为实施例3对假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏切片进行Ki67染色得到的染色照片；
图15为实施例3的正常对照组、免疫抑制组、口服生理盐水的模型组、假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠血液中ALT、AST、LDH指标水平对比图；
图16为实施例3的正常对照组、假手术组、细胞低剂量治疗组小鼠和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏的TC和TG含量对比图；
图17为实施例3对假手术组、细胞低剂量治疗组小鼠和细胞高剂量治疗组小鼠进行抗CD163和抗CD68的免疫组化染色后得到的染色照片对比图；
图18为根据图17统计得到的各组肝脏中CD163+巨噬细胞和CD68+巨噬细胞数量对比图；
图19为实施例4的中晚期NASH小鼠模型的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏切片的H&E染色照片对比图；
图20为实施例4的中晚期NASH小鼠模型的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏切片的Masson染色照片对比图；
图21为根据图20统计得到的各组肝纤维化区域统计结果对比图；
图22为实施例5采用流式细胞术对经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的总巨噬细胞占比分析结果；
图23为实施例5采用流式细胞术对经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的M1型巨噬细胞占比分析结果；
图24为实施例5采用流式细胞术对Control组和DM+LPS组进行细胞鉴定得到的M1相关炎性基因表达情况对比图；
图25为实施例6采用流式细胞术对经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的M2型巨噬细胞占比分析结果；
图26为实施例6采用流式细胞术对Control组和DM+IL-4组进行细胞鉴定得到的M2相关炎性基因表达情况对比图；
图27为实施例7的Control组，DM+LPS组、CM+LPS组和EV+LPS组的M1相关炎性基因表达情况对比图；
图28为实施例8的Control组，DM+IL4组、CM+IL4组和EV+IL4组的M2相关炎性基因表达情况对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例提供了细胞治疗剂及其制备方法和应用，以能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应对NASH起到治疗作用。
本发明实施例的所述细胞治疗剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞的产生。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体样细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝来源前体细胞或鼠肝来源前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体细胞或鼠肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体样细胞或鼠肝前体样细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞阳性表达CD24和EpCAM。
一些实施例中，所述肝源细胞的培养上清包含促进成分，以促进修复性巨噬细胞产生。
一些实施例中，所述肝源细胞在体外培养基诱导下分泌能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞产生的外泌体成分。
一些实施例中，所述体外培养基为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、HepX培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
一些实施例中，所述DMEM细胞培养基为高糖DMEM细胞培养基。
一些实施例中，所述体外培养基由所述基础培养基，以及血清类物质和双抗的至少一种组成。
一些实施例中，所述体外培养基由所述基础培养基、血清类物质和双抗组成。其中，以占所述基础培养基的体积含量计，血清类物质的含量不超过20％，双抗的含量不超过2％。
一些实施例中，所述细胞治疗剂还包括重悬成分和辅助成分的至少一种。
一些实施例中，所述重悬成分为生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
