EA011953B1

EA011953B1 - Pdx1-экспрессирующая энтодерма

Info

Publication number: EA011953B1
Application number: EA200601995A
Authority: EA
Inventors: Кевин Аллен Д`Амур; Алан Д. Эджалник; Сюзан Элиазер; Эммануэль Е. Бэтдж
Original assignee: Китера, Инк.
Priority date: 2004-04-27
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2009-06-30
Also published as: NZ550605A; WO2005116073A3; SG152273A1; ES2801001T3; KR20100035664A; JP2015180215A; JP2011229534A; JP6158152B2; JP2017079798A; KR101395516B1; JP6709262B2; AU2005247869B2; JP2015006194A; DK1740612T3; EP1740612A2; MXPA06012445A; EA200601995A1; JP6265942B2; ES2751095T3; IL178847A0

Abstract

В настоящем изобретении раскрыты культуры клеток, содержащие PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы, и способы их получения. В настоящем изобретении также раскрыты популяции клеток, содержащие практически очищенные PDX1-положительные клетки энтодермы, а также способы обогащения, выделения и очистки PDX1-положительных клеток энтодермы от(из) клеток других типов. Также раскрыты способы идентификации факторов, способных стимулировать дифференцировку клеток энтодермы, таких как PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки и PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы.

Description

Настоящая заявка представляет собой частичное продолжение заявки на патент США № 11/021618, озаглавленной “Дефинитивная энтодерма” (ОейшДуе епбобегт), поданной 23 декабря 2004 г., которая испрашивает приоритет в соответствии § 119(е) 35 Свода Законов США согласно следующим трем предварительным патентным заявкам: предварительной заявке и§ 60/566293, озаглавленной “ΡΌΧ1экспрессирующая энтодерма” (ΡΌΧ1 Ехргезвшд епбобегт), поданной 27 апреля 2004 г.; предварительной заявке и§ № 60/587942, озаглавленной “Поверхностный клеточный рецептор к хемокинам для выделения дефинитивной энтодермы” (Сйетокше се11 зшГасе гесер!ог Юг 1йе 18о1а1юп оГ йейтДуе епбобегт), поданной 14 июля 2004 г., и предварительной заявке и§ № 60/586566, озаглавленной “Поверхностный клеточный рецептор к хемокинам для выделения дефинитивной энтодермы” (Сйешокте се11 зшГасе гесер!ог Гог !11е 18о1а!юп оГ бейшйуе епбобегт), поданной 9 июля 2004 г.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины и клеточной биологии. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы млекопитающих, и к способам получения, выделения и применения таких клеток.

Предпосылки создания изобретения

Плюрипотентные стволовые клетки человека, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭС) и эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗ), впервые были выделены в культуре без фидерных фибробластов в 1994 г. (см. Вопдзо е! а1., 1994) и с фидерными фибробластами (Нодап, 1997). Позднее Тйотзоп, ВеиЫпоГГ и ЗйатЫоИ создали стабильные культуры ЭС и ЭЗ клеток человека, используя слои митотически инактивированных фидерных клеток мыши (ВеиЫпоГГ е! а1., 2000; е! а1., ЗйатЫоИ 1998; Тйотзоп е! а1., 1998).

ЭС и ЭЗ клетки человека (ЭСКч) открывают уникальные возможности для исследования ранних стадий развития человека, а также для лечебного вмешательства при некоторых болезненных состояниях, таких как сахарный диабет и болезнь Паркинсона. Например, применение инсулинпродуцирующих βклеток, происходящих от ЭСКч, могло бы дать значительное улучшение по сравнению с существующими процедурами клеточной терапии, в которых используют клетки из поджелудочной железы доноров. Однако в настоящее время не известно, как получить инсулинпродуцирующие β-клетки из ЭСКч. Поэтому ограничением современных способов клеточной терапии сахарного диабета с использованием островковых клеток поджелудочной железы является нехватка островковых клеток (инсулоцитов) высокого качества, необходимых для трансплантации. Проведение процедуры клеточной терапии для всего лишь одного пациента, больного диабетом I типа, требует трансплантации приблизительно 8х10⁸ островковых клеток поджелудочной железы (8йар1го е! а1., 2000; 8йар1го е! а1., 2001а; 8йарпо е! а1, 2001Ь). Поэтому для получения достаточного для успешной трансплантации числа клеток необходимо по меньшей мере два органа здоровых доноров. ЭСКч дают источник исходного материала, из которого можно получать значительные количества высокодифференцированных клеток для клеточной терапии заболеваний человека.

