CN111849859B - 一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用,具体地,本发明提供了一种肝实质细胞的制备方法,包括步骤:在第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下,在培养体系中培养经基因编辑的内胚层干细胞,从而获得功能性的肝实质细胞。本发明的功能性的肝实质细胞具有非常高的分化率和纯度,并且,本发明的肝实质细胞还具有治疗肝脏相关疾病的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和细胞治疗领域。具体地,本发明涉及一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用。
背景技术
Wilson’s disease是一种常染色体隐性遗传疾病,与其相关的基因ATP7B编码的是一种P型ATPase,参与细胞内Cu2+的转运。而Wilson’s disease病人ATP7B基因发生异常,导致Cu2+无法正常排泄而在肝脏、脑等组织的大量积累进而引发肝损伤及脑部豆状核变性等。WD的世界范围发病率为1/30 000~1/100 000,在中国较多见。
目前关于Wilson’s disease的治疗主要有药物和肝移植治疗,前者往往只能起到缓解作用并且存在较大的毒副作用和药物依赖性,后者则受制于合适的供体肝源。因此,发展新型的细胞替代治疗,尤其是病人特异性细胞治疗,具有极其重大的临床意义。
WD动物模型Long Evans Cinnamon (LEC)大鼠经移植正常大鼠的原代肝实质细胞后,能够改善其铜离子排泄功能,恢复正常肝功并长期存活,但目前利用人源肝实质细胞治疗WD动物尚无报道。临床实验表明,人原代肝实质细胞移植治疗Crigler–Najjar syndrometype 1等遗传代谢性肝病有效,但受制于供体的匮乏。这表明,肝实质细胞移植治疗包括WD等在内的遗传代谢性肝病在临床上具有一定的可行性,但目前人原代肝实质细胞的获取受限,且异体细胞移植需要长期服用免疫抑制剂。
目前关于Wilson’s disease的治疗主要有两种途径:一、药物性治疗,包括D-penicilillamine、Trientine、Tetrathiomolybdate等,这些药物主要是起到螯合铜从而促进其排泄的作用,此外像Zinc这种药物能够抑制机体对外来铜离子的吸收达到一定的治疗效果(Roberts and Schilsky, 2003)。然而,这些化学药物往往能引起一定的毒副作用,并且具有很强的药物依赖性,无法从根本上治愈;二、肝移植治疗,肝移植治疗被认为可应用于所有对其它药物性治疗无效的Wilson’s disease患者,也是目前治疗急性肝衰竭唯一有效的方法,但长期以来受制于供体肝的稀缺。
因此,本领域迫切需要开发一种特异性针对WD疾病的肝实质细胞的分化方法。
发明内容
本发明公开了一种特异性针对WD疾病的肝实质细胞的分化方法。
在本发明第一方面,提供了一种肝实质细胞的制备方法,包括步骤:
(a) 在第一培养条件下,在培养体系中培养内胚层干细胞,从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞;所述内胚层干细胞为经基因编辑的细胞;
(b) 在第二培养条件下,在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞,从而获得肝母细胞;和
(c)在第三培养条件下,在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞,从而获得肝实质细胞。
在另一优选例中,所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。
在另一优选例中,所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点:
其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列(NG_008806)。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞中的ATP7B具有选自下组的一个或多个氨基酸残基突变:
其中,氨基酸位置编号基于野生型人ATP7B蛋白序列(NP_000044)。
在另一优选例中,所述内胚层干细胞来源于WD病人。
在另一优选例中,用选自下组的一种或多种方法对所述内胚层干细胞进行基因编辑:CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、ABE、CBE、或其组合。
在另一优选例中,所述的内胚层干细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。
在另一优选例中,所述多能干细胞选自下组:人胚胎干细胞系(如H9、Hes2)、人诱导多能干细胞系(如ZGY-iPSCs、MT25iPSCs、WT6iPSCs)、或其组合。
在另一优选例中,所述的内胚层干细胞选自下组:H9、Hes2、ZGY-iPSC EnSC、MT25iPSC EnSC、WT6iPSC EnSC、或其组合。
在另一优选例中,所述内胚层干细胞通过如下方法获得:
(a1)在适合培养的条件下,在培养体系中培养诱导多能干细胞,从而获得定型内胚层细胞(DE),其中,所述诱导多能干细胞包括经基因编辑的细胞;
(a2)在适合培养的条件下,在培养体系中培养步骤(a1)获得的定型内胚层细胞,从而获得内胚层干细胞。
在另一优选例中,所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。
在另一优选例中,所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点:
其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列(NG_008806)。
在另一优选例中,所述诱导多能干细胞来源于WD病人。
在另一优选例中,所述诱导多能干细胞选自下组:ZGY-iPSCs、MT25iPSCs、WT6iPSCs、或其组合。
在另一优选例中,所述步骤(a1)中,所述培养体系含有定型内胚层分化培养基。
在另一优选例中,所述定型内胚层分化培养基选自下组:RPMI1640、SFD、或其组合。在另一优选例中,所述步骤(a1)中的培养体系还含有选自下组的一种或多种添加物:
ActivinA、CHIR99321/Wnt3A、bFGF、BMP4、VEGF。
在另一优选例中,所述步骤(a2)中的培养体系中,所述定型内胚层细胞的密度为0.5-4×106个细胞/平板,较佳地,1-3×106个细胞/ 平板,更佳地,1-2×106个细胞/平板。
在另一优选例中,所述的定型内胚层细胞具有以下特征:
90%-99%的细胞为定型内胚层细胞特异的表面标志物表达阳性。
在另一优选例中,所述表面标志物选自下组:CD117、CXCR4、或其组合。
在另一优选例中,所述的内胚层干细胞具有选自以下一种或多种特征:
(a) 纯度高,≥95-99%,如100%;
(b) 90%以上的细胞为内胚层干细胞特异的转录因子的表达阳性;
(c)在体外无限扩增;
(d)体内不成瘤;
(e)体外高效分化为功能性肝实质细胞;
(f)由iPS细胞获得病人特异性内胚层干细胞。
在另一优选例中,所述内胚层干细胞特异的转录因子选自下组:SOX17、EOMES、FOXA1、或其组合。
在另一优选例中,所述第一培养条件含有第1A培养基和第1B培养基。
在另一优选例中,所述第1A培养基为内胚层干细胞扩增培养基。
在另一优选例中,所述第1B培养基为诱导内胚层干细胞分化成肝向内胚层的培养基。
在另一优选例中,所述第1A培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中,所述第1B培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中,所述第1A培养基还含有选自下组的一种或多种添加物:
BMP4、bFGF、VEGF、EGF。
在另一优选例中,所述第1B培养基还含有选自下组的一种或多种添加物:
BMP4、bFGF、VEGF、EGF、HGF、TGF、地塞米松(Dexamethasone)、DMSO。
在另一优选例中,所述第二培养条件含有第二培养基。
在另一优选例中,所述第二培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中,所述第二培养条件还含有选自下组的一种或多种添加物:
bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dexamethasone、DMSO、VK1、C-E、A83-01。
在另一优选例中,所述第三培养条件含有第三培养基。
在另一优选例中,所述第三培养基选自下组:SFD、HCM、DMEM/F12、DMEM、或其组合。在另一优选例中,所述第三培养条件还含有选自下组的一种或多种添加物:
HGF、OSM、Dexamethasone、DMSO、VK1、C-E、A83-01、EGFi。
在另一优选例中,在步骤(a)中,将内胚层干细胞在第一培养条件下培养3-12天,较佳地,4-10天,更佳地,4-8天。
在另一优选例中,在步骤(b)中,将肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞在第二培养条件下培养4-12天,较佳地,4-10天,更佳地,4-8天。
在另一优选例中,在步骤(c)中,将肝母细胞在第三培养条件下培养8-24天,较佳地,10-18天,更佳地,11-15天。
在另一优选例中,所述方法具有选自下组的一个或多个特征:
(i)高肝实质细胞分化率,所述分化率为80-98%,较佳地,90-95%;
(ii)在培养过程中,每1ml的培养液中接种1×106个内胚层干细胞,可产生5-10×106个肝实质细胞;
(iii)三维悬浮分化系统,可进行规模化扩增与分化。
在另一优选例中,在步骤(a)-(c)中,所述培养体系中还含有促进分化的其他物质,选自下组:基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(BasementMembrane Extracts)、或其组合。
在另一优选例中,所述方法包括治疗性和非治疗性的。
在另一优选例中,所述的培养体系中,内胚层干细胞的密度为0.5×106-2×106细胞/ml,较佳地,1×106-2×106细胞/ml。
在另一优选例中,所述的培养体系为体积50-125ml,较佳地80-125ml,最佳地为80-100ml。
在另一优选例中,所述的获得的肝实质细胞的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为3-10,较佳地4-8,更佳地5-7。
在另一优选例中,所述肝实质细胞为功能性肝实质细胞。
本发明第二方面提供了一种肝实质细胞,所述肝实质细胞为经基因编辑的细胞,并且所述肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊,其中,所述肝实质细胞的球囊直径大小300-500 μm,球囊表面肝实质细胞大小80-100 μm,细胞层厚度8-15 μm。
在另一优选例中,所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。
在另一优选例中,所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点:
其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列(NG_008806)。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞中的ATP7B具有选自下组的一个或多个氨基酸残基突变:
其中,氨基酸位置编号基于野生型人ATP7B蛋白序列(NP_000044)。
在另一优选例中,所述肝实质细胞来源于WD病人。
在另一优选例中,所述的肝实质细胞具有选自以下一种或多种特征:
(a) 高纯度的功能性肝实质细胞,ATP7B阳性细胞类群≥90%,较佳地,90-95%;
(b)具有铜离子排泄的功能;
(c) 90-100%的细胞为肝脏特异转录因子HNF4A表达阳性;
(d)80-95% 的细胞为E-cadherin和CYP1A2表达阳性;
(e) 80-90的细胞为肝实质细胞特异分泌蛋白ALB的表达阳性;
(f)85-95%的细胞为AFP表达阳性;
(g)细胞表达肝实质细胞特异的标志物(如ALB、CYP3A4、CYP2C91A2、G6PC、ASGPR1、MRP2、ECRP);
(h)具有积累糖原的功能;
(i)具有吸收并排泄ICG的功能;
(j)具有合成尿素的功能;
(k)具有分泌白蛋白的功能;
(l)具有CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9酶的活性。
在另一优选例中,所述的肝实质细胞由所述方法制备获得。
在另一优选例中,所述的肝实质细胞由内胚层干细胞诱导获得。
本发明第二方面提供了一种本发明第二方面所述的肝实质细胞的用途,用于(i)制备治疗肝脏相关疾病的药物组合物;和/或(ii)筛选治疗肝脏相关疾病的药物。
在另一优选例中,所述经基因纠正的细胞用于制备治疗肝脏相关疾病的药物组合物。
在另一优选例中,所述经基因突变的细胞用于筛选治疗肝脏相关疾病的药物。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型包括注射剂、冻干制剂、溶液制剂。
在另一优选例中,所述肝脏相关疾病选自下组:遗传代谢性肝病、急性肝衰竭、或其组合。
在另一优选例中,所述遗传性肝病选自下组:肝豆状核变性(Wilson’s disease,WD)、糖原累积病Ia型、-抗胰蛋白酶缺乏症、血色病、先天性胆道闭锁、希特林蛋白缺乏症、家族型高胆固醇症、或其组合。
在另一优选例中,所述药物组合物还用于选自下组的一种或多种用途:
(i)恢复哺乳动物铜离子代谢功能;
(ii)降低血清中的ALT和AST水平;
(iii)降低哺乳动物中铜的含量;
(iv)延长哺乳动物的生存时间。
本发明第四方面提供了一种组合物,所述组合物含有本发明第二方面所述的肝实质细胞。
在另一优选例中,所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型包括注射剂、冻干制剂、溶液制剂。
本发明第五方面提供了一种治疗肝脏相关疾病的方法,向需要的对象施用安全有效量的本发明第二方面所述的肝实质细胞、或本发明第四方面所述的组合物。
在另一优选例中,所述的施用包括局部注射施用。
在另一优选例中,所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述非人哺乳动物包括非人灵长类动物(如猴)、或啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了WD病人特异性内胚层干细胞系的建立;其中,
外显子组测序结果揭示所获得的WD病人ATP7B基因上8号外显子存在G>T(R778L)突变,且为杂合突变(R778L/WT)。
WD病人特异性iPSCs的形态图。比例尺:200μm。
WD病人特异性iPSCs表达人类多能干细胞特异的表面标志物组合SSEA3&SSEA4及TRA160&TRA181,纯度为90%以上。
CRISPR/Cas9技术实现ATP7B基因的纠正(T>G,WT/WT)与突变(G>T, R778L/R778L)。
WD病人特异性iPSCs诱导定型内胚层分化(Definitive Endoderm,DE)及建立WD病人特异性EnSCs的策略图。
WD病人特异性iPSCs诱导分化获得的DE形态图。比例尺:200μm。
流式细胞分析表明WD病人特异性iPSCs可高效分化成DE,效率为90%以上。CD117&CXCR4为DE特异的表面标志物组合。
WD病人特异性EnSCs的形态图。比例尺:200μm。
流式细胞分析表明WD病人特异性EnSCs纯度高,表达内胚层干细胞特异的转录因子组合SOX17&EOMES&FOXA1,阳性率为90%以上。
图2显示了WD病人特异性EnSCs体外高效分化为功能性肝实质细胞(Eheps);其中,
WD病人特异性EnSCs体外分化成Eheps的策略图。
免疫荧光实验显示WD病人特异性Eheps表达肝脏特异转录因子HNF4A,成熟肝实质细胞特异蛋白E-cadherin和CYP1A2。比例尺:50μm。
流式细胞表明WD病人特异性Eheps纯度高,肝实质细胞特异分泌蛋白ALB阳性率为78%,AFP阳性率为90&以上。
qPCR实验显示WD病人特异性Eheps表达一系列肝实质细胞特异的标志物。
PAS染色实验表明WD病人特异性Eheps能够积累糖原。比例尺:200μm。
WD病人特异性Eheps能够吸收并排泄ICG。比例尺100μm。
WD病人特异性Eheps能够合成尿素。
WD病人特异性Eheps能够分泌胆汁酸。
WD病人特异性Eheps能够分泌白蛋白。
WD病人特异性Eheps具有CYP3A4酶活性并被利福平(Rif)诱导。
WD病人特异性Eheps能够分泌具有CYP1A2酶活性并被兰索拉唑(Lan)诱导。
WD病人特异性Eheps具有CYP2C9酶活性并被利福平(Rif)诱导。
