CN110431226B - 产生肝巨噬细胞的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了通过使用包含肝细胞条件培养基和基础培养基的肝巨噬细胞培养基从干细胞衍生的单核细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其中通过在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞获得所述条件培养基。还公开了用于这种方法的试剂盒和使用所述方法衍生的肝巨噬细胞及其用途。

Description

产生肝巨噬细胞的方法及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月5日提交的新加坡专利申请号10201700068V的优先权的权益，其内容为了所有目的通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及细胞生物学和生物化学，特别是衍生和维持肝巨噬细胞的方法。

背景技术

肝脏负责多种功能，最重要的功能是代谢、解毒和蛋白质合成。这些功能中的许多功能在肝细胞中进行，肝细胞是构成所有肝细胞的60％的实质细胞。然而，肝脏还含有大比例的非实质细胞，包括肝窦内皮细胞、肝星状细胞、胆管细胞和库普弗细胞(Kupffer cell，KC)。库普弗细胞是肝脏中的常驻巨噬细胞。它们位于肝窦中，是肝脏中最大的先天免疫细胞群，占所有肝细胞的约10-15％，代表体内超过80％的组织巨噬细胞。

由于其丰度和定位，库普弗细胞是肝内先天免疫系统的关键细胞成分。它们专门执行清道夫和吞噬功能，并在肝脏免疫方面和在肝脏炎症过程中调节异生物质代谢方面发挥重要作用。库普弗细胞构成身体的第一个巨噬细胞群，以充当病原体和病原体衍生产物(例如通过门静脉进入肝脏的脂多糖)的屏障。库普弗细胞在正常肝脏生理稳态和调节肝脏对毒性化合物的急性和慢性反应中起重要作用。库普弗细胞通过直接的细胞与细胞接触以及激活时释放多种炎性细胞因子和生长因子以及活性氧物质来发挥这种作用。已知这些分泌因子、尤其是白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-a(TNFα)诱导急性期蛋白质的合成并抑制细胞色素P450(CYP)酶(涉及异生物质的解毒的主要代谢酶组)的活性。证明激活的库普弗细胞在调节肝细胞损伤中的作用的一个很好的实例是对乙酰氨基酚诱导的肝毒性。据报道，库普弗细胞有助于损伤以及防止肝细胞损伤，这表明库普弗细胞可能是初始保护性反应的主要位点，该反应在进一步刺激时发展为引起损伤。由于这些相互作用导致严重的药理学和毒理学后果，因此对开发可模拟肝脏基础和炎症状态的市售体外模型存在明显的未满足的需求。这样的系统对于研究药物代谢和发现、肝毒性和预测临床结果至关重要。

大多数报道的体外研究使用来自动物来源的库普弗细胞。由于种间变异性，研究来自人来源的库普弗细胞的功能和作用将是重要的。然而，由于供体可用性、成本和繁琐的分离程序，人库普弗细胞的来源受到限制。而且，原代人库普弗细胞(PHKC)不能在延长的时间段内维持或在培养中扩繁以获得更大的细胞数。因此，需要一种衍生类似于PHKC特征的肝巨噬细胞的方法。

发明内容

在第一方面，提供了从单核细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(a)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(b)在(a)中的培养过程结束时分离上清液。

在第二方面，提供了从多能干细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括：(a)培养多能干细胞以获得单核细胞；和(b)在肝巨噬细胞培养基中培养来自(a)的单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。在一个实例中，(a)培养多能干细胞以获得单核细胞还包括：(i)培养多能干细胞以获得胚状体；和(ii)分化胚状体以获得单核细胞。在一个实例中，所述多能干细胞是经诱导的多能干细胞。在一个实例中，在第一方面和/或第二方面的方法中在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞包括在不存在细胞外基质的情况下在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞。

在一个实例中，肝巨噬细胞培养基中的基础培养基是低血清培养基。在一个实例中，肝巨噬细胞培养基中条件培养基与基础培养基的比例在10:1至1:10的范围或1:1。在另一个实例中，低血清基础培养基中的血清水平为0.1％至10％的百分比。

在第三方面，提供了用于从单核细胞衍生肝巨噬细胞的试剂盒，其包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。

在一个实例中，第三方面的试剂盒还包含未使用细胞外基质包被的细胞培养装置。在另一个实例中，试剂盒中的基础培养基适于用作低血清基础培养基。在又一个实例中，所述试剂盒还包含一种或多种用于基础培养基的以下补充剂：胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、白蛋白、脂肪酸、谷氨酰胺补充剂和缓冲剂。

附图说明

当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1显示了从人多能干细胞(hPSC)产生hPSC-肝巨噬细胞(hPSC-KC)的示意图。hPSC-单核细胞(hPSC-Mon)衍生自hPSC并分化成hPSC-KC或hPSC-非肝巨噬细胞这取决于培养条件。图1A显示胚状体(EB)的形成和附着以及可从培养上清液中收获的非贴壁hPSC-Mon的产生。在优化的原代人肝细胞条件培养基中将hPSC-Mon再处理7天以产生hPSC-KC。比例尺：200μm。图1B-C显示了使用本公开内容的方法产生的hPSC-KC(1B)与市售原代人库普弗细胞(PHKC)1C的形态学比较的相差图像。比例尺：50μm。结果表明，衍生自诱导性多能干细胞的单核细胞在适宜的培养条件下可分化为肝巨噬细胞，获得的肝巨噬细胞形态与原代人库普弗细胞相似。平行地，将hPSC-Mon在含有M-CSF(无肝信号(cue))的X-VIVO培养基中再处理7天以产生非肝巨噬细胞/> 的形态不同于PHKC和hPSC-KC的形态(图1C)。

图2显示了hPSC-KC的标志物表达。在图2A中，通过RT-PCR测定x轴上指示的标志物基因的表达水平，并针对GAPDH归一化。然后将表达水平hPSC-KC与人原代库普弗细胞(PHKC)进行比较。条形显示平均值±s.d.(n＝3)。在图2B中，通过免疫荧光证实hPSC-KC中巨噬细胞标志物的表达(左起第一组)。用DAPI对细胞进行复染(左起第二组)。将标志物表达与PHKC进行比较(左起第三组；DAPI复染：左起第四组)。比例尺：100μm。结果显示hPSC-KC以与PHKC相当的水平表达CD14、CD163和CD32，而与PHKC相比，hPSC-KC中CD68和CD11的表达水平较低。在图2C中，显示了在七天分化期期间的不同时间点的hPSC-KC(灰色阴影条形)和PHKC(黑色条形)中KC特异性标志物ID1、ID3和CLEC-4F的基因表达水平。单实线代表p<0.05，双实线代表p<0.01(双尾配对t检验)。误差条代表s.e.m，n＝3。UD：无法检测到。结果显示ID1、ID3和CLEC-4F的水平随着在7天期间形成hPSC-KC而增加，并且7天后hPSC-KC中ID1、ID3和CLEC-4F的水平与PHKC中相同标志物的水平相当。

图3显示PHKC和hPSC-KC之间的功能相似性以及响应于脂多糖(LPS)刺激时与的差异。图3A是显示LPS处理后hPSC-KC(上图)和/>(下图)中的形态变化的相差图像。比例尺：100μm。图3B和图3C显示在具有(深灰色条形)和没有(浅灰色条形)LPS处理时与/>PHKC和原代人肝细胞(PHH)相比，hPSC-KC中IL-6(图3B)和TNF-4α(图3C)的产生。在LPS处理后16小时收集来自细胞培养物的上清液，并使用ELISA测量细胞因子产生。在PHH中未检测到IL-6和TNF4α(在LPS处理后)产生。在LPS处理之前未在/>中检测到TNF4α产生。在针对细胞数归一化后呈现数据，条形代表平均值±s.d.(n＝3)。虚线代表在LPS处理之前和之后的细胞因子产生之间的倍数差异(在虚线顶部指示倍数)。实线代表p<0.05(双尾配对t检验)。结果显示hPSC-KC在形态变化和细胞因子分泌方面对LPS刺激作出积极反应。重要的是，hPSC-KC中的倍数诱导与PHKC的倍数诱导(25倍)在相同范围内。在基础水平(无LPS处理)和LPS诱导的水平方面，在hPSC-KC和PHKC中的IL-6水平之间未观察到显著差异。hPSC-KC中TNF4α产生的倍数增加(33倍)与PHKC中的倍数增加(35倍)相似。与PHKC和hPSC-KC相比，/>显示出更高得多水平的LPS诱导的IL-6和TNF4α产生。据报道，库普弗细胞在细胞因子刺激后显示出较低程度的细胞因子产生。图3中的结果显示hPSC-KC显示LPS诱导的细胞因子产生增加，其增加水平与PHKC中的相似，并且与/>相比，这些水平低得多，证实它们是KC样的。

