KR101993045B1 - 체세포에서 유도담관줄기세포로의 교차분화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체세포에서 유도담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법에 관한 것이다. 본 발명의 유도담관줄기세포로의 교차분화방법는 향후 담관줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 및 담관세포와 관련된 질환 모델링, 담관세포 분화 및 발달 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용할 것으로 사료된다.

Description

체세포에서 유도담관줄기세포로의 교차분화방법 {Direct conversion method from somatic cells to induced cholangiocyte stem cells}

본 발명은 체세포에서 유도담관줄기세포로의 교차분화방법 및 이에 의해 제조된 유도담관줄기세포에 관한 것이다.

오랜 기간 동안 만성 간 질환 등의 치료 분야에 있어서 간 이식(liver transplantation)만이 유일한 치료법으로 사용이 되어 왔으나, 이러한 간 장기 이식을 통한 치료방식은 현실적으로 많은 수요에 비해 극심한 간 공여자의 부족 현상, 고비용 및 이식후 면역거부반응 등의 한계점으로 인해 큰 제약이 따랐다.

그러나 최근 간 장기 이식방법이 아닌, 성체에서 분리한 간세포(adult hepatocyte)를 활용한 세포치료적 접근방식을 통해 만성 간 질환을 근본적으로 치료하고자 하는 방식이 각광받기 시작하였다. 그럼에도 불구하고 성체 간세포를 직접적으로 이식하는 세포치료방식은 간세포 특성상 체외 생존률 및 증식성의 한계로 인해 활용에 있어 큰 어려움이 있는 것이 사실이었다(Hay et al. (2008) Stem Cells 26, 894-902; He, J. et al. (2014) Gastroenterology 146, 789-800 e788; Si-Tayeb et al., (2010) Hepatology 51, 297-305).

이에 대한 대안으로 전능성줄기세포(배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 등) 유래의 간세포(hepatocyte-like cells)를 활용한 세포치료법이 대두된 바 있으나, 이 접근방법 또한 이식후 체내 종양세포 유전자의 활성화에 따른 종양 형성 가능성을 원천적으로 배제할 수 없어 임상적 활용에 있어서 치명적인 한계를 보여왔다(Tang, C. et al., Nat. Biotechnol. 29, 829-834).

이러한 한계를 극복하기 위해 2012년 이후 원천적으로 종양형성 가능성을 배재할 수 있는 교차분화기술(direct conversion technology)을 이용해 제한적으로 유도간세포(induced hepatocytes, iHeps)를 생산 및 이식하는 방법들이 연구되어 왔다.

최근 간 전체에서 상대적으로 작은 부분에 속하는 비(非)간세포, 즉 담관세포(cholangiocytes)와 같은 세포가 간 재생에 매우 중요하다는 사실이 밝혀짐에 따라, 체세포로부터 간세포와 담관세포를 모두 생산할 수 있는 분화능력을 가진 유도간줄기세포(induced hepatic stem-like cells, iHepSCs)를 생산하기 위한 연구가 진행 중이다.

한편, 체세포로부터 간세포와 담관세포로 분화가 가능한 유도간줄기세포로의 교차분화 연구(Yu B et al., Cell Stem Cell 2013; 13:328-340)가 발표된 바 있었으나, 뛰어난 안전성을 가지고 있음에도 불구하고 제한적인 담관세포로의 분화 효율이 걸림돌로 작용하였다.

최근 인간 전능성줄기세포를 이용하여 담관줄기세포 및 담관세포를 생산하는 방법이 개발되었으나(Ogawa M et al., Nat Biotechnol 2015; 33:853-861; Sampaziotis F et al., Nat Biotechnol 2015; 33:845-852), 기술상 종양세포 유전자의 활성화에 따른 종양 형성 가능성을 원천적으로 배제할 수 없어 임상적 활용에 있어서 한계점을 보였다.

이에 본 발명자들은 체세포로부터 담관줄기세포로의 낮은 교차분화효율을 개선하기 위한 방법을 제안하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

참고특허문헌

대한민국 등록특허 10-1587231 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 촉진용 조성물 및 방법

대한민국 등록특허 10-1743284 소분자화합물을 이용한 인간 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 효율 향상 방법

대한민국 등록특허 10-1639595 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 촉진용 조성물 및 방법

본 발명자들은 체세포에서 담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화효율을 향상시키기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 (i) 간발달 및 간재생에 필수적인 전사인자를 엄격히 선별하여 최종적으로 1a3 (Hnf1α, Foxa3) 조합을 개발하였고, 상기 조합의 유전자를 체세포에 도입하여 유도간줄기세포를 유도하였으며(step1), (ii) 이어 지속적인 체외 배양을 통해 유도간줄기세포를 담관세포 전단계인 담관줄기세포(cholangiocyte stem cell, CPC)로 분화(step2)시킴으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유도담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유도담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 체외로 분리된 포유동물의 체세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 체세포에서 유도간줄기세포(induced hepatic stem-like cells)로의 교차분화방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 Hnf1α (HNF1 homeobox A)유전자는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 Foxa3 (forkhead box A3) 유전자는 서열목록 제 2 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Hnf1α 유전자는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 구성되고, 상기 Foxa3 유전자는 서열목록 제 2 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.

본 발명에서 상기 서열목록 제 1 서열 및 2 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

한편, Hnf1α 유전자 또는 Foxa3 유전자 서열은 각각 서열목록 제 1서열 및 제2서열 중 CDS 부분을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 유전자 서열(또는 유전자의 발현을 위한 뉴클레오타이드 서열)은 적절한 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유전자 도입에서 유전자 운반체는 바이러스, 플라스미드, 리포좀 또는 니오좀을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

본 명세서에서, 용어 “유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 LAMTOR3 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, U6 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

Hnf1α 및 Foxa3 유전자 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유전자 전달체는 본 발명의 유전자 서열 또는 뉴클레오타이드 분자를 레트로바이러스에 적용하여 제조할 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol.7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau. etene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau.et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법은 포유동물의 체세포에 적용될 수 있으며, 예컨대, 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이 및 침팬지를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 유도간줄기세포는 간세포 또는 담관세포로의 분화가 모두 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 체외로 분리된 포유동물의 체세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 체세포에서 간세포(hepatic cells)로의 교차분화방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Hnf1α 유전자 및 Foxa3 유전자 발현을 위한 유전자 전달체를 포함하는, 체세포에서 간세포(hepatic cells)로의 교차분화용 조성물을 제공한다.

