KR101638403B1 - RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 유도방법에 관한 것이다. RGMc는 네오제닌 과발현 마우스 배아에서 RGMc를 처리하지 않은 정상 마우스 배아보다 네오제닌과 결합하여 배반포 내에서 OCT3/4, SOX2 및 Nanohog 등 줄기세포성 유전자를 발현하는 ICM 세포를 높은 수준으로 얻을 수 있어, 이를 이용하여 줄기세포를 유도하는 배지 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법{Media composition for inducing stem cell comprising replusive guadiance molecule c and method for inducing stem cell using the same}
본 발명은 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법에 관한 것이다.
줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있다.
첫째는 수정란으로부터 발생한 배아(배아줄기세포)로부터 얻는 것이고, 둘째는 성인이 된 몸의 각부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 상기 세포들은 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들 수 있는 자기재생(self-renewal)능력을 갖고 있다. 특히, 배아 줄기세포는 배반포의 내부세포괴/외배세포로부터 분리된다. 이 세포들은 오랜 기간 동안 자가재생이 가능하고 미분화 상태를 유지하기 위해 Oct-4 같은 전사인자를 발현하는 중요한 특성을 지니고 있다. 어떠한 조건 하에서 생식세포 및 원시 삼배엽으로 자랄 수 있다. 또한, 유전자 적중과 클론 선별을 통해 유전적으로 변형된 세포 클론을 만들 수 있다. 이와 같은 이유로, 배아줄기세포는 초기 포유류의 발달과 형질전환 연구에 좋은 방법이 된다. 쥐의 배반포에서 배아줄기세포를 분리한 이후로 (Evans, M.J. & Kaufman, M.H.(1981). Nature 292, 154-6; Martin, G.R. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-8) 많은 연구자들이 배아줄기세포 또는 배아줄기 유사세포를 햄스터(Doetshman, T. et al. (1988). Dev. Biol. 127, 224-7), 래트(Ouhibi, N. et al. (1995). Mol. Reprod. Dev. 40, 311-24), 고양이 (Yu, X. et al. (2008). Mol. Reprod. Dev. 75, 1426-32), 소 (Strelchenko, N. (1996). Theriogenology 45, 131-40), 돼지 (Li, M. et al. (2004). Zygote 12, 43-8), 원숭이 (Thomson, J.A. et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7844-8) 그리고 사람 (Thomson, J.A. et al. (1998). Science 282, 1145-47)에서 분리하는데 성공하였다. 최근에, 배아줄기세포 또는 배아줄기유사세포를 쥐(Wakayama, T. & Yanagimachi, R. (2001). Mol. Reprod. Dev. 58, 376-83), 소(Wang, L. et al. (2005). Biol. Reprod. 73, 149-55) 그리고 영장류(Byrne, J.A. et al. (2007). Nature 450, 497-502)에서 체세포 복제 착상 전 배아에서 분리하는데 성공하였다.
착상 전 배아는 배반포(blastocyst)의 ICM(inner cell mass) 배아줄기세포 분리에 가장 이상적이다. ICM-유래의 배아줄기세포는 무한으로 증식할 수 있고, 만능분화능을 갖고 어떠한 배엽으로도 분화할 수 있다. 착상전 배아 발생은 1)수정단계, 2)세포 분할 단계, 3)상실배 단계 및 4)배반포 단계(포배기라고도 함)으로 나눌 수 있는다. 초기 상실배 시기에서 난할구는 세포의 밀착을 위한 세포-세포 연결을 증가시키고, 난할구는 크기가 커지고, 극성화된다. 난할구 내에서 세포의 위치할당과 극성의 구축은 후기 상실배 시기에서 세포가 포배기에서 TE 또는 ICM으로 분화되는 것을 결정하는데 중요하다. 상기 포배기의 TE(Trophectoderm; 외피층) 또는 ICM(내괴 세포 덩어리)으로 결정하는 이론에는 세포 극성 모델(cell polarity model) 및 위치 모델(position model)이 있다. 위치 모델에서는 세포의 운명의 결정(ICM 또는 TE로의 분화)이 후기 상실배 시기에서 난할구의 위치에 의하여 결정된다고 한다. 후기 상실배 시기에서 난할 안쪽 또는 바깥쪽의 세포는 점차 고유한 특성을 갖게 된다. 난할 내의 세포의 위치가 세포의 운명을 결정하는 것이다. 세포 극성 모델은 초기 상실배의 반경에 따라 세포의 극성이 구축됨으로써, 8-세포기에서 세포 운명이 결정된다고 한다. 이어지는 난할의 분할은 분할의 각도에 따라 세포의 극성 정보를 대칭적 또는 비대칭적으로 분배한다. 상기 두 개의 이론을 뒷받침하는 상당한 정보가 존재하지만, 전분화능의 ICM 세포로 세포 운명을 결정시키는 메카니즘에 대하여 현재 밝혀진 바가 없다. 상기 ICM 또는 TE로 초기 세포운명을 결정하는 것에 대한 연구는 ICM의 분리 및 ICM-유래의 배아 줄기세포의 형성에 매우 중요하다.