图4显示了PHKC和hPSC-KC之间的标志物和功能相似性以及与的差异。图4A代表免疫荧光研究，其显示CLEC-4F在hPSC-KC和PHKC中的表达，但在/>中不表达。用DAPI对细胞进行复染。比例尺：100μm。图4B显示hPSC-KC和PHKC对羧酸盐修饰的1μmFluoSpheres的吞噬作用。右下角的白色框显示标记部分的放大图像。将细胞与FluoSpheres(激发/发射λ＝540/560)一起孵育1小时，彻底洗涤，固定并用小鼠-CD163和抗小鼠Alexa 488(激发/发射λ＝490/525)染色以可视化。分析来自三个独立实验中的每一个的至少十个图像，并显示代表性图像。细胞的灰色阴影代表CD163染色，亮白色点(由白色箭头指出)显示吞噬的珠子。共聚焦显微术用于确保珠子在细胞内，而不是细胞表面上的非特异性粘附珠子。比例尺：50μm。图4C和D显示与PHKC和/>相比，hPSC-KC中吞噬作用的定量。来自独立实验的至少4个代表性图像用于计数摄取的珠子的数量，并将其针对相应图像中的细胞数量归一化。实黑线代表p<0.05(双尾配对t检验)。条形代表平均值±s.d。结果显示hPSC-KC而非/>类似于PHKC，其特征在于CLEC-4F的表达，并且与/>相比，hPSC-KC和PHKC在进行吞噬作用方面更具活性。

图5显示了对对乙酰氨基酚的细胞毒性反应。将用LPS处理(实线)或未处理(虚线)的PHH单一培养物、PHH-PHKC共培养物(图5A)、PHH-hPSC-KC共培养物(图5B)和PHH-hPSC-Mac共培养物(图5C)在LPS处理后16小时，暴露于对乙酰氨基酚(APAP)。加入药物后24小时，使用阿尔玛蓝(Alamar Blue)测定细胞活力。细胞活力表示为与溶媒对照(DMSO)相比的活细胞的百分比。数据表示为平均值±s.d(n＝3)。*表示LPS激活的单一培养物和共培养物之间的统计学显著差异；#表示未激活的单一培养物和共培养物之间的统计学显著差异(p<0.05)。结果表明，与相比，PHH-hPSC-KC代表更敏感的肝毒性筛选模型，并且本研究中产生的hPSC-KC可以重演当与PHH共培养时商业PHKC显示的反应。

具体实施方式

本公开内容的发明人已经着手提供可用于衍生肝巨噬细胞的方法。衍生的肝巨噬细胞类似于库普弗细胞(KC)的特征，因此可以作为模拟肝脏基础状态和炎症状态的体外模型。此外，衍生的肝巨噬细胞可以在培养中扩繁并维持以获得更大的细胞数。因此，本发明有助于避免与人库普弗细胞研究相关的各种问题，特别是原代人库普弗细胞的有限可用性和原代人库普弗细胞不能在细胞培养中扩繁和维持。

在第一方面，提供了从单核细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞，其中肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(a)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(b)在(a)中的培养过程结束时分离上清液。在一个实例中，第一方面的方法不包括使用饲养细胞。

在第二方面，提供了一种从多能干细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括：(a)培养多能干细胞以获得单核细胞；和(b)在肝巨噬细胞培养基中培养来自(a)的单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。

在一个实例中，在第一方面和/或第二方面的方法中在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞包括在不存在细胞外基质的情况下在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞。在一个实例中，肝巨噬细胞培养基中的基础培养基是低血清基础培养基。在一个实例中，从单核细胞衍生肝巨噬细胞包括分化单核细胞以获得肝巨噬细胞。

本文所用的术语“巨噬细胞”是指一种白细胞，其在一个称作吞噬作用的过程中吞噬和消化细胞碎片、外来物质、微生物、癌细胞以及其表面上任何不具有对健康体细胞特异的蛋白质类型的其他物质。巨噬细胞基本上存在于所有组织中。它们在整个身体中呈现各种形式(例如，组织细胞、库普弗细胞、肺泡巨噬细胞、小胶质细胞等)，但它们都是单核吞噬细胞系统的一部分。除吞噬作用外，它们在非特异性防御(先天免疫)中起关键作用，并且还通过募集其他免疫细胞例如淋巴细胞来帮助启动特异性防御机制(适应性免疫)。在人中，功能失调的巨噬细胞引起严重的疾病，例如导致频繁感染的慢性肉芽肿病。

许多人巨噬细胞是通过组织中单核细胞的分化而产生的。它们可以使用流式细胞术或免疫组织化学染色通过其蛋白质的特异性表达来鉴定，所述蛋白质例如CD14、CD40、CD11b、CD64、EMR1、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和CD68。

本文中可互换使用的术语“肝脏巨噬细胞”和“肝巨噬细胞”是指类似于库普弗细胞并且使用本公开内容的方法衍生的巨噬细胞。这些巨噬细胞与血液/骨髓来源的巨噬细胞不同。使用本公开内容的方法获得的肝脏巨噬细胞或肝巨噬细胞的特征在于CLEC-4F、ID1或ID3或其组合的表达。CLEC-4F(C型凝集素结构域家族4成员F)是由基因CLEC-4F编码的蛋白质。CLEC4F是在常驻库普弗细胞上表达的C型凝集素。CLEC4F在肝脏以外的组织中检测不到。ID1(DNA结合抑制剂1)是由基因ID1编码的蛋白质，ID3(DNA结合抑制剂3)是由基因ID3编码的蛋白质。ID1和ID3都是螺旋-环-螺旋(HLH)蛋白质，其可与碱性HLH转录因子家族的成员形成异二聚体。ID1和ID3没有DNA结合活性，因此可以抑制它们与之相互作用的碱性HLH蛋白质的DNA结合和转录激活能力。已报道ID1和ID3为库普弗细胞特异性转录因子。

本文所用的术语“库普弗细胞”是指肝脏中的自我更新的、常驻和主要非迁移的吞噬细胞群。库普弗细胞起源于卵黄囊衍生的特异性祖细胞，其在胚胎发生期间接种肝脏。库普弗细胞是高效的吞噬细胞，其识别、摄取和降解细胞碎片、外来物质或病原体。因此，它们充当关键的哨兵，确保肝脏稳态并消除抗体、碎片或死细胞。在健康的肝脏中，库普弗细胞仅位于血管内区室(主要在肝窦内)。

本文所用的术语“原代人库普弗细胞”或短形式“PHKC”是指从人肝脏、特别是成年人肝脏中分离的库普弗细胞。

如本文所用的术语“单核细胞”是指可以分化成巨噬细胞的白细胞类型。在本公开内容的一些实例中，通过在限定条件下培养干细胞，从干细胞(即干细胞衍生的单核细胞)、特别是多能干细胞、更特别是诱导性多能干细胞衍生单核细胞。在一些实例中，单核细胞如下获得：通过(a)培养多能干细胞(特别是诱导性多能干细胞)以获得胚状体；(b)分化胚状体以获得单核细胞。这种从多能干细胞获得单核细胞的方法是本领域已知的，例如如Wilgenburg等(van Wilgenburg B、Browne C、Vowles J、Cowley SA.Efficient,long termproduction of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cellsunder partly-defined and fully-defined conditions.PloS one.2013；8:e71098)和Karlsson等(Karlsson KR、Cowley S、Martinez FO、Shaw M、Minger SL、JamesW.Homogeneous monocytes and macrophages from human embryonic stem cellsfollowing coculture-free differentiation in M-CSF and IL-3.Experimentalhematology.2008；36:1167-75)中所描述的。在一些示例性方法中，使用旋转方法在胚状体培养基中从多能干细胞获得胚状体，然后在分化培养基中培养胚状体。在一些实例中，胚状体在胚状体培养基中培养2至20天、或3至18天、或4至16天、或5至14天、或6至12天、或6至12天、或7至10天、或8至9天、或4约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，然后收集并在分化培养基中培养。

在一些实例中，胚状体培养基包含补充有Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂、骨形态发生蛋白、干细胞因子(SCF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的基础培养基。可用于胚状体培养基的基础培养基的一个具体实例是mTeSR-1培养基。

本文所用的术语“Rho相关蛋白激酶”或短形式“ROCK”是指丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。它主要通过作用于细胞骨架来参与调节细胞的形状和运动。ROCK(ROCK1和ROCK2)出现在哺乳动物(人、大鼠、小鼠、牛)、斑马鱼、非洲爪蟾、无脊椎动物和鸡中。人ROCK1具有158kDa的分子量，是小GTP酶RhoA的主要下游效应子。哺乳动物ROCK由激酶结构域、卷曲螺旋区和Pleckstrin同源(PH)结构域组成，如果不存在RhoA-GTP，PH结构域通过自抑制分子内折叠降低ROCK的激酶活性。因此，术语“Rho相关蛋白激酶抑制剂”或短形式“ROCK抑制剂”是指抑制ROCK活性的化合物。ROCK抑制剂的实例包括但不限于Y-27632(即(R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐，IUPAC名称(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺)和法舒地尔(即IUPAC名称5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉)。在一些实例中，胚状体培养基中的ROCK抑制剂的浓度为约1至约100μM、或约1.5至约90μM、或约2至约80μM、或约2.5至约70μM、或约3至约60μM、或约3.5至约50μM、或约4至约40μM、或约4.5至约30μM、或约5至约25μM、或约5至约20μM、或约5至约15μM、或约5至约10μM、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μM。在一个具体实例中，胚状体培养基中的ROCK抑制剂浓度为10μM。