상기 간세포로의 교차분화방법 및 조성물은 상술한 유도간줄기세포로의 교차분화방법에서와 동일한 유전자를 이용하므로, 상기 방법과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Hnf1α 및 Foxa3 유전자 발현을 위한 유전자 전달체를 포함하는, 체세포에서 유도간줄기세포(induced hepatic stem-like cells)로의 교차분화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 교차분화방법에서와 동일한 유전자를 이용하므로, 상기 방법과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 체세포는 섬유아세포이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 교차분화용 조성물을 체세포를 포함하는 생시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 체세포에서 유도간줄기세포(induced hepatic stem-like cells)로의 교차분화방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 “생시료(biosample)”는 유기체-유래 시료를 의미한다. 상기 생시료는 생물원(예컨대 포유동물)의 세포, 조직, 또는 생체액, 또는 본 발명에 따라 수득될 수 있는 체세포를 포함하는 미디엄(medium)을 의미하고, 이는 인간으로부터 채취한 시료 및 동물로부터 채취한 시료를 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 생시료는 세포, 세포를 포함하는 조직 추출물을 포함하는 체내 유체 시료이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 체세포에서 유도담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법을 제공한다:

(a) 체외로 분리된 포유동물의 체세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하여 유도간줄기세포를 제조하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 유도간줄기세포를 성장인자 포함 배지에서 계대배양하여 유도담관줄기세포를 제조하는 단계.

이하, 본 발명의 방법에 대하여 상세하게 설명한다.

단계 (a): 유도간줄기세포의 제조

우선, 체외로 분리된 포유동물의 체세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하여 유도간줄기세포를 제조한다. 체세포에 유전자를 도입하는 방법은 상술한 바와 같다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, pMX 레트로바이러스를 매개로 하여, 간 발달 및 간재생에 필수적인 전사인자로 알려진 Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf1a 및 Hnf1b 유전자를 체세포(MEFs, mouse embryonic fibroblasts)에 도입하고, 이를 간줄기세포 특이적인 배양액(hepatic stem cell culture medium; HepCM)에서 배양함으로써 유도간줄기세포 세포주를 확립하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 간줄기세포 특이적 배양액(HepCM)의 조성은 다음과 같다:

DMEM/F-12 supplemented with 10% FBS, 0.1 μM dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% ITS (insulin-transferrin-selenium) premix, and penicillin/streptomycin/glutamine, and both hepatocyte growth factor and epidermal growth factor.

단계(b): 유도담관줄기세포의 제조

이어, 유도간줄기세포를 성장인자(예컨대, EGF및/또는 HGF)가 포함된 배지(HepSCM)에서 배양하여 유도담관줄기세포로 분화시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 HepSCM 배지의 조성은 다음과 같다: DMEM/F-12, 10% FBS (Hyclone), 0.1 μM dexamethasone (Sigma), 10 mM nicotinamide (Sigma), 1% ITS (insulin-transferrin-selenium) premix (Gibco), penicillin/streptomycin/glutamine (Invitrogen), 10 ng/ml hepatocyte growth factor (HGF; Peprotech), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Peprotech), gelatin-coated dish.

상기 배지 조성에서 유도간줄기세포를 약 14~16번의 지속적인 계대배양과정을 거쳐 유도담관줄기세포로 분화시켰다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 체세포에서 유도담관줄기세포 (induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 유도담관줄기세포로의 교차분화방법는 향후 담관줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 및 담관세포와 관련된 질환 모델링, 담관세포 분화 및 발달 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용할 것으로 사료된다.

도 1. 유도간줄기세포 형성을 위한 실험적 과정에 대한 모식도이다.
도 2. 간 발달 및 간재생에 필수적인 전사인자로 알려진 Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf1a, Hnf1b를 일반 체세포에 도입후 약 2주경, 간세포 (AFP), 담낭세포 (CK7, CK19), 그리고 간줄기세포 (TROP2) 특이적인 마커들이 발현하는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다.
도 3a-3f. 최적 유도간줄기세포 교차분화 조합 선별. 5개 인자 도입 조건에서, 한가지의 도입인자들을 각각 제거하였을 경우에 AFP/CK19 양성 콜로니의 갯수를 측정하였으며, Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf1a, Hnf1b가 제거되었을 경우 유도간줄기세포 특이적인 상피세포 콜로니의 수가 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 3a). 또한, 각각의 제거조건 하에서의 간세포 및 간줄기세포 특이적 마커 유전자 발현양상을 확인한 결과, Hnf1a, Foxa2를 제거하였을 경우에 전체적 마커 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 3b). 이를 근거로 Hnf1a, Foxa2 (이하 1a2), 그리고 Hnf1a, Foxa3 (이하 1a3)를 각각 조합하여 유도간줄기세포를 유도한 결과, AFP/CK19 유전자 발현 양상 및 양성 콜로니의 수, EPCAM 양성 세포의 수가 1a3에서 1a2보다 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인하였고(도 3c 내지 3e), 1a3를 이용하여 생산한 유도간줄기세포에서 간줄기세포 특성을 보이는 단백질이 현저하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 3f). 대조군으로써, 성체 쥐에서 분리한 간세포 및 담낭세포를 각각 사용하였다.
도 4a-4c. 유도간줄기세포 기본 특성 분석. 1a3조합에 의해 생산한 유도간줄기세포 세포주 1-4가 간줄기세포 특이적인 성질을 나타내는지 RT-PCR (도 4a), qPCR (도 4b), 면역형광염색법(도 4c)을 통해 확인하였다. 다양한 간세포 및 담낭세포, 간줄기세포 특이적인 마커를 뚜렷하게 발현하고 있음을 확인하였다.
도 5a-5e. 유도간줄기세포의 간세포 분화능 검증. 1a3 조합을 이용하여 생산한 유도간줄기세포로부터 간세포로 분화시킨 후 모양 변화를 관찰하였으며(도 5a), 1a3조합에 의해 생산한 유도간줄기세포가 간세포 및 담낭줄기세포의 분화 특성을 보이는 지 확인하기 위해, 간세포로의 분화 유도후 7일경, RT-PCR (도 5b), 면역형광염색법(도 5c), PAS 및 ICG 염색법(도 5d), 혈청 알부민 분비량(도 5e)을 검증한 결과, 담낭세포 마커(Ggt, CK7) 및 간줄기세포 마커(Dlk1)의 발현양이 현저히 감소함과 동시에 간세포 특이적인 기능성을 뚜렷하게 보이는 등 유도간줄기세포가 간세포 분화 조건에서 성숙한 간세포로 분화가 가능함을 확인하였다.
도 6a-6d. 유도간줄기세포의 담낭세포 분화능 검증. 3차원 배지에서 담낭세포로의 분화를 유도한 후 7일경, CK19 양성의 담낭구조 및 가지형태의 모양변화를 관찰하였으며(도 6a), 분화된 세포의 특성을 qPCR (도 6b), 면역형광염색법(도 6c), 담관세포의 물 및 이온 배출 기능성을 검증하기위해 MDR1(multidrug resistance protein 1) 및 CFTR(Cystic fibrosis transmembrane regulator) 수용체 활성 분석(도 6d)을 통해 검증한 결과이다. MDR1의 기능성을 확인하기위해 rodamine 123(Rho123) 흡수 및 배출을 통해 확인하였으며, 담관의 swelling 정도의 파악을 위하여 forskolin(FSK) 및 IBMX를 처리하였으며 CFTR 저해제가 있을 때와 없을 때를 비교하여 실제 저해제가 있을시에 FSK 와 IBMX에 의한 swelling이 저해됨을 확인하였다(도 6d).
도 7. 유도간줄기세포 교차분화 효율 비교 분석. 전사인자 조합(1b3) 및 조합(1a3)을 통한 유도간줄기세포 교차분화효율과 비교하기 위해, 전사인자 도입후 14일경 유세포분석기를 이용하여 E-cadherin 또는 EPCAM 양성 반응을 보이는 세포의 수로 산출한 결과이다.
도 8a-8b. 기존 유도간줄기세포주와의 기본 특성 비교 분석.
도 9a-9c. 1b3 조합과 1a3 조합에 대하여 Rho123 전달능을 비교 관찰한 결과, 1a3 조합이 월등히 높은 수의 Rho123 흡수율을 보였다(9a). 또한 MDR1 수용체 활성 분석법(9b), qPCR기법(9c)을 이용하여 기존 유도간줄기세포주와의 담낭세포 분화능을 비교하였다.
도 10. 유도간줄기세포 및 담관줄기세포 형성을 위한 실험적 과정에 대한 모식도. (i) 간발달 및 간재생에 필수적인 1a3 (Hnf1α, Foxa3) 전사인자 조합을 이용하여 체세포를 유도간줄기세포로 유도(step1)하였고, (ii) 이어 지속적인 체외 배양을 통해 유도간줄기세포를 담관세포 전단계인 담관줄기세포(cholangiocyte stem cell, CPC)로 분화시켰다(step2).
도 11. 유도간줄기세포에서 유도담관줄기세포로의 분화.
도 12a-12d. 1a3이용한 유도간줄기세포 유도 및 확립, 특성분석. Foxa3 및 Hnf1a를 체세포에 도입후, 간세포 (AFP), 담관세포 (CK7, CK19), 그리고 간줄기세포 (TROP2) 특이적인 마커들이 발현하는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다 (도 12a). 생산한 유도간줄기세포가 간줄기세포 특이적인 성질을 나타내는지 RT-PCR, qPCR, 면역형광염색법을 통해 확인한 결과, 다양한 간세포 및 담관세포, 간줄기세포 특이적인 마커를 뚜렷하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 12b-12d).
도 13a-13c. 유도간줄기세포의 유도담관줄기세포로의 분화 과정. 유도간줄기세포의 계대배양 결과 간세포 마커인 Afp, Alb, Hnf4a의 발현량은 감소하고, 반면 CK19, SOX9과 같은 담관세포 마커는 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 13a-13b). 특히 qPCR을 이용해 다양한 담관세포 특이적인 마커를 확인해본 결과 성숙 담관세포 특이적인 마커의 발현과 더불어 Notch2, Hes1, Jag1과 같은 Notch신호전달과 관련된 마커들의 발현양이 유의적으로 증가하였다(도 13c).
도 14a-14d. Notch신호전달 활성화에 의한 유도담관줄기세포 분화기전 검증. Notch신호전달을 억제하는 약물인 DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, a γ-secretase inhibitor; Sigma)를 10ng/ml처리한 결과 담관줄기세포 및 담관세포로의 분화가 완벽하게 억제(Afp, Alb, Ttr, Hnf4a 발현양 유지, 도 14a)되고 유도간줄기세포 상태가 오히려 지속적으로 유지되는 것을 qPCR(도 14b), 면역형광염색법(도 14c), MDR1 수용체 활성 분석법(도 14d)을 통해 확인하였다.
도 15a-15f. 유도담관줄기세포의 체내 분화능 검증. 유도담관줄기세포를 C57Bl6/J 마우스에 이식하여 체내 담관세포로의 분화를 유도한 후, 간을 적출하여 이식된 유도담관줄기세포의 분화정도를 면역염색법을 통해 분석하였다. 그 결과, 유도간줄기세포에 비해 유도담관줄기세포의 경우 유의적으로 많은 수의 담관구조가 형성되었고(도 15a-15b) 이를 CK19, OPN과 같은 담관세포 특이적인 마커로 면역염색해본 결과 압도적인 양상으로 유도담관줄기세포가 기능성을 갖춘 담관세포로 분화되는 것을 확인하였다(도 15c-15f).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