一些实施例中，所述辅助成分包括免疫抑制成分。
本发明实施例提供了所述细胞治疗剂的制备方法包括：使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养，得到具有前体细胞特征的肝源细胞。
一些实施例中，所述肝细胞增殖培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂。
以占所述基础培养基的含量计，所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述血清类物质的含量不超过20％，所述无血清添加物的体积含量不超过2％。
一些实施例中，所述肝细胞增殖培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
一些实施例中，所述肝细胞增殖培养基由HepX培养基、无血清添加剂、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂、青霉素-链霉素双抗和血清类物质组成。
一些实施例中，所述体外培养基和所述肝细胞增殖培养基中任意一种的血清类物质为动物源血清。
一些实施例中，所述体外培养基和所述肝细胞增殖培养基中任意一种中的动物源血清可以用血清替代物替换。
一些实施例中，所述血清替代物为无动物源成份的血小板及其衍生物。
一些实施例中，所述血清替代物为一磷酸鞘氨酸和吲哚乙酸。
一些实施例中，所述动物源血清为胎牛血清。
一些实施例的所述肝细胞增殖培养基中，以占HepX Basal培养基的含量计，无血清添加剂的体积含量不超过2％，肝细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，表皮细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，成纤维细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，N-乙酰-L-半胱氨酸的含量为0.5-10微摩尔/升，抗坏血酸的含量为5-50微克/毫升，、TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-20微摩尔/升，Wnt信号通路激动剂的含量为1-5微摩尔/升，ROCK激酶抑制剂的含量为5-20微摩尔/升，青霉素-链霉素双抗的体积含量为1-3％，血清类物质的体积含量为5-15％。
一些实施例的肝源细胞培养方法包括：使用所述肝细胞增殖培养基对所述原代肝细胞进行培养直至汇合度不低于80％，然后对得到的细胞消化后进行传代培养。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，控制所述原代肝细胞的接种密度为0.5-1×105/cm2。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，每2-3天更换一次所述肝细胞增殖培养基。
本发明还提供了所述细胞治疗剂在制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物方面的应用，包括：
使用所述细胞治疗剂干预体内动物模型后获取离体样本；
通过所述离体样本考察所述细胞治疗剂对肝巨噬细胞的作用。
一些实施例中，所述体内动物模型为哺乳动物非酒精性脂肪性肝炎模型。
本发明各实施例中，如无特别说明，细胞培养均在37摄氏度环境下且二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中进行。细胞培养使用的培养基以及处理细胞所使用的各类试剂，例如缓冲液使用前均经无菌化处理以及0.22微米滤器过滤以去除杂质。
本发明各实施例中涉及统计学分析的数据均为三次独立重复，实验数据以均值±标准差
Figure BDA0003537425710000091
表示。正态分布数据,对两组数据间差异分析使用Student’s t-test统计法；多组数据比较分析使用one-way ANOVA，和Dunnett校正进行多重比较，必要时选用Tukey校正方法。偏态分布的数据,采用两组间Mann-Whitney U test统计法进行非参数统计分析。P值小于0.05为差异有统计学意义。所有数据均通过SPSS软件(25.0版)选取合适的统计分析方法进行分析。
以下通过具体的实施例进行详细说明：
实施例1
本实施例提供了第一种细胞治疗剂，其制备方法如下：
S0：提供人原代肝细胞；
S1：使用肝细胞增殖培养基(简记为TEM培养基)对所述原代肝细胞进行培养直至汇合度不低于80％；
S2：将经所述步骤S1后得到的细胞消化后按1：3的比例进行传代培养。
所述步骤S0中，所述人原代肝细胞来源于上海瑞德肝脏有限公司。具体的，所述人原代肝细胞在经TEM培养前经Percoll密度梯度离心联合流式分选排除掉CD24阳性和EpCAM阳性的前体细胞。