Два свойства делают ЭСКч исключительно подходящими для применения в клеточной терапии: плюрипотентность и возможность поддерживать эти клетки в культуре в течение продолжительного периода времени. Плюрипотентность характеризуется способностью ЭСКч дифференцироваться в производные всех трех первичных зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), из которых, в свою очередь, помимо внезародышевых тканей (например, плаценты) и клеток зародыша образуются все типы соматических клеток зрелого организма. Хотя плюрипотентность и придает необычайную полезность ЭСКч, в то же время она обуславливает исключительные сложности, возникающие при исследованиях и манипуляциях с этими клетками и их производными. Вследствие широкого разнообразия типов клеток, которые могут возникать в дифференцирующихся культурах ЭСКч, подавляющее большинство типов клеток образуются с очень низкой эффективностью. Кроме того, успех оценки образования любого отдельного типа клеток существенно зависит от определения соответствующих маркеров. Достижение эффективной направленной дифференцировки очень важно для применения ЭСКч в терапевтических целях.

Для того чтобы использовать ЭСКч в качестве исходного материала для наработки клеток, которые можно применять для клеточной терапии, было бы полезным решить следующие проблемы. Например, для того чтобы получить количество клеточного материала, необходимое для лечения путем трансплантации островковых клеток, было бы полезно на самых ранних стадиях эффективно направлять дифференцировку ЭСКч по линии образования островковых/в-клеток поджелудочной железы.

Полезным дополнением к эффективному регулированию процесса дифференцировки была бы возможность выделять и описывать промежуточные типы клеток, возникающие по пути дифференцировки к островковым/в-клеткам поджелудочной железы, и использовать такие клетки в качестве предшественников соответствующей линии дифференцировки для дальнейших этапов дифференцировки.

Краткое изложение сущности изобретения

Способы реализации настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим ΡΌΧ1экспрессирующие (ТОХ1-положительные) клетки энтодермы, а также к способам их получения. Допол

- 1 011953 нительные способы реализации относятся к популяциям клеток, обогащенным ΡΌΧΙ-положительными клетками энтодермы, и способам получения таких популяций клеток. Другие способы реализации относятся к способам повышения (уровня) экспрессии ΡΌΧ1 в клетках энтодермы, а также идентифицикации факторов, полезных для дальнейшей дифференцировки ΡΌΧ1-отрицательной и/или ΡΌΧ1положительной энтодермы. В некоторых примерах реализации композиций и способов, описанных в этой заявке, ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы представляют собой ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней (головной) кишки/средней кишки. В определенных предпочтительных способах реализации композиций и способов, описанных в данной заявке, ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы представляют собой ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки (головной кишки). В других предпочтительных способах реализации ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы представляют собой ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы задней части передней кишки.