한편, rgm 유전자 패밀리는 3개의 다른 유전자를 포함하고, 이 중 2개는 rgm a 및 b로, 포유동물 CNS에서 발현되어 RGMa 및 RGMb 단백질을 발생시키는 반면, 제3 멤버인 rgm c는 말초에서 발현되고(Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006), 여기서 RGMc는 철 대사에 중요한 역할을 한다는 점이 보고되었다. 또한, RGMc는 네오제닌과 결합하는 것으로 보고되고 있다. 네오제닌은 네트린-결합 단백질로 처음 소개되었으며, 네오제닌 및 RGM 패밀리가 포유류의 배아 발생 단계의 2-세포기에서 세포자살을 유발한다는 점 및 발생 최후기인 기관형성 과정에 관여함이 보고되고 있지만, 네오제닌 및 RGM 패밀리가 ICM 세포로 유도하여 이를 이용하여 ICM-유도 줄기세포를 유도할 수 있다는 점에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 마우스 배아에서 네오제닌을 과발현 시키고 RGMc를 처리한 경우, ICM 세포가 증가함을 확인함으로써, 네오제닌 과발현 및 RGMc를 이용하여 줄기세포를 고효율로 유도할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물 및 네오제닌 과발현을 세포를 이용한 줄기 세포의 유도 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물 및 네오제닌 과발현을 세포를 이용한 줄기 세포의 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 RGMc는 네오제닌 과발현 마우스 배아에서 RGMc를 처리하지 않은 정상 마우스 배아보다 네오제닌과 결합하여 배반포 내에서 OCT3/4, SOX2 및 Nanohog 등 줄기세포성 유전자를 발현하는 ICM 세포를 높은 수준으로 얻을 수 있어, 이를 이용하여 줄기세포를 유도하는 배지 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 면역염색법을 이용한 마우스 배아 발생 단계에 따른 네오제닌의 발현을 나타낸 도이다.
도 2는 RT-PCR을 이용한 마우스 배아 발생 단계에 따른 네오제닌의 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 3은 마우스 배아 발생 단계에 따른 DCC(Deleted in Colorectal cancer) 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 4는 마우스 배아 발생 단계에 따른 인테그린 β1 및 F-액틴의 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 5는 마우스 배아 발생 단계에 따른 FAK(focal adhesion kinage)의 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 6은 네오제닌의 과발현 마우스 배아 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 GFP 또는 RFP의 발현을 확인한 도이다.
도 7은 면역형광법을 이용하여 네오제닌이 넉다운된 마우스 배아 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아를 나타낸 도이다.
도 8은 면역형광법을 이용한 마우스 배아에서 네오제닌에 대한 shRNA의 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 웨스턴블롯팅을 이용한 마우스 배아에서 네오제닌에 대한 shRNA의 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아의 배아 발생 단계에 따른 이미지를 나타낸 도이다.
도 11은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아의 배아 발생 단계별로 생존한 수를 나타낸 도이다.
도 12는 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아의 배아 단계 진행이 정지된 배아의 수를 나타낸 도이다.
도 13은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아의 배반포에서 ICM 세포의 숫자를 나타낸 도이다.
도 14는 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 OCT 3/4의 발현을 확인한 도이다.
도 15는 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 OCT 3/4, SOX2, Nanog, Cdx2 및 Tead4의 발현을 확인한 도이다.