所述步骤S1中，TEM培养基由HepX Basal培养基，以及以占HepX Basal培养基的含量计：1％的无血清添加剂N-2，1％的无血清添加剂B-27，1.25μM的N-乙酰-L-半胱氨酸，20ng/mL的HGF，20ng/mL的EGF，20ng/mL的FGF，10μg/mL的抗坏血酸，1μM的TGF-β信号抑制剂A8301，3μM的Wnt信号通路激动剂CHIR99021，10μM的ROCK激酶抑制剂Y27632，2％的青霉素-链霉素双抗和10％的胎牛血清FBS组成。HepX Basal培养基、N2、B27、青霉素-链霉素双抗来源于上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清FBS来源于以色列Biological Industries公司；HGF来源于美国Sino Biological公司；EGF和FGF来源于美国Peprotech公司；A8301、CHIR99021和Y27632来源于上海陶速生物科技有限公司。
所述步骤S1中，对所述原代肝细胞进行培养的步骤包括：将所述人原代肝细胞使用TEM培养基重悬后以0.5-1×105/cm2的密度接种于用Vitronectin XFTM(来源于加拿大干细胞技术有限公司)包板的6孔板中进行培养。培养进行的过程中，每2-3天更换一次TEM培养基。
所述步骤S2中，将经所述步骤S1后得到的细胞消化后按1：3的比例进行传代培养的步骤包括：使用0.25％的Trypsin-EDTA(来源于美国Gibco公司)进行消化，并按照1:3的比例接种入新的培养皿中扩增培养到第三代并直至细胞汇合率达80％。
本实施例通过流式细胞术对经所述步骤S2得到的人肝前体样细胞(HepLPCs)进行鉴别分析，得到图1所示的各肝前体相关标志物在HepLPCs细胞中的表达情况对比图。参照图1可知，HepLPCs表达了肝前体相关标志物CK19和CD24以及肝系标志物ALB，表现出肝前体细胞特性。造血干细胞抗原CD34和白细胞共同抗原CD45的表达水平小于2％，表现出低免疫原性。
本实施例对经TEM培养基培养10天后得到的细胞进行明场拍照，得到图2所示的HepLPCs的明场照片。参照图2可知，HepLPCs细胞呈梭形且贴壁生长，细胞长满视野且表现出高核/质比的肝前体细胞特征。
实施例2
本实施例提供了NASH小鼠模型的建模方法。
本实施例使用购自上海灵畅生物科技有限公司的健康雄性5周龄野生型(WT)C57BL/6小鼠进行建模。小鼠的体重平均达到20g。每组7只小鼠，分组情况如下：
模型组：以2.5-3g/只的饲养量投喂CDAHFD高脂饲料，一周添加2-3次。
对照组：以2.5-3g/只的饲养量进行标准饮食投喂。
各组小鼠经检疫并预适应1周后，在无特定病原体级环境饲养(SPF级)饲养环境下饲养，控制室温20-26℃，湿度40-70％，光照12小时明暗交替，每笼动物不超过5只。
模型组各小鼠饲养3周后得到早期NASH小鼠模型；饲养6周后得到中晚期NASH小鼠模型。
本实施例取早期NASH小鼠模型和对照组小鼠的肝脏组织进行石蜡包埋、切片制样和H&E染色，得到图3和图4分别所示的H&E染色照片。参照图3和图4，早期NASH小鼠模型相比对照组肝脏细胞出现气球样变，呈现明显的弥漫性脂肪样变。
本实施例对早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后分别进行Masson染色和油红O染色，得到图5和图6分别所示的Masson染色照片和油红O染色照片。参照图5和图6可知，早期NASH小鼠模型的小鼠肝脏中存在大量脂质沉积。
本实施例对早期NASH小鼠模型的肝脏组织进行石蜡包埋和切片制样后，分别进行M1型巨噬细胞特异性标志物CD68的免疫组化染色以及M2型巨噬细胞特异性标志物CD163的免疫组化染色，分别得到图7和图8所示的染色照片。参照图7和图8可知，早期NASH小鼠模型的小鼠肝组织伴随炎性细胞浸润。
本实施例通过眼眶取血检测血液样本肝功相关指标AST、ALT、LDH以及检测离体肝脏组织中总胆固醇TC和肝脏甘油三脂TG含量，评估早期NASH小鼠模型和对照组小鼠的肝细胞脂质沉积情况，得到图9所示的早期NASH小鼠模型和对照组的血生化及TC、TG含量对比图。参照图9可知，早期NASH小鼠模型与正常饲料喂养的对照组相比，肝脏血生化指标AST/ALT较正常组上升6～7倍，LDH较正常组上升2倍，提示NASH小鼠出现较为明显的肝损伤。早期NASH小鼠模型与对照组TG含量无明显差别，△△P<0.05，无统计学意义；而TC含量则有明显降低。
可见，特殊高脂饮食喂养小鼠3周后NASH小鼠疾病模型构建成功。
实施例3
本实施例使用实施例1的HepLPCs对早期NASH小鼠模型进行干预，考察HepLPCs对NASH疾病的作用。其中早期NASH小鼠模型进行如下分组，每组7只小鼠：
模型组：口服生理盐水。
免疫抑制组：口服免疫抑制剂FK506，剂量为0.2mg/kg；