图3显示了WD病人特异性Eheps体外模拟WD铜离子代谢障碍的表型。其中,
qPCR实验表明不同基因型(ATP7BR778L/R778L;ATP7BR778L/WT;ATP7BWT/WT)的Eheps均表达ATP7B,且在RNA水平上无差异。
流式细胞表明WD病人特异性Eheps为ATP7B+,阳性率为93%。
不同基因型(ATP7BR778L/R778L;ATP7BR778L/WT;ATP7BWT/WT)的Eheps在500μM Cu2+处理3hrs后细胞铜离子积累情况。ATP7BR778L/R778L与ATP7BR778L/WT的Eheps内有明显的铜离子积累。
不同基因型(ATP7BR778L/R778L;ATP7BR778L/WT;ATP7BWT/WT)的Eheps在100μM Cu2+处理24hrs后的形态图。ATP7BR778L/R778L与ATP7BR778L/WT的Eheps出现明显的坏死,ATP7BWT/WT无明显死亡。比例尺:500μm。
不同基因型(ATP7BR778L/R778L;ATP7BR778L/WT;ATP7BWT/WT)的Eheps在100μM Cu2+处理24hrs后细胞球结构完整率。
图4显示了ATP7B纠正过(ATP7BWT/WT)的WD病人特异性Eheps移植后能够部分恢复WD大鼠铜离子代谢功能并改善其生存。其中,
(A) 移植和未移植WD Eheps的ARG大鼠生存曲线。移植WD Eheps能够显著提升ARG大鼠的存活率。
(B)(C) 移植和未移植WD Eheps的ARG大鼠血清ALT与AST水平。移植Eheps后大鼠肝功能能够恢复,其血清ALT与AST水平显著性低于未移植WD Eheps的ARG大鼠。
(D) 移植和未移植WD Eheps的ARG大鼠肝脏HE染色。未移植WD Eheps的ARG大鼠肝脏有明显的肝炎,而移植WD Eheps的大鼠肝脏正常。
(E) 移植和未移植WD Eheps的ARG大鼠肝脏铜离子染色。移植WD Eheps的ARG大鼠肝脏并未检测到明显的铜离子沉淀物。
(F) (G)(H)(I)移植和未移植WD Eheps的ARG大鼠肝铜、尿铜以及血清铜和胆汁铜的检测。移植WD Eheps能部分恢复ARG大鼠的铜离子排泄功能,因此肝铜与尿铜含量比未移植Eheps的ARG大鼠明显下降。铜离子主要通过胆汁排泄,铜离子排泄功能的恢复,也使得胆汁与血清中铜离子含量上升。
(J) 移植与未移植WD Eheps的ARG大鼠血清人源白蛋白含量;HSA,humanserumAlbumin,n=3。
(K) 人源白蛋白免疫荧光染色实验显示移植WD Eheps的ARG大鼠肝脏内能检测到ALB阳性细胞,未移植细胞的大鼠肝脏未发现ALB阳性细胞。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,在本发明的培养体系中培养经基因编辑的内胚层干细胞,能够获得成熟的功能性的且具有特定结构的肝实质细胞,并且本发明的肝实质细胞用于特异性的治疗等肝脏相关疾病或筛选治疗肝脏相关疾病的药物。在此基础上,本发明人完成了本发明。
具体地,本发明人首先建立了ATP7B杂合子(ATP7BR778L/WT)WD病人特异性iPSC系,并利用CRISPR/Cas9技术对ATP7B进行突变或纠正以建立纯合子WD病人特异性iPSC系(ATP7BR778L/R778L; ATP7BWT/WT),随后诱导分化成定型内胚层并建立WD病人特异性EnSC系,然后以WD病人特异性EnSCs为起点采用三维悬浮分化系统规模化制备高纯度的功能性肝实质细胞(Endodermstemcell-derivedhepatocytes,Eheps),最后对ATP7BR778L/WT及ATP7BR778L /R778L的Eheps进行Cu2+处理来模拟WD铜离子代谢障碍表型,而脾脏移植ATP7BWT/WT的Eheps能够部分恢复WD大鼠铜离子排泄功能并提高其生存率。
术语
如本文所用,术语“A83-01”化学式为C25H19N5S,CAS编号为909910-43-6;
“C-E”的化学式C27H24F2N4O3,CAS编号为209986-17-4;
“EGFi”化学式为C22H23N3O4.HCl,CAS编号为183319-69-9;
如本文所用,术语“平板”指各个规格的平板,包括58mm2的平板。
如本文所用,术语“人类内胚层干细胞”、“内胚层干细胞”能互换使用,均指衍生自人类多能干细胞。本文的内胚层干细胞可以来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。
基因突变
基因突变(DNA序列变异,gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换,而引起的基因结构的改变。
基因上发生基因突变的位点即为本文中的突变位点,在突变位点上可以发生碱基的增添、缺失或替换。
如“chr11:g.67051695A>C”表示在人第11号染色体上的g.67051695位点由A突变为了C。
“chr11:g.64577368_64577374(GCGGGTC)>-” 表示在人第11号染色体上的g.64577368至64577374位点的GCGGGTC缺失。
“chr19:g.14938120->T” 表示在人第19号染色体上的g.14938120位点增添了碱基T。
一类典型的基因突变是SNV,即单核苷酸变异,尤其是导致氨基酸突变的SNV。
在本发明中,“c.2333G>T”指在第13号染色体上的2333位点的G突变为T。
在本发明中,“c.2621C>T”指第13号染色体上的2621位点的C突变为T。
在本发明中,“c.2975C>T”指第13号染色体上的2975位点的C突变为T。
此外,在本发明中,还存在氨基酸突变的情况。
如“p.R778L”指ATP7B蛋白的第778位的精氨酸突变为亮氨酸。
肝母细胞
在本发明中,内胚层干细胞在肝向特定因子下形成的具有生成胆管上皮细胞
与肝实质细胞的双潜能肝向祖细胞。
在一优选实施方式中,本发明的肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊,其中,所述肝母细胞的球囊直径大小300-500 μm,球囊表面肝母细胞大小60-80 μm,细胞层厚度6-12 μm。
肝实质细胞
在本发明中,肝母细胞在肝实质细胞成熟诱导因子的作用下形成具有肝脏功能
的实质细胞,在本发明中,本发明的肝实质细胞来源WD病人,并且为经基因编辑的肝实质细胞。
在一优选实施方式中,本发明的肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊,其中,所述肝实质细胞的球囊直径大小300-500 μm,球囊表面肝实质细胞大小80-100 μm,细胞层厚度8-15 μm。
内胚层干细胞
在本发明中,人类多能干细胞在定向内胚层特化因子的作用下形成的可在体外
无限增值,并保持内胚层特性的干细胞。
在本发明中,本发明的内胚层干细胞来源WD病人,并且为经基因编辑的内胚层干细胞。
肝实质细胞的诱导培养方法
本发明的肝实质细胞的起始细胞为来源于WD病人的经基因编辑的内胚层干细胞,优选地,在第一培养基(包括第1A培养基和第1B培养基)、第二培养基、第三培养基存在的培养体系中进行共培养,从而获得功能性的具有特定结构的肝实质细胞;其中,所述第1A培养基包括:BMP4、bFGF、VEGF、EGF;第1B培养基包括:BMP4、bFGF、VEGF、EGF、HGF、TGF、Dexamethasone、DMSO;所述第二培养基包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dexamethasone、DMSO、VK1、C-E、A83-01;所述第三培养基包括HGF、OSM、Dexamethasone、DMSO、VK1、C-E、A83-01、EGFi。
在另一优选例中,所述第1A培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中,所述第1B培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中,所述第二培养基选自下组:SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。在另一优选例中,所述第三培养基选自下组::SFD、HCM、DMEM/F12、DMEM、或其组合。在一优选实施方式中,本发明的培养系统还可含有促进分化的其他物质,选自下组:基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
在一优选实施方式中,本发明的人类内胚层干细胞分化为肝实质细胞的方法包括:
