JP2013540424A - 幹細胞の運命を調節するためのグリピカン４活性の制御及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が、幹細胞に基づく治療による変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される病的状態の処置に使用するために、弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞に、従って関する。

Description

本発明は、細胞に基づく治療に伴う奇形腫を回避可能にする幹細胞及び前駆細胞の自己複製及び分化の特性を調節するための方法に関する。本発明は、従ってまた、変性疾患、心疾患、代謝性疾患及び障害などのヒトの病的状態を処置するための新規な幹細胞に基づく治療に関する。

いくつかの進展が、異なるヒトの疾患の症状を解消するために病院で行われてきたにもかかわらず、効果的で長持ちする治療の同定は、いまだ注目の話題である。これは特に、障害並びにニューロンの、心臓の、及び筋肉の変性疾患の文脈において関連する。この種の疾患のための現在の治療は、患者の症状を緩和できる薬物の投与に重点を置いている。しかしながら、これらの処置は、しばしば副作用を引き起こし、疾患の進行を止めない。例えば、現今、パーキンソン病に罹患している患者は、Ｌ‐ドーパ及びドーパミン受容体アゴニストで処置される。しかしながら、そのような処置の有効性は、数年後に減少し、そして眩暈及び幻覚などの副作用を増加する傾向にある。

他の主な社会的及び経済的問題は、心血管疾患の処置に関連する。血管造影、バイパス手術、及び血管形成術は、一大産業を示している。百万を超える心臓血管造影が、実際に毎年行われ、そしてそれは、莫大な年間コストを示す。それにもかかわらず、この高額な手術は、心臓病患者のために、物理的に侵襲性及び外傷性である。さらに、広範囲に及ぶ分析に基づいて、この費用のほとんどが無駄になっていると思われる。実際、病歴の評価において、この種の手術は、疾患よりも５〜１０倍、より命にかかわり、そして多くの場合有効ではないことが示されてきた。

従って、代替的な及び有効な方策（strategy）が、多くの重篤なヒトの疾患を解消するために必要である。

幹細胞に関する研究は、そのような目的を実現するためにそれらを使用することの可能性をもたらしてきた。幹細胞は、それらの自己複製及び複数の細胞型に分化するための能力により定義され、医学及び薬理学における応用が非常に期待される。現在までに、それらは、さまざまな方法により得られることができる。例えば、幹細胞は、胚から分離することができる（embryonic stem cells or ESCs; Martinら、(1981) Proc. Natl. Acad. Science USA 78:7634-7638）。それらは、成体組織中にも存在するが、それらの分化能は、すべての体細胞型に分化する独自の特徴を有するＥＳＣよりも制限されている。新規の種類の多能性幹細胞は、正常な皮膚細胞の脱分化を通じて最近作り出された。これらの幹細胞は、人工多能性幹細胞と呼ばれている（iPS cells; Takahashiら、(2007) Cell 131:861-872）。それらは、移植における免疫拒絶のリスク及び胚破壊に関連する倫理的な問題を克服することを可能にしつつ、ＥＳＣの同様の特徴及び独自の治療可能性を保持する。

現在開発中である方策は、幹細胞の移植、患者自身の幹細胞の操作、及び生化学的シグナル又は反応を起こすように幹細胞を誘発する薬物を放出する足場材料（scaffold material）の使用を含む。しかしながら、病院における幹細胞の応用は、依然として主要な現実的課題を克服するために研究者の能力に依拠している。第一に、幹細胞の分離及び維持は、培地条件の改良をさらに必要とする。第二に、幹細胞分化の効率が、実質的に高められる必要がある。第三に、幹細胞の分化は、薬物送達及び治療を妨げる状況である同種の細胞集団というよりもむしろ異種の細胞集団を生じる（Xi及びZhang (2008) J. Cell. Biochem. 105:1153-1160; Murry及びKeller (2008) Cell 132:661-80）。第四に、これらの異種の培養物は、インビボにおいてインプラントした場合、腫瘍又は奇形腫になる傾向がある残存多能性幹細胞を含む（Blumら、(2009) Cell Cycle 8:3822-30）。従って、医学及び薬理学において幹細胞の成功した開発の必要条件は、容易に利用でき及び多面的な機能を有する幹細胞生物学の重要な調節因子に作用する効果的かつユーザーフレンドリーな方法論の確立である。

細胞の運命及び性質は、可溶性増殖因子、細胞外マトリックスの相互作用、及び細胞間相互作用を含むそれらの微小環境に依拠する。可溶性増殖因子は、重要なシグナル伝達プレイヤーの一つである。具体的に、それらは、生理学的な及び病理学的な条件において細胞の運命を進展するために単独又は共同して働き、そしてそれらは、それらの受容体活性化の時間及び強度に従って標的細胞上にさまざまな生物学的生産を引き起こす。ヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリピカン（Ｇｐｃ）などの細胞表面タンパク質は、放出されるペプチドのレベルと細胞との相互作用を調節するための主導的な役割を担う。

グリピカンタンパク質は、ＧＰＩアンカーにより細胞膜と結合したコアドメイン、及び付着したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖からなる。グリピカンは、ＧＡＧを介して、ケモカイン、成長因子／形態形成因子（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）などの多数の細胞外マトリックスタンパク質と結合することが提示されてきた（Filmusら、(2008) Genome Biol. 9:224; Ficoら、(2007) Cell Mol Life Sci.）。結合に関して、グリピカンは、周囲環境におけるリガンド濃度に依拠して、これらの細胞外シグナルと受容体との相互作用を促進できるか、又は受容体活性化を下方制御／遮断することによりそれらを隔離することができるかのいずれかである（Gutierrezら、(2010) Mol. Cell. Biol. 30:1634-1649; Yanら、(2009) Development Cell 17:470-481）。遺伝子に関する及び発生学的研究は、グリピカンが、形態形成及び成体生理学の間の細胞シグナル伝達事象を調節することを示す（Galliら、(2003) Development 130:4919-4929; Luxardiら、(2007) Biochem. Biophys. Res. Comm. 352:55-60）。

本発明は、グリピカン４タンパク質が、さまざまな幹細胞型により発現され、並びに自己複製及び分化の幹細胞特性を確立し及び維持するために必要であることを本発明者等が発見したことに基づく。具体的には、本発明者等により行われたマウスＥＳＣにおけるグリピカン４の生物学的機能の遺伝子に関する研究は、グリピカン４が自己複製対分化の適切なバランスを確立するために必要であることを明らかにした。特に、本発明者等は、ＥＳＣにおけるグリピカン４活性の減少が、細胞が多能性シグナルを奪われた場合、又はそれらが分化シグナルに供される場合、早期分化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を引き起こすことを示した。さらに、ｇｐｃ４^mut ＥＳＣを使用するインビボアッセイを行うことにより、本発明者等は、これらの細胞が、野生型と対照的に、ヌードマウスに移植した場合、奇形腫を発症しないが、それらが、依然としてすべての胚性組織について発生する能力があることを示した。要するに、本発明者等の知見は、ｇｐｃ４^mut細胞が、多能性であるが、非許容的な自己複製条件に置かれた場合に、時期尚早に分化する固有の能力を有することを示す。

本発明は、従って、幹細胞又は前駆細胞に関し、ここで多くのグリピカンファミリーの発現及び／又は活性が、変性疾患、心疾患、代謝性疾患及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療法による処置用に使用するために、弱められ又は消失（abolish）させられている。

第二態様において、本発明は、幹細胞又は前駆細胞中のグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を弱め又は消失することを含む、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化（ｅａｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を示す幹細胞又は前駆細胞を生産するためのインビトロ方法に関し；それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を得る。

本発明の第三態様において、体細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を一過性に増加し又は誘導し、次に、一過性に減少し又は弱めることを含む、体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生産するためのインビトロ方法に関連し、それによって、人工多能性幹細胞を得る。

第四態様において、本発明は、上記インビトロ方法により取得できる幹細胞、前駆細胞、又はｉＰＳ細胞に関する。

本発明の第五態様は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のための上記インビトロ方法により取得できる幹細胞又は前駆細胞に関連する。

本発明の第六態様は、以下のステップ：
ａ）上記方法によって細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産し、及び
ｂ）細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップａ）で生産した幹細胞又は前駆細胞を供すること
を含む、幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞を生産するためのインビトロ方法に関し、それによって分化した細胞を生産する。

本発明の第七態様は、毒性学的スクリーニングのための、上記インビトロ方法により生産された幹細胞、前駆細胞、又はｉＰＳ細胞の使用を目的とする。

第八態様において、本発明は、サンプル由来の幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのグリピカンファミリーのメンバーの使用に関連する。

本発明の第九態様は、サンプル由来の幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法に関し、ここでサンプルは、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し；それによって、サンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する。

本発明の第十態様は、ガンの処置用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子に関連する。

本発明の第十一態様は、変性疾患後の組織再生誘導用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストに関する。

図１は、野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体（ｍｕｔ）胚性幹細胞について、６日にわたる神経分化の半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析を示す。多能性マーカー（Ｏｃｔ４）の転写及び神経細胞系のマーカー（ネスチン）の転写を示す。 図２は、野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体（ｍｕｔ）胚性幹細胞について、７日にわたる心臓分化の半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析を示す。多能性マーカー（Ｏｃｔ４）の転写及び心臓細胞系のマーカー（αＭＨＣ）の転写を示す。 図３は、６日にわたる野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体（ｍｕｔ）胚性幹細胞の分化誘導の免疫染色によるＯｃｔ４及びネスチンの発現を示す。 図４は、野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体（Ｇｐｃ４．ｍｕｔ）胚性幹細胞について、６日にわたるＯｃｔ４及びネスチンの発現の定量分析を示す。結果は、Ｏｃｔ４及びネスチンポジティブ細胞のパーセンテージで示す。^***は、Ｐ＜０．００１を示し、及び^**は、Ｐ＜０．０２を示す。 図５は、野生型（ｗｔ）胚性幹細胞を左脇腹に注射し、及びＧｐｃ４変異体（Ｇｐｃ４．ｍｕｔ）細胞を右脇腹に注射した、注射後４週間のヌードマウスの実施例を示す。 図６は、図５で示されたようなマウスから解剖された外因性の細胞塊を示す。 図７は、図５で示されたようなマウスから解剖された外因性の細胞塊（ｇ）を示す。 図８は、Ｗｎｔタンパク質の異なる投与量が細胞に添加された場合、野生型（ｗｔ）又はＧｐｃ４変異体細胞（Ｇｐｃ４．ｍｕｔ）において測定されたＷｎｔ活性のレベルを示す。 図９は、経時的な野生型（ｗｔ）心筋細胞、及びＧｐｃ４変異体（Ｇｐｃ４．ｍｕｔ）心筋細胞間の胚体鼓動のパーセンテージを示す。 図１０は、野生型（ｗｔ）又はＧｐｃ４変異体（Ｇｐｃ４．ｍｕｔ）細胞の分化誘導について免疫染色によるドーパミン作動性神経マーカー（ＴＨ）の発現を示す。 図１１は、２つのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系（すなわちＧｐｃ４^gt-1及びＧｐｃ４^gt-2）対野生型（ｗｔ）ＥＳＣにおけるｇｐｃ４転写レベルの半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析を示す。ｇｐｃ４転写レベルが、同等の野生型に対してＧｐｃ４変異体ＥＳＣにおいて特異的に下方制御されていることに留意する。左の数は、増幅産物のサイズを示す（キロベース、Ｋｄ）。 図１２は、Ｇｐｃ４変異体ＥＳＣ系、Ｇｐｃ４^gt-1変異体、及び野生型（ｗｔ）ＥＳＣにおけるＧｐｃ４タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。アクチンタンパク質レベルを、ローディング対照として使用した。 図１３は、最適培地条件で生育した野生型（ｗｔ）由来、及び２つのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系（Ｇｐｃ４^gt-1及びＧｐｃ４^gt-2）由来の全ＲＮＡの半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析を示す。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ‐２、Ｒｅｘ‐１、及びＧａｐｄｈの増幅産物を示す。 図１４は、１０日目における野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系（Ｇｐｃ４^gt-1）中のＴｕｊ１ポジティブ細胞の免疫蛍光画像を示す（４０倍の倍率；上のパネル）。下のパネルは、１０日目におけるＧｐｃ４^gt-1と野生型（ｗｔ）を比較した増進された神経回路網が現れている明視野像を示す（１０倍の倍率）。 図１５は、２、４、６、８、１０及び１３日目における神経分化野生型（ｗｔ）及びＧｐｃ４変異体（Ｇｐｃ４^gt-1）細胞から抽出された全ＲＮＡの半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析を示す。Ｏｃｔ４、ネスチン、Ｍａｐ２、及びＧａｐｄｈの増幅産物を示す。 図１６は、野生型（ｗｔ）心筋細胞（白バー）、及び２つのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系（Ｇｐｃ４^gt-1（ハッシュバー）、及びＧｐｃ４^gt-2（ドットバー））由来の心筋細胞における６日目から１５日目までの鼓動部分（ｂｅａｔｉｎｇ ｆｏｃｉ）のパーセンテージを表したヒストグラムを示す。 図１７は、野生型（ｗｔ）、及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系（Ｇｐｃ４^gt-1）のＥＢ分化の間の２、５、７、１０日目で抽出された全ＲＮＡにおけるＯｃｔ４、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、Ｎｋｘ２．５、α‐Ｍｈｃ、Ｇａｔａ４、Ｔｄｏ、及びＧａｐｄｈ発現の半定量的ＲＴ‐ＰＣＲを示す。 図１８は、ｓｈＲＮＡ対照及びｓｈＲＮＡ Ｇｐｃ４をエレクトロポレーションされた脳におけるＢ細胞（白バー）、Ｃ細胞（ハッシュバー）、及びＡ細胞（ドットバー）の定量分析を示す。細胞をカウントし、ＧＦＰ発現細胞の総数に対するＭａｓｈ１ポジティブ及びＤＣＸポジティブ細胞のパーセンテージとして報告した。 図１９は、パーキンソン病のラットモデルにおける運動非対称性に関して移植されたＧｐｃ４変異体細胞と同等の野生型（ｗｔ）細胞の影響の対比を示す。シクロスポリンの免疫反応を抑制されたラットに、６‐ＯＨＤＡを黒質に注入することにより一側性病変を来した（左側）。移植病変ラットにおける機能的回復を、反対側の前肢（右側）について無動の回復に関して採点するために、円筒試験（ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｔｅｓｔ）を実施することにより分析した。自発的な前肢使用を、２つの時点（３及び６週間）で評価し、そしてデータを、全肢のパーセンテージとしての右肢（損傷）の使用として示す。３０％回復が、Ｇｐｃ４変異体細胞移植の３週間後の場合のみ起こったことに留意する。Ｇｐｃ４変異体（上のパネル）、及び野生型（ｗｔ）細胞（下のパネル）の移植後、６週間での脳切片のエオシン／ヘマトキシリン染色を、図の右に示す。野生型細胞を移植した脳において大きな奇形腫が発生したが、Ｇｐｃ４変異体細胞を移植した脳では発生しないことに留意する。