细胞低剂量治疗组：术前一天口服给予免疫抑制剂0.2mg/kg；术中每只腹腔注射200微升细胞注射液，使用生理盐水重悬0.5×106个HepLPCs得到细胞注射液；
细胞高剂量治疗组：和细胞低剂量治疗组的区别在于，每只注射的细胞注射液中含1×106个HepLPCs；
假手术组：每只脾脏注射200微升生理盐水；
上述各组完成注射或口服后第10天处死小鼠，取肝脏组织进行石蜡包埋和切片后进行H&E染色和油红O染色，观察肝脏病理改变以脂质沉积情况，得到图10所示的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏H&E染色照片和油红O染色照片对比图。参照图10，相较于假手术组，细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组显示肝脏的脂质沉积情况显著减轻。
本实施例应用NAFLD活动度评分(NAS)对肝脏镜下病理改变进行分析，得到图11所示的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组的NAS评分对比图。参照图11，假手术组组NAS评分在4-6分之间，符合NASH的病理评定标准，而各细胞治疗组低于2分，显示可排除NASH。显示HepLPCs对早期NASH小鼠模型起到了积极的干预作用。
本实施例对假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏切片进行Masson染色和肝纤维化区域统计，得到图12所示的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏切片的Masson染色照片以及图13所示的各组肝纤维化区域统计结果对比图。参照图12和图13可知，细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏中的纤维化区域相比较假手术对照组均显著减少，特别是细胞高剂量治疗组纤维减少情况最明显，显示HepLPCs治疗早期NASH小鼠模型能对肝脏纤维化起到较强的缓解能力。
本实施例对假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏切片进行Ki67染色，得到图14所示的染色照片。参照图14可知，相较于假手术组，HepLPCs促进了细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠的肝再生。
本实施例对正常对照组NC、免疫抑制组CDA+FK506、口服生理盐水的模型组CDA+saline、假手术组CDA+sham、细胞低剂量治疗组CDA+HepLPCs(low dose)和细胞高剂量治疗组CDA+HepLPCs(high dose)小鼠进行眼眶取血，通过血生化水平分析考察了各组的ALT、AST、LDH指标，得到图15所示的各组ALT、AST、LDH指标水平对比图。参照图15，与假手术组相比，两组细胞治疗组在ALT、AST、LDH三项指标均有一定量的下降。细胞低剂量治疗组肝功能指标ALT治疗窗口下降16％；细胞高剂量治疗组肝功能指标ALT治疗窗口下降31.5％；与假手术组相比，细胞低剂量治疗组肝功能指标AST治疗窗口下降15％；细胞高剂量治疗组肝功能指标AST治疗窗口下降22％；与假手术组相比，细胞低剂量治疗组肝功能指标LDH治疗窗口下降13.9％；细胞高剂量治疗组肝功能指标LDH治疗窗口下降17％。由此可见，HepLPCs可改善早期NASH小鼠模型的肝功能。
本实施例对正常对照组、假手术组、细胞低剂量治疗组小鼠和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏的TC和TG含量进行测定，得到图16所示的各组肝脏TC和TG含量对比图。参照图16，与假手术组相比，细胞高剂量治疗组肝脏肝固醇TC含量下降23.4％；与假手术组相比，细胞低剂量治疗组肝脏甘油三酯TG含量下降17.6％；细胞高剂量治疗组肝脏甘油三酯TG无明显差异；从TC、TG检测来看，假手术组TC、TG含量均较正常组高。尽管不同的细胞剂量缓解NASH肝脂代谢的能力不同，但总的来说，HepLPCs显示出可显著改善NASH肝脏脂代谢能力。
本实施例对假手术组、细胞低剂量治疗组小鼠和细胞高剂量治疗组小鼠的肝脏组织进行抗CD163和抗CD68的免疫组化染色并对不同组肝脏中CD163+巨噬细胞和CD68+巨噬细胞数量进行了统计，得到图17所示的各组的抗CD163和抗CD68的免疫组化染色照片对比图，以及图18所示的各组肝脏中CD163+巨噬细胞和CD68+巨噬细胞数量对比图。参照图17和图18，两组细胞治疗组与假手术组小鼠相比较,肝脏内CD163+巨噬细胞数量都明显增加，CD68+巨噬细胞稍有减少。以上结果提示HepLPCs抑制了巨噬细胞相关的炎症反应，并促进修复型巨噬细胞的产生。
实施例4