内胚层干细胞在Matrigel(Corning, cat#354230)包被的10cm细胞培养板用EnSC培养基进行培养。培养5-6天后,用胰酶消化成单细胞,转入低吸附六孔板(Corning, cat#3471)中震荡培养,所有分化培养基参考以下所示,培养基每两天进行更换。
第1天到第6天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),hBMP4 (50ng/ml); bFGF (10 ng/ml); hVEGF (10 ng/ml), hEGF (10 ng/ml), HGF(25ng/ml),TGFa(20ng/ml), Dexamethasone(40ng/ml),DMSO(1%v/v)。
第6天到第12天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),hBMP4 (50ng/ml); bFGF (10 ng/ml); hVEGF (10 ng/ml), hEGF (20 ng/ml), HGF(25ng/ml),Dexamethasone(40ng/ml),DMSO(1%v/v),OSM(20ng/ml), C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM)。
第12天到第18天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),HGF(25ng/ml),Dexamethasone(40ng/ml),OSM(20ng/ml), C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM),EGFi(2uM)。
第18天到第24天,HCM培养基(Lonza)添加L-Ascorbic Acid PhosphateMagnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10- 4M),Dexamethasone(40ng/ml),C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM),EGFi(2uM)。
所有涉及的小分子化合物都购自Selleck,小分子化合物均参考说明书配制。细胞因子购自RD,溶解方法参照说明书。
在本发明中,基础培养基的选择没有特别限制。
在一优选实施方式中,第一培养基、第二培养基中的基础培养基为SFD (Serumfree differentiation medium),包括以下组分:
75%Iscove的改良Dulbecco’s培养基(IMDM)(Cellgro),添加有1%的N2和B27补充剂(Gibco-BRL),1%青霉素/链霉素,0.05%牛血清白蛋白的25%Ham’s F12培养基(Cellgro)。
在本发明中,第三培养基中的基础培养基为SFD和HCM (hepatocyte culturemedium),其中,HCM培养基可市售获得(Commercial medium: Lonza: CC-4182)(Ogawa,S., Surapisitchat, J., Virtanen, C., Ogawa, M., Niapour, M., Sugamori, K.S.,...&Zhao, B. (2013). Three-dimensional culture and cAMP signaling promotethe maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.Development, 140(15), 3285-3296.)。
肝脏相关疾病
本发明的经基因编辑的肝实质细胞、或其药物组合物可用于治疗肝脏相关疾病(如遗传代谢性肝病(如,肝豆状核变性(也称 Wilson’s disease,WD)、糖原累积病Ia型、-抗胰蛋白酶缺乏症、血色病、先天性胆道闭锁、希特林蛋白缺乏症、家族型高胆固醇症)、急性肝衰竭等等)或筛选治疗肝脏相关疾病的药物。
WD疾病
WD是一种常染色体单基因隐性遗传疾病,具有一定的发病率和较高的死亡率,最早于1912年被Kinnear Wilson描述为渐进式神经退行性疾病。1993年,与其相关的基因ATP7B被鉴定出来,ATP7B编码的是一种P型ATPase,参与细胞内Cu2+的转运。ATP7B在中枢神经系统、乳腺、肾脏、胎盘及肝脏等其他组织中均有表达,但在肝脏的表达水平最高。肝脏是机体铜代谢调节最主要的器官,ATP7B也主要在肝脏内发挥其功能。饮食中的Cu2+在近端小肠被吸收后,经门脉循环进入肝实质细胞,随后Cu2+在胞内重新分布、利用以及排泄。ATP7B主要位于高尔基体反面网络区(Trans-Golgi network,TGN),主要功能是将肝实质细胞中的Cu2+整合至蓝胞浆素(ceruloplasmin)以及参与Cu2+的胆汁排泄途径。此外,ATP7B还参与将Cu2+转运至囊泡,这些囊泡结构最后可能进入溶酶体。而Wilson’s disease病人ATP7B的两个等位基因都发生突变,导致无法表达有功能的Cu2+转运蛋白,引起铜在体内尤其是肝脏和脑部的积累,使肝实质细胞Cu2+浓度及血清中Cu2+含量过高,进而引发肝脏及其他器官的衰竭和脑部结构破坏,导致个体死亡。随后的研究又发现,引发Wilson’s disease的突变在世界不同人群中存在明显的差异。R778L突变主要在中国、日本以及韩国的Wilson’sdisease患者中发现(高达55%),而H1069Q突变是在白人Wilson’s disease患者中比较普遍(约38%)。
组合物
本发明提供了一种包括本发明所述的经基因编辑的肝实质细胞的组合物。
优选地,所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
本发明的药物组合物,包括药学上可接受的载体和有效量活性成分:本发明所述的肝实质细胞。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,“药学上可接受的载体”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应 (如毒性、刺激和变态反应) 的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途,用于治疗肝脏相关疾病(如遗传代谢性肝病(如,肝豆状核变性(也称 Wilson’s disease,WD)、糖原累积病Ia型、-抗胰蛋白酶缺乏症、血色病、先天性胆道闭锁、希特林蛋白缺乏症、家族型高胆固醇症)、急性肝衰竭等)或用于筛选治疗肝脏相关疾病的药物。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明首次发现,在本发明的第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下,在培养体系中培养内胚层干细胞,可获得极高分化率(高达90%)的功能性肝实质细胞,并且本发明的功能性肝实质细胞的纯度也非常高,高达90%。
(2)本发明的经基因编辑的肝实质细胞可特异性的治疗肝脏相关疾病。
(3)本发明首次建立了WD病人特异性EnSC细胞系,其可在体外近乎无限增殖,因此能够获得满足临床应用的包括肝实质细胞在内的衍生细胞。
(4)本发明利用基因编辑技术(如CRISPR/Cas9技术)首次实现杂合子WD病人特异性iPSC ATP7B基因的编辑。与传统通过病毒介导的基因表达方式相比,其更加稳定且不存在免疫原性问题。
(5)本发明WD病人特异性EnSCs为起点进行三维悬浮肝向分化能够获得大量的高纯度的功能性肝实质细胞。
(6)本发明获得的WD病人特异性Eheps功能成熟,纯度高,具有一定的三维组织结构,能够在体外更真实地模拟WD,为揭示WD更为详尽的发病机制与药物筛选提供了理想的体外模型。
(7)本发明移植WD病人特异性ATP7BWT/WT的Eheps首次治疗了WD大鼠。一方面,移植病人特异性细胞在将来临床应用上能够避免免疫排斥反应;另一方面,细胞移植的方式浸润性低,操作简单且安全;再者,WD病人特异性EnSC细胞能够在体外无限扩增并分化为高纯度的功能性肝实质细胞,因此能够满足临床治疗的需要。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另有说明,否则本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
通用材料和方法
1.利用仙台病毒重编程系统(Sendaivirusreprogrammingsystem)建立WD病人特异性iPSCs(如ZGY-iPSC,FHY-iPSC)。