本文所用的术语“骨形态发生蛋白”或短术语“BMP”是指与细胞表面上的特异性受体(称为骨形态发生蛋白受体(BMPR))相互作用的一组蛋白质。通过BMPR的信号转导导致SMAD蛋白家族成员的动员。涉及BMP、BMPR和SMAD的信号转导通路在心脏、中枢神经系统和软骨的发育以及产后骨发育中是重要的。可用于胚状体培养基的BMP的实例包括但不限于BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10和BMP15。在一个具体实例中，使用的BMP是BMP4。在一些实例中，胚状体培养基中的BMP浓度为约1至约200ng/ml、或约5至约180ng/ml、或约10至约160ng/ml、或约15至约140ng/ml、或约20至约120ng/ml、或约25至约100ng/ml、或约30至约90ng/ml、或约35至约80ng/ml、或约40至约70ng/ml、或约40至约60ng/ml、或约40至约55ng/ml、或约40至约50ng/ml、或约40至约45ng/ml、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml。在一些具体实例中，胚状体培养基中的BMP浓度为约1至约80ng/ml。在一个具体实例中，胚状体培养基中的BMP浓度为50ng/ml。

本文所用的术语“干细胞因子”或短术语“SCF”是指早期作用的细胞因子，其在胚胎和成体造血的调节中起关键作用。SCF以造血层级的多个水平促进细胞的细胞存活、增殖、分化、粘附和功能激活。与其他细胞因子例如血小板生成素和Flt3/Flk-2配体一起，SCF通常用于促进培养中原始造血干细胞和多能祖细胞的扩繁。SCF以两种生物活性剪接形式存在：可溶性和跨膜同种型。在与其受体(c-Kit酪氨酸激酶受体；CD117)结合后，它激活PI3K、JAK/STAT和MAPK通路。在一些实例中，胚状体培养基中的SCF的浓度为约1至约200ng/ml、或约5至约180ng/ml、或约10至约160ng/ml、或约15至约140ng/ml、或约20至约120ng/ml、或约25至约100ng/ml、或约30至约90ng/ml、或约35至约80ng/ml、或约40至约70ng/ml、或约40至约60ng/ml、或约40至约55ng/ml、或约40至约50ng/ml、或约40至约45ng/ml、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml。在一些具体实例中，胚状体培养基中的SCF浓度为约1至约50ng/ml。在一个具体实例中，胚状体培养基中的SCF浓度为20ng/ml。

本文所用的术语“血管内皮生长因子”或短术语“VEGF”是指刺激血管形成的由细胞产生的信号蛋白。VEGF家族在哺乳动物中包含五个成员：VEGF-A、胎盘生长因子(PGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。它们是参与血管发生和血管生成的重要信号蛋白。在一些实例中，胚状体培养基中的VEGF浓度为约1至约200ng/ml、或约5至约180ng/ml、或约10至约160ng/ml、或约15至约140ng/ml、或约20至约120ng/ml、或约25至约100ng/ml、或约30至约90ng/ml、或约35至约80ng/ml、或约40至约70ng/ml、或约40至约60ng/ml、或约40至约55ng/ml、或约40至约50ng/ml、或约40至约45ng/ml、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml。在一些具体实例中，胚状体培养基中的VEGF浓度为约1-约80ng/ml。在一个具体实例中，胚状体培养基中的VEGF浓度为50ng/ml。

在一些其他实例中，分化培养基包含补充有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素、谷氨酰胺补充剂、抗氧化剂和/或抗生素的基础培养基。可用于分化培养基的基础培养基的一个具体实例是X-VIVO培养基。

本文所用的术语“巨噬细胞集落刺激因子”或短形式“M-CSF”是指分泌的造血生长因子，其参与单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞的增殖、分化和存活。它与集落刺激因子1受体结合。在一些实例中、分化培养基中的M-CSF的浓度为约1至约500ng/ml、或约10至约450ng/ml、或约20至约400ng/ml、或约30至约350ng/ml、或约40至约300ng/ml、或约50至约250ng/ml、或约60至约200ng/ml、或约70至约180ng/ml、或约80至约160ng/ml、或约90至约140ng/ml、或约100至约120ng/ml、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500ng/ml。在一些具体实例中，分化培养基中的M-CSF浓度为约50至约200ng/ml。在一个具体实例中，分化培养基中的M-CSF浓度为100ng/ml。

如本文所用的术语“白细胞介素”是指首先看到由白细胞表达的一组细胞因子。白细胞介素的常见家族包括白细胞介素1(IL-1)至白细胞介素15(IL-15)和白细胞介素17(IL-17)。在一个具体实例中，分化培养基中使用的白细胞介素是白细胞介素3(IL-3)。在一些实例中、分化培养基中的白细胞介素的浓度为约1至约200ng/ml、或约5至约180ng/ml、或约10至约160ng/ml、或约15至约140ng/ml、或约20至约120ng/ml、或约25至约100ng/ml、或约30至约90ng/ml、或约35至约80ng/ml、或约40至约70ng/ml、或约40至约60ng/ml、或约40至约55ng/ml、或约40至约50ng/ml、或约40至约45ng/ml、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml。在一些具体实例中，分化培养基中的白细胞介素的浓度为约1至约50ng/ml。在一个具体实例中，分化培养基中的白细胞介素浓度为25ng/ml。

谷氨酰胺支持具有高能量需求并合成大量蛋白质和核酸的细胞的生长。它是快速分裂细胞和无效率地使用葡萄糖的细胞的替代能源。细胞需要氮原子来构建分子例如核苷酸、氨基酸、氨基糖和维生素。铵是无机氮源，在生理pH主要作为带正电荷的阳离子NH4+存在。最初将细胞使用的铵氮作为谷氨酸的胺或谷氨酰胺的酰胺掺入有机氮中。这两种氨基酸为蛋白质、核酸和其他含氮化合物的合成提供了氮的主要储库。谷氨酰胺补充剂的实例包括L-谷氨酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。在一些实例中，分化培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为约0.5至约50mM、或约1至约45mM、或约1.5至约40mM、或约2至约35mM、或约3至约30mM、或约4至约25mM、或约5至约20mM、或约6至约18mM、或约7至约16mM、或约8至约14mM、或约9至约12mM、或约10至约11mM、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45或50mM。在一些具体实例中，分化培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为约1至约10mM。在一个具体实例中，分化培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为2mM。

在一个实例中，抗氧化剂是但不限于β-巯基乙醇。在一些实例中，分化培养基中的抗氧化剂浓度为约0.1至约10mM、或约0.2至约9mM、或约0.3至约8mM、或约0.4至约7mM、或约0.5至约6mM、或约0.6至约5mM、或约0.7至约4.5mM、或约0.8至约4mM、或约0.9至约3.5mM、或约1至约3mM、或约1.1至约2.5mM、或约1.2至约2mM、或约1.3至约1.9mM、或约1.4至约1.8mM、或约1.5至约1.7mM、或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10mM。在一些具体实例中，分化培养基中的抗氧化剂浓度为约0.1至约1mM。在一个具体实例中，分化培养基中的抗氧化剂浓度为0.055mM。

在一些实例中，抗生素是但不限于青霉素、链霉素、氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多粘菌素B、放线菌素、博来霉素、环己酰胺、遗传霉素(G148)、潮霉素B、丝裂霉素C和其组合。在一个实例中，抗生素是青霉素。在另一个实例中，抗生素是链霉素。在又一个实例中，抗生素是青霉素和链霉素。在一些实例中，分化培养基中的青霉素浓度为约1至约500U/ml、或约10至约450U/ml、或约20至约400U/ml、或约30至约350U/ml、或约40至约300U/ml、或约50至约250U/ml、或约60至约200U/ml、或约70至约180U/ml、或约80至约160U/ml、或约90至约140U/ml、或约100至约120U/ml、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500U/ml。在一些具体实例中，分化培养基中的青霉素浓度为约50至约200U/ml。在一个具体实例中，分化培养基中的青霉素浓度为100U/ml。在一些实例中，分化培养基中的链霉素浓度为约1至约500mg/ml、或约10至约450mg/ml、或约20至约400mg/ml、或约30至约350mg/ml、或约40至约300mg/ml、或约50至约250mg/ml、或约60至约200mg/ml、或约70至约180mg/ml、或约80至约160mg/ml、或约90至约140mg/ml、或约100至约120mg/ml、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500mg/ml。在一些具体实例中，分化培养基中的青霉素浓度为约50至约200mg/ml。在一个具体实例中，分化培养基中的青霉素浓度为100mg/ml。

在肝巨噬细胞培养基中培养以获得肝巨噬细胞的单核细胞可以通过CD14细胞表面受体的表达来表征。

如本文所用的术语“CD14”是指由基因CD14(分化簇14)编码的蛋白质。CD14是先天免疫系统的组分。它作为共同受体(与Toll样受体TLR 4和MD-2一起)用于检测细菌脂多糖(LPS)。CD14仅在脂多糖结合蛋白(LBP)存在下才能结合LPS。尽管LPS被认为是其主要配体，但CD14也识别其他与病原体相关的分子模式，例如脂磷壁酸。

如本文所用的术语“干细胞”是指未分化的生物细胞，其能够分化成更特化的细胞并且能够分裂(通过有丝分裂)以产生更多的干细胞。干细胞存在于多细胞生物中。在哺乳动物中，存在两种广泛类型的干细胞：胚胎干细胞，其例如从胚泡的内细胞团中分离；和成体干细胞，其存在于各种组织中。干细胞也可以分类为多能干细胞和多潜能干细胞。