本实施例使用实施例1的HepLPCs对中晚期NASH小鼠模型进行干预，考察HepLPCs对NASH疾病的作用。其中中晚期NASH小鼠模型的分组处理情况请参见实施例3，区别在于：细胞低剂量治疗组每只小鼠脾脏输注的细胞注射液含1×106个细胞，细胞高剂量治疗组每只小鼠脾脏输注的细胞注射液含2×106个细胞。
本实施例对中晚期NASH小鼠模型的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏切片进行H&E染色，得到图19所示的染色照片。参照图19可知，相较于假手术组，细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏显示脂质沉积得以改善。
本实施例对中晚期NASH小鼠模型的假手术组、细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组小鼠肝脏切片进行Masson染色，并统计了纤维化区域,得到图20所示的各组Masson染色照片对比图，以及图21所示的各组肝纤维化区域统计结果对比图。参照图20和图21，细胞低剂量治疗组和细胞高剂量治疗组的小鼠肝脏中的纤维化区域相比较对照组均显著减少，特别是细胞低剂量治疗组的纤维减少情况最明显，可见HepLPCs对中晚期NASH小鼠模型的肝脏纤维化起到较强的缓解能力。
实施例5
本实施例提供了炎症细胞模型的建模方法。
目前，大量的实验和临床数据支持巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发生和发展中的核心作用。巨噬细胞在不同因素诱导下可出现两种经典的细胞亚群，即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。二者功能截然不同。业内通常认为，M1型巨噬细胞促进炎症反应，通过产生大量促炎性细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、以及一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)介导机体的炎症反应。
因此，有必要进行炎症细胞模型的建模，以通过炎症细胞模型深入考察HepLPCs对M1型巨噬细胞的作用。
具体的，将6～8周成年C57小鼠脊椎脱臼处死后取股骨髓腔中的骨髓团块；对上述骨髓团块经70μm细胞筛网过滤后在500g的离心力下离心5分钟后弃上清；用红细胞裂解液(来源于上海碧云天生物技术有限公司)重悬沉淀物后再次在500g的离心力下离心5分钟后弃上清得到二次沉淀物；用BMDM培养基对二次沉淀物进行反复的重悬和离心以充分洗涤沉淀中残余的红细胞裂解液以及细胞碎片。最后使用BMDM培养基对纯化后的细胞进行重悬后按(8～10)×105/孔接种入12孔板，接种时每孔加入小鼠GM-CSF并控制浓度为40ng/mL。接种完成后的6-8小时后，将细胞转移到新的培养皿中进行培养，每3天更换一次添加有40ng/mL小鼠GM-CSF的BMDM培养基直至培养至第7天，实现巨噬细胞的分化成熟。其中，BMDM培养基由500mL 1640培养液(来源于上海源培生物科技股份有限公司)、5％青霉素-链霉素双抗和10％FBS组成。
具体的，巨噬细胞分化成熟后，将培养基更换为含100ng/mL的LPS的BMDM培养基后进行6小时的培养，以完成体外定向极化诱导。
本实施例采用流式细胞术对经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs以及经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定，得到图22所示的总巨噬细胞占比分析结果以及图23所示的M1型巨噬细胞占比分析结果。参照图22和图23可知，经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs的巨噬细胞总表型标志物F4/80+的表达占比达到92.8％，即总巨噬细胞占比92.8％，符合BMDM实验细胞纯度；经LPS刺激6小时后得到的BMDMs中，M1表型标志物CD11c+以及F4/80+的表达占比为88.1％，即M1型巨噬细胞占比88.1％。可见BMDMs经本实施例的小鼠GM-CSF诱导分化以及LPS刺激后得到的炎症细胞模型中，M1型巨噬细胞占比满足纯度要求。
本实施例采用流式细胞术对未处理的BMDMs(Control组)以及经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs(DM+LPS组)进行细胞鉴定，得到图24所示的M1相关炎性基因表达情况对比图。参照图24，和对照组相比，经LPS刺激6小时后的BMDMs的M1相关基因表达水平均上调。其中，IL6表达水平上调为823.200±174.500，IL1β表达水平上调为8.389±0.029，iNOS表达水平上调为24.650±1.196。
实施例6