1.1 Wilson病人外周血单核细胞(PBMC)的分离
1)将采集的病人血样本(8mL每人)转移至50ml离心管中,2500rpm 离心8min,降速4。
2)离心后,去除上层血浆,用生理盐水1:1稀释血细胞(全血),总体积约30mL。
血细胞充分混匀后,将30ml血细胞缓慢加入事先预温的淋巴细胞分离液中Ficoll(15ml/管),2500rpm离心30min,降速0。
3)移液管吸弃上清(生理盐水、血浆、血小板等);吸取白膜层,加入50ml离心管中,约30ml/管。
4)将PBMC补充生理盐水至45ml/管,2000rpm,8min离心;
5)弃上清,重悬细胞,补充生理盐水至40ml,1500rpm,8min离心洗涤。1200rpm,8min离心继续洗涤一次。最后1000rpm,8min离心洗涤一次(全血尽量避免低速离心)
6)离心结束后,重悬计数。细胞继续培养或冻存,若继续培养则取1-2×106重悬至2mL PBMC培养基,若冻存则按每管2×106数量即可(冻存液为0.9mLFBS加0.1mL DMSO)。
(7)取部分的WD病人的PBMC细胞,抽提基因组DNA并进行外显子测序,发现鉴定出该病人的ATP7B基因上8号外显子存在G>T(R778L)突变,且为杂合突变(R778L/WT)(图1A)。
1.2 诱导病人PBMCs成iPSCs
1)上述外周血单核细胞培养5天后开始进行病毒感染,感染当天记为第0天。将细胞转入15mL离心管中,并用1Ml QBSF培养基收集贴壁的细胞并一并转入15mL离心管中。300RCF离心10分钟,去上清后加入1mL EM培养基重悬计数。吸取含1.25 x 104– 2.5 x104细胞悬液于96孔板的一个孔中。加入预先混合好的仙台病毒(OCT4, SOX2, KLF4, cMYC; 1:1:1:1,MOI=10),每个孔用EM补齐至200 ul。2250RMP离心90min感染后,转入37度培养箱培养过夜。
2)第1天,收集病毒感染过的细胞,300 RCF离心10min,去上清,用2mLEM重悬,并转入12孔板的一个孔中,继续培养一天。将辐照的MEF种植在1:10 matrigel包被的10-cm培养板上(5×106 MEFs/培养板),6000个感染的外周血单核细胞对应一个10cm培养板。
3)第2天,重新将感染过的外周血单核细胞种植在2)中铺好MEF的细胞培养板上。收集12孔板中的感染过的外周血单核细胞,平均分配并种植到3-4个MEF板,用MEF培养基饲养。
4)第5、7天,用MEF培养基:HES培养基(1:1)继续培养。
5)第9天,补充滋养层MEFs,并用HES培养基培养,每2-3天更换一次培养基。
6)第21至28天,显微镜下无菌操作,挑取形态正常的iPSC克隆于预先铺好MEFs的12孔板中,挑取当代用加入ROCKi的HES培养基培养,传数代后即可建立稳定的病人特异iPSC细胞系。
1.3 WD病人特异iPSC的培养
稳定的病人特异iPSC细胞可在HES培养基中维持,细胞密度达到70%-85%进行传代,WD病人特异性iPSCs可正常传代并维持其干性,结果如图1B和1C所示。
2. CRISPR/Cas9 基因编辑 WD iPSCs
WD iPSCs 传至六孔板,次日细胞密度能达到50%-60%,转染前用PBS清洗3遍,改用不含抗生素的培养基培养,传代24小时候开始转染pST1374-Cas9(2μg/孔),pGL3-U6-sgRNA(2μg/孔)及加入相应的单链DNA作为模板(10μM,2ul/孔)。24h之后加药筛选,Puromycin (1μg/ml),Blastcidin(10μg/ml)双药筛。72小时后,消化成单细胞,种植再提前铺好MEF的10cm细胞培养板上继续培养,每个培养板2000个细胞。待长出克隆后,挑取克隆传代并测序验证(图1D)。
SgRNA序列:
F(5’CCGGTGTTCATTGCCCTGGGCCTG3’),
R(5’CAAACAGGCCCAGGGCAATGAACA3’)
单链DNA模板序列:
5’AGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCGGTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCC’ 3。
3. WD病人特异EnSC的建立
3.1 诱导定型内胚层分化(图1E)
待iPSC长至85%丰度时(8×106个细胞/平板),按1:2-1:3传代培养(此时不加MEF)。2-3天后,细胞生长至85%以上,PBS洗三遍后,加入定型内胚层分化培养基,具体如下:第0天,RPMI1640基础培养基中加入L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),ActivinA(100ng/ml),CHIR99321(3μM);第1、2天,RPMI1640基础培养基中加入L-AscorbicAcid Phosphate Magnesium(50μg/ml),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),ActivinA(100ng/ml),BMP4(0.25ng/ml), bFGF(5ng/ml), VEGF(10ng/ml);第3、4、5天,SFD基础培养基中加入L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml),L-glutamine(1X,Cellgro),MTG(4.5×10-4M),ActivinA(100ng/ml),BMP4(0.25ng/ml), bFGF(5ng/ml),VEGF(10ng/ml),其分化后的形态如图1F所示,其分化效率如图1G所示。
3.2 WD EnSCs的建立
定型内胚层诱导分化第6天,胰酶消化成单细胞,并用CD117和CXCR4抗体共染30分钟。用ARIA Ⅱ分选出CD117+CXCR4+细胞,种植在预先铺好MEF的matrigel包被的10cm培养板上,每个10cm 培养板种植1.2-2×106细胞,经多次传代即可建立稳定的WD EnSCs,其形态如图1H所示,其纯度如图1I所示。EnSCs维持培养基:在SFD培养基中添加L-AscorbicAcid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X,Cellgro),MTG(4.5×10-4M),hBMP4 (50 ng/ml); bFGF (10 ng/ml); hVEGF (10 ng/ml);hEGF (10 ng/ml) 。所有细胞因子购自RD,EnSCs维持培养基现用现配。
无血清基础培养基(Serum Free Differentiation Medium, SFD):750ml IMDM(Invitrogen cat#: 12200-036) , 250ml Ham’s F12 (Cellgro cat#: 10-080-CV), 5mlN2-SUPPLEMENT(Gibco cat#: 17502-048), 10ml B27(不含RA) (Gibco cat#: 12587-010),5 ml 10% BSA (Sigma)。4度避光保存。
4. WD EnSC 肝向分化(图2A)
内胚层干细胞(1.2-2×106个细胞/平板)在Matrigel(Corning, cat#354230)包被的10cm细胞培养板用EnSC培养基进行培养。培养5-6天后,用胰酶消化成单细胞,转入低吸附六孔板(Corning, cat#3471)中震荡培养,所有分化培养基参考以下所示,培养基每两天进行更换。最终内胚层干细胞扩增12倍。
第1天到第6天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),hBMP4 (50ng/ml); bFGF (10 ng/ml); hVEGF (10 ng/ml), hEGF (10 ng/ml), HGF(25ng/ml),TGFa(20ng/ml), Dexamethasone(40ng/ml),DMSO(1%v/v),分化为经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞。
第6天到第12天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),hBMP4 (50ng/ml); bFGF (10 ng/ml); hVEGF (10 ng/ml), hEGF (20 ng/ml), HGF(25ng/ml),Dexamethasone(40ng/ml),DMSO(1%v/v),OSM(20ng/ml), C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM),分化为肝母细胞,肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊,其中,所述肝母细胞的球囊直径大小400μm,球囊表面肝母细胞大小70 μm,细胞层厚度8μm。