[유도간줄기세포의 제작 및 특성분석]

실험방법

1. 유도간줄기세포 세포주의 제작

유도간줄기세포 교차분화 유도, 배양, 확립과정: pMX 레트로바이러스를 매개로, 간 발달 및 간재생에 필수적인 전사인자로 알려진 Foxa1 (NM_008259), Foxa2 (NM_010446), Foxa3 (NM_008260), Hnf1a (NM_009327), Hnf1b(NM_008261)를 최초 5만개의 일반 체세포(MEFs, mouse embryonic fibroblasts)에 도입한 후 48시간 뒤 간줄기세포 특이적인 배양액(hepatic stem cell culture medium; HepCM)에서 배양을 하였다 (도 1). 약 2주 후 상피세포 형태를 가진 유도간줄기세포 콜로니가 생성되는 것을 확인하였고, 이를 분리하여 유도간줄기세포 세포주를 확립하였다(Du, Y. et al, (2014). Cell Stem Cell 14, 394-403; Huang, P. et al, Nature 475, 386-389; Huang, P. et al, (2014) Cell Stem Cell 14, 370-384; Sekiya, S. et al., (2011) Nature 475, 390-393).

*간줄기세포배양액 조성: DMEM/F-12 supplemented with 10% FBS (Biowest), 0.1 μM dexamethasone (Sigma), 10 mM nicotinamide (Sigma), 1% ITS (insulin-transferrin-selenium) premix (Gibco), and penicillin/streptomycin/glutamine (Invitrogen), and both hepatocyte growth factor (Peprotech) and epidermal growth factor (Peprotech).

2. 최적 유도간줄기세포 교차분화 조합 선별

유도간줄기세포로의 최적 교차분화 조합을 선별하기 위해 1) RT-PCR기법을 이용해 간세포(Afp, Alb), 담관세포(CK7, CK19), 간줄기세포(Epcam, Trop2) 특이적인 마커의 발현여부를 분석하였고, 2) 면역형광염색법을 이용하여AFP와 CK19 양성반응을 보이는 콜로니 수를 측정하였으며, 3) 간줄기세포 특이적인 표면단백질인 EPCAM양성의 세포수를 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 측정하였다.

1) RT-PCR

유도된 간줄기세포의 유전자 발현 양상 분석을 위해 RNA를 Hybrid-RTM (GeneAll)을 이용하여 추출한 후, 총 1 μg 의 RNA로부터 역전사효소 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 합성하였다(각각 해당 제품의 표준방법대로 시행). 그 후 각각의 마커에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다.