도 16은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에 네트린-1을 처리한 경우 배아 발생 단계별 이미지를 나타낸 도이다.
도 17은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에 RGMc를 처리하는 경우 배아 발생 단계별 이미지를 나타낸 도이다.
도 18은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 네트린-1 또는 RGMc를 처리하는 경우, OCT3/4의 발현을 확인한 도이다.
도 19는 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 네트린-1을 처리하는 경우, 배반포의 ICM 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 20은 네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아에서 RGMc를 처리하는 경우, 배반포의 ICM 세포의 수를 나타낸 도이다.
본 발명은 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 RGMc는 네오제닌 과발현 마우스 배아에서 RGMc를 처리하지 않은 정상 마우스 배아보다 네오제닌과 결합하여 배반포 내에서 OCT3/4, SOX2 및 Nanohog 등 줄기세포성 유전자를 발현하는 ICM 세포를 높은 수준으로 얻을 수 있어, 이를 이용하여 줄기세포를 유도하는 배지 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
상기 배지 조성물에 네오제닌 단백질이 과발현되는 세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어, '배양 배지(culture media)'는 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM( Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "줄기세포"는 동물의 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 한정된 분화능 (multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 본 발명의 줄기세포는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 전분화능 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포이다.
상기 배아줄기세포 (embryonic stem cell; ESC)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 ICM(inner cell mass; 내세포괴)을 추출하여 체외에서 배양한 것으로 동물의 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 바람직하게는 마우스 유래의 마우스 배아줄기세포이다.
상기 줄기세포는 마우스, 돼지, 개, 인간, 염소, 고양이, 양, 소로 구성된 군 중 선택된 1종 이상인 포유동물로부터 유래한 세포로부터 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 줄기세포는 네오제닌 과발현 세포에서 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 줄기세포는 착상 전 마우스의 배아로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 배아 줄기세포는 내세포괴(ICM, inner cell mass) 유래의 배아 줄기세포임이 바람직하다. 또한, 본 발명의 줄기세포는 Oct3, Oct4, SOX2 및 Nanog가 발현될 수 있다.
또한, 본 발명은
1)포유동물의 세포에 네오제닌을 과발현시키는 단계; 및
2)상기 네오제닌이 과발현된 세포를 RGMc를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계;를 포함하는, 줄기세포의 유도 방법을 제공한다.
제 1)단계는 네오제닌을 과발현시키는 단계로, 세포는 착상 전 배아인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2-PN 접합체 단계의 배아인 것을 특징으로 한다. 1)단계는 네오제닌을 포함하는 벡터를 도입하여 네오제닌을 과발현시키는 것을 특징으로 한다.
상기 포유동물은 마우스, 돼지, 개, 인간, 염소, 고양이, 양, 소로 구성된 군 중 선택된 1종 이상의 포유동물인 것을 특징한다.
2)단계는 네오제닌이 과발현된 세포에 RGMc를 처리하는 단계로, RGMc는 네오제닌과 결합하여 배반포에서 OCT3/4등 줄시세포성 유전자의 발현을 유도하고, ICM 세포의 수를 증가시킨다.
또한, 본 발명의 줄기세포의 유도 방법은 상기 2)단계 이후에 내세포괴(ICM) 유래의 배아줄기세포를 얻는 단계;를 더 포함할 수 있다, ICM 유래의 배아줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 널리 알려진 방법으로 분리할 수 있다.
이하 본 발명에 대하여 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명의 하나의 예시일뿐 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지 않느다.
[ 실시예 1] 착상전 마우스 배아에서 네오제닌의 발현 패턴 확인
1. 마우스의 배아의 과배란 유도 및 2- PN 접합체 생성( recovery )
동계 교배된 마우스 종인 C57BL 마우스를 Oriental Bio(Sungnam, S. Korea)에서 구입하였고, 상기 마우스를 삼육대학교의 IRBR(Institutional Review Board Regulation)에 따라 교배하였다. 마우스들을 표준 조건인 22±3℃, 60%의 습도에서 12 시간씩 명/암 주기를 주면서 키웠다.