第12天到第18天,SFD培养基添加L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10-4M),HGF(25ng/ml),Dexamethasone(40ng/ml),OSM(20ng/ml), C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM),EGFi(2uM)。
第18天到第24天,HCM培养基(Lonza)添加L-Ascorbic Acid PhosphateMagnesium(50μg/ml,Wako, cat# 013-19641),L-glutamine(1X, Cellgro),MTG(4.5×10- 4M),Dexamethasone(40ng/ml),C-E(0.1uM), A83-01(0.5uM),EGFi(2uM),分化为肝实质细胞,最终得到6×106个细胞/ml的肝实质细胞,所述肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊,其中,所述肝实质细胞的球囊直径大小400μm,球囊表面肝实质细胞大小90 μm,细胞层厚度10μm。
所有涉及的小分子化合物都购自Selleck,小分子化合物均参考说明书配制。细胞因子购自RD,溶解方法参照说明书。
5. 流式细胞分析
1)细胞表面蛋白染色,细胞样品用胰酶消化成单细胞后,取5×104到1×105细胞直接用相对应的抗体工作液重悬,冰上孵育30分钟,后用FACS 缓冲液洗3遍,用300μl FACS缓冲液重悬,冰上避光,尽快上机。实验室现有的表面蛋白抗体大都是荧光素直接标记,若有需要二抗标记的,在一抗孵育并洗涤后继续用二抗工作液孵育,后续操作一致。
2)细胞胞内蛋白染色,细胞样品用胰酶消化成单细胞后,取1×106细胞用1.6%PFA 37℃固定30min,后用FACS缓冲液洗3遍,500μl FACS缓冲液重悬保存于4℃ (固定的细胞样品最多可以保存1个月)。染色过程中用1×Saponin 缓冲液,所有抗体均用1×Saponin缓冲液稀释,一抗室温孵育30分钟,1×Saponin 缓冲液洗3遍,二抗避光孵育30分钟,1×Saponin 缓冲液洗3遍,300μl FACS缓冲液重悬,冰上避光,尽快上机。所有胞内蛋白染色,都设有同型对照。
流式细胞仪购自BD公司,型号是LSR Ⅱ。流式数据都采用Flowjo软件进行分析。结果如图2C所示,流式细胞表明WD病人特异性Eheps纯度高,肝实质细胞特异分泌蛋白ALB阳性率为78%,AFP阳性率为90%以上。
6. 免疫荧光染色
EnSCs分化的三维Eheps,先用4%PFA 37℃固定1个小时,再用含有0.5%TritonX-100(购自Sigma)0.05%BSA的PBS缓冲液室温孵育通透10分钟。然后PBS洗3遍,再用3%BSA溶液室温封闭1小时。一抗孵育4℃过夜或者室温2至3小时后,用PBS洗三遍,二抗孵育1小时。PBS洗3遍后,用即染型DAPI染色5分钟。采用Leica TCS SP5 激光共聚焦显微镜进行拍照(图2B)。
新鲜肝脏用4%PFA 4℃固定过夜, 75%、80%、85%、90%及100%乙醇各处理1h,后转入二甲苯/石蜡中放置2h,最后浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成薄片,为5微米厚。随后可进行人源白蛋白的染色,白蛋白抗体使用浓度为1:400。
7.QPCR检测
所有细胞样品或组织样品用微量试剂盒(购自天根生物)抽提RNA并反转成cDNA(Promaga),用SYBR法进行qPCR实验(Rhoche)。
结果如图3所示,结果表明,利用QPCR检测ATP7B在WD Eheps的表达水平,发现与成体肝组织接近(图3A)。此外,流式细胞分析发现超过90%的Eheps表达ATP7B(图3B)。这也表明,WD Eheps具有在体外模拟WD的潜力。
8. PAS染色、ICG吸收与排泄实验
用于PAS染色实验的细胞用4%PFA在37度固定15分钟,后PBS清洗3次,重碘酸中处理10分钟,去离子水清洗3-5分钟,使用Schiff试剂处理15分钟,去离子水清洗3~5分钟,显微镜下观察。(PAS染色的试剂盒购自Sigma-Aldrich),结果表明,WD Eheps能积累糖原,图2E所示。
ICG吸收与排泄实验:首先用细胞培养基配制ICG工作染液(1mg/ml),用ICG工作液37℃培养细胞1小时,PBS清洗3次,将细胞转移至新鲜培养基(不含ICG);在倒置显微镜下观察ICG的吸收情况,细胞继续培养24小时后,再次观察细胞ICG的释放情况。(ICG购自上海生工)。
结果如图2F所示。结果显示,WD Eheps能够吸收并排泄ICG,结果表明,其具有肝实质细胞的部分体外功能。
9.细胞培养上清中白蛋白及尿素的检测
细胞培养后,正常离心获取上清,上清可短暂保留于-80℃冰箱中。白蛋白检测采用ELISA方法(Bethyl),尿素检测采用尿素测定试剂盒(STANBIO LABORATORY)。所有操作严格按照产品说明书进行。用生化分析仪测定胆汁酸含量。
结果如图2G、2H、2I所示,结果显示,WD Eheps能够合成分泌白蛋白、尿素和胆汁酸,结果表明,其具有肝实质细胞的部分体外功能。
10. P450家族酶活性检测
待测细胞用相应的诱导剂(CYP3A4用利福平诱导,浓度为25μM;CYP1A2用Lansoprazole诱导,浓度为10μM)诱导48小时后。细胞与相对应浓度的底物用在300μl反应体系中37℃孵育3小时,用900μl预冷的甲醇中止反应。用Agilent 1200 HPLC及ABI 4000Mass-Spectrometer进行液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS/MS)分析反应上清中的产物生成。实验中的阳性对照采用5个成人的原代肝实质细胞。细胞数量用总蛋白含量指示,并用于所有数据的均一化。
结果如图2J、2K、2L所示,结果显示,利用LC-MS/MS检测药物代谢产物发现,Eheps在未加诱导剂处理时就已经具有一定的CYP酶活性,如CYP3A4、CYP1A2以及CYP2C9。此外,Eheps能够响应特异的诱导剂,如CYP3A4常用的诱导剂Rifampcin(RIF),CYP1A2常用的诱导剂Lansoprazole(LAN),并且诱导后的酶活性与体外三明治培养48hrs的原代肝实质细胞接近。
11. Eheps移植ARG大鼠实验
6-8周的ARG大鼠,按70mg/kg 注射Restrosine(购自Santa Cruz和Sigma)。4周后开始移植。Eheps经胶原酶B(1mg/ml)消化1h后,再用0.25% Trypsin-EDTA处理5分钟。消化好的细胞经70μm滤膜过滤,最后用400-500μl PBS重悬5×106Eheps。采用异氟烷气体麻醉大鼠后,开腹后暴露其肝脏,结扎左肝叶根部血管并切除该肝叶造成肝损伤。后通过牵拉附着于脾脏的脂肪暴露脾脏,用丝线将脾脏前端结扎,用胰岛素针将细胞悬液从脾脏注入。注射完成后,将脾脏等放回原位,缝合关腹。为防止感染,术后注射8万个单位的青霉素。阴性对照,为注射PBS组别。实验过程中观察并记录大鼠存活。移植4个月后处理存活大鼠,采集血液、尿液、胆汁以及肝脏等样本进行后续的分析。
从存活率情况看,移植Eheps治疗的大鼠(移植组)在细胞移植后四个月的存活率可达到50%以上,而未移植Eheps治疗的ARG大鼠(对照组)都死亡(图4 A)。这也说明Eheps移植对延长ARG大鼠生命具有一定的帮助。移植组存活的大鼠血清ALT、AST水平与对照组大鼠临死前相比有显著下降(图4B和C)。从肝脏HE染色的结果来看,未移植Eheps的大鼠出现明显的肝实质细胞死亡,相反,移植Eheps后存活的大鼠肝脏并未检测到明显的肝实质细胞坏死(图4D)。也就是说移植Eheps能够帮助改善ARG大鼠的肝功能。