本实施例提供了修复型巨噬细胞模型的建模方法。
业内通常认为M2型巨噬细胞主要产生免疫调节因子白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等，参与Th2细胞型免疫应答，抑制炎症和纤维化，在组织的修复过程中具有重要作用。
因此有必要建立修复型巨噬细胞模型，并通过修复型巨噬细胞模型深入考察HepLPCs对M2型巨噬细胞的作用。
本实施例通过IL-4刺激巨噬细胞建立修复型巨噬细胞模型，具体过程包括：小鼠原代骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的获取方法以及使用小鼠GM-CSF对BMDMs进行为期7天的诱导分化的方法请参见实施例2。采用IL-4对得到的成熟原代巨噬细胞进行6小时的体外定向极化诱导后消化巨噬细胞，得到修复型巨噬细胞模型。其中，IL-4刺激的过程中控制IL-4的浓度为40ng/mL。其余具体实验步骤请参见实施例5。
本实施例采用流式细胞术对经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定，得到图25所示的M2型巨噬细胞占比分析结果。参照图22和图25可知，经IL-4刺激6小时后得到的BMDMs中，M2表型标志物CD206+以及巨噬细胞总表型标志物F4/80+的表达占比为97％，即M2型巨噬细胞占比97％。可见BMDMs经本实施例的小鼠GM-CSF诱导分化以及IL-4刺激后得到的修复型巨噬细胞模型中，M2型巨噬细胞占比满足纯度要求。
本实施例采用流式细胞术对未处理的BMDMs(Control组)以及经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs(DM+IL-4组)进行细胞鉴定，得到图26所示的M2相关炎性基因表达情况对比图。参照图26，和Control组相比，经IL-4刺激6小时后的BMDMs的M2相关基因表达水平均上调。其中，CD206表达水平上调为114.000±3.579，IL10表达水平上调为2.634±0.028，ARG1表达水平上调为53.260±8.083。
实施例7
本实施例对实施例1的HepLPCs进行体外培养，从得到的体外培养上清中提取外泌体成分(简记为HepLPCs-Ex)，并考察其对实施例5的炎症细胞模型的作用。
实施例1的HepLPCs的体外培养以及获取体外培养上清(HepLPCs-CM)的过程包括：实施例1的传代培养结束后，将TEM培养基更换为使用无血清的高糖DMEM培养基后，继续进行24小时的体外培养；所述体外培养结束后收集细胞上清，对所述细胞上清在300g离心力下离心10分钟以去除细胞碎片从而得到体外培养上清。
本实施例使用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒对HepLPCs-CM中的外泌体成分进行提取，得到HepLPCs-Ex。具体的提取方法请参见试剂盒说明书。将提取得到的HepLPCs-Ex委托逍鹏生物进行NTA检测，结果表明提取的样本颗粒直径多集中于90-110nm之间，峰值在96nm。
本实施例控制BMDMs细胞数目为5×105个，外泌体浓度和HepLPCs-CM浓度均为1.3ug/uL。将HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex分别加入到炎症细胞模型混合后培养6小时，形成CM+LPS组和EV+LPS组，通过qPCR考察Control组，DM+LPS组、CM+LPS组和EV+LPS组的M1相关炎性基因表达情况，得到图27所示的各组M1相关炎性基因水平对比图。
参照图27，对照组DM+LPS组的M1相关炎性基因IL6、IL1β和iNOS的表达显著，通过HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex干预均能够使得上述M1相关炎性基因表达水平显著下降，且HepLPCs-Ex干预使得上述M1相关炎性基因表达水平下降的程度与HepLPCs-CM的干预效果相当。
综上所述，HepLPCs在无血清基础培养基的诱导下释放的外泌体HepLPCs-Ex能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化。
实施例8
本实施例考察了实施例7的外泌体成分HepLPCs-Ex对实施例6的修复型巨噬细胞模型的作用。
本实施例控制BMDMs细胞数目为5×105个，外泌体浓度和HepLPCs-CM浓度均为1.3ug/uL。将HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex分别加入到实施例6的修复型巨噬细胞模型混合后培养6小时，形成CM+IL4组和EV+IL4组，通过qPCR考察Control组，DM+IL4组、CM+IL4组和EV+IL4组的M2相关炎性基因表达情况，得到图28所示的各组M2相关炎性基因水平对比图。