마커 유전자 발현 확인을 위한 프라이머 서열정보

유전자명	Genebank Number	프라이머 서열 (F/R)
Aat	NM_009243	5'-CCTGCTAAACA6pCGCAGAA-3'
		5'-TCGATGGTCAGCACAGCCTTA-3'
Afp	NM_007423	5'-CGTGATGCTTTGGGCGTTTA-3'
		5'-GCCAAAAGGCTCACACCAAAG-3'
Alb	NM_009654	5'-AAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACG-3'
		5'-GGGTAGCCTGAGAAGGTTGTGG-3'
Hnf1a	NM_009327	5'-CCTGCTGCCATCCAACCATA-3'
		5'-CCACGGTTACTGGGAAGAGGA-3'
Hnf4a	NM_008261	5'-GCCAACGATCACCAAGCAAG-3'
		5'-TGAGGGTATGAGCCAGCAGAA-3'
E-cadherin	NM_009864	5'-TTCAAGAAGCTGGCGGACAT-3'
		5'-CATCTCCCATGGTGCCACAC-3'
Ttr	NM_013697	5'-CCCTGCTCAGCCCATACTCCTA-3'
		5'-TGCTTTGGCAAGATCCTGGT-3'
CK8	NM_031170	5'-AAGCTGGTGTCCGAGTCTTCTGA-3'
		5'-AGCTCAGGCTGGCAAGGACT-3'
CK18	NM_010664	5'-GATCGTGGATGGCAGAGTGG-3'
		5'-TTCCCTCCTTCTCTGCCTCAGT-3'
Tat	NM_146214	5'-AAGGCAGCCAGGAGGAGTGT-3'
		5'-TGAGGAGGAGCAGCCCAACT-3'
G6p	NM_008061	5'-CGGATCCTGGGACAGACACA-3'
		5'-CTTTGCATGGCGGTTGACTT-3'
Ocln	NM_008756	5'-TCGCACATCAAGAGGATGGTG -3'
		5'-GCCTCTGGAGAGAATTGCAGAGA-3'
Dsp	NM_023842	5'-GGCTGACGGAAGAGGAAACTG -3'
		5'-ATGGTGGCCAACAGCGACT-3'
Col1a1	NM_007742	5'-CCCTGCCTGCTTCGTGTAAA-3'
		5'-TCGTCTGTTTCCAGGGTTGG-3'
Thy1	NM_009382	5'-CTTTCCCTCTCCCTCCTCCAAG-3'
		5'-CGAGGGCTCCTGTTTCTCCTT-3'
CK19	NM_008471	5'-CCCCAAGGCCATCTGAGCTA-3'
		5'-GAGTAAACTTTTATCACCCCAGTCAGG-3'
CK7	NM_033073	5'-CCTCAGGGCCTATTCCATCAA-3'
		5'-GTCTCTCCAAGCCCACAGCTT-3'
Ggt	NM_008116	5'-CAGCTGCCTCAGACTCCAGAA-3'
		5'-TTCCCATTCTCGTCCCTTGG-3'
Trop2	NM_020047	5'-GAGATGAGAAGCGAACCTAGCTTGTAG-3'
		5'-AACTTGTTTGTGGAGAGAGAAGGAAGA-3'
Epcam	NM_008532	5'-GGTGGTGTCATTAGCAGTCATCG-3'
		5'-TGTGGATCTCACCCATCTCCTT-3'
Dlk1	NM_010052	5'-GGATTCTGCGAGGCTGACAA-3'
		5'-GCAGATGCACTGCCATGGTT-3'
Notch2	NM_010928	5'-TTTGTGTCCCGCCCTTGTC-3'
		5'-AGGGCATTTGCAGGAGAACTG-3'
Cftr	NM_021050	5'-CTGCTTGATGAGCCCAGTGC-3'
		5'-TGAAGGGAGTCGTACTGCCAGA-3'
Aqp1	NM_00747	5'-CGGTCATTTGGCTCTGCTGT-3'
		5'-CACTGGTCCACACCTTCATGC-3'
Hnf1b	NM_009330	5'-GTGTCCACTGCAAGCCTGG-3'
		5'-CCCAGAGACTGATGGTGTGGA-3'
Jag1	NM_013822	5'-ACCTGCGTGGTCAATGGAGA-3'
		5'-CACATTCGCACCGATACCAGTT-3'
Sstr2	NM_009217	5'-TGCTAGAGAACACAGGGAAGCGA-3'
		5'-TGTCGTAGTATGGCTCGGTCTGG-3'
Hes1	NM_008235	5'-GTGAAGCACCTCCGGAACCT-3'
		5'-CTCGTTCATGCACTCGCTGA-3'
Mdr1	NM_011075	5'-CGAAGCAACATCAGCTCTGGA-3'
		5'-CTTTGCTCCAGCCTGCACAC-3'
Gpbar1	NM_174985	5'-GTGGCCACATTGCTCCTGTC-3'
		5'-TGGCTCTTCCTCGAAGCACTC-3'
Sctr	NM_001012322	5'-CCATGGAGGTCCAGCTGTTCT-3'
		5'-CGTTGCTGAAGGAGTTGCTGA-3'
Slc4a2	NM_009207	5'-GCCTTTGCGCATGGTGGTACT-3'
		5'-TGCCTCTGGACAGCAGCTACA-3'
Mrp2	NM_013806	5'-ACTTTCAATGCCGGCTTCCT-3'
		5'-TGGTCCTAGACAGCGGCAAG-3'
Mrp3	NM_029600	5'-CCGGCTCAACACAATCATGG-3'
		5'-TAGGCAAGTCCCGCATCCTT-3'
Ntcp	NM_001177561	5'-CAAGGCTGCTGCAACAGAAGA-3'
		5'-ACCAGAGTTCSAGGCCATTAGGG-3'
MaoA	NM_173740	5'-GGGTTCAAGAGCCTGAGTCCA-3'
		5'-TGATCAGCAGGAGGCCTGT-3'
Nat2	NM_010874	5'-GGAGAATGGAACCTGGTAGGA-3'
		5'-GACGCTGGTGATGTCTGAAGG3'
GS	NM_008131	5'-GGAGGTTATGCCTGCCCAGT-3'
		5'-CAATGGCCTCCTCAATGCAC-3'
Gsta4	NM_010357	5'-CAGATGGCCCCTATGTTGAG-3'
		5'-GGGCAGAGTGGTTTTGTTGT-3'
Sult1a1	NM_133670	5'-CCATGGCTAACTACACAACCATCC-3'
		5'-CACAGCTAAGGAGAGGACCCTTG-3'
Ugt1a1	NM_201645	5'-CTGGAGCTCGCGTTTGCTT-3'
		5'-CCTTCTGCTGGAGCTGCTGA-3'
MaoB	NM_172778	5'-GTGGGCCAGGAAACCAAGAG-3'
		5'-TTTGGCAGCCAGAACCAGAA-3'
Mgst1	NM_019946	5'-GACCTCAGGCAGCTCATGGA-3'
		5'-GCGTTCCACCTTCTCGTCAGT-3'
Cyp1a1	NM_009992	5'-CCTTCCGGCATTCATCCTTC-3'
		5'-TTTCAGGCCGGAACTCGTTT-3'
Cyp2a5	NM_007812	5'-GCACTTCCTAGATGACAAGGGACA-3'
		5'-CAGGCTCAACGGGACAAGAA-3'
Cyp2d22	NM_001163472	5'-CCTCTCCTCGGCTGAGTTTCA-3'
		5'-CGCCAGTGCATCAGGTTCA-3'
Cyp3a11	NM_007818	5'-TTCCAGCCTTGTAAGGAAACACA-3'
		5'-TGTACTGAATCTTTAACCAGGCATCA-3'
Cyp3a13	NM_007819	5'-TCCTGCAGAACTTCACTGTCCA-3'
		5'-TGGTTTCTGGTCCACAGGATACA-3'
Cyp3a44	NM_177380	5'-TGGACCCAGGAACTGCATTG-3'
		5'-GCATCCCGTGGCACAACTT-3'
Gapdh	NM_008084	5'-CCAATGTGTCCGTCGTGGAT-3'
		5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'