보다 구체적으로, 3 내지 4주령의 C57BL 암컷에 PMS(pregnat mare`s serum; FolligonTM)를 4 내지 10IU(0.1~0.2ml)로 복강 내 주사한 후, 5 내지 10IU(0.1~0.2ml)의 hCG(human chorionic gonadotrophin; ChorulonTM)를 마우스 복강 내에 주사하였다. hCG를 주사한 다음, 상기 암컷 마우스를 동종의 성숙한 수컷과 성적으로 교배시켰다. 교배 후, 다음날 아침, 암컷 마우스를 희생시키고, 질내 플러그(virginal plug)를 확인하였다. hCG 주사 후, 18 내지 20시간 후, 축적된 덩어리(Cumulus mass)를 수집하였다. 상기 덩어리를 flame-polished 마이크로파이펫으로 축적된 세포를 제거함으로써 수정 또는 수정되지 않는 난자를 분리하였다. 이 후, 상기 난자(egg)를 300 mg/ml의 하이알루로니다제(hyaluronidase)를 처리하여 4mg/ml의 BSA(bovine serum albumin) 를 첨가한 H6 배지(Gibco BRL; Grand Island NY)에서 10분 동안 37℃로 배양하였다. 이 후, 2-PN 접합체를 현미경을 이용하여 선별하였고, 미네랄 오일이 있는 M16 배양배지(Gibco BRL; Grand Island, NY)에서 5%의 CO2에서 24시간, 37℃ 조건으로 배양하였다.
2. 면역염색법을 이용한 네오제닌 발현 패턴 확인
착상 전 다양한 단계의 마우스 배아에서 네오제닌의 발현 패턴을 확인하기 위하여, 다중 클론 항-네오제닌 항체를 이용한 면역염색법을 수행하였다.
보다 구체적으로, 착상 전 마우스 배아를 4%의 PBS(phosphate-buffered saline) 내의 4%의 파라포름알데히드로 30분동안 4℃로 고정시킨 다음, 1%의 BSA를 포함하는 PBS로 세차례 세척하였다. 이 후, 상기의 배아를 5분동안 상온에서 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS에서 삼투시켰다. PBS 내의 10%의 일반 염소 혈청에서 30분동안 상온으로 블로킹 한 다음, 배아를 일차항체로 배양하였다. 일차항체로 토끼의 항-네오제닌 항체(1:100 희석)를 사용하여, 1% PBS-BSA에서 하룻밤동안 4℃로 배앙하였다. PBS로 세번 세척 후, Alexa 488-염소 항-토끼 IgG 및 당나귀 항-마우스 IgG를 1:500으로 희석하여 사용하였다. 액틴 섬유를 시각화하기 위하여, 배아를 1μg/ml의 팔로이딘(phalloidin)에서 1시간동안 상온에서 배양하였다. 또한, 핵을 1μg/ml의 DAPI로 5분동안 염색하였다. PBS로 3번 더 세척한 후, 배아를 유리 바닥 접시(glass bottom dish)에 한 방울(a drop) 떨어뜨려, LSM700 META(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)를 이용하여 염색된 배아의 공초점 이미지를 얻었다. 모든 배아의 이미지는 3D 이미지 및 측면도를 만드는데 사용하였고, ZESS 소프트웨어(ZEN2010, ZEISS, Germany)를 이용하여 분석하였다. 면역염색법으로 배아 단계에 따른 면역염색 이미지를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 2-세포기(2-cell stage)에서, 네오제닌의 발현은 일시적으로 발현하고, 상기 발현은 초기 상실배(early morula)시기까지 계속되었으나, 이 후 후기 상실배 및 배반포(blastocyst) 시기에는 발현이 되지 않음을 확인하였다.