如本文所用的术语“多能干细胞”或“多能细胞”是指具有完全分化多样性、自我更新并且可以在组织内保持休眠或静止的干细胞。它们有可能分化成三个胚层中的任何一个：内胚层，例如内部胃粘膜、胃肠道和肺自其发育；中胚层，例如肌肉、骨骼、血液和泌尿生殖器结构自其发育；或外胚层，例如表皮组织和神经系统自其发育。然而，值得注意的是，细胞多能性被认为是一个连续体，从可以形成胚胎本身的每个细胞的完全多能细胞(例如胚胎干细胞和经诱导的多能干细胞)到不完全或部分多能细胞，其可以形成所有三个胚层的细胞，但可能不具有完全多能细胞的所有特征。

如本文所用的术语“胚胎干细胞”是指源自胚泡(早期植入前胚胎)的内细胞团的多能干细胞。在一个实例中，本文公开的方法在不使用人胚胎干细胞的情况下进行。在又一个实例中，使用非人源胚胎干细胞进行本文公开的方法。

本文所用的术语“诱导性多能干细胞”或短形式“iPSC”或“iPS细胞”是指可以直接从成体细胞(通常是成体体细胞例如成纤维细胞，肺细胞或B细胞)产生的多能干细胞。iPSC通常通过将特定组的多能性相关基因或“重编程因子”的产物引入给定细胞类型而得到。在引入重编程因子后，细胞开始形成类似于多能干细胞的集落，其可以基于它们的形态、所选择的其生长的条件或通过表面标志物或报告基因的表达来分离。诱导性多能干细胞的实例包括但不限于由人成纤维细胞产生的诱导性多能干细胞。在一个具体实例中，诱导性多能干细胞是iPSC-IMR90细胞。

如本文所用的术语“多潜能干细胞”是指非特化细胞，其具有长时间自我更新的能力并分化成具有特定功能的特化细胞。与多能干细胞相比，多潜能干细胞可以产生其他类型的细胞，但其分化能力有限。因此，成体干细胞通常被认为是多潜能干细胞，因为它们的特化潜力限于一种或多种细胞系。多潜能干细胞的实例包括但不限于来自骨髓的产生红细胞、白细胞和血小板的造血干细胞(成体干细胞)；来自骨髓的产生基质细胞、脂肪细胞和骨细胞类型的间充质干细胞(成体干细胞)；产生各种类型的皮肤细胞的上皮干细胞；和有助于分化的肌肉组织的肌肉卫星细胞。

尽管本公开内容的方法被证明可用于衍生人肝巨噬细胞，但应理解该方法也可用于衍生其他哺乳动物物种的肝巨噬细胞。因此，干细胞可以从任何哺乳动物物种中分离，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猪、绵羊、牛、马、猴和人，这取决于要产生肝巨噬细胞的物种。在一个实例中，干细胞获自人，以衍生类似于原代人库普弗细胞的肝巨噬细胞。

术语“胚状体”或短形式“EB”是指干细胞的三维聚集体。与单层培养物相比，干细胞聚集时形成的球状体结构使EB的非贴壁培养物能够悬浮，使EB培养物固有地可扩展。这对于生物加工方法是有用的，由此可以产生大量细胞用于潜在的临床应用。

如本文所用的术语“条件培养基”是指细胞培养基，其进一步补充有源自用于使培养基条件化的细胞的可溶性因子。例如，当肝细胞用于使培养基条件化时，获得的条件培养基将含有肝细胞分泌的可溶性因子。肝细胞分泌的可溶性因子的非限制性实例包括：白蛋白、C-反应蛋白(CRP)、α胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、纤溶酶原、胆汁(其包含有机分子，包括胆汁酸、胆固醇、磷脂和胆红素)、表1中列出的先天免疫蛋白、用以吸引先天免疫细胞的趋化因子(例如MCP-1和CXCL1)和抗炎蛋白例如肽聚糖识别蛋白。

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表1.肝细胞分泌的先天免疫蛋白

用于获得条件培养基的细胞培养基可以是基础培养基。在一些实例中，基础培养基适于培养用于使培养基条件化的细胞。在一个具体实例中，基础培养基适于培养肝细胞，即肝细胞特异性培养基。在一个具体的实例中，基础培养基是William’s E培养基。用于获得条件培养基的基础培养基可以补充有如下所述的一种或多种生长补充剂和/或生长促进剂。

使培养基条件化可以包括将细胞在基础培养基中培养一段时间，直到细胞完成多个细胞周期，或直到细胞已经达到细胞周期中的特定阶段。例如，用于使培养基条件化的细胞可以已经完成了1个细胞周期，或2、3、4、5、6、7、8、9或10个细胞周期。细胞也可以处于间期G₁、S或G₂，或处于有丝分裂期。在一些实例中，使培养基条件化包括在基础培养基中培养细胞约12、18、24、30、36、42、48、54、60、72、84或96小时，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些实例中，将细胞培养约12小时至约10天、或约1天至约9天、或约2天至约8天、或约3天至约7天、或约4天至约6天。在一些具体实例中，将细胞培养约1天至约7天。在一个具体实例中，将细胞培养约1天。为了获得条件培养基，在培养过程结束时收集上清液。在一些实例中，在收集上清液后，可以使用新鲜培养基继续培养细胞如上所定义的一段时间，以便继续产生条件培养基。

在一个实例中，使培养基条件化不包括饲养细胞的使用。

如本文所用的术语“基础培养基”是指仅含有用于细胞生长的必需补充剂的细胞生长培养基。在大多数情况下，可用于本公开内容的方法的基础培养基是可商购的。可商购的基础培养基的实例包括Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium(AdvancedDMEM)、DMEM、RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基、X-VIVO^TM培养基(造血培养基)和William’s E培养基。在一个具体实例中，用于获得条件培养基的基础培养基是William's E培养基。