Некоторые способы реализации настоящего изобретения относятся к культурам клеток, содержащим ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки, отличающимся тем, что ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, развивающиеся из передней части кишечной трубки. В некоторых способах реализации такие культуры клеток содержат клетки человека. В таких культурах клеток человека клетки ΡΌΧ1-положительной энтодермы прямой кишки могут составлять по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10% или по меньшей мере приблизительно 25% числа клеток человека в указанной культуре. В некоторых способах реализации настоящего изобретения количество клеток рассчитывают без учета присутствующих в указанной культуре фидерных клеток, и оно составляет по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10% или по меньшей мере приблизительно 25%. В некоторых описанных в настоящей заявке способах реализации культур клеток, ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки могут экспрессировать маркер, выбранный из группы, состоящей из содержащего гомеобокс (гомеобокссодержащего) гена А13 (НОХА13), гомеобокс содержащего гена С6 (НОХС6) и 8ΘΧ17. В других способах реализации культуры клеток, содержащие клетки ΡΌΧ1-положительной энтодермы передней кишки, практически не содержат клеток висцеральной энтодермы, клеток париетальной энтодермы и/или нервных клеток. В некоторых способах реализации культуры клеток также содержат один из следующих компонентов: соединение - ретиноид, такое как ретиноевая кислота (КА), РСР-10 или В27.

Дополнительные способы реализации настоящего изобретения относятся к обогащенным, выделенным или в значительной степени очищенным популяциям ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки, отличающимся тем, что ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, развивающиеся из передней части кишечной трубки. В некоторых способах реализации ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки получают из плюрипотентных клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки человека. Другие способы реализации настоящего изобретения относятся к популяциям клеток, которые содержат клетки, отличающиеся тем, что по меньшей мере приблизительно 90% этих клеток представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки, и где указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. В предпочтительных способах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки составляют по меньшей мере приблизительно 95% популяции клеток. В еще более предпочтительных способах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки составляют по меньшей мере приблизительно 98% популяции клеток.

Другие описанные в настоящей заявке примеры реализации относятся к способам получения ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки путем обработки культуры клеток или популяции клеток, содержащей клетки дефинитивной энтодермы, которые практически не экспрессируют ΡΌΧ1 (Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы) фактором дифференцировки передней трубки, например, таким как ретиноид. Ретиноид, например ретиноевую кислоту, можно добавлять в количестве, варьирующем приблизительно от 0,01 до 50 мкМ. В некоторых способах реализации дифференцировку Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительную энтодерму передней кишки усиливают посредством добавления к культуре клеток или популяции клеток РСР-10 и/или В27. РСР-10 можно добавлять в концентрации приблизительно от 5 до 1000 нг/мл. В некоторых способах реализации В27 добавляют к культуре клеток или популяции клеток в количестве, составляющем приблизительно от 0,1 до 20%. РСР-10 и/или В27 можно добавлять к культуре клеток или популяции клеток приблизительно в то же время, что и ретиноид, либо каждый фактор можно добавлять по отдельности с перерывами продолжительностью до нескольких часов. В определенных способах реализации ретиноид добавляют к культуре Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы, возраст которой составляет приблизительно 4 дня.

Другие примеры реализации относятся к способам применения факторов дифференцировки передней кишки для дальнейшего повышения эффективности образования Ρ^X1-положительных клеток энто

- 2 011953 дермы прямой кишки или популяции клеток, которую привели в контакт с ретиноидом, например с ретиноевой кислотой. В таких примерах реализации эффективность дифференцировки ΡΌΧ1отрицательной дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительную энтодерму передней кишки увеличивают посредством добавления в культуру клеток или популяцию клеток активина А и/или активина В. Активин А и/или активин В можно добавлять в концентрации приблизительно от 5 до 1000 нг/мл. Другие примеры реализации относятся к способам повышения эффективности образования ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток посредством дифференцировки ΡΌΧ1-отрицательных клеток в среде, содержащей ретиноид, причем указанную среду предварительно кондиционировали посредством поддержания или выращивания в ней клеток определенных типов. Такие типы клеток включают, без ограничения, эмбриональные стволовые клетки или другие плюрипотентные клетки, которые предварительно подвергли дифференцировке в среде, содержащей сыворотку или белки, принадлежащие к надсемейству факторов роста ΤΟΡβ, такие как активин А, активин В, Νοάαΐ и/или фактор морфогенеза костей (ΒΜΡ). В некоторых примерах реализации в культуру клеток или популяцию клеток добавляют кондиционированную среду в количестве, составляющем приблизительно от 1 до 100% всей среды для культивирования. Факторы роста надсемейства ΤΟΡβ и/или кондиционированную среду можно добавлять в культуру клеток или популяцию клеток приблизительно в то же время, что и ретиноид, либо можно добавлять каждый фактор по отдельности отдельно с перерывами продолжительностью до нескольких часов.