为进一步检测Eheps对ARG大鼠铜离子代谢功能的恢复作用,我们进行了大鼠肝脏铜离子染色的实验。未移植Eheps的大鼠肝脏切片铜离子染色发现较多的黑褐色铜沉淀颗粒,而移植Eheps后存活的大鼠并为检测到明显的铜沉淀颗粒物(图4E)。然后,我们对大鼠肝铜、尿铜、血清铜及胆汁铜进行定量分析。WD因为铜转运蛋白ATP7B功能缺失,导致铜离子在肝脏积累,因此在未给予治疗的WD大鼠肝铜含量显著高于正常大鼠,然而移植Eheps后大鼠肝铜含量明显下降(图4F)。与肝铜一致,尿铜含量在移植Eheps后也出现明显下降(图4G)。肝实质细胞铜离子排泄的途径主要包括胆汁途径以及铜蓝蛋白螯合后分泌至血清中,这两条途径都依赖于ATP7B功能的正常行使。ARG大鼠ATP7B蛋白功能破坏,而导致铜离子无法正常排泄出去。因此,未给予治疗的ARG大鼠血清铜与胆汁铜的水平都很低,而移植Eheps后发现大鼠血清铜离子和胆汁铜离子有了显著提高(图4H和I),这表明移植Eheps后能够改善大鼠铜离子排泄功能。
我们首先检测了大鼠血清人源白蛋白含量(HSA),未移植Eheps的大鼠血清中未检测到HSA,而移植Eheps且存活的大鼠血清中能够检测到HSA的分泌(图4J)。大鼠人源白蛋白免疫荧光染色实验表明,移植Eheps且存活的大鼠肝脏中能够观察到明显的人源白蛋白阳性区域(图4K)。
12. 铜离子含量测定
肝脏组织用浓硝酸充分消解至透明,尿液、血清及胆汁样品离心后取上清。所有样品利用原子吸收分光光度计测定(上海光谱)。肝脏组织铜离子含量用单位湿重的铜离子含量表示。
结果如图4(A-I)显示,移植基因纠正过的 WD Eheps可恢复肝脏组织铜离子代谢功能。
为了在体外模拟WD,我们展开了铜离子处理WD Eheps(包括ATP7BR778L/WT,ATP7BR778L/R778L, ATP7BWT/WT)的实验。我们首先用低浓度的铜离子(100μM)处理WD Eheps 24小时。发现未纠正与突变成纯合子的Eheps(包括ATP7BR778L/WT, ATP7BR778L/R778L, ATP7BWT/WT)在铜离子处理24小时候出现大量的细胞死亡,而纠正过的Eheps(ATP7BWT/WT)未观察到明显的细胞死亡(图3D和E)。这表明,通过CRIRPR/Cas9纠正ATP7B能使Eheps不被铜离子毒死。为进一步探究WD Eheps的铜离子排泄能力,我们用高浓度的铜离子(500μM)处理WD Eheps 3小时后,检测Eheps胞内的铜离子含量。如果ATP7B蛋白正常,则其可正常排泄铜离子故而胞内铜离子含量能够维持较低水平;反之,铜离子排泄功能障碍,胞内的铜离子含量较高。我们发现,发现未纠正与突变成纯合子的Eheps(包括ATP7BR778L/WT, ATP7BR778L/R778L)内积累较多的铜离子,而纠正过的Eheps(ATP7BWT/WT)胞内铜离子含量与前两者相比较低,且有明显差异(图3C)。以上实验表明,未纠正与突变成纯合子的Eheps(包括ATP7BR778L/WT, ATP7BR778L /R778L)铜离子排泄功能障碍,能够很好地在体外模拟WD;而纠正过的Eheps(ATP7BWT/WT)铜离子代谢正常,说明CRIRPR/Cas9纠正基因能够使WD Eheps恢复正常的功能。
讨论
目前,肝移植是重症肝病治疗的最有效手段;肝实质细胞移植作为替代手段在多种肝病的治疗上也已展现出积极的疗效。人原代肝实质细胞是目前用于肝病细胞替代治疗的唯一细胞类型。尽管一个供体的肝实质细胞能够应用于多个病人,但供体肝质量与数量问题严重阻碍了原代肝实质细胞移植的发展。此外,病人特异性细胞有助于解决免疫排斥问题,是个体化再生医学的重要研究方向之一。
为此,本发明建立了WD病人特异性EnSCs,结合CRISPR/Cas9技术与干细胞体外分化技术,成功地实现WD体外铜离子代谢功能恢复,并利用细胞替代治疗成功延长了ARG大鼠的生存期。
该研究既有重大的临床指导意义:首先,这是目前首次报道利用人源肝实质细胞成功实现WD动物的细胞替代治疗;其次,这些人源肝实质细胞来源于干细胞体外定向分化;最后,这是首次实现CRISPR/Cas9技术在WD细胞治疗上的应用。这项研究为遗传性代谢疾病等的个体化细胞替代治疗提供了理论与实践依据。
WD Eheps体外模拟Wilson’s disease
WD是先天遗传代谢性疾病,目前关于其研究主要依赖于LEC大鼠等动物模型,缺乏理想的体外细胞模型。iPSCs技术的出现,使得在体外研究WD成为可能。先前有报道,利用WD病人特异性的iPSCs在体外诱导分化成肝实质细胞,能够在体外模拟WD铜离子代谢缺陷的表型,但由于该诱导分化方法在效率、终末分化细胞功能以及培养方式等方面的缺陷,所获得的肝实质细胞尚不是理想的WD体外模型。本发明利用WD EnSCs体外高效分化获得高纯度(ATP7B阳性细胞类群超过90%)的功能性肝实质细胞,且具有3D培养方式形成的类器官结构。因此,WD Eheps在体外模拟Wilson病具有得天独厚的优势,可忠实地模拟肝实质细胞铜代谢缺陷;CRISPR/Cas9纠正过的WD Eheps能够恢复铜离子排泄的功能。
此外,本发明获得的重要提示是ATP7B杂合子可能能够导致WD。之前普遍认为WD是一种常染色体隐性遗传疾病,也就是说只有当两条染色体ATP7B基因都发生了突变才会致病。然而,外显子组测序结果表明,本发明获得的WD病人都是杂合子(ATP7BR778L/WT),即只有一条染色体的ATP7B存在突变。这种杂合子情况虽然在之前的疾病调查统计中出现过,但杂合子本身是否致病或是否存在除ATP7B突变以外的致病因素目前尚不清楚。本发明利用CRISPR/Cas9技术将杂合子另外一条染色体正常的ATP7B进行同一位点的突变,从而获得隐性纯合子的WD Eheps(ATP7BR778L/R778L),发现ATP7BR778L/WT与ATP7BR778L/R778L的 WD Eheps在铜离子排泄缺陷方面无明显差异;另一方面,经CRISPR/Cas9纠正的杂合子恢复了正常的铜离子代谢功能。这两方面数据表明,该位点单个等位基因的突变是引起WD的必要条件。而ATP7BR778L/WT杂合子致病,可能是由于独立于外显子该位点突变以外的其它因素造成,例如非外显子区域的基因组发生突变并造成ATP7B出现功能障碍引起。总的来说,WD Eheps能够在体外忠实模拟Wilson’s disease,这为WD机制研究以及药物筛选提供了一个理想的体外平台。
干细胞分化技术与CRISPR/Cas9技术结合在Wilson病治疗中的意义
遗传代谢性疾病的治疗,目前研究最多的是基因治疗,即通过表达正常基因来恢复其功能进而达到疾病治疗的效果。目前,最常见的两种基因治疗方式包括:1)腺病毒介导的体内基因治疗;2)将利用慢病毒体外过表达正常基因的细胞重新回输体内。基因治疗的临床研究已经开展20余年,近些年来在血友病、先天性失明等疾病的治疗取得重大进步。然而,通过病毒介导的基因传递方式,具有引起插入式基因突变的风险,免疫原性问题以及基因沉默问题等也极大地限制了AAV介导的基因治疗效率。为了避免插入式基因突变,目前用于体内治疗的AAV经改造后不会插入细胞基因组。这对于中枢神经系统疾病的治疗往往能取得较为稳定的疗效,而对于依然能够发生的细胞分裂的组织如肝脏等的疗效很快会丢失。此外,有关基因治疗的效率、剂量以及靶向性等问题仍需深入研究。
利用干细胞定向分化技术大规模获得可移植的功能细胞是再生医学研究的热点。基于该技术的细胞替代性治疗,有望成为治愈糖尿病、遗传性肝病等代谢的终极手段。EnSCs相对于PSCs所具有的一系列独特优势,决定了其在WD等重症肝病个体化治疗的临床价值。相比于前面提到的原代肝实质细胞, Eheps能够解决细胞数量以及细胞来源这两个关键问题,并且能够避免伦理上的争议。
CRISPR/Cas9技术是基因编辑领域的一项突破性技术,与传统的基因编辑方法ZFN,TALEN相比,其效率更高、时间更短。CRISPR/Cas9技术自诞生以来,尽管其安全性问题一直备受争议,但其在基础研究以及未来临床治疗上具有重大意义。对于Wilson’sdisease这一类由于遗传物质突变引起的先天遗传代谢性疾病而言,CRISPR/Cas9能够在基因组水平上纠正其突变,从根本上治疗WD,这能彻底克服传统药物治疗的药物依赖性及副作用等问题。
综上,本发明结合干细胞分化技术于CRISPR/Cas9技术获得了病人特异性的ATP7B纠正过的Eheps,并移植至免疫缺损型WD大鼠体内能够实现铜离子代谢的改善,延长动物生存时间。在接受细胞移植且最后能够存活的WD大鼠,其肝铜及尿铜含量等显著性下降。此外,在其血清中能够检测到人源白蛋白,同时肝脏组织的免疫荧光染色也能看到人白蛋白阳性区域,这些都直接表明外源的Eheps能够在体内整合并发挥功能。这为其它遗传代谢性疾病的临床治疗提供了新的思路。然而,本发明发现Eheps在大鼠体内的整合率不高,因此提高体内整合率可进一步增强细胞移植治疗的效果。此外,随着3D打印及微流控等组织工程技术的发展,利用分化获得的肝脏细胞在体外构建在结构与功能上接近成体的肝组织和器官有望成功。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用
<130> P2019-0172