在一些实例中，肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基包含一种或多种或所有以下组分：(1)富含脂质的白蛋白，例如富含脂质的牛血清白蛋白。这种富含脂质的白蛋白的具体实例包括但不限于由ThermoFisher Scientific提供的I和/>II。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中富含脂质的白蛋白的浓度为约80至约2000mg/L、或约100至约1900mg/L、或约200至约1800mg/L、或约300至约1700mg/L、或约400至约1600mg/L、或约500至约1500mg/L、或约600至约1400mg/L、或约700至约1300mg/L、或约800至约1200mg/L、或约900至约1100mg/L、或约100、150、250、350、450、550、650、750、850、950、1050、1150、1250、1350、1450、1550、1650、1750、1850、或1950mg/L。在一个具体实例中，富含脂质的白蛋白是浓度为400mg/L的/>II。(2)钒酸盐化合物例如偏钒酸铵。钒酸盐化合物通常以痕量添加到基础培养基中，例如，其浓度为约6×10^-5至约1.5×10^-3mg/L、或约1×10^-4至约1.4×10^-3mg/L、或约2×10^-4至约1.3×10^-3mg/L、或约3×10^-4至约1.2×10^-3mg/L、或约4×10^-4至约1.1×10^-3mg/L、或约5×10^-4至约1×10^-3mg/L、或约6×10^-4至约9×10^-4mg/L、或约7×10^-4至约8×10^-4mg/L、或约8×10^-5、1×10^-4、1.5×10^-4、2.5×10^-4、3.5×10^-4、4.5×10^-4、5.5×10^-4、6.5×10^-4、7.5×10^-4、8.5×10^-4、9.5×10^-4、1×10^-3、1.05×10^-3、1.15×10^-3、1.25×10^-3、1.35×10^-3、或1.45×10^-3mg/L。在一个具体实例中，钒酸盐化合物是浓度为3×10^-4mg/L的偏钒酸铵。(3)维生素C(也称为抗坏血酸或L-抗坏血酸)或其衍生物。维生素C衍生物的实例包括但不限于抗坏血酸磷酸酯(特别是抗坏血酸2-磷酸酯)、抗坏血酸磷酸钠和抗坏血酸磷酸镁。在一些实例中，在肝巨噬细胞培养物中使用的基础培养基中维生素C或其衍生物的浓度为约0.5mg/L至约12.5mg/L、或约1mg/L至约12mg/L、或约1.5mg/L至约11.5mg/L、或约2mg/L至约11mg/L、或约2.5mg/L至约10.5mg/L、或约3mg/L至约10mg/L、或约3.5mg/L至约9.5mg/L、或约4mg/L至约9mg/L、或约4.5mg/L至约8.5mg/L、或约5mg/L至约8mg/L、或约5.5mg/L至约7.5mg/L、或约6mg/L至约7mg/L，或约0.5、0.75、1.25、1.75、2.25、2.75、3.25、3.75、4.25、4.75、5.25、5.75、6.25、6.75、7.25、7.75、8.25、8.75、9.25、9.75、10.25、10.75、11.25、11.75或12.25mg/L。在一个具体实例中，浓度为2.5mg/L的抗坏血酸磷酸酯用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。(4)钙补充剂，优选为可溶形式。这种钙补充剂的一个具体实例是氯化钙，可以使用其无水或二水合物形式。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中钙补充剂的浓度为约40mg/L至约1000mg/L、或约100mg/L至约900mg/L、或约150mg/L至约950mg/L、或约200mg/L至约900mg/L、或约250mg/L至约850mg/L、或约300mg/L至约800mg/L、或约350mg/L至约750mg/L、或约400mg/L至约700mg/L、或约450mg/L至约650mg/L、或约500mg/L至约600mg/L、或约80、125、175、225、275、325、375、425、475、525、575、625、675、725、775、825、875、925、975或1000mg/L。在一个具体实例中，在用于肝巨噬细胞培养基的基础培养基中使用的钙补充剂是浓度为200mg/L的无水形式的氯化钙。(5)铜补充剂，优选为可溶形式。铜补充剂的具体实例包括但不限于硫酸铜(II)(也称为正硫酸铜)和氯化铜(II)。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中铜补充剂的浓度为约0.25×10^-3mg/L至约6.25×10^-3mg/L、或约0.5×10^-3mg/L至约6×10^-3mg/L、或约1×10^-3mg/L至约5.5×10^-3mg/L、或约1.5×10^-3mg/L至约5×10^-3mg/L、或约2×10^-3mg/L至约4.5×10^-3mg/L、或约2.5×10^-3mg/L至约4×10^{- 3}mg/L、或约3×10^-3mg/L至约3.5×10^-3mg/L、或约0.25×10^-3、0.75×10^-3、1.25×10^-3、1.75×10^-3、2.25×10^-3、2.75×10^-3、3.25×10^-3、3.75×10^-3、4.25×10^-3、4.75×10^-3、5.25×10^-3、5.75×10^-3或6.25×10^-3mg/L。在一个具体实例中，用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中的铜补充剂为浓度为1.25×10^-3mg/L的正硫酸铜。(6)维生素B₅(也称为泛酸)或其衍生物。维生素B₅衍生物的实例包括但不限于泛酸钙，特别是D-泛酸钙和原维生素泛醇(也称为泛酰醇(pantothenol))。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中维生素B₅或其衍生物的浓度为约0.8mg/L至约16mg/L、或约1mg/L至约15mg/L、或约2mg/L至约14mg/L、或约3mg/L至约13mg/L、或约4mg/L至约12mg/L、或约5mg/L至约11mg/L、或约6mg/L至约10mg/L、或约7mg/L至约9mg/L、或约1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5或15.5mg/L。在一个具体实例中，浓度为4mg/L的D-泛酸钙用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。(7)乙醇胺。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的乙醇胺浓度为约0.3mg/L至约10mg/L、或约0.5mg/L至约9.5mg/L、或约1mg/L至约9mg/L、或约1.5mg/L至约8.5mg/L、或约2mg/L至约8mg/L、或约2.5mg/L至约7.5mg/L、或约3mg/L至约7mg/L、或约3.5mg/L至约6.5mg/L、或约4mg/L至约6mg/L、或约4.5mg/L至约5.5mg/L、或约0.25、0.75、1.25、1.75、2.25、2.75、3.25、3.75、4.25、4.75、5.25、5.75、6.25、6.75、7.25、7.75、8.25、8.75、9.25或9.75mg/L。在一个具体实例中，肝巨噬细胞培养物中使用的基础培养基中乙醇胺的浓度为1.9mg/L。(8)铁补充剂，优选为可溶形式。在一些实例中，铁补充剂是三价铁(即铁(III))补充剂，例如硝酸铁。在另一些实例中，铁补充剂是二价铁(即铁(II))补充剂，例如硫酸亚铁。在一个具体实例中，所用的硝酸铁是硝酸铁九水合物(Fe(NO₃)₃·9H₂O)的形式。在另一具体实例中，所用的硫酸亚铁是硫酸亚铁七水合物(FeSO₄·7H₂O)的形式。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中铁补充剂的浓度为约0.02mg/L至约0.5mg/L、或约0.05mg/L至约0.45mg/L、或约0.1mg/L至约0.4mg/L、或约0.15mg/L至约0.35mg/L、或约0.2mg/L至约0.3mg/L、或约0.02、0.05、0.08、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475或0.5mg/L。在一个具体实例中，浓度为0.1mg/L的硝酸铁九水合物用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。(9)肌醇，也称为环己烷-1,2,3,4,5,6-己醇。在一个具体实例中，使用的肌醇是肌肉-肌醇(myo-Inositol)，也称为1,2,3,4,5,6-六羟基环己烷，i-肌醇或内消旋-肌醇。肌肉-肌醇在真核细胞中作为许多次级信使的结构基础起着重要作用。此外，肌醇作为结构脂质磷脂酰肌醇(PI)及其各种磷酸盐——磷脂酰肌醇磷酸盐(PIP)脂质的重要组分。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的肌醇浓度为约1mg/L至约40mg/L、或约5mg/L至约35mg/L、或约7.5mg/L至约30mg/L、或约10mg/L至约25mg/L、或约12.5mg/L至约20mg/L、或约15mg/L至约17.5mg/L、或约1、2.5、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40mg/L。在一个具体实例中，浓度为7.2mg/L的肌肉-肌醇在用于肝巨噬细胞培养基的基础培养基中使用。(10)碳补充剂。在一个实例中，碳补充剂是丙酮酸钠，其通常作为葡萄糖之外的碳源提供。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的碳补充剂的浓度为约20mg/L至约600mg/L、或约30mg/L至约550mg/L、或约40mg/L至约500mg/L、或约50mg/L至约450mg/L、或约60mg/L至约400mg/L、或约70mg/L至约350mg/L、或约80mg/L至约300mg/L、或约90mg/L至约250mg/L、或约100mg/L至约200mg/L、或约110mg/L至约190mg/L、或约120mg/L至约180mg/L、或约130mg/L至约170mg/L、或约140mg/L至约160mg/L、或约25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或600mg/L。在一个具体实例中，浓度为110mg/L的丙酮酸钠用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。(11)锰补充剂，优选为可溶形式。这种锰补充剂的一个具体实例是氯化锰(II)。在一个具体实例中，所用的氯化锰(II)是氯化锰四水合物(MnCl₂·4H₂O)的形式。锰补充剂通常以痕量添加到基础培养基中，例如其浓度为约1×10^-5至约3×10^-4mg/L、或约2×10^-5至约2.5×10^-4mg/L、或约3×10^-5至约2×10^-4mg/L、或约4×10^-5至约1.5×10^-4mg/L、或约5×10^-5至约1×10^-4mg/L、或约6×10^-5至约9×10^-5mg/L、或约7×10^-5至约8×10^-5mg/L、或约1×10^-5、2.5×10^-5、5×10^-5、7.5×10^-5、1×10^-4、1.5×10^-4、2×10^-4、2.5×10^-4或3×10^-4mg/L。在一个具体实例中，浓度为5×10^{- 5}mg/L的氯化锰(II)用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。(12)葡萄糖，其是一种用作细胞的主要能量来源的可溶性己糖。D-葡萄糖是动物细胞使用的天然形式。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的葡萄糖浓度为约2g/L至约25g/L、或约3g/L至约22.5g/L、或约4g/L至约20g/L、或约5g/L至约18g/L、或约6g/L至约16g/L、或约7g/L至约14g/L、或约8g/L至约12g/L、或约9g/L至约10g/L、或约2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、22.5或25g/L。在一个具体实例中，浓度为4.5g/L的葡萄糖用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。这种高葡萄糖水平在无血清培养基或低血清培养基中特别有用。

在一个具体实例中，肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基是Advanced DMEM培养基。

根据要进行的实验、讨论中的细胞类型以及细胞的所需状态(饥饿或其他)需要时，任何细胞培养基也可以补充有其他组分。在一些实例中，基础培养基适于培养单核细胞。在一些其他实例中，基础培养基适于培养肝细胞。在一些其他实例中，基础培养基适于培养巨噬细胞，特别是肝巨噬细胞。使用的补充剂可取决于细胞培养基中的血清水平。当细胞培养基是低血清培养基或无血清培养基时，可能需要特殊补充剂。可以使用的细胞培养补充剂的实例是但不限于氨基酸、化学化合物、盐、缓冲盐或试剂、抗生素、抗真菌剂、细胞因子、生长因子、激素、脂质及其衍生物。

基础培养基还可含有用于细胞增殖的补充剂，生长补充剂和/或生长促进剂。

在一个实例中，生长补充剂包括葡萄糖和/或氨基酸摄取的促进剂、和/或脂肪生成和/或细胞内转运的促进剂、和/或蛋白质和/或核酸合成的促进剂。这种促进剂的实例是胰岛素，特别是人重组胰岛素。胰岛素是低血清或无血清培养基中的重要成分。胰岛素支持细胞生长并调节葡萄糖、氨基酸和脂质的细胞摄取和利用。胰岛素还具有抗凋亡特性。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的胰岛素的浓度为约0.5至约100μg/ml、或约1至约95μg/ml、或约2至约90μg/ml、或约3至约85μg/ml、或约4至约80μg/ml、或约5至约75μg/ml、或约6至约70μg/ml、或约7至约65μg/ml、或约8至约60μg/ml、或约9至约55μg/ml、或约10至约50μg/ml、或约12至约45μg/ml、或约14至约40μg/ml、或约16至约35μg/ml、或约18至约30μg/ml、或约20至约25μg/ml、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7,5、8、8,5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、432、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml。在一些具体实例中，任何细胞培养基中的胰岛素的浓度为约1至约10μg/ml。在一个具体实例中，任何细胞培养基中的胰岛素浓度为6.25μg/ml。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的胰岛素浓度为约2mg/L至约50mg/L、或约5mg/L至约45mg/L、或约10mg/L至约40mg/L、或约15mg/L至约35mg/L、或约20mg/L至约30mg/L、或约2、5、8、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5或50mg/L。在一个具体实例中，浓度为10mg/L的人重组胰岛素(全链)用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。