외래 유전자 발현 분석을 위한 프라이머 서열 정보

유전자명	프라이머 서열
exo-Foxa3	5'-GTGGTACCTCACCCTTACCG-3'
	5'-TGGTGGGCACAGGATTCACT-3'
exo-Hnf1a	5'-GTGGTACCTCACCCTTACCG-3'
	5'-AGGCCTGGATCAGCACTTCC-3'
exo-Hnf1b	5'-GTGGTACCTCACCCTTACCG-3'
	5'-AGGCCTGGATCAGCACTTCC-3'

2) 면역형광염색법

면역형광염색을 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드(Sigma)에 20분간 상온에서 처리하여 고정시킨후, 0.3% Triton X-100 (Sigma)와 5 % FBS (Biowest)가 포함된DPBS (Biowest)를 이용하여 2시간동안 blocking 과정을 진행하였다. 이후 세포를 1차 항체로 4ºC 의 상태에서 하룻밤동안 어두운 상태에서 항원-항체 반응을 시킨다. DPBS로 3번 세척한 이후, 알맞게 결합된 2차 항체를 2시간 동안 상온의 어두운 조건하에 반응시킨다. 세포 핵은 Hoechst33342 (Fluka)로 염색하였으며, 형광현미경 혹은 콘포칼레이저 현미경으로 관찰하였다(Fluoview FV1000-ASWv1.5; Tokyo, Japan). 실험에 사용된 1차 항체의 정보는 다음과 같다: rabbit anti-E-cadherin (Cell Signaling, 1:200), mouse anti-Albumin (R&D Systems, 1:100), mouse anti-CK7 (Abcam, 1:200), rabbit anti-CK19 (Abcam, 1:250), rabbit anti-EPCAM (Santa Cruz, 1:100), rabbit anti-LGR5 (Abcam, 1:200), rabbit anti-SOX9 (Novus Biologicals, 1:200), anti-TROP2 (Santa Cruz, 1:200), goat anti-F-actin (Thermo, 1:200), and rabbit anti-ZO-1 (Invitrogen, 1:200).

3) 유세포분석

유세포분석을 위해 세포를 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde, Sigma)에 20분간 고정시킨후, 상온에서 0.3% Triton X-100 (Sigma) 용액에 10분간 처리하여 항체가 침투할 수 있도록 한다. Blocking과정을 위해 0.3 % bovine serum albumin (Sigma) 용액으로 15분간 처리하도록 하며, 이후 Epcam 혹은 E-cadherin 항체를 4°C 에서 30분간 반응시킨다. DPBS용액으로 몇차례 세척을 한 이후, 2차 항체를 20분동안 암막상태의 4°C 에서 부착시킨다. 세포를 0.1% Tween20 (Sigma)를 함유한 DPBS 용액에서 2차례 세척한 후, Calibur Flow Cytometer (Becton Dickinson)를 이용하여 분석한다. 유세포분석에 사용된 1차 항체의 정보는 다음과 같다. rabbit anti-E-cadherin (Cell Signaling, 1:200), goat anti-EPCAM (e-bioscience, 1:50). 실험결과는 FlowJo (Tree Star) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

3. 유도간줄기세포 특성분석

유도간줄기세포로의 최적 교차분화 조합 (1a3: Hnf1a, Foxa3) 확정후 생산된 유도간줄기세포의 특성 분석을 다양한 방법으로 수행하였다. 이를 위해 RT-PCR, quantitative PCR(qPCR) 기법, 면역형광염색법, 콜라겐 및 magrigel을 활용한3차원 분화 배양법, periodic-acid staining (PAS) 염색법, indocyanine green (ICG) 염색법, 혈청 알부민 측정을 위한 ELISA기법, Rho123 처리에 따른 MDR1 수용체 활성 분석법, forskolin처리에 따른 CFTR 수용체 활성 분석법 등을 활용하였다.

1) RT-PCR 및 면역형광염색법은 상술한 바와 같다. 한편, 정량적 PCR 분석을 수행하기 위해, SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 제품을 이용하여 유도간줄기세포 특정 마커들의 프라이머와 함께 qPCR을 진행하였다. 발현 정도는 Gapdh 유전자 발현을 기준으로 하였으며, MEF(Mouse embryonic fibroblast)을 음성대조군으로 설정하여 계산하였다. 모든 qPCR 실험은 ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) 기기를 이용하여 진행하였다.

2) 콜라겐 및 magrigel을 활용한3차원 분화 배양법

유도간줄기세포를 담관세포로 분화시키기위해, 이전 논문에서 발표된 3차원 분화 배양법을 이용하였다(Tanimizu et al. 2004 Journal of cell science 117, 6425-6434; Li et al. 2010 Gastroenterology 139, 2158-2169 e2158; Yu et al. 2013 Cell Stem Cell 13, 328-340). 담관세포의 가지형태를 유도하기 위해 800 μl 의 1.2 mg/ml 타입 1 콜라겐 (Corning)과 100 μl 의 10× DPBS, 20 μl 의 1N NaOH, 그리고 80 μl 의 물을 얼음위에서 균일하게 섞어서 배양환경을 조성하였다. 또한 담관조직의 cyst 형태를 구성시키기 위해, 1.2 mg/ml 의타입 1 콜라겐과 40% 의 메트리젤을 1:1 비율 (v/v)로 섞어서 사용하였다. 이러한 혼합체를 같은 부피의 담관세포분화배양액 (Cholangiocyte Differentiation Medium, CDM: DMEM/F12 에 10% fetal bovine serum (HyClone) 과 20 ng/ml HGF (Peprotech)를 섞은 용액)에 1 × 10⁵ 의 유도간줄기세포를 섞은 용액을 혼합하였다. 이후, 세포가 혼합된 용액을 4-well plate에 37°C 에서 30분간 고체화 시켰다. 그후 마지막으로 메디아를 만들어진 젤 위에 조심스럽게 첨가하였다.

3) periodic-acid staining (PAS) 염색법

PAS (periodic acid-Schiff) 염색을 위하여 제품(Periodic Acid-Schiff Kit, sigma)의 표준사용법에 따라 진행하였다. 세포를 10% 포르말린이 첨가된95% 의 차가운 에탄올 용액에서 고정시킨 후, 1분 동안 흐르는 수돗물에서 세척한다. 이후 periodic acid 용액에 5분간 상온에서 처리한 후, 증류수로 3번 이상 세척하였다. 마지막으로 Schiff's reagent 용액으로 15분간 상온에서 반응시킨 후에 수돗물로 5분간 세척하였다.