細胞
本明細書で使用されるように、用語「体細胞」又は「分化した細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ）」は、区別なく使用され、そして具体的な構造を示し、具体的な機能を提供する対象の非胚細胞（ｎｏｎ‐ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）を意味し、ここで遺伝子の発現における潜在的可能性が制限されている。

本明細書で使用されるように、用語「幹細胞」は、自己複製（すなわち、同じ分化能を有する子孫）を行うことができ、及びまた分化能についてより制限された子孫細胞を生産する細胞を意味する。従って、本発明によれば幹細胞は、以下の２つの特性：
（ｉ）自己複製、すなわち未分化状態を維持しつつ、細胞分裂の多数のサイクルを通過する能力；及び
（ｉｉ）潜在能力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、すなわち特異的な細胞型に分化する能力
を持っている。

本発明の文脈において、幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、及び寡能性幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を包含する。

用語「全能性幹細胞」は、胚細胞及び胚体外細胞（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌ）型に分化できる細胞を意味する。そのような細胞は、完全な生存能力がある生命体を構成する。これらの細胞は、卵子と精細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数回の分割により生産される細胞も、全能性である。

用語「多能性幹細胞」は、いずれかの三胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉に分化する能力を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞は、任意の胎児又は成体細胞型を生じさせることができる。しかしながら、単細胞又は多能性細胞の集合体（conglomerate）は、それらが、胚をまとめる能力を欠いているため、胎児又は成体動物に成長できない（Mitolipov及びWolf (2009) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114:185-199）。

用語「多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、多くの細胞に分化できるが、細胞の近縁のファミリーのものにのみ分化できる幹細胞を意味する。

用語「寡能性幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、リンパ球系幹細胞又は骨髄系幹細胞などのいくつかの細胞にのみ分化できる幹細胞を意味する。

本発明の文脈では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）；胚本体の幹細胞及び羊水幹細胞、臍帯血幹細胞、ウォルトン膠質（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ）幹細胞、羊膜幹細胞、胎盤幹細胞などの胚体外組織の幹細胞を含む胎児性幹細胞；成体幹細胞、ガン幹細胞、並びに人工多能性幹細胞を包含する。好ましくは、本発明によれば幹細胞は、胎児性幹細胞、成体幹細胞、ガン幹細胞、及び人工多能性幹細胞を包含する。より好ましくは、本発明によれば幹細胞は、胎児性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞を包含する。

用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞又は桑実胚期前の胚の内細胞塊の胚盤葉上層組織由来の多能性幹細胞を意味する。ヒト胚は、受精後４〜５日で胞胚期に達し、その時点で、それらは５０〜１５０の細胞からなる。胚性幹細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２などのいくつかの転写因子、及びグリコリピド、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４などの細胞表面タンパク質、及びケラチン硫酸抗原Ｔｒａ‐１‐６０とＴｒａ‐１‐８１の発現によりまた定義されてもよい。

好ましくは本発明によれば、用語「幹細胞」は、ヒト胚由来の幹細胞を含まない。より好ましくは本発明によれば、幹細胞は、ヒト胚に直接由来しない。さらに好ましくは、公的に入手可能な及び以前に確立された幹細胞系に由来する胚性幹細胞は、本発明において使用されるような「幹細胞」の意味の範囲内に含まれる。

特に、表１に記載の細胞系の一つに由来するヒト胚性幹細胞は、本発明において使用されるような「幹細胞」の意味の範囲内に含まれる。

用語「胎児性幹細胞（ｆｅｔａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、胎児本体、又は好ましくは臍帯血、羊水、ウォルトン膠質、羊膜、及び胎盤を含む妊娠の間に現れる胚体外組織のいずれかに由来する幹細胞を意味する。

「羊水幹細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、羊水中に存在する幹細胞に対応する。それらは、すべての三胚葉由来の異種集団を表す。

「羊膜幹細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、羊膜又は羊膜（ａｍｎｉｏｎ）の内層（羊膜上皮細胞）、又は外層（羊膜間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、若しくは羊膜由来の幹細胞）に由来する幹細胞に対応する。

「臍帯血細胞」は、臍帯血に由来する幹細胞に対応し、そして特に、造血幹細胞及び間葉系幹細胞を含む。

「臍帯マトリックス幹細胞」、「臍帯血管周囲細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ）」、又は「臍帯間質細胞」とも呼ばれる「ウォルトン膠質幹細胞」は、ウォルトン膠質として公知の、臍帯の外側領域に由来する幹細胞に対応する。ウォルトン膠質は、臍帯の２つの動脈と１つの静脈を囲む粘液状の結合組織である。

「胎盤幹細胞」は、胎盤組織由来の幹細胞に対応し、そして絨毛間葉系間質細胞、及び絨毛栄養膜細胞を含む。

本明細書で使用されるように、用語「成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」、「体性幹細胞」、及び「組織特異的幹細胞」は区別なく使用され、そしてそれ自体のような他の細胞を分割して作り出すための能力、及びそれ自体よりもより分化した細胞を分割して作り出すための能力を有する発達した生物に見られる未分化細胞を意味する。好ましくは、成体幹細胞は、多能性幹細胞である。成体幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋を含むさまざまな成体組織から単離されてきた。これらの幹細胞のそれぞれは、遺伝子発現、因子応答性、及び培地中の形態に基づいて特徴付けることができる。本発明の文脈において、成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、嗅成体幹細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、及び神経堤幹細胞を包含する。

「造血幹細胞」は、骨髄で見られる幹細胞を意味し、そしてそれは血液型を生じさせる。

「乳腺幹細胞」は、乳腺に由来する幹細胞を意味し、そしてそれは、乳腺の内腔及び筋上皮細胞の両方を生じさせる。

「間葉系幹細胞」は、間質起源の幹細胞を意味し、そして特に、脂肪組織、肺、骨髄、及び歯に由来する。

「脂肪由来幹細胞」は、脂肪組織で見られる幹細胞を意味する。

「内皮幹細胞」は、骨髄で見られる幹細胞の第３の種類を意味する。

「神経幹細胞」は、神経系で見られる幹細胞を意味する。

「心臓幹細胞」は、心臓で見られる幹細胞を意味する。

「嗅成体幹細胞」は、鼻の裏に存在する嗅粘膜で見られる幹細胞を意味する。

「神経堤幹細胞」は、毛包、消化管、坐骨神経、心室流出路、並びに脊髄及び交換神経節で見られる幹細胞を意味し、そしてそれは、胚性神経堤の幹細胞のレムナントを表すように見える。神経堤幹細胞は、神経細胞、シュワン細胞、筋線維芽細胞、軟骨細胞、及びメラニン細胞を生じさせる可能性がある。

本明細書で使用されるように、「ガン幹細胞」は、正常細胞に関連する特性、具体的には、特定のガンサンプルで見られるすべての細胞型を生じさせる能力を有するガン細胞を意味する。好ましくは、ガン幹細胞は、はっきりと区別できる集団として腫瘍において存在し、新たな腫瘍を生じさせることにより、再発、耐性及び／又は転移を引き起こす。ガン幹細胞の例は、当業者に周知であり、及び具体的には、白血病性幹細胞、脳ガン幹細胞、乳ガン幹細胞、大腸ガン幹細胞、卵巣ガン幹細胞、膵臓ガン幹細胞、及び前立腺ガン幹細胞を含む。

本明細書で使用されるように、用語「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、分化した細胞（例えば、非多能性細胞）、典型的に成体線維芽細胞などの成体体細胞に人工的に由来（例えば、完全又は部分的逆転により誘導される）する多能性幹細胞の種類を意味する。

本明細書で使用されるように、用語「前駆細胞」は、分化により生じることができる細胞と比較して、より原始的である（例えば、完全に分化した細胞よりも発生経路又は進行に従ってより初期である）細胞表現型を有する細胞を意味する。しばしば前駆細胞は、有意又は非常に高い増殖能も有する。前駆細胞は、発生経路及び細胞が成長し及び分化する環境に依拠して、複数のはっきりと区別できる分化した細胞型、又は単一に分化した細胞型を生じさせることができる。好ましくは、本発明の文脈において、前駆細胞は、ヒト胚に直接由来しない。

グリピカン
本発明の文脈において、用語「グリピカンファミリー」は、グリコシル‐ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞膜の外表面に結合しているヘパラン硫酸プロテオグリカンのグループを意味する。ヒトゲノムにおいて６つのグリピカンファミリーメンバー：グリピカン１、グリピカン２、腸管タンパク質ＯＣｌ‐５又はＧＴＲ２‐２又はＭＸＲ７とも呼ばれるグリピカン３、Ｋ‐グリピカンとも呼ばれるグリピカン４、グリピカン５、及びグリピカン６が存在する。グリピカンタンパク質は、５５５〜５８０の間のアミノ酸長である。それらは特に、Filmusら、（２００８）Genome Biology 9:224において記載される。

グリピカンファミリーのすべてのメンバーは、Ｎ末端分泌シグナルペプチド、ＧＰＩアンカーの付着のために必要である推定疎水性Ｃ末端シグナル配列、及び膜付着点近くにグリコサミノグリカン鎖の挿入のための２〜４のコンセンサス部位を運ぶ（Song及びFilmus (2002) Biochim. Biophys. Acta 1573:241-246）。それらはすべて、それらの主要なポリペプチド配列の保存を示す。特に、１４個のシステイン残基が保存され、分子内ジスルフィド結合を形成し、すべてのグリピカンが３次元構造を維持すると考えられる。

典型的に、ヒトグリピカン１のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｕｍｂｅｒ）Ｐ３５０５２の下、引用され；ヒトグリピカン２のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーＱ８Ｎ１５８の下、引用され；ヒトグリピカン３のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーＰ５１６５４の下、引用され；ヒトグリピカン４のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーＯ７５４８７の下、引用され；ヒトグリピカン５のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーＰ７８３３３の下、引用され；及びヒトグリピカン６のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーＱ９Ｙ６２５の下、引用される。本発明の文脈において、上記スイスプロットの引用は、２０１０年５月５日に利用可能であったものである。

グリピカンは、異なる胚の構造の形態形成の間に、主に発現する（Song及びFilmus (2002) Biochem. Biophys. Acta 1573:241-246）。それらの細胞内局在のため、それらは、細胞外環境に存在するすべての手がかり（cue）、特に分泌されたシグナルペプチドに供され、そしてそれは、細胞生理学的プロセスの基礎をなす胚発生、組織の恒常性、及び病態生理学の重要な制御因子である。グリピカンは、これらの指令的なシグナルの必須の細胞膜調節因子として進化してきた。特にそれらは、標的細胞が定義された細胞内及び発生の事象に関して受けることができるように、これらのシグナル伝達の手がかりが、適切な強度で及び適切な時に細胞膜で気づかれることを確保する（Galliら、(2003) Development 130:4919-4929; Ficoら、(2007) Cell Mol. Life Sci.; Williamsら、(2010) Proc. Natl. Acad. Sci. 107:5869-5874; Capurroら、(2008) Dev Cell. 14:700-11; Capurroら、(2005) Cancer Res. 65:6245-54）。これと一致して、グリピカンの機能の変化は、ヒト先天的形成異常及びガンの根底にある（Cano-Gauciら、(1999) J Cell Biol. 146(1):255-64; Capurroら、(2005) Cancer Res. 65(14):6245-54）。

グリピカンの主な機能は、Ｗｎｔｓ、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇｓ（Ｈｈｓ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のシグナル伝達を調節する（Topczewskiら、(2001) Developmental Cell 1:251-264; Songら、(2005) J. Biol. Chem. 280:2116-2125; Yan及びLin (2007) Developmental Biology 312:203-216; Ohkawaraら、(2003) Development 130:2129-2138; Williamson (2007) Cancer Res. 67(1):57-65）。生物学的な文脈に依拠して、グリピカンは、シグナル伝達活性を促すことができるか、又は阻害することができるかのいずれかである。

好ましくは、本発明の文脈において、グリピカンファミリーのメンバーは、グリピカン４である。

グリピカン４は、発生している前脳、すなわち前腸内胚葉細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｃｅｌｌ）及び前方神経隆起細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｒｉｄｇｅ ｃｅｌｌ）の誘導及びパターン形成のために重要である２つのシグナル伝達中心によりマウス胚において発現する最も重要なグリピカン遺伝子である。前方神経隆起に隣接する前方神経外胚葉細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）におけるグリピカン４の発現は、グリピカン４が、細胞を誘導し及び応答することの両方におけるシグナル伝達を調節するかもしれないことを示唆している（Luxardiら、(2007) Biochem. Biophys. Res. Comm. 352:55-60）。マウス胚における頭屈（ｈｅａｄ‐ｆｏｌｄ）期の間、グリピカン４は、推定前脳領域で主に発現する。続いて、その発現は、発生している前脳の神経前駆に存在する（Hagiharaら、(2000) Developmental Dynamics 219:353-367）。

一般的に、グリピカン４のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。好ましくは、本発明によれば、グリピカンファミリーのメンバーは、配列番号１と少なくとも８０％の同一性がある配列を含むか、又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性がある配列からなるタンパク質であり、より好ましくは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性がある配列を含むか、又は配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性がある配列からなるタンパク質である。

本明細書で意図したように、第二アミノ酸配列と少なくともｘ％の同一性がある第一アミノ酸配列は、第二ペプチド配列の全長に関して、２つの配列が最適に整列された対である場合、ｘ％が、第二配列のそれらのペアのアミノ酸と同一である第一配列のアミノ酸の数を示すことを意味する。本明細書で意図したように、２つの配列は、ｘが最大である場合、最適に整列された対であるといわれる。