在另一个实例中，生长补充剂是铁载体。铁载体的一个实例是转铁蛋白，特别是全铁转铁蛋白(holo-transferrin)。在一个具体实例中，转铁蛋白是人转铁蛋白，特别是人全铁转铁蛋白。在另一具体实例中，转铁蛋白是牛转铁蛋白，特别是牛全铁转铁蛋白。转铁蛋白促进细胞外铁的储存和运输。转铁蛋白还可以帮助降低氧自由基和过氧化物的毒性水平。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的转铁蛋白的浓度为约0.5至约100μg/ml、或约1至约95μg/ml、或约2至约90μg/ml、或约3至约85μg/ml、或约4至约80μg/ml、或约5至约75μg/ml、或约6至约70μg/ml、或约7至约65μg/ml、或约8至约60μg/ml、或约9至约55μg/ml、或约10至约50μg/ml、或约12至约45μg/ml、或约14至约40μg/ml、或约16至约35μg/ml、或约18至约30μg/ml、或约20至约25μg/ml、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7,5、8、8,5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、432、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml。在一些具体实例中，在任何细胞培养基中转铁蛋白的浓度为约1至约10μg/ml。在一个具体实例中，任何细胞培养基中转铁蛋白的浓度为6.25μg/ml。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中转铁蛋白的浓度为约2.5mg/L至约37.5mg/L、或约5mg/L至约35mg/L、或约7.5mg/L至约32.5mg/L、或约10mg/L至约30mg/L、或约12.5mg/L至约27.5mg/L、或约15mg/L至约25mg/L、或约17.5mg/L至约22.5mg/L、或约2.5mg/L、或约3mg/L、或约4mg/L、或约5mg/L、或约6mg/L、或约7mg/L、或约8mg/L、或约9mg/L、或约10mg/L、或约12mg/L、或约14mg/L、或约16mg/L、或约18mg/L、或约20mg/L、或约22mg/L、或约24mg/L、或约26mg/L、或约28mg/L、或约30mg/L、或约32mg/L、或约34mg/L、或约36mg/L、或约38mg/L。在一个具体实例中，浓度为7.5mg/L的人全铁转铁蛋白用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。

在另一个实例中，生长补充剂是亚硒酸或亚硒酸钠，其是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅助因子，并且在细胞培养基中用作抗氧化剂。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的亚硒酸或亚硒酸钠的浓度为约0.5至约100ng/ml、或约1至约95ng/ml、或约2至约90ng/ml、或约3至约85ng/ml、或约4至约80ng/ml、或约5至约75ng/ml、或约6至约70ng/ml、或约7至约65ng/ml、或约8至约60ng/ml、或约9至约55ng/ml、或约10至约50ng/ml、或约12至约45ng/ml、或约14至约40ng/ml、或约16至约35ng/ml、或约18至约30ng/ml、或约20至约25ng/ml、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7,5、8、8,5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、432、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中亚硒酸钠的浓度为约1ng/ml至约25ng/ml、或约2ng/ml至约22.5ng/ml、或约3ng/ml至约20ng/ml、或约4ng/ml至约17.5ng/ml、或约5ng/ml至约15ng/ml、或约7.5ng/ml至约12.5ng/ml、或约2.5ng/ml、或约5ng/ml、或约7.5ng/ml、或约10ng/ml、或约12ng/ml、或约14ng/ml、或约16ng/ml、或约18ng/ml、或约20ng/ml、或约22ng/ml、或约24ng/ml、或约25ng/ml。在一个具体实例中，浓度为5ng/ml的亚硒酸钠用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。

胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸通常用作生长补充剂混合物。

在一个实例中，生长补充剂是球状非糖基化血清蛋白。这种球状非糖基化血清蛋白的一个实例是白蛋白。牛血清白蛋白由于其稳定性和在生物反应中无干扰而被常用。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的球形非糖基化血清蛋白的浓度为约0.5至约50mg/ml、或约1至约45mg/ml、或约1.5至约40mg/ml、或约2至约35mg/ml、或约2.5至约30mg/ml、或约3至约25mg/ml、或约3.5至约20mg/ml、或约4至约15mg/ml、或约4.5至约10mg/ml、或约5至约9.5mg/ml、或约5.5至约9mg/ml、或约6至约8.5mg/ml、或约7至约8mg/ml、或约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mg/ml。在一些具体实例中，任何细胞培养基中的球状非糖基化血清蛋白的浓度为约1至约5mg/ml。在一个具体实例中，任何细胞培养基中的球状非糖基化血清蛋白的浓度为1.25mg/ml。

在另一个实例中，生长补充剂是脂肪酸，特别是前列腺素和细胞膜生物合成中必需的多不饱和脂肪酸。这种脂肪酸的实例包括n-3、n-6和n-9家族的脂肪酸。一个实例是亚油酸，它是一种不是由动物细胞合成的n-6不饱和脂肪酸，因此需要补充，特别是对于无血清或低血清培养基。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的脂肪酸的浓度为约0.5至约100μg/ml、或约1至约95μg/ml、或约2至约90μg/ml、或约3至约85μg/ml、或约4至约80μg/ml、或约5至约75μg/ml、或约6至约70μg/ml、或约7至约65μg/ml、或约8至约60μg/ml、或约9至约55μg/ml、或约10至约50μg/ml、或约12至约45μg/ml、或约14至约40μg/ml、或约16至约35μg/ml、或约18至约30μg/ml、或约20至约25μg/ml、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7,5、8、8,5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、432、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml。在某些特定的实例中，任何细胞培养基中脂肪酸的浓度为约1至约10μg/ml。在一个具体实例中，任何细胞培养基中脂肪酸的浓度为5.35μg/ml。

在另一个实例中，生长补充剂是谷氨酰胺补充剂。谷氨酰胺支持具有高能量需求并合成大量蛋白质和核酸的细胞的生长。它是快速分裂细胞和无效率地使用葡萄糖的细胞的替代能源。细胞需要氮原子来构建分子例如核苷酸、氨基酸、氨基糖和维生素。铵是无机氮源，在生理pH主要作为带正电荷的阳离子NH4+存在。细胞使用的铵氮最初是作为谷氨酸的胺或谷氨酰胺的酰胺掺入有机氮中。这两种氨基酸为蛋白质、核酸和其他含氮化合物的合成提供了氮的主要储库。谷氨酰胺补充剂的实例包括L-谷氨酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为约0.1％至约10％质量/体积、或约0.2％至约9.5％质量/体积、或约0.3％至约9％质量/体积、或约0.4％至约8.5％质量/体积、或约0.5％至约8％质量/体积、或约0.6％至约7.5％质量/体积、或约0.7％至约7％质量/体积、或约0.8％至约6.5％质量/体积、或约0.9％至约6％质量/体积、或约1％至约5.5％质量/体积、或约1.1％至约5％质量/体积、或约1.2％至约4.5％质量/体积、或约1.3％至约4％质量/体积、或约1.4％至约3.5％质量/体积、或约1.5％至约3％质量/体积、或约1.6％至约2.5％质量/体积、或约1.7％至约2％质量/体积、或约1.8％至约1.9％质量/体积、或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10％质量/体积。在一些具体实例中，任何细胞培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为约0.5至约2％质量/体积。在一个具体实例中，任何细胞培养基中的谷氨酰胺补充剂的浓度为1％质量/体积。

用于补充细胞培养基的缓冲剂通常必须是化学和酶稳定的，对生化反应的影响有限，具有高溶解度，高膜不可渗透性，具有非常低的可见光和紫外光吸收以及介于6.0和8.0之间的pKa值。一种常用的缓冲剂是HEPES缓冲剂((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))，它是一种两性离子有机化学缓冲剂，尽管二氧化碳浓度(由细胞呼吸产生)发生变化，但仍有效维持生理pH值。在一些实例中，本文使用的任何细胞培养基中的缓冲剂的浓度为约0.1％至约10％质量/体积、或约0.2％至约9.5％质量/体积、或约0.3％至约9％质量/体积、或约0.4％至约8.5％质量/体积、或约0.5％至约8％质量/体积、或约0.6％至约7.5％质量/体积、或约0.7％至约7％质量/体积、或约0.8％至约6.5％质量/体积、或约0.9％至约6％质量/体积、或约1％至约5.5％质量/体积、或约1.1％至约5％质量/体积、或约1.2％至约4.5％质量/体积、或约1.3％至约4％质量/体积、或约1.4％至约3.5％质量/体积、或约1.5％至约3％质量/体积、或约1.6％至约2.5％质量/体积、或约1.7％至约2％质量/体积、或约1.8％至约1.9％质量/体积、或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10％质量/体积。在一些具体实例中，任何细胞培养基中缓冲剂的浓度为约0.5至约2％质量/体积。在一个具体实例中，任何细胞培养基中缓冲剂的浓度为1.5％质量/体积。