4) indocyanine green (ICG) 염색법

인도시아닌그린(Indocyanine green, ICG, Sigma) 흡수 분석을 위해, ICG용액을 배양중인 세포의 배양액에 최종농도가 1 mg/ml 이 되도록 첨가하였다. 이후 세포를 37°C 에서 1시간동안 배양한후, PBS용액으로 3번 세척한다. 광학현미경을 통해 ICG가 세포내에 잘 흡수되었는지 관찰한다. 흡수를 확인한 이후, 세포의 ICG 배출을 확인하기위해 세포를 ICG가 없는 일반 배양액에서 37°C 조건하에 6시간동안 배양한 후 관찰하였다.

5) 혈청 알부민 측정을 위한 ELISA기법

세포배양액에서의 알부민 측정을 위해, 세포를48시간 동안 배양한 후 배양액을 수거, Mouse Albumin ELISA Kit (Shibayagi)을 이용하여 혈청 알부민의 양을 측정하였다(제품 표준 사용방법 이용).

6) Rho123 처리에 따른 MDR1 수용체 활성 분석법

담관세포의 가장 중요한 주요 기능중 하나인 물 및 이온배출과 관련된 수용체 중 하나인 Mdr1(Multidrug resistance protein 1)을 유도간줄기세포로부터 유도된 담관세포에서 확인하기 위해, rhodamine123의 배출로 활성을 측정하였다. 담관세포는 Rho123를 세포 내부공간으로 이동시킬 수 있으며, 이를 통해 담관세포의 기능성을 확인하였다. Mdr1의 저해제인 verapamil을 처리하여 그에 따른 MDR1수용체의 저해 효과를 분석하기 위해, Rho123를 처리하기 30분 전에 미리 10 μM 의 verapamil(sigma)을 배양액에 섞어서 배양하였다. 젤상태의 세포 혼합물을 배양액으로 3번 세척한 후, Rho123를 함유하고 있는 담관세포(cyst)을 형광 현미경으로 관찰, 갯수를 측정하였다.

7) forskolin처리에 따른 CFTR 수용체 활성 분석법

담관세포를 10 μM calcein-AM (Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 배양액에서 30분동안 배양한다. 세포배양액으로 3번 세척한 후, 형광현미경에서 관찰한다(0시간째). Cftr에 의한 액체 수송 및 담관세포 팽창 현상을 관찰하기 위해, 10 μM 의 forskolin (FSK, a cAMP agonist; Enzo Life Sciences) 와 100 μM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine, nonselective PDE inhibitor; Sigma) 를 24시간 동안 처리하였다. Cftr 활성억제를 위해서는 FSK/IBMX 처리 3시간 전에 미리 30 μM CFTRinh-172 (a CFTR inhibitor; Sigma)를 처리하도록 하였다. FSK/IBMX를 처리한 후 24시간째에 10 μM calcein-AM으로 다시 염색하여 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 담관세포의 총 면적은 ImageJ (NIH ver. 1.50) 를 이용하여 측정하였으며, 팽창 정도의 측정은 비자극 상태의 담관세포 크기로 비교하도록 하였다.

4. 기존 유도간줄기세포와의 비교분석

기존에 전사인자 조합(1b3: Hnf1b, Foxa3)을 이용한 유도간줄기세포 교차분화효율(Yu B et al., Cell Stem Cell 2013; 13:328-340)과 본 연구진이 개발한 조합(1a3)에 따른 유도간줄기세포 교차분화효율을 비교하기 위해, 전사인자 도입후 14일경 유세포분석기를 이용하여 E-cadherin 또는 EPCAM 양성 반응을 보이는 세포의 수로 산출하였다. 또한, 각 조합에 의해 생산한 유도간줄기세포 세포주의 특성과 담관세포로의 분화능을 비교하기 위해, RNA sequencing 분석법, MDR1 수용체 활성 분석법, qPCR기법을 이용하여 분석하였다. MDR1 수용체 활성 분석법 및 정량적 PCR방법은 상술한 바와 같다.

실험결과

1. 간 발달 및 간재생에 필수적인 전사인자로 알려진 Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf1a, Hnf1b를 최초 5만개의 일반 체세포에 도입후 약 2주경, 간세포 (AFP), 담관세포 (CK7, CK19), 그리고 간줄기세포 (TROP2) 특이적인 마커들이 발현하는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다 (도 2).

2. 유도간줄기세포로의 최적 교차분화 조합을 선별하기 위해 RT-PCR 을 진행한 결과, Hnf1b첨가시 발현양이 5개 인자 모두를 넣었을 때보다 크게 떨어지는 것을 확인하였고, Foxa2, Foxa3, Hnf1a가 제거되었을 경우 유도간줄기세포 특이적인 상피세포 콜로니의 수가 크게 감소하는 것을 확인하였다. 이를 근거로 Hnf1a, Foxa2 (이하 1a2), 그리고 Hnf1a, Foxa3 (이하 1a3)를 각각 조합하여 유도간줄기세포를 유도한 결과, AFP/CK19 양성 콜로니의 수 및 EPCAM 양성 세포의 수가 1a3에서 1a2보다 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인하였고, 1a3를 이용하여 생산한 유도간줄기세포에서 간줄기세포 특성을 보이는 단백질이 현저하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 3a-3f).

3. 1a3조합에 의해 생산한 유도간줄기세포 세포주가 간줄기세포 특이적인 성질을 나타내는지 RT-PCR, qPCR, 면역형광염색법을 통해 확인한 결과, 다양한 간세포 및 담관세포, 간줄기세포 특이적인 마커를 뚜렷하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 4a-4c).

4. 1a3조합에 의해 생산한 유도간줄기세포가 간세포 및 담관줄기세포의 분화 특성을 보이는 지 확인하기 위해, Matrigel이 포함된 배지에서 간세포로의 분화 유도후 7일경, RT-PCR, 면역형광염색법, PAS 및 ICG 염색법, 혈청 알부민 분비량을 검증한 결과, 담관세포 마커(Ggt, CK7) 및 간줄기세포 마커(Dlk1)의 발현양이 현저히 감소함과 동시에 간세포 특이적인 기능성을 뚜렷하게 보이는 등 유도간줄기세포가 간세포 분화 조건에서 성숙한 간세포로 분화가 가능함을 확인할 수 있었다(도 5a-5e).

5. 콜라겐과 매트리겔(Matrigel)이 포함된 3차원 배지에서 담관세포로의 분화를 유도한 후 7일경, 분화된 세포의 특성을 qPCR, 면역형광염색법, MDR1 및 CFTR 수용체 활성 분석을 통해 검증한 결과, 3차원 배지 상에서 CK19을 발현하는 담관세포 특이적인 형태로의 분화가 진행되었고, 이외에도 Cftr, CK7와 같은 담관세포 특이적인 마커가 체내 유래 담관조직 수준으로 강하게 발현되었다. 또한 MDR1 수용체를 매개로 Rho123를 흡수함과 동시에 CFTR 수용체를 통해 포스콜린(forskolin) 처리시 cAMP 신호전달이 활성화되는 것을 확인함으로써 담관세포로의 분화 조건 상에서 성숙한 담관세포로 분화능을 가지고 있음을 알 수 있었다(도 6a-6d).