アライメントは、手動又は自動で行うことができる。ペプチド配列の自動化された整列のためのアルゴリズムは、当業者に周知であり、そして例えば、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載され、ブラスト（Ｂｌａｓｔ）ソフトフェアなどのソフトウェアにより実装される。「ニードル（ｎｅｅｄｌｅ）」プログラム、そしてそれは、２つの配列の全長を検討する場合、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム（Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用してそれらの最適なアライメント（ギャップを含む）を見つけるが、例えば本発明に従って同一性のパーセンテージを計算するために使用されてもよい。ニードルプログラムは、例えば、ｅｂｉ.ａｃ.ｕｋワールドワイドウェブサイト上で入手できる。本発明に従った同一性のパーセンテージは、好ましくは、１０．０と同等の「ギャップオープン（Ｇａｐ Ｏｐｅｎ）」パラメーター、０．５と同等の「ギャップエクステンド（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ）」パラメーター、及びＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを有するＥＭＢＯＳＳ：：ニードル（グローバル）プログラムを使用して計算する。

上で定義された配列と少なくとも８０％同一である前記アミノ酸配列は、例えば少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠損、又は置換により、及び／又は化学処理により、変異により天然のペプチド配列から得てもよい。

本発明によれば、グリピカンファミリーの数は、また配列番号１の配列の断片からなってもよい。

本明細書で使用されるように、引用配列の用語「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、引用配列の１つに劣る長さを有する配列を意味する。本発明の文脈において、断片は、例えば、１０〜５５０の間のアミノ酸、より好ましくは、５０〜４５０の間のアミノ酸、１００〜３５０の間のアミノ酸、又は１５０〜２５０の間のアミノ酸を含む長さを有してもよい。

本発明によれば、断片は特に、グリピカンファミリーのメンバーの断片でもよく、及び好ましくはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）付着部位を欠いているグリピカンコアタンパク質か、又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを欠いているグリピカンタンパク質のＮ末端ドメインのいずれかを含んでもよい。これらの機能性ドメインは、例えば、Williamsら、(2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(13):5869-5874、及びZittermanら、(2010) Int. J. Cancer. 126(6):1291-1301に記載されている。

グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞
本発明の第一態様は、上で定義されたような幹細胞又は前駆細胞の使用に関し、ここでグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性は、弱められ又は消失させられている。

本明細書で使用されるように、用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の生産、必要に応じて、タンパク質の分泌、該当する場合は、これらに限定されないが、例えば、転写、翻訳、折りたたみ、修飾、及びプロセシングを含む細胞プロセスを意味する。

本明細書で使用されるように、用語「グリピカンファミリーのメンバーの活性」は、グリピカンファミリーのメンバーにより介在される任意の生物活性を含む。例えば、グリピカンは、Ｗｎｔｓ、ヘッジホッグ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のシグナル伝達を調節する。

グリピカンファミリーのメンバーの活性を評価するための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、Williamsら、(2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(13):5869-5874、及びYanら、(2009) Developmental Cell 17:471-484に記載されている。それらは、特に、Ｗｎｔ又はＦＧＦｓなどのグリピカンリガンドにより引き起こされるシグナル伝達経路の活性化のアッセイを含む。特に、グリピカン４の活性は、ＥＳＣにおけるＷｎｔ経路の活性化をアッセイすることにより、又は神経外胚葉細胞におけるＦＧＦ経路の活性化をアッセイすることにより評価してもよい。

用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「弱める（ｒｅｄｕｃｅ）」、「消失する（ａｂｏｌｉｓｈ）」、又は「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、本明細書で一般的に、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「弱める（ｒｅｄｕｃｅ）」又は「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」又は「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、少なくとも２０％の減少、又は少なくとも３０％の減少、又は少なくとも４０％の減少、又は少なくとも５０％の減少、又は少なくとも６０％の減少、又は少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少、又は少なくとも９０％の減少、又は１００％までの減少（例えば、参照サンプルと比較して消失レベル）、又は参照レベルと比較して１０〜１００％の間の任意の減少を意味する。好ましくは、「消失（ａｂｏｌｉｓｈ）」は、少なくとも約９０％の減少、又は１００％までの減少（例えば、参照サンプルと比較して消失レベル）を意味する。

用語「統計的に有意」又は「有意」は、統計学的有意性を意味し、及び分子濃度の正常未満、又はより低い２標準偏差（２ＳＤ）を一般的に意味する。当該用語は、差がある統計的証拠を意味する。帰無仮説が実際正しい場合、帰無仮説を棄却する決定の確率として定義される。決定は、しばしばＰ値を使用してなされる。本発明は、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性の減少又は消失が、これらの細胞の初期分化の誘導を可能にすることを示してきた。従って、幹細胞又は前駆細胞は、ここで本発明によれば、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられており、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞である。

本発明の目的は、従ってまた、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を弱めること又は消失することを含む、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産するためのインビトロ方法であり；それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を取得する。

本発明の文脈において、用語「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」又は「細胞分化（ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、それによって細胞が、発生経路のさらに下流に移動し、そしてより特定化され、及び最終分化した細胞にさらに近づいた細胞に関連することが知られているマーカー及び表現型の特徴を発現し始めるプロセスを意味する。分化は、それによって細胞がより特定化された表現型を取る、例えば、他の細胞型とはっきりと区別できる１つ以上の特徴又は機能を獲得する発生上のプロセスである。

本明細書で使用されるように、「初期分化を示す細胞（ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎ ｅａｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という表現は、細胞分化を引き起こす同様の環境条件に供された場合、野生型又は非前処理幹細胞又は前駆細胞よりも、より特定化された細胞に、より素早く分化する幹細胞又は前駆細胞を意味する。典型的に、本発明によれば、初期分化を示す細胞は、細胞分化を引き起こす同様の環境条件に供される場合、野生型又は非前処理細胞よりも１〜５日早く、特に２〜４日早く、好ましくは３日早くそれらの分化の次のステップに到達する。

本明細書で使用されるように、「細胞分化を引き起こす環境条件（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という表現は、幹細胞又は前駆細胞が、より特定化された細胞への前記細胞の分化を引き起こすために培養される培養条件を意味する。細胞分化を引き起こす環境条件は特に、細胞が培養される培地の特性、適切な細胞フィーダー層の存在又は不存在、温度条件、湿度、大気のＣＯ₂含有量、又は転写因子を発現している細胞の形質移入を包含する。当業者に周知なように、細胞分化を引き起こす環境条件は、培養される細胞型、及び生産される特定化された細胞型に依拠する。特に、特定の系列に向かう分化は、内因性の転写因子を活性化することにより、形質移入因子を偏在的に発現している細胞を形質移入することにより、選択された成長因子に細胞を供することにより、又は系列誘導できる細胞型で細胞を共培養することにより実現されてもよい。幹細胞又は前駆細胞はまた、成長因子及び／又はそれらのアンタゴニストの組み合わせにより目的の系列に分化させてもよい。特定の組織型の分化した細胞を得るために、幹細胞又は前駆細胞の細胞培養物中に添加してもよい主要な誘導因子は、例えば、Trouson (2006) Endocrine Rev. 27:208-219において要約される。好ましくは、本発明によれば、細胞分化を引き起こす環境条件は、神経又は心臓分化を引き起こす環境条件である。

神経分化を引き起こす環境条件は、例えば、Ficoら、(2008) Stem Cells and Development 17:573-584、Yingら、(2003) Nat Biotechnol. 21(2):183-186、及びVierbuchenら、(2010) Nature. 463(7284):1035-1041に記載されている。典型的に、神経分化は、以下のプロトコールを使用して引き起こされてもよい。０日目で、ＥＳＣは、単一細胞懸濁液中で分離されてもよく、及び１０００細胞／ｃｍ²が、ゼラチンコートプレート上に播種されてもよい。培地は、好ましくは、分化プロセスの間、毎日交換する。神経分化のための培地（血清不含ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）添加培地）は、１５％のＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノールを添加したノックアウトダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）最小必須培地を典型的に含んでもよい。

心臓分化を引き起こす環境条件は、例えば、Maltsevら、(1993) Mech Dev. 44(1):41-50に記載されている。典型的に心臓分化は、以下のプロトコールを使用することにより引き起こされてもよい。胚体（ＥＢ）は、５ｍｌのＰＢＳを含む１０ｃｍの細菌用皿の蓋の上に懸滴（３００細胞／３０μｌドロップ）でＥＳＣから調製してもよい。ＥＢを含む懸滴は、２日間、５％のＣＯ₂を含む大気中、３７℃でインキュベートしてもよい。懸滴は、その後、２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で洗浄し、新しい皿に再度播種し、そしてさらに３日間３７℃でインキュベートして５日齢のＥＢを産生する。５日目に、ＥＢは、鼓動している心筋細胞の形態分析のためにゼラチンコート２４ウェルプレート上に別々に播種してもよく、ＲＴ‐ＰＣＲ及びウェスタンブロットのために１００ｍｍの組織培養プレート上に播種してもよい。

幹細胞又は前駆細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を弱め又は消失させるための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、核酸分子阻害剤の使用、及びグリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストと幹細胞又は前駆細胞とを接触することを含む。ピリグリカンファミリーのメンバーのアンタゴニストは、特に可溶性グリピカン３（例えば、Zittermanら、(2010) Int J Cancer. 126(6):1291-301に記載されている）、グリピカン４抗体（例えば、Geraldesら、(2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48:5750-5755に記載されている）、グリピカン３抗体（例えば、Ishiguroら、(2008) Cancer Res. 68(23):9832-9838に記載されている）、及びグリピカン５抗体が挙げられる。

適切な核酸分子阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡなどのアンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡｉを含む。

遺伝子のインビボでの翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第７，４２５，５４４号；米国特許第７，３０７，０６９号；米国特許第７，２８８，５３０号；米国特許第７，１７９１７９６号）。アンチセンス核酸は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）などの特定の核酸分子の少なくとも一部と相補的であり、又はハイブリダイズする核酸分子（例えば、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、若しくは修飾（例えば、２’‐Ｏ‐アルキル（例えば、メチル）置換分子などの分子の安定性を増加する修飾）、又はそれらの組み合わせを含む分子）である（Weintraub (1990) Scientific Am. 262:40-46）。アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡｓなどの一致する核酸とハイブリダイズして２本鎖分子を形成し、そしてそれは、細胞が２本鎖ｍＲＮＡを翻訳しないので、ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。本発明で使用されるアンチセンス核酸は、例えば、少なくとも１５、２０、２５、５０、７５、又は１００ヌクレオチド長、典型的に少なくとも１０〜１２ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸はまた、抑制性二本鎖を形成することを意図される標的核酸と同じ長さであってもよい。アンチセンス分子は、グリピカンファミリーのメンバー、特にグリピカン４を対象にするアンチセンス分子は、当該技術分野において公知であり、本発明における使用のために特に適切である。そのようなアンチセンス分子は、例えば、Hauptら、(2009) J Cell Physiol. 220(3):780-791; Taylor (2009) PLoS Pathog. 5(11):e1000666、及びUmezu (2010) Cancer Sci. 101(1):143-148に記載されている。アンチセンス核酸は、例えば遺伝子治療法を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして細胞内に導入でき、又はアンチセンス核酸をコードする核酸が導入される細胞において生産できる。

ｓｉＲＮＡは、両端に短い２〜３のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する約２０〜２５のヌクレオチド長の２本鎖合成ＲＮＡ分子である。２本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ分子のセンス及びアンチセンス鎖の一部分、この場合、グリピカンファミリーのメンバー、特にグリピカン４のｍＲＮＡの一部分を示す。ｓｉＲＮＡ分子は、典型的に開始コドンから約５０〜１００ヌクレオチド下流のｍＲＮＡ標的の領域を標的にするように設計される。細胞への導入において、ｓｉＲＮＡ複合体は、内因性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を引き起こし、標的ｍＲＮＡの切断及び分解を生じる。さらに、安定性、特異性、及び有効性を高めるために、ｓｉＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖内に、修飾ヌクレオチド又はモチーフの取り込みなどのｓｉＲＮＡ組成物のさまざまな改良が記載され、そして本発明の本態様に従った使用にために適切である（国際公開第２００４／０１５１０７号；国際公開第２００３／０７０９１８号；国際公開第１９９８／３９３５２号；米国特許出願公開第２００２／００６８７０８号；米国特許出願公開第２００２／０１４７３３２号；米国特許出願公開第２００８／０１１９４２７号を参照）。

短又は小ヘアピンＲＮＡ分子は、機能的にｓｉＲＮＡと類似しているが、タイトなヘアピンカーブを作るより長いＲＮＡ配列を含む。ｓｉＲＮＡのように、それらは、細胞のＲＮＡ干渉経路を通じて遺伝子発現を静める。ｓｈＲＮＡは、細胞機構によりｓｉＲＮＡに切断される。本発明の方法に従って使用できるグリピカン４の発現を阻害する適切なｓｈＲＮＡ分子は、限定されないが、以下の配列のＳｉｇｍａにより商品化されたｓｈＲＮＡ分子を含む。

ＲＮＡｉ分子を設計する場合に考慮すべき検討事項は、例えば、標的とされる配列、ＲＮＡ標的の二次構造、及びＲＮＡ結合タンパク質の結合を含む。ｓｉＲＡＮを最適化するための方法は、当業者に明らかであろう。典型的な方法が、例えば、Vickerら、(2003) J Biol Chem 278:7108-7118、及びYangら、(2003) Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947に記載されている。

核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡｓ）を作製するための方法は、通常の方法であり、そして当業者に明らかであろう。インビトロ方法は、例えば、無細胞系におけるグリピカン４配列のプロセシング（例えば、ＲＮＡｓｅＩＩＩ又はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）で長い２本鎖ＲＮＡｓを消化すること）、インビトロにおける組み換え２本鎖グリピカン４ＤＮＡの転写、及びグリピカン４配列に対するヌクレオチド配列ホモログの化学合成を含む（例えば、Tuschlら、(1999) Genes & Dev. 13:3191-3197を参照）。インビボ方法は、例えば（１）基質がインビボでｓｉＲＮＡに変換されるように細胞内へのＤＮＡベクターの形質移入（例えば、Kawasakiら、(2003) Nucleic Acids Res 31:700-707を参照）、（２）ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用するプラスミド系からの短ヘアピンＲＮＡｓの発現（例えば、Kawasakiら、(2003) Nucleic Acids Res 31:700-707を参照）、及び／又は（３）タンデムプロモーターからの短ＲＮＡの発現（例えば、Miyagishiら、(2003) Nature Biotechnol 20:497-500を参照）が挙げられる。一般的に、培養物において細胞でのグリピカン４の発現を阻害するために、１つ以上のｓｉＲＮＡが、培地中の細胞に添加でき、典型的に約５０〜２００μｇ、好ましくは約５０μｇのｓｉＲＮＡ／ｍｌの最終濃度である。形質移入、エレクトロポレーション、又は当該技術分野における公知の他の技術を含む、任意のさまざまな従来の方法が、細胞内にｓｉＲＮＡを導入するために使用できる（例えば、Hannon (2002) Nature 418:244-251を参照）。Schiffelersら、(2004) Nucleic Acid Res. 32:e149などにより記載されているようなナノ粒子方法、及びSongら、(2005) Nature Biotechnol 23:709-717などにより記載されているような融合タンパク質方法が、また有用である。

ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＡＭＢＩＯＮ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）からのｓｉＲＮＡ分子合成キットなどの市販のキットが、ｓｉＲＮＡ分子を合成するために使用されてもよい。他の例において、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ（登録商標）（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＳＩＧＭＡ‐ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はＯＰＥＮＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）からなどの商業用供給源から取得する。

本明細書で使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニスト」という表現は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化により仲介されるシグナルの誘導を阻害する、好ましくはグリピカンファミリーのメンバーに結合することにより阻害する天然又は合成化合物を意味する。グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストは、化合物、特に、グリピカンファミリーのメンバーに結合する炭水化物、又はグリピカンファミリーのメンバーに特異的な抗体、好ましくはグリピカンファミリーのメンバーに特異的な中和若しくは遮断抗体でもよい。

グリピカンファミリーのメンバーに特異的な、特にグリピカン４に特異的な中和又は遮断抗体は、例えば、Ford-Perrissら、(2003) Developmental Dynamics 227:170-184に記載されている。

本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。そのように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片と抗体及び抗体断片の変異体（誘導体を含む）、並びに非従来型抗体も包含する。用語「抗体」は、本明細書で使用されるように、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両方を含み、そして例えば、抗原により免疫された動物により生産されたインビボで作られた抗体、及び例えば、ハイブリドーマにより産生されたインビトロで作られた抗体を包含する。本発明によれば、抗体は、哺乳類由来の抗体、特にマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、又はヒト由来の抗体でもよい。本発明によれば、抗体はまた、サメ由来の抗体でもよい。

好ましくは、本発明によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。用語「モノクローナル抗体」は、単一のアミノ酸組成の抗体を意味し、特異的な抗原に対して向けられており、そしてＢ細胞又はハイブリドーマの単一クローンにより生産される。

目的の免疫原で特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生産するための方法は、当業者公知の方法である（例えば、Harlow及びLane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stitesら、(eds); Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publication, Los Altos, CA、及びKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497を参照）。望む特異性を有する本発明従った抗体を含む抗血清を生産するために、目的のグリピカンファミリーのメンバーが、マウス、ウサギ、又は霊長類などの適切な動物を免疫するために使用できる。フロイントアジュバントなどの標準的なアジュバントは、標準的な免疫付与プロトコールに従って使用することができる。免疫原調製物に対する動物の免疫反応は、試験採血し、そして目的の抗原に対する反応性の力価を決定することによりモニターしてもよい。さらに、抗原に対して特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清の分画、及び抗体の精製が、当業者に周知の方法を使用して、続いて達成することができる。

モノクローナル抗体は、当業者によく知られているさまざまな手法を使用して得られてもよい。典型的に、望む抗体で免疫した動物由来の脾臓細胞が、通常、骨髄腫細胞と融合することにより不死化される（Kohler及びMilstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519）。不死化の代替的な方法は、例えば、エプスタインバーウィルス、ガン遺伝子、若しくはレトロウィルスでの形質転換、又は当該技術分野において周知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する望む特異性及び親和性の抗体の生産のためにスクリーニングされ、そしてそのような細胞から生産されたモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む、さまざまな手法により高められてもよい。さらに、モノクローナル抗体は、Huseら、(1989) Science 246:1275-1281により概説される一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、望む特異性を有する抗体又はそのような抗体の結合断片をコードする核酸配列の同定によって組み換え的に生産されてもよい。モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を使用して生産されてもよく、又はファージディスプレイにより生産されてもよい。用語「ファージディスプレイ」は、本明細書では、バクテリオファージカプシド上に発現され、及びカプシドをコードする遺伝子中に挿入される核酸配列によりコードされるリガンドを選択するための方法を意味する。本方法は、当業者に周知であり、そして特に、Scott及びSmith (1990) Science 249:386-390、及びMarksら、(1991) J. Mol. Biol. 222:581-597により記載されている。

用語「抗体断片」は、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（ＦＶ）₂、ＣＤＲ、抗体断片から形成されるナノボディ、ダイアボディ、多重特異的抗体（ｍｕｌｔｉ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び完全な抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する他の抗体断片が挙げられる。抗体断片は、ペプシン、パパイン、又はトリプシンなどでの、完全な抗体の酵素的又は化学的切断により生産されてもよい。あるいは、それらは、米国特許第５１３，９５７号、６９３，２４９号、７８９，６１９号、７７６，３９１号、７９９，７７０号、７９９，７７２号、及び８０９，０８３号などにおいて記載されるような組み換えＤＮＡ手法を使用して調製でき、ここで、抗体断片は、公知の組み換え手法を使用して免疫された動物由来の抗体産生Ｂ細胞のＲＮＡから生産される。

用語「Ｆａｂ」は、約５００００Ｄａの分子量及び抗原結合活性を有する抗体一価断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味し、そして軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及び第一重鎖定常ドメイン（ＣＨ₁）からなる。

「Ｆｖ」断片は、Ｆａｂ断片のＮ末端部分であり、そして１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。

用語「Ｆ（ａｂ’）₂」は、約１０００００Ｄａの分子量、及び抗原結合活性を有する抗体二価断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味し、そしてそれは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂ断片を含む。

用語「Ｆａｂ」は、約５００００Ｄａの分子量、及び抗原結合活性を有する抗体断片を意味し、そしてそれは、Ｆ（ａｂ’）₂断片のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。

用語「Ｆｄ」は、ＶＨ及びＣＨ₁ドメインからなる抗体断片を意味する。

用語「ｄＡｂ」（Wardら、(1989) Nature 341:544-546）は、単一の可変ドメイン抗体、すなわちＶＨ又はＶＬドメインからなる抗体断片を意味する。

一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコード化リンカーにより結合されるＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現されるＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーと共有結合する。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価及び多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖｓの結合により自然発生的に形成されるか、又は二価ｓｃ（Ｆｖ）₂などのペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを結合することにより産生できる。

用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味し、そしてその断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ‐ＶＬ）においてＶＬドメインと連結するＶＨドメインを含む。同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを、他の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成して、そして２つの抗原結合部位を作る。

非従来型抗体は、これらに限定されないが、ナノボディ、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Zapataら、(1995) Protein Eng. 8:1057-1062）、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、オリゴボディ（ｏｌｉｇｏｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ミニボディ、並びに多価（例えば、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、及びペンタボディ）を有する抗体が挙げられる。ナノボディは、軽鎖の不存在下で十分に機能的であるために発展してきた天然の重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、一本鎖Ｆｖ断片のたった半分のサイズであるが、従来の抗体の親和性及び特異性を有する。それらの極度の安定性とヒト抗体フレームワークとの高度のホモロジーの組み合わせの、この特有の構造の結果は、ナノボディが、従来の抗体がアクセスできなかった治療標的と結合できることである。多重ｓｃＦｖ（例えば、ダイアボディ、テトラボディ）などの多価を有する組み換え抗体断片は、６０〜１００ｋＤａのサイズの小さな分子が、より早い血液クリアランス及び素早い組織取り込みを提供するので、親抗体について改良を提供する（Powerら、(2003) Methods Mol Biol 207:335-350、及びWuら、(1999) Tumor Targeting 4:47-58を参照）。

非従来型抗体を作製するためのさまざまな手法が、記載されている。ロイシンジッパーを使用して生産される二重特異性抗体が、Kostelnyら、(1992) J. Immunol. 148:1547-1553で記載されている。ダイアボディ技術が、Hollingerら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448で記載されている。一本鎖Ｆｖダイマーの使用により二重特異性抗体断片を作製するための他の方法が、Gruberら、(1994) J. Immunol. 152:5368で記載されている。三重特異性抗体が、Tuttら、(1991) J. Immunol. 147:60で記載されている。

「アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）」は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）菌由来の表面タンパク質、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの一つの足場に基づく３へリックスバンドルからなる、６ｋＤａの分子量を有する小さな単純タンパク質である。この足場は、親和性リガンドとして素晴らしい特性を有し、そして任意の所定の標的タンパク質と高い親和性で結合するように設計できる。ドメインは５８のアミノ酸からなり、１３のアミノ酸がランダム化されて、多くのリガンド変異体を有するアフィボディ（登録商標）ライブラリーを産生する。従って、ライブラリーは、同一のフレームワーク及び可変表面結合特性を有する多数のタンパク質リガンドからなる。

「アビマー（ａｖｉｍｅｒ）」は、インビトロエキソンシャッフリング及びファージディスプレイを使用して改変された多重結合タンパク質又はペプチドである。複数の結合ドメインが結合され、単一エピトープ免疫グロブリンドメインと比較してより大きな親和性及び特異性を生じる。

「ミニ抗体（ｍｉｎｉ‐ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「ミニボディ」は、ヒンジ領域によりｓｃＦｖから分離された、それらのＣ末端でオリゴマー化ドメインを含むｓｃＦｖポリペプチド鎖である（Packら、(1992) Biochem 31:1579-1584）。オリゴマー化ドメインは、自己会合（ｓｅｌｆ‐ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）α‐へリックス、例えば、ロイシンジッパーを含み、そしてそれは、追加のジスルフィド結合によりさらに安定化できる。オリゴマー化ドメインは、ポリペプチドの機能的結合タンパク質へのインビボでのフォールディングを促進すると考えられるプロセスである、膜を横断する一方向性フォールディング（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ ｆｏｌｄｉｎｇ）と適合性であるように設計される。ミニボディは、当業者に周知の組み換え方法を使用して生産してもよい（例えば、Packら、(1992) Biochem 31:1579-1584、及びCumberら、(1992) J. Immunology 149B:120-126を参照）。

「オリゴボディ」は、合成抗体である。これらの試薬の特異性は、ウェスタンブロット分析及び免疫組織化学により明らかにされている。それらはいくつかの望む特性、すなわち、それらの生産が免疫系から独立しているので、それらは数日で調製でき、そして精製された標的タンパク質の必要性がないという特性を有する（Radrizzaniら、(1999) Medicine (B Aires) 59(6):753-8）。オリゴボディは、当該技術分野において周知の組み換え方法を使用して生産される（Radrizzaniら、(2000) Medicina (B Aires) 60 Suppl 2:55-60）。

Ｆａｂ断片は、プロテアーゼ、パパインで本発明に従ってモノクローナル抗体を処理することにより得ることができる。またそのようなＦａｂ断片は、原核生物の発現系又は真核生物の発現系に関してベクター内に上記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを挿入し、そして原核生物又は真核生物内にベクターを導入して（必要に応じて）Ｆａｂ断片を発現することにより生産できる。

Ｆ（ａｂ’）₂断片は、プロテアーゼ、ペプシンで本発明に従ってモノクローナル抗体を処理することにより得ることができる。また、そのようなＦ（ａｂ’）₂断片は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、下記のようにＦａｂ’断片を結合することにより生産できる。

Ｆａｂ’断片は、還元剤、ジチオトレイトール、及び任意によりスルフヒドリル基に対する保護基で、上で定義したようにＦ（ａｂ’）₂断片を処理することにより、ジスルフィド結合の切断が生じ、得ることができる。また、そのようなＦａｂ’断片は、原核生物に関する発現ベクター、又は真核生物に関する発現ベクター内に本発明に従ったモノクローナル抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを挿入し、そして原核生物又は真核生物内にベクターを導入して（必要に応じて）その発現を行うことにより生産できる。

これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第４，０３６，９４５号、及び４，３３１，６４７号、Nisonoffら、(1960) Arch. Biochem. Biophys. 89:230; Porter (1959) Biochem. J. 73: 119; 及びEdelmanら、(1967) In: Method in Enzymology Vol 1, p422, Academic Pressで記載されている。一価の軽‐重（light-heavy）鎖断片を形成するための重鎖の分離、さらに断片の切断、又は他の酵素的、化学的、若しくは遺伝子的手法などの抗体を切断する他の方法が、上で定義されたようにグリピカンファミリーのメンバーに結合する断片であるかぎり、また使用されてもよい。

ｓｃＦｖは、オリゴヌクレオチドによりつながれるＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製できる。構造遺伝子を、次に、原核生物に対する発現ベクター又は真核生物に対する発現ベクター内に挿入し、そしてそれを、続いて原核又は真核宿主細胞内に導入して（必要に応じて）ｓｃＦｖ断片を発現する。組み換え宿主細胞は、その後、２つのＶドメインを結合するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを生産するためのそのような方法は、例えば、Whitlowら、(1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Birdら、(1988) Science 242:423-426; Ladnerら、米国特許第４，９４６，７７８; Packら、(1993) Biotechnology 11:1271-1277、及びSandhu (1992) Crit. Rev. Biotech. 12:437で記載されている。

ヒト化ｓｃＦｖ断片を生産するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングと呼ばれる周知の手法が使用されてもよく、そしてそれは、ドナーｓｃＦｖ断片からＣＤＲを選択すること、及び例えば、国際公開第９８／４５３２２号；国際公開８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；及び欧州特許第０１７３４９４号に記載されているように公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワークにそれらを移植することを含む。

抗体断片の他の形態は、単一のＣＤＲをコードするペプチドである。ＣＤＲペプチドは、本発明に従ったモノクローナル抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、Larrickら、(1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106で記載されているように、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成して、調製してもよい。

具体的な実施態様において、本発明に従った抗体は、キメラ抗体である。

「キメラ」抗体は、少なくとも２つの異なる起源由来の構成要素で構成される抗体を意味する。特定の実施態様において、キメラ抗体は、他の分子、例えば、第二の種由来の抗体の一部と融合した第一の種由来の抗体の一部を含む。そのような特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト由来の抗体の一部と融合した非ヒト動物由来の抗体の一部を含む。そのような特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト由来の抗体の定常領域と融合した非ヒト動物由来の抗体の可変領域の全部又は一部を含む。