在一个实例中，氨基酸是但不限于异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸、丝氨酸、其组合和衍生物。在一个实例中，氨基酸是谷氨酰胺。根据需要，本文列出的氨基酸可以以L-或D-立体异构体提供。在一个实例中，谷氨酰胺补充剂是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。在另一具体实例中，氨基酸是丙氨酸，特别是L-丙氨酸。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中L-丙氨酸的浓度为约1mg/L至约50mg/L、或约2.5mg/L至约45mg/L、或约5mg/L至约40mg/L、或约7.5mg/L至约35mg/L、或约10mg/L至约30mg/L、或约12.5mg/L至约27.5mg/L、或约15mg/L至约25mg/L、或约17.5mg/L至约22.5mg/L、或约5mg/L、或约8mg/L、或约10mg/L、或约12mg/L、或约14mg/L、或约16mg/L、或约18mg/L、或约20mg/L、或约22mg/L、或约24mg/L、或约26mg/L、或约28mg/L、或约30mg/L、或约32mg/L、或约34mg/L、或约36mg/L、或约38mg/L、或约40mg/L、或约42mg/L、或约44mg/L、或约46mg/L、或约48mg/L、或约50mg/L。在一个具体实例中，浓度为8.9mg/L的L-丙氨酸用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。

在一个实例中，抗真菌剂是但不限于两性霉素B、克霉唑(clotimazol)、制霉菌素及其组合。

在另一个实例中，抗生素是但不限于氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、多粘菌素B、放线菌素、博来霉素、环己酰胺、遗传霉素(G148)、潮霉素B、丝裂霉素C及其组合。在一个实例中，抗生素是青霉素。在另一个实例中，抗生素是链霉素。在又一个实例中，抗生素是青霉素和链霉素。在一个实例中，抗生素是庆大霉素。

在一个实例中，盐、缓冲盐或试剂是但不限于氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸氢钠(Na₂HPO₄)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄)、氯化钙(CaCl₂)、氯化钙(CaCl₂ x 2H₂O)、碳酸氢钠(NaHCO₃)及其组合。在一个具体实例中，缓冲剂是碳酸氢钠(NaHCO₃)。在一些实例中，用于肝巨噬细胞培养物的基础培养基中的碳酸氢钠浓度为约0.5g/L至约20g/L、或约1g/L至约18g/L、或约2g/L至约16g/L、或约3g/L至约16g/L、或约4g/L至约14g/L、或约5g/L至约12g/L、或约6g/L至约10g/L、或约7g/L至约9g/L、或约0.5g/L、或约1.5g/L、或约2.5g/L、或约3.5g/L、或约4.5g/L、或约5.5g/L、或约6.5g/L、或约7.5g/L、或约8.5g/L、或约9.5g/L、或约10.5g/L、或约11.5g/L、或约12.5g/L、或约13.5g/L、或约14.5g/L、或约15.5g/L、或约16.5g/L、或约17.5g/L、或约18.5g/L、或约19.5g/L。在一个具体实例中，浓度为3.7g/L的碳酸氢钠用于肝巨噬细胞培养基中使用的基础培养基中。

如本文所用的术语“低血清”是指低于通常使用的血清水平的血清水平。例如，细胞培养中常用的血清水平为10％。因此，“低血清”水平可以指血清水平低于10％，例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、或约0.1％至约0.5％、约0.5％至约1.0％、约1.0％至约1.5％、约1.5％至约2.0％、约2.0％至约2.5％、约2.5％至约3.0％、约3.0％至约3.5％、约3.5％至约4.0％、约4.0％至约4.5％、约4.5％至约5.0％、约5.0％至约6.0％、约6.0％至约7.0％、约7.0％至约8.0％、约8.0％至约9.0％、或约9.0％至约9.5％、或约9.5％至约10％。在一些具体实例中，低血清水平是指0.1％至约10％的血清水平。在一些具体实例中，低血清水平是指0.1％至5％的血清水平。

在一些实例中，在单核细胞附着期间，例如在于肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞的至少第一天期间、或至少头12小时至24小时、或至少头两天、或至少头24至36小时、或至少头36至48小时，在第一和/或第二方面的方法中的基础培养基中使用约0.1％至约10％、或约0.1％至约9％、或约0.1％至约8％、或约0.1％至约7％、或约0.1％至约6％的血清水平。在单核细胞附着后，基础培养基中的血清水平可以但不需要进一步降低，或者可以使用无血清基础培养基。因此，在一些实例中，在干细胞衍生的单核细胞附着后，例如在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞的第一天之后、或者头12小时至24小时之后、或者头两天之后、或者头24小时至36小时之后、或者头36至48小时之后，在第一和/或第二方面的方法中的基础培养基中使用0％至约5％、或0％至约4％、或0％至约3％、或0％至约2％、或0％至约1％、0％至约0.5％、或0％至约0.1％的血清水平。在一些其他实例中，在干细胞衍生的单核细胞附着后，例如在肝巨噬细胞培养基中培养干细胞衍生的单核细胞的第一天之后、或者头12小时至24小时之后、或者头两天之后、或者头24小时至36小时之后、或者头36至48小时之后，在第一和/或第二方面的方法中的基础培养基中使用约0.1％至约5％、或约0.1％至约4％、或约0.1％至约3％、或约0.1％至约2％、或约0.1％至约1％、或约0.1％至约0.5％的血清水平。在一个具体实例中，在干细胞衍生的单核细胞附着后，使用的基础培养基是无血清的。

如上所述，在第一方面的方法中使用的肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基。在一些实例中，条件培养基与基础培养基的比例在约10:1至约1:10、或约9:1至约1:9、或约8:1至约1:8、或约7:1至约1:7、或约6:1至约1:6、或约5:1至约1:5、或约4:1至约1:4、或约3:1至约1:3、或约2:1至约1:2。在一些实例中，条件培养基与基础培养基的比例为约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一个具体实例中，条件培养基与基础培养基的比例为约1:1。

在其中低血清基础培养基与肝细胞条件培养基以1:1的比例混合并且所得培养基用于培养单核细胞以获得肝巨噬细胞的具体实例中，可观察到获得的肝巨噬细胞的细胞分化增加和/或细胞附着增强。

如本文所用，术语“细胞外基质”或“ECM”是指细胞分泌的细胞外分子的集合，其为周围细胞提供结构和生物化学支持。细胞粘附、细胞间通讯和分化是ECM的常见功能。基质材料可包括聚L-赖氨酸、层粘连蛋白、明胶、胶原蛋白、角蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素或层粘连蛋白、I型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白1的混合物及其衍生物或片段。

如本文所用的术语“饲养细胞”是指提供细胞外分泌以促进干细胞或单核细胞生长的细胞层。饲养细胞不能分裂，因此它不同于共培养系统，因为只有一种类型的细胞(例如干细胞或单核细胞)能够增殖。饲养细胞的典型实例是成纤维细胞，其是结缔组织中最常见的细胞。无饲养细胞培养系统的一个优点是它消除了饲养细胞分泌的不确定的生物活性分子。

在第三方面，提供了用于从单核细胞衍生肝巨噬细胞的试剂盒，其包含条件培养基和基础培养基，其中条件培养基包含在细胞外基质存在下在无血清细胞培养基中培养1至7天后由肝细胞分泌的因子。

在一些实例中，试剂盒中的基础培养基适于用作低血清基础培养基。在一个实例中，试剂盒可以进一步包含未使用细胞外基质包被的细胞培养装置。在一些其他实例中，试剂盒可以进一步包含用于基础培养基的任何以下补充剂：胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、白蛋白、脂肪酸、谷氨酰胺补充剂和缓冲剂。

在一些实例中，第三方面的试剂盒中的条件培养基和基础培养基可以在零下(摄氏度)温度储存。例如，当将培养基长期储存超过6个月时，储存温度可为约-60℃至约-90℃、或约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-85℃或约-90℃。在一个具体实例中，将培养基储存在约-80℃以进行长期储存。当储存用于短期使用时，可以将培养基储存在约-10℃至约-30℃、或约-10℃、约-15℃、约-20℃、约-25℃或约-30℃。

本申请提供的用于衍生肝巨噬细胞的改进的培养基和方法将适用于其中肝巨噬细胞有用的所有技术。特别重要的是使用本文提供的培养基和方法来衍生类似于原代库普弗细胞、特别是原代人库普弗细胞的特征和功能的肝巨噬细胞。原代库普弗细胞、特别是原代人库普弗细胞的可用性有限，这导致这种细胞昂贵。与原代人库普弗细胞相比，更容易扩大使用如本文所述的培养基和方法获得的肝巨噬细胞的数量。例如，使用如本文所述的培养基和方法，可以在约2周、或约1周、或约12天、约10天、约8天、约6天或约4天内从多能衍生的单核细胞获得肝巨噬细胞。与不能在体外扩繁的原代人库普弗细胞相反，使用如本文所述的培养基和方法获得的肝巨噬细胞可以在体外扩繁。当肝巨噬细胞必须与从同一患者获得的肝细胞一起使用时(例如在共培养研究或移植中)，如本文所述的培养基和方法还使得有可能使用从患者获得的多能干细胞产生肝巨噬细胞。当从不同受试者获得肝细胞和库普弗细胞时，这将有助于最小化或消除存在的背景免疫应答。