6. 기존 연구진에 의해 발표된 전사인자 조합(1b3)을 통한 유도간줄기세포 교차분화효율을 본 발명자가 개발한 조합(1a3)을 통한 유도간줄기세포 교차분화효율과 비교하기 위해, 전사인자 도입후 14일경 유세포분석기를 이용하여 E-cadherin 또는 EPCAM 양성 반응을 보이는 세포의 수로 산출한 결과, 각각 5.6% 대비 37.9%, 11.8% 대비38.0%로 현저하게 1a3에 의해 많은 양의 세포가 유도간줄기세포로 교차분화되는 것을 확인하였다(도 7).

7. 1b3 또는 1a3 조합을 통해 생산한 유도간줄기세포 세포주의 경우, 1a3에 의해 생산된 유도간줄기세포가 1b3에 의해 생산된 유도간줄기세포에 비하여 체내 유래 간줄기세포(LEPCs)와 더욱 유사한 전체 유전자 발현 양상을 보이는 것을 RNA sequencing 분석(heatmap 및 PCA)을 통해 확인하였다(도 8a-8b).

8. MDR1 수용체 활성 분석법, qPCR기법을 이용하여 담관세포로의 분화능을 체외에서 확인한 결과 1a3에 의해 생산된 유도간줄기세포가 1b3에 의해 생산된 유도간줄기세포에 비하여 더 많은 수의 Rho123를 흡수한 성숙한 담관세포로 분화가 되는 것을 관찰할 수 있었고, 담관세포로 유도 분화후 유의적으로 높은 수준의 담관세포 특이적 마커를 발현하고 있는 것을 알 수 있었다(도 9a-9c).

이상의 결과는 최초 5개의 전사인자를 도입후, AFP/CK19양성 콜로니 수 측정 및 mRNA유전자 발현 양상, EPCAM양성 세포수 측정 방법을 적절히 사용하여 비록 Foxa3라는 공통의 전사인자를 사용했음에도 불구하고 기존의 Foxa3와 Hnf1b간의 조합(1b3)과 비해 Hnf1a와의 조합(1a3)에서 유의적으로 높은 효율의 유도간줄기세포로의 교차분화가 가능하며 특히 생산된 유도간줄기세포의 특성이 기존에 비해 체내 간줄기세포 수준으로 향상됨과 동시에 그에 따라 담관세포로의 분화능이 월등히 개선될 수 있음을 말해준다.

결론

본 발명에서는 기존의 체세포에서 유도간줄기세포로의 낮은 교차분화효율 및 담관세포로의 분화 효율을 제고하기 위하여, 1) 간발달 및 간재생에 필수적인 전사인자를 엄격히 선별하여 최종적으로 1a3 (Hnf1α, Foxa3) 라는 조합을 개발하였고, 2) 고수준의 유도간줄기세포로의 교차분화효율을 달성하였으며 3) 유도간줄기세포로의 기본 특성과 체외에서의 담관세포 분화능 면에서도 비약적인 향상을 보여주었다.

이러한 유도간줄기세포로의 교차분화연구는 향후 유도간줄기세포를 이용한 세포치료제 개발의 가속화 및 유도간줄기세포 유래 간세포 및 담관세포를 이용한 신약물질의 독성 검증, 환자 특이적인 분화세포의 효율적인 대량생산 등에 유용하게 사용할 것으로 사료된다.

[유도담관줄기세포의 제작 및 특성분석]

실험방법

1. 유도담관줄기세포 분화 유도, 배양, 확립

본 발명의 유도간줄기세포를 EGF와 HGF가 포함된 배지(*HepSCM과 동일한 조성)에서 약 14~16번의 지속적인 계대배양과정을 거쳐 유도담관줄기세포로 분화시켰다(도 11). HepSCM 조성/배양조건은 다음과 같다: DMEM/F-12, 10% FBS (Hyclone), 0.1 μM dexamethasone (Sigma), 10 mM nicotinamide (Sigma), 1% ITS (insulin-transferrin-selenium) premix (Gibco), penicillin/streptomycin/ glutamine (Invitrogen), 10 ng/ml hepatocyte growth factor (HGF; Peprotech), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Peprotech), gelatin-coated dish

2. 유도담관줄기세포 특성분석

유도간줄기세포에서 유도담관줄기세포로의 분화과정을 추적하고 관련 신호전달체계를 quantitative PCR (qPCR) 분석법 및 면역형광염색법을 이용하여 검증하였다. 실험방법은 상술한 바와 같다. 이후 유도담관줄기세포의 체내 기능성을 검증하기 위해 1 x 10⁶의 유도담관줄기세포를 0.1% DDC(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)를 처리하여 생산한 C57Bl6/J 마우스에 이식하여 체내 담관세포로의 분화를 유도하였고 4주후 마우스에서 간을 적출하여 이식된 유도담관줄기세포의 분화정도를 면역염색법을 통해 분석하였다.

실험결과

1. 간 발달 및 간재생에 필수적인 전사인자로 알려진Foxa3, Hnf1a를 최초 5만개의 일반 체세포에 도입후 약 2주경, 간세포 (AFP), 담관세포 (CK19), 그리고 간줄기세포 (CK7, TROP2) 특이적인 마커들이 발현하는 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다 (도 12a). 1a3조합에 의해 생산한 유도간줄기세포 세포주가 간줄기세포 특이적인 성질을 나타내는지 RT-PCR, qPCR, 면역형광염색법을 통해 확인한 결과, 다양한 간세포 및 담관세포 (CK19), 간줄기세포 (CK7, TROP2)특이적인 마커를 뚜렷하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 12b-12d).

2. 1a3 를 이용하여 생산한 유도간줄기세포를 EGF와 HGF가 포함된 배지(*HepSCM과 동일한 조성)에서 약 14~16번의 지속적인 계대배양과정을 거친 결과 간세포 마커인 Afp, Alb, Hnf4a의 발현량은 감소하고, 반면 CK19, SOX9과 같은 담관세포 마커는 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 13a-13b). 특히 qPCR을 이용해 다양한 담관세포 특이적인 마커를 확인해본 결과 성숙 담관세포 특이적인 마커의 발현과 더불어 Notch2, Hes1, Jag1과 같은 Notch신호전달과 관련된 마커들의 발현양이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 13c).

상기 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 HepSCM이라는 배양조건 상에서 14~16번의 계대배양을 거쳐 유도간줄기세포가 유도담관줄기세포(1a3-iCPC)로 분화되는 과정상, Notch 신호전달체계가 깊이 관여하고 있음을 의미한다. 이를 검증하기 위해 Notch신호전달을 억제하는 약물인 DAPT를 10ng/ml처리한 결과 담관줄기세포 및 담관세포로의 분화가 완벽하게 억제(Afp, Alb, Ttr, Hnf4a 발현양 유지, 도 14a-14c)되고 유도간줄기세포 상태가 오히려 지속적으로 유지되는 것을 qPCR, 면역형광염색법, MDR1 수용체 활성 분석법을 통해 확인하였다.