参照图28，相较于对照组DM+IL4组的M2相关炎性基因CD206、IL10和ARG1的表达水平，通过HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex干预均能够使得上述M2相关炎性基因表达水平上调，且HepLPCs-Ex干预使得上述M2相关炎性基因表达水平上调的程度与HepLPCs-CM的干预效果相当。
综上所述，HepLPCs在无血清基础培养基的诱导下释放的外泌体HepLPCs-Ex能够促进修复型巨噬细胞，即M2型巨噬细胞的产生。

Claims (12)

1.一种细胞治疗剂，其特征在于，包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞的产生。
2.根据权利要求1所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述肝源细胞阳性表达CD24和EpCAM。
3.根据权利要求2所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述肝源细胞在体外培养基诱导下分泌能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化并促进M2型巨噬细胞产生的分泌成分。
5.根据权利要求4所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为HepX培养基、DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、NeurobasalMedium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
6.根据权利要求1所述的细胞治疗剂，其特征在于，还包括重悬成分和辅助成分的至少一种，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种，所述辅助成分包括免疫抑制剂。
7.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，包括：
使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养，得到具有前体细胞特征的肝源细胞；
所述肝细胞增殖培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，所述肝细胞增殖培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
9.根据权利要求8所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，所述肝细胞增殖培养基由所述血清类物质，HepX Basal培养基、无血清添加剂、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂和青霉素-链霉素双抗组成。
10.根据权利要求9所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，以占HepX Basal培养基的含量计，无血清添加剂的体积含量不超过2％，丙酮酸钠含量为0.5-1.5毫摩尔/升，肝细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，表皮细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，成纤维细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，N-乙酰-L-半胱氨酸的含量为0.5-10微摩尔/升，抗坏血酸的含量为5-50微克/毫升、TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-10微摩尔/升，Wnt信号通路激动剂的含量为1-5微摩尔/升，ROCK激酶抑制剂的含量为5-20微摩尔/升，青霉素-链霉素双抗的体积含量为1-3％，所述血清类物质的体积含量为3-15％。
11.根据权利要求1所述的细胞治疗剂在制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物方面的应用，其特征在于，包括：
使用所述细胞治疗剂干预体内动物模型后获取离体样本；
通过所述离体样本考察所述细胞治疗剂对肝巨噬细胞的作用。
12.根据权利要求11所述的细胞治疗剂在制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物方面，其特征在于，所述体内动物模型为哺乳动物非酒精性脂肪性肝炎模型。
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