除非上下文另有明确说明，如本文所用的，单数形式“一”、“一个/一种”和“该/所述”包括复数指代。例如，术语“引物”包括多种引物，包括其混合物。

如本文所用的，在制剂组分浓度的上下文中，术语“约”通常意指所述值的+/-5％、更通常为所述值的+/-4％、更通常为所述值的+/-3％、更通常为所述值的+/-2％、甚至更通常为所述值的+/-1％、甚至更通常为所述值的+/-0.5％。当在持续时间的上下文中使用时，术语“约”通常意指所述时间的+/-20％，更通常为所述时间的+/-15％，更通常为所述时间的+/-10％。更通常为所述时间的+/-5％，甚至更通常为所述时间的+/-2％，甚至更通常为所述时间的+/-1％。例如，当所述持续时间为1天时，术语“约1天”可以指1天+/-0至6小时。作为另一个实例，当所述持续时间为1小时时，术语“约1小时”可以指1小时+/-0至10分钟。

贯穿本公开内容，可以以范围形式公开某些实例。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所公开范围(range)的范围(scope)的刚性限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1至6等范围的描述具有具体公开的子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数字例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，本文使用的术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，但认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的其中具体体现的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内的。

在本文中广泛和一般地描述了本发明。落入通用公开内容中的每个较窄种类和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或否定限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体记载了被移除的材料。

其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员亚组的形式描述实验部分

以下实施例说明了通过其可以实施本发明方面的方法或者可以制备适合于实施本发明某些实施方案的材料。

实施例1--针对hPSC-KC的分化的培养条件的优化

根据Wilgenburg等人描述的方法从iPSC-IMR90分化hPSC衍生的单核细胞(hPSC-Mon)。初步结果显示胚状体(EB)可以在无血清和无饲养细胞条件下在培养中形成和维持(图1A)。EB在2周内贴壁，单核细胞可在培养约18天时产生。可以从分化培养物的上清液每周收获这些单核细胞。

从上清液中收集hPSC-Mon并将其分化成肝巨噬细胞(hPSC-KC)(图1A)。hPSC-Mac用作对照以分析非肝巨噬细胞和肝巨噬细胞(KC)之间的相似性和差异。结果显示hPSC-Mon可以分化成贴壁的hPSC-KC(图1A)。

为了将hPSC-Mon分化成hPSC-KC，用包含1:1比例的PHHCM和Advanced DMEM(低血清)的培养基处理hPSC-Mon(图1A)。Advanced DMEM含有0.5％青霉素/链霉素(10,000U/mL/(10,000μg/mL)，含人重组胰岛素(6.25μg/ml)、人转铁蛋白(6.25μg/ml)、亚硒酸(6.25μg/mL)、牛血清白蛋白(BSA)-(1.25mg/mL)和亚油酸(5.35μg/mL)的1X ITS+，2mM GlutaMAX^TM和15mM HEPES缓冲液。将0.1至10％FBS添加到该培养基中仅用于细胞附着，并从细胞培养的第二天减少至0-5％。

将hPSC-KC的形态与PHKC进行比较(图1B)。hPSC-KC的直径和表型与PHKC的直径和表型相似。总体而言，结果显示hPSC-KC可以使用PHHCM和优化的培养条件从hPSC-Mon产生。

实施例2--hPSC-KC的标志物表达

在产生hPSC-KC后，通过基因表达和免疫染色分析细胞的标志物表达。F4/80已被记录为小鼠库普弗细胞的代表性标志物，但不是人细胞的代表性标志物。最近，CD14与库普弗细胞的CD32、CD68和CD11亚群的分类的组合已被用于定义人中的库普弗细胞。此外，CD163已被用作激活的巨噬细胞的标志物。因此，通过基因表达研究检查了这些标志物在hPSC-Mac和hPSC-KC中的表达。结果显示hPSC-KC以与PHKC相当的水平表达CD14、CD163和CD32(图2A)。hPSC-KC中的CD68和CD11表达约为PHKC的30％。通过免疫染色证实了标志物表达(图2B)。

实施例3--激活后hPSC-KC产生的细胞因子与PHKC相似但与不同

为了激活hPSC-KC以检查细胞因子的产生，在培养的最后16小时期间将脂多糖(LPS)加入培养基中。在孵育期结束时收集培养基，并分析LPS激活后的形态变化和细胞因子产生。结果显示LPS激活在和hPSC-KC中诱导了从圆形到扁平和铺展的细胞的典型形态变化(图3A)。重要的是，hPSC-KC中的倍数诱导与PHKC的倍数诱导(25倍)在相同范围内(图3B)。原代人肝细胞(PHH)中IL-6的产生低于可检测水平。hPSC-KC中TNF4α产生的倍数增加(33倍)类似于PHKC中的倍数增加(35倍)(图3C)。LPS激活后PHH中TNF4α的产生低于可检测水平。与PHKC和hPSC-KC相比，/>产生高得多水平的细胞因子，这在非肝巨噬细胞中是典型的(图3B和图3C)。

实施例4--PHKC和hPSC-KC之间的标志物和功能相似性以及与的差异

在确认hPSC-KC在LPS刺激后表达巨噬细胞标志物并产生细胞因子后，目的在于分析hPSC-KC和之间的标志物和功能差异。关于巨噬细胞和KC之间标志物表达差异的报道有限。CLEC-4F是C型凝集素的成员，是与其他巨噬细胞相比在库普弗细胞中差异表达的唯一报道的标志物。因此，分析了/>和hPSC-KC在CLEC-4F表达方面是否不同。结果显示CLEC-4F在hPSC-KC和PHKC中表达，但在/>中不表达(图4A)。关于库普弗细胞和巨噬细胞之间的功能差异的报道表明，与其他巨噬细胞相比，库普弗细胞显示更高程度的吞噬作用和更低水平的细胞因子产生。关于细胞因子产生的结果已经证明，与/>相比，hPSC-KC产生较低水平的IL-6和TNF4α(图3B和3C)。接下来，检查hPSC-Mac和hPSC-KC中吞噬作用的水平是否不同。将hPSC-KC、/>和PHKC与荧光珠子一起孵育1小时，并使用荧光显微镜分析吞噬珠子的数量。结果显示所有三种细胞类型都吞噬珠子(hPSC-KC和PHKC，图4B；/>数据未显示)。细胞摄取的珠子的定量显示，与/>(54％)相比，hPSC-KC具有更高的吞噬珠子的细胞百分比(82％)(图4B)。与/>相比，hPSC-KC中细胞摄取的珠子的平均数量也更高(图4C)。与hPSC-KC相比，PHKC显示略微更低的吞噬珠子的细胞百分比(63％)和略微更低的摄取的珠子的平均数量，但是这些值仍然高于/>结果表明，与/>相比，hPSC-KC和PHKC在进行吞噬作用方面确实更具活性。

实施例5--在与PHH的共培养物中的hPSC-Mac和hPSC-KC中的差异毒性反应

以前的报道显示当与库普弗细胞共培养时人和大鼠肝细胞中CYP表达和活性的抑制。已报道，当肝细胞与激活的巨噬细胞一起培养时，乙醇诱导的氧化应激会增强。然而，阐明人KC-/Mac-肝细胞共培养物和肝细胞单一培养物之间毒性反应的差异的报道有限。来自Hepregen和Life Technologies等公司的简要报告表明，与肝细胞单一培养物相比，人肝细胞和库普弗细胞的共培养物显示出不同的毒性反应，并且可能是模拟在炎症条件下的肝毒性反应的更相关的模型。因此，分析了是否可鉴定PHH-PHKC共培养物和PHH单一培养物之间在对范例肝毒物的毒性反应上的差异，以及这种差异是否可以在PHH-hPSC-KC或PHH-hPSC-Mac共培养物中重现。将单一培养物和共培养物用范例肝毒物对乙酰氨基酚处理24小时，并使用阿尔玛蓝测定法测量细胞活力。将细胞活力定量为与溶媒对照(DMSO)相比的细胞死亡百分比。结果显示，与单一培养物对照相比，在PHH-PHKC(图5A)和PHH-hPSC-KC(图5B)的共培养物中观察到更高的细胞死亡，这由毒性曲线向左的典型移位表示。在共培养物和PHH单一培养物之间没有观察到细胞死亡的差异(图5C)。这些结果表明PHH-KC可能代表更敏感的肝毒性筛选模型，并且本研究中产生的hPSC-KC可以重现市售PHKC当与PHH共培养时显示的反应。/>

Claims (9)

1.一种从多能干细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括：

(a)培养多能干细胞以获得单核细胞；和

(b)在肝巨噬细胞培养基中培养来自(a)的单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：

(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和

(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中培养多能干细胞还包括：

(i)培养多能干细胞以获得胚状体；和

(ii)分化胚状体以获得单核细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多能干细胞是经诱导的多能干细胞。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述基础培养基是低血清基础培养基。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞包括在不存在细胞外基质的情况下在所述肝巨噬细胞培养基中培养所述单核细胞。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述条件培养基与所述基础培养基的比例在10:1至1:10的范围。

7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述条件培养基与所述基础培养基的比例是1:1。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述低血清基础培养基中的血清水平为0.1％至10％的百分比。

9.一种从经诱导的多能干细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括：

(a)培养所述经诱导的多能干细胞以获得单核细胞；和

(b)在不存在细胞外基质的情况下，在肝巨噬细胞培养基中培养来自(a)的单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，并且其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：

(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和

(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。