3. 유도담관줄기세포의 체내 분화능을 검증하기 위해 1 x 10⁶의 유도담관줄기세포를 0.1% DDC를 처리하여 생산한 C57Bl6/J 마우스에 이식하여 체내 담관세포로의 분화를 유도하였고 4주후 마우스의 간을 적출하여 이식된 유도담관줄기세포의 분화정도를 면역염색법을 통해 분석하였다. 그 결과, 유도간줄기세포에 비해 유도담관줄기세포의 경우 유의적으로 많은 수의 담관구조가 형성되었고(도 15a-15b) 이를 CK19, OPN과 같은 담관세포 특이적인 마커로 면역염색해본 결과 압도적인 양상으로 유도담관줄기세포가 기능성을 갖춘 담관세포로 분화되는 것을 확인하였다(도 15c-15f).

이상의 결과는 1) 간발달 및 간재생에 필수적인 1a3라는 전사인자 조합을 통해 체세포를 유도간줄기세포로 교차분화시킨 후, 2) 이 세포를 지속적으로 14~16회에 달하는 계대배양 과정을 통해 담관세포 전단계인 담관줄기세포로 분화시킬 수 있음을 의미한다(도 1 참조).

결론

상기 결과는 향후 담관줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 및 담관세포와 관련된 질환 모델링, 담관세포 분화 및 발달 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용할 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Direct conversion method from somatic cells to induced cholangiocyte stem cells <130> PN170182 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3203 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 aaacagagca ggcaggggcc ctgattcact ggccgctggg gccagggttg ggggctgggg 60 gtgcccacag agcttgacta gtgggatttg ggggggcagt gggtgcagcg agcccggtcc 120 gttgactgcc agcctgccgg caggtagaca ccggccgtgg gtgggggagg cggctagctc 180 agtggccttg ggccgcgtgg cctggtggca gcggagccat ggtttctaag ctgagccagc 240 tgcagacgga gctcctggct gccctgctcg agtctggcct gagcaaagag gccctgatcc 300 aggccttggg ggagccaggg ccctacctga tggttggaga gggtcccctg gacaaggggg 360 agtcctgcgg tgggagtcga ggggacctga ccgagttgcc taatggcctt ggagaaacgc 420 gtggctctga agatgacacg gatgacgatg gggaagactt cgcgccaccc attctgaaag 480 agctggagaa cctcagccca gaggaggcag cccaccagaa agccgtggtg gagtcacttc 540 ttcaggagga cccatggcgc gtggcgaaga tggtcaagtc gtacttgcag cagcacaaca 600 tcccccagcg ggaggtggtg gacaccacgg gtctcaacca gtcccacctg tcacagcacc 660 tcaacaaggg cacacccatg aagacacaga agcgggccgc tctgtacacc tggtacgtcc 720 gcaagcagcg agaggtggct cagcaattca cccacgcagg gcagggcgga ctgattgaag 780 agcccacagg cgatgagctg ccaactaaga aggggcgtag gaaccggttc aagtggggcc 840 ccgcatccca gcagatcctg ttccaggcct acgagaggca aaaaaacccc agcaaggaag 900 agcgagagac cttggtggag gagtgtaata gggcggagtg catccagagg ggggtgtcac 960 catcgcaggc ccaggggcta ggctccaacc ttgtcacgga ggtgcgtgtc tacaactggt 1020 ttgccaaccg gcgcaaggag gaagccttcc ggcacaagtt ggccatggac acctataacg 1080 gacctccacc ggggccaggc ccgggccctg cgctgcctgc tcacagttcc cccggcctgc 1140 ccacaaccac cctctctccc agtaaggtcc acggtgtacg gtacggacag tctgcaacca 1200 gtgaggcagc cgaggtgccc tccagcagcg gaggtccctt agtcacagtg tctgcggcct 1260 tacaccaagt atcccccaca ggcctggagc ccagcagcct gctgagcaca gaggccaagc 1320 tggtctcagc cacggggggt cccctgcctc ccgtcagcac cctgacagca ctgcacagct 1380 tggagcagac atctccgggt ctcaaccagc agccgcagaa ccttatcatg gcctcgctac 1440 ctggggtcat gaccatcggg cccggggagc ctgcctccct gggacccacg ttcacgaaca 1500 cgggcgcctc caccctggtt atcggtctgg cctccactca ggcacagagc gtgcctgtca 1560 tcaacagcat ggggagtagc ctgaccacgc tgcagccggt ccagttttcc caaccactgc 1620 atccctccta tcagcagcct ctcatgcccc ccgtacagag ccacgtggcc cagagcccct 1680 tcatggcaac catggcccag ctgcagagcc cccacgcctt atacagccac aagcctgagg 1740 tggcccagta cacgcacacc agcctgctcc cgcagaccat gttgatcaca gacaccaacc 1800 tcagcaccct tgccagcctc acacccacca agcaggtctt cacctcagac acagaggcct 1860 ccagtgagcc cgggcttcac gagccaccct ctccagccac caccatccac atccccagcc 1920 aggacccgtc gaacatccag cacctgcagc ctgctcaccg gctcagcacc agtcccacag 1980 tgtcctccag cagcctggtg ttgtatcaga gttccgactc caacgggcac agccacctgc 2040 tgccatccaa ccatagtgtc atcgagactt ttatctccac ccagatggcc tcctcttccc 2100 agtaaccgtg gtgactgcct cccaggagct gggtccccag ggcctgcact gcctgcatag 2160 ggggtgagga gggccgcagc cacactgcct ggaggatatc tgagcctgcc atgccacctg 2220 acacaggctg ctggccttcc cagaagtcta cgcattcatt gacactgctg ctcctccatc 2280 atcaggaagg gatggctctg aggtgtctca gcctgacaag 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Claims (8)

1. 체외로 분리된 마우스 섬유아세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 마우스 섬유아세포에서 유도담관줄기세포(induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 Hnf1α 유전자는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 교차분화방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 Foxa3 유전자는 서열목록 제 2 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 교차분화방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 도입에서 유전자 운반체는 바이러스, 플라스미드, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 교차분화방법.
   
5. 삭제
6. Hnf1α 유전자 및 Foxa3 유전자 발현을 위한 유전자 전달체를 포함하는, 마우스 섬유아세포에서 유도담관줄기세포(induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화용 조성물.
   
7. 삭제
8. 다음 단계를 포함하는 마우스 섬유아세포에서 유도담관줄기세포(induced cholangiocyte stem cells)로의 교차분화방법:
   (a) 체외로 분리된 마우스 섬유아세포에 Hnf1α 및 Foxa3 유전자를 도입하여 유도간줄기세포를 제조하는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)의 유도간줄기세포를 성장인자 포함 배지에서 계대배양하여 유도담관줄기세포를 제조하는 단계.

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