特に、本発明に従った抗体は、ヒト化抗体であってもよい。「ヒト化」抗体は、ヒト抗体とより厳密に一致（アミノ酸配列で）するように改変した非ヒト抗体を意味する。特定の実施態様において、非ヒト抗体の可変領域の抗原結合残基の外側のアミノ酸残基が改変される。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、望む特異性、親和性、及び結合能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの全部又は一部と、望む抗原結合特異性を有する非ヒト抗体などの他の抗体由来のＣＤＲの全部又は一部とを置換することにより構築される。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、ＣＤＲの全部又は実質的に全部が、非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、及びフレームワーク領域（ＦＲ）の全部又は実質的に全部が、ヒト抗体のＦＲに対応する可変領域を含む。そのような特定の実施態様において、ヒト化抗体はさらに、ヒト抗体の定常領域（Ｆｃ）を含む。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中、又はドナー抗体中において見られない残基を含んでもよい。

用語「ヒト抗体」は、ヒト抗体配列を含み、及び非ヒト動物由来の抗体配列を含まないモノクローナル抗体を意味する。特定の実施態様において、ヒト抗体は、天然の抗体において見られない合成配列を含んでもよい。当該用語は、抗体が作られる方法によって限定されない。例えば、さまざまな実施態様において、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて、ファージディスプレイにより、ヒトＢリンパ球により、又は組み換え方法より作られてもよい。

好ましくは、本発明に従ったグリピカンファミリーのメンバーの具体的な抗体は、グリピカンファミリーのメンバーの特異的な中和又は遮断抗体である。

本明細書で使用されるように、用語「中和抗体」又は「遮断抗体」は、抗体が特異的に結合するエピトープを含む抗原の生物活性を遮断し、又は中和することができる抗体を意味する。使用される中和抗体の量に従って、抗原によって産生される残存生物活性が残るかもしれない。中和抗体は、インビトロ及び／又はインビボにおいて生物活性を遮断又は弱めることができる。本発明の文脈において、グリピカンファミリーのメンバーの特異的な中和抗体は、前記グリピカンファミリーのメンバーと結合し、それによって前記グリピカンファミリーのメンバーにより仲介されるシグナル伝達を阻止及び／又は阻害する抗体を意味する。

グリピカンファミリーのメンバー、特に、グリピカン４の特異的な中和又は遮断抗体は、例えば、Ford-Perrissら、(2003) Developmental Dynamics 227:170-184に記載されている。

グリピカンアンタゴニストを同定するための手法は、当業者に周知であり、そして典型的に、グリピカンタンパク質を発現する細胞において早期に神経及び心臓分化を誘導する候補化合物の能力をアッセイすることを含む。

典型的に、グリピカン４の発現は、以下のプロトコールを使用することにより弱め又は消失させてもよい。１０ｃｍの組織培養プレートおいて、細胞を、１０ｍｌの完全培地中に約１０⁵細胞で播種してもよい。細胞をＣＯ₂インキュベーターにおいて３７℃で、好ましくは２４時間、それらが７０〜８０％コンフェルトに達するまで、インキュベートしてもよい。細胞を、その後、標準方法を使用して、リポフェクタミンを用いて、形質移入してもよい。それぞれの形質移入に関して、２μｇのｓｈＲＮＡを、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を含む５００ｎｇのＤＮＡと組み合わせてもよい。レポーター遺伝子の発現は、典型的に、細胞形質移入の効率を検査することを可能にする。形質移入混合物を取り除いた後、通常生育培地を、交換してもよく、そして細胞をグリピカン４の発現分析（例えば、半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ又は定量的ＲＴ‐ＰＣＲ）をする前に、さらに２４〜４８時間培養してもよい。

好ましくは、上記方法により生産された幹細胞又は前駆細胞の自己複製は、幹細胞又は前駆細胞が、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供されないかぎり、維持される。特に、本発明に従って生産された幹細胞又は前駆細胞は、それらが、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供されない場合、長期培養において自然に分化しない。

本発明の他の目的はまた、上で定義されたようなインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞に関する。

上で定義されたようなインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞はまた、分化した細胞を生産するために使用されてもよい。本発明は従ってまた、以下のステップ：
ａ）上で定義された方法により細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産し；及び
ｂ）上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップａ）で生産された幹細胞又は前駆細胞を供すること
を含み、それによって分化した細胞が生産される、幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞を生産するためのインビトロ方法に関する。

人工多能性幹細胞を生産するための方法
本発明者等は、早期の及び／又は増進した分化を引き起こす幹細胞におけるグリピカン４の機能の喪失を証明したので、それらは、体細胞におけるグリピカン４活性の調節が、これらの細胞の脱分化を誘導でき、そして従って人工多能性幹細胞を生産することを可能にすることを予測した。

本発明は、従ってまた、体細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を、一過性に増加又は誘導し、次に一過性に減少又は弱め、それによって人工多能性幹細胞を得ることを含む、体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生産するためのインビトロ方法に関する。

本明細書で使用されるように、用語「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増進（ｅｎｈａｎｃｅ）」、又は「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）」は、一般的に、統計的に有意な量による増加を意味する。なんらかの誤解を避けるために、用語「増加」、「増進」、又は「活性化」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は１００％までの増加、又は参照レベルと比較して１０〜１００％の間の任意の増加、又は少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の増加、又は参照レベルと比較して２倍〜１０倍以上間の任意の増加を意味する。

用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、又は「弱める（ｒｅｄｕｃｅ）」は、本明細書において、上項「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞」で定義されたものと同じ意味を有する。

用語「統計的に有意（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）」、又は「有意（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」は、統計学的有意性を意味し、及び分子濃度の正常超、又はより高い２標準偏差（２ＳＤ）を一般的に意味する。当該用語は、差がある統計的証拠を意味する。帰無仮説が実際正しい場合、帰無仮説を棄却する決定の確率として定義される。決定は、しばしばＰ値を使用してなされる。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性の一過性の増加／減少（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ／ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｐｉｃａｎ ｆａｍｉｌｙ）」、又は「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を一過性に増加し／減少する（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ／ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｐｉｃａｎ ｆａｍｉｌｙ）」という表現は、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が、定められた期間の間のみ、増加され／減少されることを意味する。

体細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を一過性に誘導又は増加するための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、グリピカンファミリーのメンバーをコードする核酸で体細胞を一過性に形質移入すること、又はグリピカンファミリーのメンバー若しくはグリピカンファミリーのメンバーの活性化因子と体細胞とを一過性に接触することを含む。

好ましい実施態様において、核酸は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一性の配列を含む、又は配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一性の配列からなるタンパク質をコードする。

本明細書において使用されるように、用語「形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ)」、又は「形質移入すること（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ)」は、細胞内に核酸を意図的に導入するプロセスを意味する。当業者に周知なように、形質移入の手法は、シクロデキストリン、ポリマー類、ＤＥＡＥ‐デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどの特にカチオンポリマー、リン酸カルシウム緩衝液、リポソーム、デンドリマー、又はナノ粒子を使用する化学物質に基づく形質移入；エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学形質移入（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）；遺伝子ガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、マグネットフェクション若しくはマグネットアシストトランスフェクション（Ｍａｇｎｅｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）；形質導入などのウィルス方法、；ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、又はヒートショックが挙げられる。

本明細書において使用されるように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、そして適切ならば、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味する。当該用語はまた、均等物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡ又はＤＮＡいずれかのアナログを含むことを理解すべきである。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」という表現は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化に仲介されるシグナルの誘導を活性化又は増強する天然又は合成化合物を意味する。グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子は、特に、グリピカンファミリーのメンバーと結合する炭水化物、又はグリピカンファミリーのメンバーの特異的な活性化抗体であってもよい。

細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を一過性に弱める手法は、当業者に周知であり、そして例えば、核酸分子阻害剤の使用、特にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡでの細胞の形質移入、及び上項「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞」で記載されたように、幹細胞又は前駆細胞と、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストとを一過性に接触させることを含む。

特定の理論に拘泥されることなく、特定の期間の間のグリピカンファミリーのメンバーの一過性の増加が、初期化効率を改善するために必要であり、そして次のグリピカンファミリーのメンバーの一過性の減少が、奇形腫リスクを克服するために重要であると考えられる。

好ましくは、上で定義された方法により生産されたｉＰＳ細胞が、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、それらの自己複製は、維持される。

本発明はまた、上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得されるｉＰＳ細胞に関する。

幹細胞又は前駆細胞の使用
本発明は、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカン４の調節は、インビボで注入された場合、腫瘍形成を予防することを可能にし、従って、幹細胞又は前駆細胞の適用の具体的な有効性を付与し、ここでグリピカン４の発現及び／又は活性は、再生医療において弱められ又は消失させられる。

本発明の他の目的は、従って、幹細胞又は前駆細胞に関し、ここでグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性は、病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のために弱められ又は消失させられている。具体的な実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。

本発明はまた、病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のために上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞に関する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。

本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体における病的状態の幹細胞に基づく治療による処置方法を記載する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。

本発明はまた、上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体における病的状態の幹細胞に基づく治療による処置方法を記載する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。

本発明の文脈において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、齧歯動物（ラット、マウス、ウサギ）、霊長類（チンパンジー）、ネコ科の動物（ネコ）、イヌ科の動物（イヌ）などのヒト又は非ヒト哺乳動物を示す。好ましくは、個体は、ヒトである。

本明細書において使用されるように、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療的処置、及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味し、ここで本目的は、疾患の進行を阻止し又は遅らせることである。

「治療上の有効量」は、任意の治療に適用できる妥当な利益／リスクで、疾患を処置するための細胞の十分な量を意味する。本明細書において開示されるような細胞の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。必要とされる正確な量は、治療される疾患の種類及び疾患の重度などの因子に依拠して変化するであろう。

本発明の文脈において、「変性疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、運動又は食生活などの通常の身体上の摩損又はライフスタイルの選択にかかわらず、時間とともに病気に冒された組織又は器官の機能又は構造が、徐々に悪くなる疾患を意味する。変性性疾患の例は、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又はルーゲーリック病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統委縮症、ニーマンピック病、アテローム性動脈硬化症、進行性核上麻痺、ガン、テイサックス病、糖尿病、心臓疾患、円錐角膜を含める炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、及びハンチントン病が挙げられる。好ましくは、本発明に従った変性疾患は、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、多系統委縮症、ガン、糖尿病、心臓疾患、及びハンチントン病からなる群から選択される。

本発明の文脈において、用語「心疾患（ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、又は「心臓疾患（ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、心臓に影響を及ぼす疾患を意味する。特に、心疾患は、冠動脈性心疾患、心筋症、心臓血管疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧性心疾患、炎症性心疾患、及び心臓弁膜症を包含する。

「冠動脈性心疾患」は、心筋及び周囲組織に十分な血液循環を供給するための冠動脈血液循環の障害を意味する。

「心筋症」は、なんらかの理由による心筋の機能低下を意味する。

「心臓血管疾患」は、心臓自体及び／又は血管系、特に心臓に出入りする静脈及び動脈に影響を及ぼす疾患を意味する。

「虚血性心疾患」は、通常、冠動脈疾患に起因する、心筋の虚血により特徴付けられる疾患を意味する。

「心不全」は、体全体にわたって血液の十分な量を満たす又は送り込むための心臓の能力を損なう任意の構造的又は機能的心疾患に起因し、そのために心臓及び体の不全をもたらす状態を意味する。

「高血圧性心疾患」は、高血圧、特に局所的な高血圧により引き起こされる心疾患を意味する。

「炎症性心疾患」は、心筋及び／又はその周囲組織の炎症に関連する疾患を意味する。

「心臓弁膜症」は、心臓の１以上の弁に影響を及ぼす疾患プロセスを意味する。

好ましくは、本発明に従った心疾患は、心筋症、虚血性心疾患、心不全、高血圧性心疾患、及び心臓弁膜症からなる群から選択される。

本発明の文脈において、「代謝性疾患」は、正常な代謝を混乱させる疾患を意味する。好ましくは、本発明に従った代謝性疾患は、炭水化物代謝障害である。

本明細書において使用されるように、「炭水化物代謝障害」は、炭水化物、例えば、グルコースの代謝が乱されている疾患を意味する。炭水化物代謝障害は、糖尿病、空腹時高血糖、太り過ぎ（ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ）、及び肥満が挙げられる。

本明細書において使用されるように、「糖尿病」は、通常、異常に高い血糖値を引き起こす、遺伝性の及び環境の要因の組み合わせに起因する混乱した代謝症候群を意味する。

本明細書において使用されるように、「空腹時高血糖」は、６．１ｍｍｏｌ／ｌ超の血糖を引き起こす、混乱した代謝症候群を意味する。

本明細書において使用されるように、「太り過ぎ」は、過剰な体脂肪が、健康に悪影響を及ぼすかもしれない程度にまで蓄積している状態を意味する。太り過ぎは、通常、２５ｋｇ／ｍ²以上のボディマスインデックスとして定義される。

本明細書において使用されるように「肥満」は、過剰な体脂肪が、健康に悪影響を及ぼすかもしれない程度にまで蓄積している状態を意味する。肥満は、通常、３０ｋｇ／ｍ²以上のボディマスインデックスとして定義される。

本明細書において使用されるように、用語「障害（ｉｎｊｕｒｙ）」は、外部の化学物質又は力により引き起こされる身体の構造又は機能に生じた被害又は損傷を意味し、そしてそれは、物理的又は化学的、及び偶然によって又は意図的によってのいずれかでもよい。障害は、特に、あざ、外傷、切り傷、擦り傷、火傷、骨折、関節脱臼、脳震盪、捻挫、及びショックを包含する。

「あざ」は、打撲傷により引き起こされる皮下出血を意味する。「外傷」、「切り傷」、及び「擦り傷」は、出血を引き起こす皮膚に対する又は皮膚を貫く損傷を意味する。「火傷」は、過剰な熱、化学物質への暴露、又は低温により引き起こされる損傷である。「骨折」は、骨の損傷である。「関節脱臼」は、肩又は指の脱臼など、その正常な関節からの骨の移動である。「脳震盪」は、頭蓋骨又は脳へのなんらかの侵入なしに、衝撃により引き起こされる軽度の外傷性脳損傷である。「捻挫」は、突然の極端な伸縮により引き起こされる靭帯に生じる損傷である。「ショック」は、組織が十分な酸素及び栄養を取ることができない重度の病状である。