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ccggtgttca ttgccctggg cctg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
caaacaggcc cagggcaatg aaca 24
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aggagccctg tgacattctt cgacacgccc cccatgctct ttgtgttcat tgccctgggc 60
cggtggctgg aacacttggc aaaggtaaca gcagcttcag gttcagaaaa gagctgctcc 120
Claims (23)
1.一种肝实质细胞的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(a) 在第一培养条件下,在培养体系中培养内胚层干细胞,从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞;所述内胚层干细胞为经基因编辑的细胞;其中,所述第一培养条件含有第一培养基,所述第一培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁(L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium)、1X的L-谷氨酰胺(L-glutamine)、4.5×10 -4M的MTG、50ng/mL的hBMP4、10ng/mL的bFGF、10ng/mL的hVEGF、10ng/mL的hEGF、25ng/mL的HGF、20ng/mL的TGFa、40ng/mL的地塞米松(Dexamethasone)和1%(v/v)DMSO;
(b) 在第二培养条件下,在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞,从而获得肝母细胞;其中,所述第二培养条件含有第二培养基,所述第二培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、50ng/mL的hBMP4、10ng/mL的bFGF、10ng/mL的hVEGF、20ng/mL的hEGF、25ng/mL的HGF、40ng/mL的地塞米松、1%(v/v)DMSO、20ng/mL的OSM、0.1μMC-E、0.5μMA83-01;和
(c) 在第三培养条件下,在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞,从而获得肝实质细胞;其中,所述第三培养条件含有第三3A培养基和第3B培养基,肝母细胞先在第3A培养基中培养,然后再在第3B培养基中培养;其中,第3A培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、25ng/mL的HGF、40ng/mL的地塞米松、20ng/mL的OSM、0.1μM的C-E、0.5μM的A83-01、2μM的EGFi、第3B培养基为HCM培养基,其中,在所述HCM培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、40ng/mL的地塞米松、0.1μM的C-E、0.5μM的A83-01、2μM的EGFi;
所述C-E的化学式为C 27H 24F 2N 4O 3,CAS编号为209986-17-4;
所述A83-01的化学式为C 25H 19N 5S,CAS编号为909910-43-6;
所述EGFi化学式为C 22H 23N 3O 4.HCl,CAS编号为183319-69-9。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点:
c.2333G>T;
c.2621C>T;
c.2975C>T;
其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列NG_008806。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述经基因突变的细胞中的ATP7B具有选自下组的一个或多个氨基酸残基突变:
pR778L;
pH1069Q;
pA874V;
pP992L;
其中,氨基酸位置编号基于野生型人ATP7B蛋白序列NP_000044。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述内胚层干细胞来源于WD病人。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(a)中,将内胚层干细胞在第一培养条件下培养3-12天。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,在步骤(a)中,将内胚层干细胞在第一培养条件下培养4-10天。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,在步骤(a)中,将内胚层干细胞在第一培养条件下培养4-8天。
10.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(b)中,将肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞在第二培养条件下培养4-12天。
11.如权利要求10所述的制备方法,其特征在于,在步骤(b)中,将肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞在第二培养条件下培养4-10天。
12.如权利要求11所述的制备方法,其特征在于,在步骤(b)中,将肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞在第二培养条件下培养4-8天。
13.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(c)中,将肝母细胞在第三培养条件下培养8-24天。
14.如权利要求13所述的制备方法,其特征在于,在步骤(c)中,将肝母细胞在第三培养条件下培养10-18天。
15.如权利要求14所述的制备方法,其特征在于,在步骤(c)中,将肝母细胞在第三培养条件下培养11-15天。
16.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述方法具有选自下组的一个或多个特征:
(i)高肝实质细胞分化率,所述分化率为80-98%;
(ii)在培养过程中,每1ml的培养液中接种1×10 6个内胚层干细胞,可产生5-10×10 6个肝实质细胞;
(iii) 三维悬浮分化系统,可进行规模化扩增与分化。
17.如权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(i)高肝实质细胞分化率为90-95%。
18.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(a)-(c)中,所述培养体系中还含有促进分化的其他物质,选自下组:基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
19.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的培养体系中,内胚层干细胞的密度为0.5×10 6-2×10 6细胞/ml。
20.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的培养体系中,内胚层干细胞的密度为1×10 6-2×10 6细胞/ml。
21.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的获得的肝实质细胞的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为3-10。
22.如权利要求21所述的制备方法,其特征在于,所述的获得的肝实质细胞的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为4-8。
23.如权利要求22所述的制备方法,其特征在于,所述的获得的肝实质细胞的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为5-7。
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