3. RT - PCR 을 이용한 네오제닌 발현 패턴 확인
RT-PCR을 분석을 통하여 네오제닌의 발현 패턴을 확인하였다. 보다 구체적으로, 각 발생 단계별로 10 내지 20개의 배아의 RNA를 TRIZOL을 이용하여 분리하였다. 대략 5.0μgdml 총 RNA를 Superscript ⅡTM 역전사효소를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 역전사하였다. 이 후, 하기 표 1에서 네오제닌에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.(15초 동안 95℃, 4분동안 60℃, 4분 동안 58 내지 60℃를 한 사이클로, 40회 반복; 40회 반복 후, 95℃ 10분 유지), 상기 PCR을 수행 후, 95℃에서 15초, 58 내지 60℃에서 10분을 한 사이클로 40회를 반복하였다. β-액틴을 대조군으로 사용하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
프라이머 이름 DNA 서열 PCR 조건
네오제닌 정방향 프라이머 5'-TACACTCCAGTGCCAGATCC-3' 2.5mM MgCl
60℃
네오제닌 역방향 프라이머 5'-GCCGGGTACAAAAGACAGCA-3'
Oct3/4 정방향 프라이머 5`-CACGAGTGGAAAGCAACTCA-3` 58℃
Oct3/4 역방향 프라이머 5`-AGATGGTGGTCTGGCTGAAC-3`
Sox2 정방향 프라이머 5`-GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG-3` 58℃
Sox2 역방향 프라이머 5`-TCACATGTGCGACAGGGGCAG-3 `
Nanog 정방향 프라이머 5`-CACCCACCCATGCTAGTCTT-3` 60℃
Nanog 역방향 프라이머 5`-ACCCTCAAACTCCTGGTCCT-3`
Tead4 정방향 프라이머 5`-AGCTAAGAACAAGGCCCTGC-3` 58℃
Tead4 역방향 프라이머 5`-TGCCAAAACCCTGAGATTGC-3`
Cdx2 정방향 프라이머 5`-GCAGTCCCTAGGAAGCCAAGTGA-3` 58℃
Cdx2 역방향 프라이머 5`-CTCTCGGAGAGCCCAAGTGTG-3`
β-액틴 정방향 프라이머 5`-TGTATGCCTCTGGTCGTACCACAG-3` 58℃
β-액틴 역방향 프라이머 5`-GATGTCACGCACGATTTCCCTCTC-3`
도 2에 나타난 바와 같이, 초기 배아 상태에서 일시적으로 발현하였다가, 4-세포기에 최고치로 발현하였으나, 상실배 및 이 후의 단계에서 발현이 되지 않음을 확인하였다.
4.배아 발생 단계에 따른 F- 액틴 , DCC ( Deleted in Colorectal cancer ), 인테그린 β1, 또는 FAK ( focal adhesion Kinage )의 발현 패턴 확인
배아 발생단계에 따른 F-액틴, DCC, 인테그린 β1 또는 FAK 발현 패턴을 면역염색법을 통해 확인하였다.
보다 구체적으로, 실시예 1-2의 방법으로, 일차항체를 염소 항-DCC 항체(1:100 희석), 토끼 항-FAK 항체(1:100 희석), 및 토끼 항-인테그린 β1 항체(1:100)를 사용하여 면역염색법을 수행하였다. 이의 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.
도 3 내지 5에 나타난 바와 같이, 상기 단백질들은 네오제닌 발현 패턴과 같은 일시적이고, 배아 내 위치 특이적인 발현 패턴(polarized expression pattern)을 보이지 않음을 확인하였다.
[ 실시예 2] 네오제닌 발현 수준 변화에 따른 배아세포의 기능적 변화 확인
1. 네오제닌 과발현 및 네오제닌 넉다운 효과 확인.
초기 배아 단계에서 네오제닌의 역할을 확인하기 위하여, 네오제닌을 발현하는 벡터(neogenin overexpression, OE) 또는 네오제닌을 표적화하는 miRNA를 보유한 벡터를 2-PN 접합체에 주사하였다.