上で説明したように、本発明者等は、奇形腫の発生のリスクが、グリピカン４の発現が弱められた幹細胞をヌードマウスの脇腹に移植した場合、野生型細胞と比較して、克服されたことを示した。

従って、好ましい実施態様において、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞を使用した場合、奇形腫の形成は抑えられる。

本発明の文脈において、「奇形腫」は、すべての三胚葉の正常な誘導体に類似している組織又は器官構成要素を有する被包型腫瘍を意味する。

本発明はまた、スクリーニングアッセイ、好ましくはインビトロスクリーニングアッセイ、特に医薬品、遺伝子的、又は毒物学的スクリーニングアッセイ、好ましくは毒物学的スクリーニングのための上で定義されたインビトロ方法により生産された幹細胞、前駆細胞、又はｉＰＳ細胞の使用を提供する。

グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子及びその使用
上記のように、ガン幹細胞は、腫瘍形成をする特性を有する幹細胞である。実際、それらは、自己複製及び複数の細胞型について分化の幹細胞プロセスを通じで腫瘍を生み出すであろう。それらは、腫瘍中に生き残り、新たな腫瘍を生じることにより再発及び転移を引き起こすと考えられる。従って、ガンを処置するための方策は、具体的にガン幹細胞を標的にすることである。

本発明等は、これらの細胞の運命について決定を下すことができる幹細胞におけるグリピカン４の発現及び／又は活性の調節を示した。特に、ガン幹細胞におけるグリピカン４の発現及び／又は活性を弱め又は消失することが、ガン幹細胞の自己複製を低下し、及び／又は分化マーカーの発現を促進することができるかもしれない。

従って、本発明の他の態様は、ガンの処置用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子に関する。

本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体におけるガンを処置するための方法を記載する。

本発明の文脈において、用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、当該技術分野におけるその使用、例えば、目的のプロセス、経路、若しくは事象における定性的な若しくは定量的な変化、変更、若しくは修飾を引き起こし又は容易にすることの意味で、一貫して使用される。限定なしに、そのような変化は、プロセス、経路、若しくは事象の異なる構成要素若しくは分岐の相対的な強度若しくは活性における増加、減少、又は変更であってもよい。

本明細書において使用されるように、「調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、目的のプロセス、経路、若しくは事象において定性的若しくは定量的に変化、変更、若しくは修飾を引き起こす又は容易にする作用物質である。特に、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子又はグリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストでもよい。好ましくは、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストである。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニスト」という表現は、上項「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞」で定義されたものと同じ意味である。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子」という表現は、上項「人工多能性幹細胞を生産するための方法」で定義されたものと同じ意味である。

本明細書において使用されるように、用語「ガン」は、任意の悪性病変、又は悪性細胞分裂若しくは悪性腫瘍、又は制御されていない若しくは不適切な細胞分裂を含む任意の状態を含み、及び制限されないが、制御されていない又は不適切な細胞増殖により特徴付けられる任意の疾患を含む。ガンは、ガン腫、肉腫、腺ガン、腺腫、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫が挙げられる。特に、ガンは、膀胱ガン、乳ガン、大腸及び直腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓（腎細胞）ガン、白血病、肺ガン、黒色腫、皮膚ガン（非黒色腫）、非ホジキンリンパ腫、膵臓ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、胃ガン、肝臓ガン、卵巣ガンでもよく、これらを含んでもよい。ガンはまた、副腎ガン、肛門ガン、再生不良性貧血、胆管ガン、膀胱ガン、骨ガン、脳ガン、乳ガン、気管支及び肺ガン、中枢神経系ガン、子宮頸ガン、大腸及び直腸ガン、結合組織ガン、脳神経ガン、消火器ガン、子宮内膜ガン、内分泌ガン、食道ガン、ユーイングファミリー腫瘍、胆嚢ガン、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部ガン、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓ガン、喉頭及び下咽頭ガン、喉頭ガン、白血病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｃａｎｃｅｒ）、白血病‐リンパ腫、白血病‐骨髄腫、不特定の細胞型ガンの白血病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｏｆ ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｃａｎｃｅｒ）、口唇ガン、肝臓ガン、肺カルチノイド腫瘍、リンパ球、造血及び関連組織ガン（Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃａｎｃｅｒ）、リンパ腫ガン、悪性免疫増殖性ガン、悪性新生物ガン、生殖器の悪性新生物、尿路ガンの悪性新生物、髄膜ガン、中皮腫ガン、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び中耳ガン、上咽頭ガン、鼻咽頭ガン、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫ガン、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭ガン、骨肉腫、中咽頭ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、副甲状腺ガン、陰茎ガン、末梢及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫ガン、末梢神経ガン、腹膜ガン、咽頭ガン、下垂体腫瘍、輪状後部領域ガン、前立腺ガン、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺ガン、肉腫、軟組織ガン、黒色腫皮膚ガン、非黒色腫皮膚ガン、副鼻腔ガン、小腸ガン、胃ガン、精巣ガン、胸腺腫及び胸腺ガン、甲状腺ガン、舌ガン、へんとう腺ガン、気管ガン、ガンＮＯＳ、泌尿器ガン、尿道ガン、子宮ガン、子宮肉腫、膣ガン、外陰ガン、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍であってもよい。

好ましくは、上で定義されたようにガンの処置用の使用のためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、ガン幹細胞の自己複製を低下し、及び／又は分化マーカーの発現を引き起こす（例えば、Piccirilloら、(2006) Nature 444:761-765）。

本発明の他の態様は、成体幹細胞におけるグリピカン４の活性の調節に関する。

上記のように、成体幹細胞又は組織特異的幹細胞は、さまざまな組織で見られ、そして自己複製及び分化の特性を有する。従って、それらは、疾患後の組織再生のための重要な治療標的と考えられる。本発明は特に、グリピカン４の活性を調節することにより、あるべき場所における成体幹細胞に影響を与えて、それらの分化能を高め、そして組織修復を促進することを提示する。

従って、本発明はまた、特に変性疾患後の組織再生を含む使用のためのグリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストに関する。

本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストの治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、特に変性疾患後の個体における組織再生を含む方法を提供する。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニスト」という表現は、上項「グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞」において定義されたものと同じ意味である。

本発明の文脈において、用語「組織再生」、又は「組織修復」は、互換的であり、そして修復される組織へと発生することができる細胞の増殖、分化、生存、及び移動を意味する。特に、この経路において、特定の組織の機能細胞が、おそらく組織特異的幹細胞又は組織特異的前駆細胞から再生され、正常な機能性組織の再生を生じる。従って、本発明の文脈において、組織再生の誘導用に使用するためのアンタゴニストは、再生される組織に存在する組織特異的細胞、成体幹細胞、又は組織特異的前駆細胞の分化を増強するためのものである。好ましくは、アンタゴニストは、再生される組織に存在する組織特異的幹細胞の分化を増強するために使用されるものである。

本方法において処置できる疾患又は障害は、特に、上で定義された変性疾患、脊髄損傷、心疾患、脳卒中、自閉症、眼疾患、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、虚血性心疾患、ガン、創傷治癒、及び火傷が挙げられる。好ましくは、本方法において処置される疾患は、上で定義された変性疾患である。

特に脳、心臓、血管系、呼吸系、腎臓系、脾臓系、リンパ系、骨髄、骨、骨格筋系、免疫系、生殖器系、皮膚、軟骨、神経系、消火器系、肝臓、膵臓系、造血系、ホルモン系含む本質的に任意の組織又は器官が、誘導組織再生のための標的にできる。

上で定義された調節因子、アンタゴニスト、及び活性化因子は、懸濁液、ミクロエマルション、マクロエマルション、ミセル、蓄積注射などのためのデポー製剤、局所及び皮下投与又はリポソーム中に適切な乾燥製剤などの任意の適切な形態の下、処方されてもよい。それらは、例えば、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）などのポリマーと、又はシクロデキストリンと組み合わせることにより、放出制御製剤として処方されてもよい。

好ましくは、上で定義したような調節因子、アンタゴニスト、及び活性化剤は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物の形態で投与される。

用語「医薬的に許容できる担体」は、本発明の化合物と一緒に患者に投与されてもよい担体を意味し、そして化合物の治療上の有効量を送達するために十分な用量について投与する場合、それらの医薬品活性を損なわず、非毒性である。

本発明の組成物に使用してもよい医薬的に許容できる担体及び媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、制限されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ‐ａ‐トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸などの自己乳化薬剤送達システム（ＳＥＤＤＳ）、ツイーン又は他の同様のポリマー送達マトリックスなどの製剤中で使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物などの緩衝物質、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩又は電解質、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系の物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレン‐ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂肪などが挙げられる。

当業者によって理解されるように、組成物は、意図する投与経路と適合するように、適切に処方される。適切な投与経路の例としては、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内などの非経口投与、頬側、吸入、点鼻、及び肺噴霧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐｒａｙ）などの経口投与、皮内投与、経皮（局所）投与、経粘膜的投与、眼内投与、腫瘍内投与、及び直腸投与が挙げられる。

本発明に従った組成物は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０００μｇ／ｋｇの範囲の投与量、あるいは約０．１〜約１０００μｇ／ｋｇの範囲の投与量、あるいは約１〜約５００μｇ／ｋｇの範囲の投与量で送達されてもよい。効果的な投与量はまた、投与経路及び他の薬剤との併用の可能性に依拠して変化する。

精製方法
グリピカン４は、さまざまな幹細胞型に大部分が存在しているので、本発明者等は、幹細胞及び分化細胞の両方を含んでもよい細胞の混合物から細胞のこの型を精製するためにこれらの細胞上のグリピカン４の存在を使用することを提示する。

本発明は従って、サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのグリピカンファミリーのメンバーのリガンドの使用にまた関する。

本発明は、サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法を提供し、ここでサンプルは、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し、それによってサンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する。

本明細書において使用されるように、「サンプル」は、大きい集まりの一部を意味する。好ましくは、本発明に従ったサンプルは、生体由来の物質である。生体サンプルの例は、限定されないが、腎臓、肝臓、心臓、肺など、動脈、静脈などの臓器又は組織の一部、血漿、血小板、血液細胞の亜集団などの血液及びそれらの成分が挙げられる。

本発明の文脈において、「幹細胞を特異的に精製すること（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という表現は、構成要素の混合物の中にいる、特に細胞の混合物の中にいる幹細胞を特異的に単離することを意味する。特異的な精製の後、混入物質が幹細胞の間にまだ存在するかもしれないが、幹細胞は、精製細胞の大部分を示す。例えば、幹細胞は、８５％超の精製細胞、より好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超、最も好ましくは９９％超の精製細胞を示す。

本明細書において使用されるように、「グリピカンファミリーのメンバーのリガンド」は、グリピカンファミリーのメンバーに向かって結合親和性を有する分子を意味する。特に、リガンドは、特異的な態様でグリピカンファミリーのメンバーと結合することが好ましく、グリピカンファミリーのメンバーと選択的に結合するリガンドであり、細胞の他のタンパク質と比較して特異的であることが好ましい。特異的なリガンドは特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び組み換え抗体、又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、及びｓｃＦｖ断片などのそれらの断片；ファージ抗体（ｐｈＡｂｓ）；ラマ及びラクダ抗体；及びアプタマーからなる群から選択される。好ましくは、特異的なリガンドは、モノクローナル抗体である。

本発明に従った精製方法において、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドは、サンプルから幹細胞の単離を容易にするために固定化できる。特に、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドは、固体支持体への結合を介して固定化できる。適切な固体支持体の非限定的な例は、ガラス若しくはプラスチックスライド、樹脂、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、又はビーズ（限定されないが、ラテックス、ポリスチレン、若しくはガラスビーズを含む）などの粒子が挙げられる。共有及び非供給結合、又は受動的吸収の使用を含む、当該技術分野における公知の任意の方法が、固体支持体にグリピカンファミリーのメンバーのリガンドを付着するために使用できる。

本発明を、以下の図面及び例によりさらに説明する。

実施例１：ｇｐｃ４ ^mut 細胞の細胞分化特性
本発明者等は、経時的に多能性及び系列特異的マーカーの発現を追うことによりＧｐｃ４変異体細胞の細胞分化特性を評価するために、半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ方法を使用した。免疫細胞化学を、的確な時点で細胞分化を定量するために適用した。最後に、培養プレートにおいて、次に起こる神経分化、及び胚体の収縮能に基づき発生している心筋細胞の機能活性に関して、顕微鏡検査を適用した。

材料及び方法
グリピカン４変異体細胞
本発明者等により使用されたグリピカン４変異体細胞（Ｇｐｃ４変異体）を、W. Skarnesによって遺伝子トラップ技術を使用して作製した（Skarnesら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6592-6596）。マウス胚性幹細胞（１２９／Ｏｌａマウス株由来のＥ１４Ｔｇ２ａ．４）を、分泌型トラップベクター（ｐＧＴ１．８ＴＭ、ｐＧＴ１Ｍｐｆｓ）と共にエレクトロポレーションした。ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）により得られたｃＤＮＡのダイレクトシークエンシングにより、グリピカン４の内在性遺伝子に接合した遺伝子トラップベクター配列からなる融合転写物を発現する２つのＥＳＣ系を同定した。本発明者等は、これらのＥＳＣ系が、グリピカン４のエキソン１におけるプライマー及び分泌型トラップベクターのｌａｃＺ遺伝子におけるもう一つのプライマーを使用してＲＴ‐ＰＣＲ分析を行うことにより、この融合転写産物を産生したことを確認した。ゲノムウォーキングを行うことにより、本発明者等は、遺伝子トラップベクターの挿入が、マウスグリピカン４遺伝子座の第一イントロンにおいて発生したことを示した。本発明者等により使用された２つのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系を、Ｇｐｃ４^gt‐1及びＧｐｃ４^gt‐2と命名した。

半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ研究
全ＲＮＡを、酸‐フェノール抽出（Ｔｒｉｚｏｌ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）により単離した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を、Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ ＲＴ‐ＰＣＲキットで、メーカーが推奨するように行った。ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。サイクル数を、ＰＣＲの飽和効果を回避するために、反応曲線の直線部分のＰＣＲ条件を選択するように選んだ。特異的プライマーの配列、サイクル数、アニーリング温度、及び増幅産物の長さを、それぞれのプライマーの組み合わせについて確立した。