보다 구체적으로, 네오제닌이 과발현하는 경우와 넉다운되는 경우와 시각적으로 구별하기 위하여, RFP(red fluorescence protein) 및 GFP(green fluorescence protein)를 지표로 함께 발현시켰다. RFP를 함유하는 벡터는 마우스의 네오제닌-프래그(flag)가 융합된 구조 cDNA를 포함하였으며(네오제닌 과발현 벡터), GFP를 함유하는 벡터는 네오제닌을 타겟팅하는 shRNA(pcDNA-EmGFP-miRNA-Neogenin; invitrogel Grand Island,NY)를 포함하도록 하였다. 상기 벡터를 박테리아에 도입하여 이를 증폭하였다. 이 후, 벡터의 1.0μg/ml 농도의 10pl을 각각의 2-PN 접합체에 전동 현미조작기(motorized micromanipulator; EMM-3NV, Narishegem Tokyo, Japan)가 부착된 마이크로인젝터(IM-9A, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 주입하였다. 주입 파이펫 및 지지 파이펫(holding piptette)을 유리 파이펫 풀러(glass pipette puller; PC-10, Narishige, Tokyo, Japan)를 사용하여 준비하였다. 지지 파이펫은 20㎛의 내부 반경 및 50㎛의 외부 반경을 갖도록 추가적으로 제조하였고, 주사 파이펫은 팁의 길이가 500㎛보다 짧고, 내부 반경이 1 내지 2㎛가 되도록 제조하였다. 미세주사 후, 주사된 2-PN 접합체를 Ham`s F10 배지에서 배양하였고, 형광현미경 및 위상차 현미경(phage-contrast microscope)하에서 이를 관찰하였다. 세포를 용해하여 네오제닌의 발현양을 재확인하기 위하여, 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 이의 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 트랜스펙션이 잘되었는지 확일하는 지표로서, GFP 및 RFP의 발현을 확인한 결과, 2-세포기 또는 4-세포기의 배아에서 잘 발현됨을 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 네오제닌의 넉다운된 마우스 배아에서 네오제닌의 발현이 거의 없는 것을 확인하였다.
도 8(면역형광법) 및 도 9(웨스턴 블롯)에 나타난 바와 같이, 비특이적인 조각화된 shRNA를 마우스 배아에 도입하는 경우, 네오제닌 발현에 대한 넉다운 효과는 네오제닌을 표적화하는 shRNA를 마우스 배아에 주사하는 경우보다 현저히 낮음을 확인하였다.
2.배아 발생 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운에 따른 이미지 관찰
네오제닌 과발현 마우스 배아 또는 네오제닌 넉다운 마우스 배아의 위상차 이미지를 수득하였다.
네오제닌 miRNA(네오제닌 넉다운) 또는 네오제닌 cDNA(네오제닌 과발현)를 주입한 후, 2-PN 접합체(zygote)에서 배반포까지의 각각의 배아 단계의 이미지를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 포배기까지는 네오제닌 넉다운 마우스 배아와 과발현 마우스 배아에서 외형적인 큰 차이는 발견되지 않았고, 배아 발생의 잠재적인 차이점이 발견되지 않았다.
3. 배아 발생 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운에 따른 배아의 생존률 및 발생 진행 여부 확인
배아 발생 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운하는 경우, 세포의 생존률 및 발생 단계 진행이 정지(arrested)된 배아의 수를 도 11, 도 12 및 표 2에 나타내었다(각각의 실험은 5번을 수행하여 평균±SEM으로 나타냄).

 2-PN 접합체
 네오제닌 cDAN 또는 miRNA가 주사된 2-PN 접합체
 배아 발생 단계
2-세포기 4~8 세포기 상실배 배반포
대조군 90 90 87
(96.7%)		 87
(96.7%)		 83
(92.2%)		 78
(86.7%)
네오제닌 넉다운 배아 218 206 201
(97.6%)		 194
(94.2%)		 185
(89.8%)		 172
(83.5%)
네오제닌
과발현 배아		 218 190 184
(96.8%)		 178
(93.7%)		 167
(87.9%)		 159
(83.7%)
도 11, 도 12 및 표 2에 나타난 바와 같이, 네오제닌 넉다운 배아 및 네오제닌 과발현 배아의 발생 갹 단계에서 생존한 배아의 숫자 및 배아 발생이 정지된 배아의 숫자 사이에 큰 차이가 없음을 확인하였다.
4. 배아의 배반포 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운에 따른 ICM(inner cell mass )의 세포의 수 확인.
배아 발생 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉 다운하는 경우, 배반포 하나당 ICM(inner cell mass)세포의 수를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, ICM 발생에서 배반포당 ICM 세포의 숫자가 네오제닌을 과발현시킨 경우가 네오제닌을 넉다운시킨 경우보다 6.5 배정도 많음을 확인하였다.