免疫細胞化学
細胞を、室温で３０分間、４％のパラホルムアルデヒド及び１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で固定した。固定に続いて、サンプルを、５分間、１×ＰＢＳで、３回洗浄し、そして次に室温で１５分間、１０％の正常ヤギ血清及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を有する１×ＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を、その後、５分間、１×ＰＢＳ中で、３回洗浄し、そして対応する使用希釈倍率で、１０％の正常ヤギ血清及び１×ＰＢＳ中で一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体でのインキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、さらに室温で３０分間、１０％の正常ヤギ血清及び１×ＰＢＳ中で適切な二次抗体と共にインキュベートした。最後に、サンプルを１×ＰＢＳで４回洗浄し、そして４，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ、２５０ｎｇ／ｍｌ）で対比染色した。標識を、倒立顕微鏡を使用して蛍光灯で検出した。

結果
マウス胚性幹細胞におけるＧｐｃ４
本発明者等は、ｇｐｃ４エキソン１及びエキソン３におけるＰＣＲプライマーを使用して半定量性ＲＴ‐ＰＣＲにより野生型の及びｇｐｃ４短縮転写産物のレベルを分析した。図１１に示すように、ｇｐｃ４遺伝子をマウスＥＳＣにおいて発現させ、そしてｍＲＮＡレベルを、２つのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系、Ｇｐｃ４^gt‐1及びＧｐｃ４^gt‐2について著しく減少させた。定量分析では、Ｇｐｃ４転写産物がそれぞれ、Ｇｐｃ４^gt‐1細胞について８０±１％減少し、Ｇｐｃ４^gt‐2細胞について５０±０．５％減少したことを示した（Ｐ＜０．００１）。さらに、短縮転写産物を、ノーザンブロット分析により検出しなかった。また、融合転写産物のレベルは、Ｇｐｃ４^gt‐1ＥＳＣよりもＧｐｃ４^gt‐2において高かった（図１１）。一貫して、ウェスタンブロット分析は、Ｇｐｃ４タンパク質のレベルが、野生型対照と比較してＧｐｃ４変異体ＥＳＣ系において減少していたことを示した（図１２）。

Ｇｐｃ４ハイポモルフ型突然変異体（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）はマウスＥＳＣの分化を加速する
自己複製及び分化系列決定の特性を調節する際のＧｐｃ４に関する機能的要求を評価するために、本発明者等は、自己複製のために最適な条件下、野生型及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣを培養し、そしてそれはＬＩＦの存在下、及び胚性線維芽細胞フィーダー層における生育に関与する。Ｇｐｃ４^gt‐1及びＧｐｃ４^gt‐2ＥＳＣ系の両方が、野生型対照と類似している形態的及び生育特性を示した。変異体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＲｅｘ‐１などの多能性マーカーを同程度のレベルで発現し、そして分化のマーカーを欠損していた（図１３）。注目すべきは、他のＧｐｃファミリーメンバーにおける代償性変化（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｃｈａｎｇｅ）を、Ｇｐｃ４変異体ＥＳＣｓにおいて検出しなかった。従って、Ｇｐｃ４変異体細胞は、外因性の自己複製維持シグナルによって完全に支持される場合、ＥＳＣの分子及び細胞特性を保持する。

本発明者等は、Ｇｐｃ４変異体細胞が、野生型胚性幹細胞よりも３日早く、Ｏｃｔ４などの多能性マーカーの発現を有意に下方制御し、そして神経及び心臓系（それぞれネスチン及びαＭＨＣ）のマーカーを有意に上方制御したことを示した（図１及び２）。さらに、神経分化Ｇｐｃ４変異体細胞において見られるＯｃｔ４ポジティブ細胞の６０％の減少は、失われた多能性Ｏｃｔ４細胞が、神経細胞型について細胞運命の切り替えを受けたことを示しており、ネスチンポジティブ細胞の６０％の増加と著しく相関する（図３及び４）。

Ｇｐｃ４変異体細胞が、すべての細胞系について分化するための胚性幹細胞特性を保持するかどうかについて理解するために、本発明者等は、胚盤胞内にＧｐｃ４変異体細胞を注射し、そして胚組織においてそれらの存在を追った。本発明者等は、Ｇｐｃ４変異体細胞が、すべての三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）において存在していたことを示した。これらの研究は、Ｇｐｃ４変異体細胞が、発生シグナルに対する応答及び全ての体細胞型についての分化の重要な特性を保持することを証明した。

実施例２：腫瘍形成を抑えるグリピカン４の調節
実施例１に記載した結果は、発明者等に、Ｇｐｃ４の調節が、インビボで注射した場合、腫瘍形成を抑えるかどうかを評価するために駆り立てた。

多能性細胞は、着床前のマウス胚に戻す場合、すべての三胚葉の誘導体へと発生する（Murry及びKeller (2008) Cell. 132:661-680）。Ｇｐｃ４変異体ＥＳＣは、迅速な分化を示し、さらに複数の細胞型を生じる。Ｇｐｃ４がインビボで細胞多能性の側面を制御するかどうかを評価するために、本発明者等は、野生型マウスの胚盤胞にＧｐｃ４^gt‐1ＥＳＣを注射することによりキメラマウス胚を作製した。Ｇｐｃ４機能の喪失が、アフリカツメガエル胚における原腸形成及び脳のパターニングに影響を及ぼすこと（Galliら、(2003) Development 130:4919-4929）を以前に示したので、本発明者等は、初期発生段階、すなわちＥ６．７５／Ｅ７．５，Ｅ９．５及びＥ１３．５で、胚を分析した。Ｇｐｃ４変異体細胞、Ｇｐｃ４^gt‐1の分布に続いてβ‐Ｇａｌ発現があった。Ｅ６．７５／Ｅ７．５で採取された胚の８５．７％が、β‐Ｇａｌ⁺であり（１２／１４胚）、Ｅ９．５で７２％がポジティブであり（１３／１８胚）、そしてＥ１３．５で６２．５％であった（１０／１６胚）。β‐Ｇａｌ染色の全組織標本の試験は、発生している胚の組織に対するＧｐｃ４変異体のＥＳＣ誘導体の広範な寄与を明らかにし、そしてそれは、対応する発生段階でのｇｐｃ４ｍＲＮＡの発現プロファイルと似ていた。組織切片は、Ｇｐｃ４^gt‐1ＥＳＣが、神経上皮、頭部間葉（ｈｅａｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）、発生している心筋、肺、及び腸内に統合されたことを明らかにした。注目すべきは、β‐Ｇａｌ発現の全組織標本により評価されるように、キメラ現象の程度は、胚が後の段階に達するにつれて（Ｅ６．７５／Ｅ７．５〜Ｅ９．５、約５０％減少）減少した。さらに高度のキメラ現象を有する胚の画分は、頭部、中胚葉節（ｓｏｍｉｔｅ）及び尾芽において、全体の形態異常を示した。まとめると、これらの知見は、Ｇｐｃ４変異体ＥＳＣが、すべての胚細胞系の初期発生に寄与し、従って、重要な多能性特性を保持することを示した。それらはまた、Ｇｐｃ４欠乏が、特異的な発生のプロセスと互換性がないかもしれないことを示唆した。

本発明者等は次に、野生型及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣ（Ｇｐｃ４^gt‐1）を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして５×１０⁷細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁したかどうかを求めた。全量で１００μｌの細胞懸濁液を、６週齢の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒ‐ｎｕ）に皮下注射した。６匹のマウスをそれぞれの実験に使用し、そしてそれらを、２連で行った。マウスを、注射後１週間、奇形腫形成に関してモニターした。腫瘍の発生を、合計４週間、１日おきにモニターした。腫瘍を、腫瘍重量を確立するために解剖し、そしてさらにＨ＆Ｅで染色したパラフィン包埋切片を作製することにより分析した。

一般的には、ＳＣＩＤマウスへの野生型ＥＳＣの注射は、奇形腫形成を引き起こす（Murry及びKeller、2008）。これと一致して、野生型ＥＳＣを注射したマウスは、４週間後、大きな奇形腫を発生した（図５及び６）。これらの奇形腫平均重量は、４．５±１．９ｇであり（図７）、そしてそれらは、神経上皮（外胚葉）、軟骨／骨（中胚葉）、及び粘液産生上皮（内胚葉）を含むすべての三胚葉由来の組織含んでいた。驚くべきことに、Ｇｐｃ４^gt‐1ＥＳＣの注射は、０．８±０．４ｇの平均重量（図７）を有する小さな組織塊（図５及び６）の発生をもたらした。組織学的分析は、胚葉由来の組織がないが、β‐Ｇａｌ発現Ｇｐｃ４^gt‐1細胞の存在を明らかにした。

要約すると、本発明者等は、Ｇｐｃ４変異体細胞をヌードマウスの脇腹に移植した場合、野生型細胞と対照的に、奇形腫のリスクを克服したことを示す（図５）。定性的及び定量的分析は、Ｇｐｃ４変異体細胞が、単離された細胞として残ったか、又は野生型細胞よりも１０倍小さい細胞凝集塊の一部となったかのいずれかを示し、なんらかの奇形腫形態を示さなかった（図６及び７）。

従って、Ｇｐｃ４は、異種環境に移植した場合、明確な幹細胞性特性、すなわち奇形腫を発生する能力の維持に関与することにより、ＥＳＣの運命を制御する。従って、それらは、Ｇｐｃ４調節が、初めて、それらの腫瘍形成特性からＥＳＣ分化能の分離を可能にすることを明らかにする。

実施例３：幹細胞における基本的なＧｐｃ４機能の分子機構
本発明者等は次に、Ｇｐｃ４が細胞多能性を調節する環境シグナルを制御する可能性を評価するために幹細胞における基本的なＧｐｃ４機能の分子機構を調査した。

胚性幹細胞における多能性を維持するためのペプチドシグナルは、骨形成タンパク質、白血病阻害因子、及びＷｎｔファミリーメンバーが挙げられる。

Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を、ＴＯＰ‐ＦＬＡＳＨアッセイを使用して試験した。野生型及びＧｐｃ４変異体胚性幹細胞を、ＴＯＰ‐ＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポータープラスミド、又はその変異体対照、ＦＯＰ‐ＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかで、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ含有プラスミドと一緒に形質移入した。ＴＯＰ‐ＦＬＡＳＨプラスミドベクター中の酵素ルシフェラーゼの上流のＴｃｆ配列に結合する内因性β‐カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）／Ｔｃｆ転写複合体は、Ｗｎｔ経路の活性化によってルシフェラーゼ発現を駆動する。ＦＯＰ‐ＦＬＡＳＨプラスミドを、変異したＴｃｆ配列を含むため、対照として使用した。形質移入２４時間後、細胞を２４時間、５ｎｇ、１０ｎｇ、及び５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａで形質移入し、そしてライセートを、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に採取した。ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍｉｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定し、そしてウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。アッセイを、少なくとも２つの独立した実験において２連で行った。値を、Ｗｎｔ３ａを含まない培地で処理することにより標準化した。

本発明者等は、Ｗｎｔ活性が、野生型ＥＳＣと比較してＧｐｃ４変異体ＥＳＣで減少したことを示し、従って、Ｇｐｃ４が、Ｗｎｔシグナル伝達に対して幹細胞の適切な応答のために必要であることを証明した（図８）。

実施例４：心臓の修復のためのグリピカン４調節の使用
本発明者等は、インビトロ分化におけるＥＳＣ中のＧｐｃ４の役割を評価した。本発明者等は、胚体（ＥＢ）を使用して、中胚葉及び内胚葉の細胞系にＧｐｃ４変異体及び野生型ＥＳＣを分化した。ＥＢは、収縮性部分により明らかにされる、心筋細胞などのさまざまな分化した細胞型を産生する（Parisiら、(2003) J. Cell. Biol. 163:303-314）。特に、野生型及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣを、本質的に、Maltsevら、(1993) Mech Dev. 44(1):41-50に記載されるように、ＥＢにおいて培養した。簡潔に説明すると、ＥＢの調製を、５ｍｌのＰＢＳを含む１０ｃｍの細菌用皿の蓋の上に懸滴（３００細胞／３０μｌドロップ）中で行った。ＥＢを含む懸滴を、２日間、５％のＣＯ₂を含む大気中、３７℃でインキュベートした。懸滴は、その後、２０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で洗浄し、新しい皿に再度播種し、そしてさらに３日間３７℃でインキュベートして５日齢のＥＢを産生する。５日目に、ＥＢを、鼓動している心筋細胞の形態分析のためにゼラチンコート２４ウェルプレート上に別々に播種し、又はＲＴ‐ＰＣＲ及びウェスタンブロットのために１００ｍｍの組織培養プレート上に播種した。

Ｇｐｃ４変異体及び野生型ＥＢのサイズは、培養５日後、類似していた（Ｇｐｃ４^gt‐1ＥＢ：１４６２５±６２５細胞；野生型ＥＢ：１２８２５±３２５細胞；Ｐ＞０．０５）。対照的に、それらの系列分化の動態は、大幅に異なっていた。野生型培養物において、鼓動しているＥＢは、７日目で最初に現れ、そしてそれらのパーセンテージは、１５日目で６５±１％まで増加した（図１６）。それよりも、鼓動するＥＢの増加は、Ｇｐｃ４変異体細胞で加速及び増強され、そして６日目で８０±１．３５％、７日目で９５±１％に達した（図１６）。サルコメアタンパク質α‐アクチンに関して免疫染色されたより大きな領域が、Ｇｐｃ４^gt‐1ＥＢで見られた。興味深いことに、Ｇｐｃ４^gt‐2細胞における鼓動しているＥＢの数は、野生型とＧｐｃ４^gt‐1の間中間であり（図１６）、Ｇｐｃ４が用量依存的にＥＳＣの運命を制御していることを示していた。

これらの知見と一致して、Ｏｃｔ４及びクリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）などの未分化細胞に関するマーカーの発現は、７日目になって初めて変化した野生型対照とは対照的に、Ｇｐｃ４変異体ＥＢにおいて、２日目及び５日目で減少した（図１７）。一貫して、初期中胚葉（ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ））、心筋細胞（Ｎｋｘ２．５及びα‐Ｍｈｃ）、並びに内皮細胞（ＣＤ３１）に関するマーカーは、途中で上方制御が見られた（図１７）。内胚葉の分化（例えばＧａｔａ４）もまた、変異体ＥＢにおいて発生したが、大幅な変化は、肝細胞（Ｔｄｏマーカー；図１７）などの完全に分化した細胞の発現プロファイルにおいて観察されなかった。Ｇｐｃ４変異体ＥＢのこの著しい分化表現型は、ＥＳＣにおけるＧｐｃ４レベルを弱めることが、細胞系移行（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｅｎｔｒｙ）を増強することを示唆している。