5. 배아의 배반포 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운에 따른 줄기세포 마커 유전자 발현양상 확인
면역염색법 및 RT-PCR을 이용하여, 배아의 배반포 단계에서 네오제닌의 과발현 또는 넉다운에 따른 줄기세포 마커 유전자 중 하나인 Oct3/4, SOX2, Nanog, Cdx2 및 Tead4의 발현양상을 확인하여 이의 결과를 도 14(면역염색법) 및 도 15(RT-PCR)에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 네오제닌이 넉다운된 배아와 비교하여 네오제닌이 과발현된 경우, ICM-특이적으로 Oct3/4의 발현이 증가함을 확인하였다.
상기의 결과에 의해, 네오제닌은 초기의 세포 운명의 결정에 네오제닌이 관련되어 있음을 확인하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 네오제닌 넉다운 배반포에서는 Oct3/4, Sox2 및 Nanog가 검출되지 않았으나, 네오제닌이 과발현한 배반포에서는 상기 유전자가 발현됨을 확인하였다. RT-PCR 결과는 전사인자인 Oct3/4, SOX2, Nanog의 발현과 네오제닌의 발현 사이에 강력한 연관성을 나타낸다.
[ 실시예 3]착상 전의 마우스 배아 발생 단계에서 네오제닌 리간드의 효과 확인
1. 네오제닌 과발현 또는 넉다운된 배아에 네오제닌 리간드 처리에 따른 배아 발생 단계에서 배아의 생존률 및 발생 진행 여부 확인
2-PN 접합체(네오제닌 과발현 또는 네오제닌 넉다운)를 배반포까지 96시간 동안 20%(v/v)의 네트린-1(netrin-1)이 포함된 배지 또는 재조합 RGMc가 10ng/ml로 포함된 배지에서 배양하였다. 이 후, 배아 발생 단계에서 배아의 형태를 관찰하여 도 16(네트린-1) 및 도 17(RGMc)에 나타내었다. 또한, 하기 표 3(네트린-1 처리) 및 표 4(RGMc 처리)에 배아의 생존률 및 세포 단계 진행 여부를 나타내었다.

실험대상의 배아 수 배아 발생 단계
2-세포기(%) 4~8세포기(%) 상실배(%) 배반포(%)
일반 배아 20 19(95.0) 19(95.0) 19(95.0) 19(95.0)
일반 배아에 20% 네트린-1 처리 20 20(100) 18(90.0) 18(90,0) 9(45.0)
네오제닌KD 배아에 20% 네트린-1 처리 23 22(95.7) 19(82.6) 22(95.7) 10(43.5)
네오제닌OE 배아에 20% 네트린 처리 30 29(96.7) 28(93.3) 27(90.0) 17(56.7)

실험대상의 배아 수 배아 발생 단계
2-세포기(%) 4~8세포기(%) 상실배(%) 배반포(%)
일반 배아 28 28(100) 28(100) 27(96.4) 22(78.5)
일반 배아에 10ng의 RGMc 처리 30 30(100) 24(80.0) 27(90) 23(76.7)
네오제닌KD 배아에 10ng의 RGMc 처리 72 70(97.2) 57(79.2) 62(86.1) 45(62.5)
네오제닌OE 배아에 10ng의 RGMc 처리 65 64(98.5) 56(86.2) 53(81.5) 41(63.1)
표 3 및 도 16에 나타난 바와 같이, 네트린-1의 처리는 배아가 배반포까지 도달하는 배아를 감소시킨다. 대부분 배아는 상실배 시기에 멈쳐 있음을 확인하였다. 배아 발생의 정지는 네오제닌이 넉다운되는 경우 더욱 강해졌으며, 네오제닌 과발현에 의하여 부분적으로 회복되었다.
표 4 및 도 17에 나타난 바와 같이, 네오제닌 과발현하는 배아에 RGMc를 처리하는 경우, 증가된 숫자의 ICM 세포를 갖는 배반포 부분(fraction)이 증가하였으나, 네오제닌이 넉다운된 배아에 RGMc를 처리하는 경우, 배반포에서 ICM 형성이 제대로 되지 않음을 확인하였다.