さらに、本発明者等は、ｇｐｃ４^mut心筋細胞が、野生型細胞よりもしっかりとして永続的な収縮能を有することを示した（図９）。

結論として、本発明者等は、鼓動するＥＢのパーセンテージが、野生型ＥＳＣよりもＧｐｃ４変異体ＥＳＣで高く、そしてこの高いパーセンテージをはるかに迅速に実現したことを示した。

実施例５：パーキンソン病の細胞に基づく治療のためのグリピカン４調節の使用
Ｇｐｃ４は、神経系に向かってもＥＳＣ分化の開始を制御する
Ｇｐｃ４が特異的な細胞型の分化率を制御するかどうか、又は分化に対するＥＳＣ関与の段階でより一般的に必要とされるかどうかを理解するために、本発明者等は、定義されたプロトコール（Ficoら、(2008) Stem Cells and Development 17:573-584）を使用することにより、神経細胞系を生じるＧｐｃ４変異体ＥＳＣの能力を試験した。特に、野生型及びＧｐｃ４変異体ＥＳＣを、０日目で、単一細胞懸濁液において分離し、そして１０００細胞／ｃｍ²を、ゼラチンコートプレート上に播種した。分化プロセスの間、培地を毎日交換した。神経分化のための培地（血清不含ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）添加培地）は、１５％のＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノールを添加したノックアウトダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）最小必須培地を含んでいた。神経分化後、Ficoら、(2008) Stem Cells and Development 17:573-584に記載されたように、形態学的検査及びマーカー分析を続けた。

異なる時点で分化している細胞の免疫染色では、非常に多くのネスチンポジティブ神経前駆細胞を、野生型と違って、２日目でＧｐｃ４変異体細胞において検出し（図３）、そしてそれらのパーセンテージは、４日目での野生型についてよりも約６０％高い（図４）ことが明らかになった。Ｔｕｊ１、ＧＡＢＡ、及びカルレチニンなどの神経マーカーを、野生型対照と比較した場合、分化しているＧｐｃ４^gt-1ＥＳＣにおいて初期段階でまた発現していた（図１４）。ＥＢにおける以前の結果と一致して、本発明者等は、野生型細胞よりも約６０％低い（図４）、４日目でのＯｃｔ４の有意な下方制御（図３）を見出した。

異なる時期での、Ｏｃｔ４、ネスチン、及びＭａｐ‐２などの細胞型マーカーの発現プロファイル分析は、免疫染色結果を支持した（図１５）。ホスホヒストンＨ３又は活性化カスパーゼ３ポジティブ細胞を数えることで、神経誘導体の増加した数が、神経前駆細胞の増殖又は生存の増加から主に生じたというよりもむしろ、この系列に移行するためにＧｐｃ４^gt-1ＥＳＣの増強された能力から主に生じたことを明らかにした。

総合すれば、これらの結果は、ＥＳＣにおけるＧｐｃ４の損失が、それらの複数の細胞系に向かう分化に影響を及ぼすことを示した。これらの著しい変化は、系列分化の開始時に起こり、Ｇｐｃ４が、ＥＳＣの自己複製及び分化系列決定のバランスを制御できることを示す。さらに、本発明者等は、神経細胞に分化したＧｐｃ４変異体細胞が、通常はドーパミン作動性細胞の運命を引き起こすために必要とされる因子の不存在下ですら、中脳ドーパミン作動性細胞の特性を有するチロシンヒドロキシラーゼ神経の多数を発生するための本質的な能力を有する（野生型細胞よりも１５倍超）ことを示した（図１０）。

実施例６：Ｇｐｃ４は、インビボにおける神経幹細胞の維持を制御する
本発明者等は、Ｇｐｃ４のｍＲＮＡは、神経ＳＣが存在する新生動物の神経形成領域及び成体マウス脳において発現することを見出した（Alvarez-Buylla及びGarcia-Verdugo、(2002) J. Neurosci. 22:629-634; Kokoevaら、(2002) EMBO J. 21:2312-2322）。従って、本発明者等は、Ｇｐｃ４が高度に発現している嗅球（ＯＢ）神経発生系に集中している神経ＳＣなどの他のＳＣ型の運命を、Ｇｐｃ４がまた、制御するかどうかを決定した。

放射状グリア初代神経ＳＣに由来する生後産生されたＯＢ神経（またＢ型細胞と呼ばれる）は、脳室下帯に位置した（SVZ; Doetschら、(1999) Cell 97:703-716）。これらの神経ＳＣは、ゆっくりと分割して、Ｍａｓｈ１を発現している、高速分割（ｆａｓｔ‐ｄｉｖｉｄｉｎｇ）一過性増幅（ｔｒａｎｓｉｔ‐ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）前駆細胞（またＣ型細胞と呼ばれる）を産生し、そしてそれは、ダブルコルチン（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）などの神経マーカーを発現している神経芽細胞（またＡ型細胞と呼ばれる）を順に産生する。神経芽細胞は、ＯＢに吻側移動経路（ＲＭＳ）を通じて移動し、ここでそれらは、局所介在神経へと分化する（Alvarez-Buylla及びGarcia-Verdugo、２００２）。生後脳エレクトロポレーションに合わせてＲＡＮ干渉に基づく以前に記載した方法が、ＯＢ神経発生の間の遺伝子機能を分析するために許容される（Boutinら、(2008) PLoS One 3:e1883; Boutinら、(2010) Proc Natl. Acad. Sci. USA 107:1201-1206）。本発明者等は、ＳＶＺ神経ＳＣにおけるＧｐｃ４機能を研究するためにこの方法を採用した。本発明者等は、最初に、Ｇｐｃ４特異的ｓｈＲＮＡプラスミドの活性を、ＮＨＩ３Ｔ３細胞内にマウスＧｐｃ４、Ｍｙｃタグ含有発現プラスミドと共に、それらのそれぞれを同時形質移入（ｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）することにより検証した。ウェスタンブロット分析は、ｓｈ‐２及びｓｈ‐５が低活性であり、そしてｓｈ‐３が全く活性を示さなかった一方で、それらの１つであるｓｈ‐１がＧｐｃ４タンパク質の発現を効果的に阻害したことを示した（Ｇｐｃ４タンパク質の下方制御：ｓｈ１、７６％；ｓｈ２、４３％；ｓｈ５、４０％；アクチンローディング対照を使用して標準化）。すべての４つのｓｈＲＮＡプラスミドを、最初のインビトロ試験のために使用した。

Ｇｐｃ４ ｓｈＲＮＡベクター又は空の対照ベクターを、ＧＦＰ発現プラスミドと共に同時エレクトロポレーション（ｃｏ‐ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）し、そしてそれは、形質移入した細胞の可視化を可能にした。

エレクトロポレーションされた生後脳細胞のエレクトロポレーション及び形態学／分子分析を、以前に記載されたように行った（Boutinら、2008; Boutinら、2010）。これらの研究のために、エレクトロポレーションを、１日齢の仔（Ｐ１）の側部心室壁について行い、そして分析を、エレクトロポレーション６日後（Ｐ６）に行った。最初に、発明者等は、ＧＦＰ発現により、ＶＺ，ＳＶＺ、及びＲＭＳについて形質移入細胞の広範囲の分布を調べた。ＧＦＰポジティブ細胞を、それらの形態に応じて分類した。初代神経ＳＣ（Ｃ型細胞）を、それらの強いＧＦＰ発現、並びに心室及び内膜表面を含有する頂側膜（ａｐｉｃａｌ）／基底膜（ｂａｓａｌ）プロセスのそれぞれにより、同定した。Ｃ型細胞は、相対的に低いＧＦＰレベル、丸い形状、及びしばしば形成されたクラスターを有する。Ａ型細胞は、最も低いＧＦＰレベル、小さな体細胞及び最大２つのプロセスを有する。

Ｐ６で、対照及びＧｐｃ４ ｓｈＲＮＡでエレクトロポレーションした両方の脳において、多くのＡ型ポジティブ細胞は、ＲＭＳに既に入っており、そしてさらにＯＢに達していた。しかしながらＳＶＺにおいて、２つの群の間の３つの異なる細胞型の割合について、著しい差があった。ＧＦＰポジティブ細胞の総数に対するＧＦＰポジティブ初代神経ＳＣ（Ｂ型細胞）のパーセンテージは、Ｇｐｃ４ ｓｈＲＮＡ条件において大幅に減少した（対照：２６．５±３．９％、Ｇｐｃ４ ｓｈ１：６±０．５％；図１８）。興味深いことに、神経ＳＣパーセンテージにおける減少は、ＧＰＣ４の下方制御のレベルと正比例し、ＧＰＣ４発現は、用量依存的にインビボにおける神経ＳＣプールの維持のために重要であることを示した。Ｇｐｃ４下方制御後のＳＶＺにおけるＣ型細胞及びＡ型細胞の数を、ＧＦＰとＭａｓｈ１及びダブルコルチンとの共局在化により測定した。Ｍａｓｈ１（１：１００；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）及びダブルコルチン（１：２５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用する免疫染色を、（Boutinら、2008; Boutinら、2010）に記載されたように行った。データを、平均±標準誤差として示す。スチューデント アンペアード ｔ検定、又はマン‐ホイットニー検定を使用して、Ｉｎｓｔａｔソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用するデータ群間の差を評価した。Ｐ＜０．０５の場合、差を統計的に有意とみなした。

本発明者等は、対照及びｓｈ１エレクトロポレーション群の両方について、ＧＦＰポジティブ細胞の同様の大部分が、ＤＣＸポジティブＡ型細胞であることを見出した（対照：６４．７±２．３％、Ｇｐｃ４ ｓｈＲＮＡ：６５．６±２．２％）。対照的に、本発明者等は、しばしばクラスターを形成する対照と比較して、ｓｈ１をエレクトロポレーションした動物で、Ｍａｓｈ１ポジティブＣ型細胞であるＧＦＰポジティブ細胞について強い増加を見出した（対照：８．８±１．６％、Ｇｐｃ ｓｈＲＮＡ：２８．４±２．２％）（図１８）。つまり、インビボでの神経ＳＣおけるＧｐｃ４下方抑制が、初代神経ＳＣの直接のより少ない未熟な娘前駆細胞を選んで、初代神経ＳＣの割合を減少し、従って、分化に向かうＮＳＣからバランスをシフトする。

従って、これらのデータは、Ｇｐｃ４が、インビボにおいて神経ＳＣプールを維持することに関与し、そしてＳＶＺにおいて分化の開始を抑えることを示す。

実施例７：パーキンソン病治療のための神経の臨床的に関連性のある細胞源としてのＧｐｃ４変異体ＥＳＣ
弱められたＧｐｃ４活性を有するＥＳＣのインビトロでの神経分化を行うことにより、本発明者等は、これらの細胞が、腹側中脳ドーパミン作動性特性を有する多数のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現している神経を自然的に発生することを発見した。本発明者等は、パーキンソン病のためのラット動物モデルにおいて、前臨床試験を行うことにより、これらの細胞型の潜在的な治療の影響について検討した。

本目的のために、本発明者等は、黒質線条体路への６‐ＯＨＤＡの融合を通じて、一側性病変（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｌｅｓｉｏｎｉｎｇ）シクロスポリン免疫抑制ラットによりパーキンソン病の動物モデルを作製した。本発明者等は、これらのパーキンソン病の脳の線条体おける弱められたＧｐｃ４活性を有する細胞の移植が、行動試験によって評価されたように、野生型細胞よりも、パーキンソン病の症状のより効果的な機能的回復につながることを見出した（図１９）。さらに、Ｇｐｃ４変異体細胞は、インビボにおいて奇形腫を発生しなかったので、これらの細胞の治療効果が後の段階で持続し、そしてそれは対照的に、野生型細胞において発生することにより、脳異常形成及び死につながった（図１９）。

要するに、上記研究は、減少させたＧｐｃ４活性を有する多能性細胞が、奇形腫の副作用を避けて、インビボにおいて検討した機能的回復を行うために適切な細胞系になることができるインビボでの証拠を提供する。

Claims (15)

1. 変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性が、弱められ又は消失させられた、幹細胞又は前駆細胞。
2. 前記幹細胞又は前駆細胞が、ヒト胚に直接由来しない、請求項１に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。
3. 奇形腫の形成を抑える、請求項１又は２に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。
4. 前記グリピカンファミリーのメンバーがグリピカン４である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。
5. 細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞のインビトロ生成方法であって、以下：
   幹細胞又は前駆細胞において前記グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を弱め又は消失させ；
   それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を回収すること
   を含む、方法。
6. 前記幹細胞又は前駆細胞が、ヒト胚に直接由来しない、請求項５に記載の方法。
7. 体細胞における前記グリピカンファミリーのメンバーの発現及び／又は活性を一過性に増加し又は誘導し、次に一過性に減少し又は弱め、それによって人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を回収することを含む、体細胞由来の人工多能性幹細胞のインビトロ生成方法。
8. 請求項５〜７のいずれか一項に記載のインビトロ方法により取得できる、幹細胞、前駆細胞、又はｉＰＳ細胞。
9. 変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置に使用するための、請求項５又は６に記載のインビトロ方法により取得できる、幹細胞又は前駆細胞。
10. 幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞のインビトロ生成方法であって、以下のステップ：
    ａ）請求項５又は６に記載の方法により細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生成し；及び
    ｂ）細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップａ）において生成された前記幹細胞又は前駆細胞を供すること
    を含み、それによって分化した細胞を生成する、方法。
11. 毒物学的スクリーニングのために請求項５〜７のいずれか一項に記載のインビトロ方法により生成される幹細胞、前駆細胞、又はｉＰＳ細胞の使用。
12. サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するための前記グリピカンファミリーのメンバーの使用。
13. サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法であって、ここで前記サンプルが前記グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し；
    それによって前記サンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する、方法。
14. 前記ガンの処置に使用するための前記グリピカンファミリーのメンバーの活性調節因子。
15. 変性疾患後の組織再生を誘導するための、好ましくは再生させる前記組織中に存在する組織特異的幹細胞の分化を増強するための前記グリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニスト。

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