2. 네오제닌 리간드 처리에 따른 Oct3 /4 발현 양상 및 ICM 형성 양상확인
네오제닌이 과발현되는 배아 또는 네오제닌이 넉다운된 배아에 네오제닌 리간드 처리 후, Oct3/4에 대한 면역염색한 경우의 결과를 도 18에 나타내었고, 네트린-1 처리 후, 배아의 ICM 세포의 숫자를 도 19에 나타내었고, RGMc 처리 후, 배아의 ICM 세포의 숫자를 도 20에 나타내었다.
도 18 내지 도 20에 나타난 바와 같이, Oct3/4에 대한 면역염색한 경우, RGMc 처리 및 네오제닌이 과별현된 배아에 RGMc를 처리한 경우, 가장 높은 숫자의 ICM 세포 숫자를 가졌고, 네트린-1 처리 및 네오제닌 넉다운의 경우, 배반포에서 가장 적은 숫자의 ICM 세포를 산출하였다.
도 19에 나타난 바와 같이, ICM 세포 숫자의 정량적 분석은 20%의 네트린-1처리는 배반포에서 ICM 세포 숫자를 31.3% 까지 감소를 유발하고, 상기 숫자는 네오제닌을 넉다운 한 경우 더욱 감소된다.
도 20에 나타난 바와 같이, RGMc를 배아에 처리한 경우, ICM 세포의 숫자가 25%까지 증가하고, 상기 증가는 네오제닌이 과발현하는 경우, 더욱 증가함을 확인하였다.
종합적으로, 네트린-1을 처리한 배아는 처리하지 않은 대조군보다 유의적으로 낮은 ICM 세포 수를 보였고, RGMc 처리는 배아 발생을 정지시키지 않고, 높은 ICM 세포 수를 나타내었다. 정량적으로 20%의 네트린-1을 처리하는 경우, 일반 배아에서 배반포까지 성장한 것이 50%까지 저해되었으나, RGMc를 처리하는 경우, 처리하지 않는 경우와 차이가 없음을 확인하였고, 상기 배반포 단계의 배아의 ICM 형성이 현저히 증가함을 확인하였다.
상기의 결과를 종합하면, 네오제닌은 네오제닌의 리간드인 RGMc에 의존하여 Oct3/4-매개 세포 전달 경로의 상위조절 또는 하위 조절하여, 배반포 시기에서 ICM의 형성과 관련됨을 나타낸다.
특히, RGMc를 처리하는 경우, 배반포 시기에서 Oct3/4 활성화시키고, ICM 형성을 유도함으로써 인간을 포함하는 포유동물의 배반포에서 ICM-유래의 배아줄기세포를 제조할 수 있다.

Claims (14)

  1. RGMc (Repulsive guidance molecule C)를 유효성분으로 포함하는, 인간을 제외한 포유류 배아의 ICM(inner cell mass)-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유류 배아는 네오제닌을 과발현하는 배아인 것을 특징으로 하는 ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포는 마우스, 돼지, 개, 염소, 고양이, 양 및 소로 구성된 군 중에서 선택된 1종 이상인 포유동물로부터 유래한 세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 ICM-유래 배아 줄기세포는 네오제닌 과발현 배아에서 유도되는 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 ICM-유래 배아 줄기세포는 착상 전 마우스의 배아로부터 유래한 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 ICM-유래 배아 줄기세포는 Oct3, Oct4, SOX2 및 Nanog가 발현되는 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
  9. 1) 인간을 제외한 포유동물의 배아에 네오제닌을 과발현시키는 단계; 및
    2)상기 네오제닌이 과발현된 배아를 제1항에 따른 배지 조성물에서 배양하는 단계;
    를 포함하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화유도 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 1)단계에서 배아는 착상 전 배아인 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화유도 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 착상 전 배아는 2-PN 접합체 단계의 배아인 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화 유도 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 1)단계는 네오제닌을 포함하는 벡터를 도입하여 네오제닌을 과발현시키는 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화유도 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 포유동물은 마우스, 돼지, 개, 염소, 고양이, 양 및 소로 구성된 군 중에서 선택된 1종 이상의 포유동물인 것을 특징으로 하는, ICM-유래 배아 줄기세포로의 분화유도 방법.
  14. RGMc (Repulsive guidance molecule C)를 유효성분으로 포함하는, 인간을 제외한 포유류 배아의 ICM(inner cell mass) 유도용 배지 조성물.












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