Примеры реализации настоящего изобретения относятся также к способам получения популяции клеток, обогащенной ΡΌΧ1-положительными клетками энтодермы передней кишки. В определенных примерах реализации эти способы включают этап получения популяции плюрипотентных клеток, в которой по меньшей мере одна из плюрипотентных клеток содержит по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты, которая находится под контролем промотора ΡΌΧ1. В некоторых примерах реализации эта нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (ΟΡΡ) или его биологически активный фрагмент. В других примерах реализации дополнительные этапы способа включают дифференцировку плюрипотентных клеток в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки, и отделение ΡΌΧ1-положительных клеток от ΡΌΧ1трицательных клеток. В некоторых примерах реализации описанных здесь способов этап дифференцировки дополнительно включает добавление в популяцию плюрипотентных клеток по меньшей мере одного фактора роста, принадлежащего надсемейству ΤΟΡΡ, в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку плюрипотентных клеток в Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и добавление к ΡΌΧ1-отрицательным клеткам дефинитивной энтодермы факторов дифференцировки передней кишки в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки.

Некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу увеличения (уровня) экспрессии продукта гена ΡΌΧ1 в §ΟX17-экспрессирующих (8ΘΧ17-положительных) клетках дефинитивной энтодермы посредством приведения в контакт таких клеток с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для того, чтобы увеличить экспрессию продукта гена ΡΌΧ1. В некоторых примерах реализации фактор дифференцировки выбирают из группы, состоящей из ретиноевой кислоты (КА), Ρ6Ρ-10 и В27.

Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу идентификации фактора роста, способного стимулировать дифференцировку кВА^три^и-ельных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В таких способах ΡΌΧ1отрицательные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с потенциальными факторами дифференцировки и определяют, увеличилась ли экспрессия ΡΌΧ1 в популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии ΡΌΧ1 в популяции клеток до контактирования с указанным потенциальным фактором. Увеличение экспрессии ΡΌΧ1 в популяции клеток указывает на то, что исследуемый потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки. В некоторых примерах реализации уровень экспрессии ΡΌΧ1 определяют способом количественной полимеразой цепной реакции (О-ГСК). Некоторые примеры реализации вышеупомянутого способа включают дополнительно этап определения экспрессии гена НОХА13 и/или гена НОХС6 в популяции клеток до и после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу (§та11 то1еси1е), например ретиноид, такой как ретиноевая кислота. В других потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид, например фактор роста, такой как ΡΟΡ-10 (фактор роста фибробластов 10).

Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу идентификации фактора,

- 3 011953 способного стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-положительных клеток передней кишки. В таких способах реализации ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки и определяют, увеличивается или уменьшается экспрессия маркера в популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии того же маркера в популяции клеток до приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. Увеличение или уменьшение уровня экспрессии маркера указывает на то, что потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки. В некоторых примерах реализации экспрессию маркера определяют способом количественной ПЦР. В некоторых примерах реализации потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу, например ретиноид, такой как ретиноевая кислота. В других потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид, например фактор роста, такой как ЕСЕ-10.

В некоторых областях не существует общепринятого определения термина содержать. В настоящей заявке термин содержать используют в открытом значении, что допускает включение любых дополнительных элементов. С учетом этого, дополнительные примеры реализации настоящего изобретения описаны в приведенных ниже параграфах.

1. Культура клеток, содержащая клетки человека, в которой по меньшей мере 2% указанных клеток человека представляют собой панкреатический и дуоденальный гомеобокссодержащий фактор-1 (ΡΌΧ1)положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.

2. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 10% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.

3. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 10% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.

4. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 25% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.

5. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой присутствуют фидерные клетки человека и по меньшей мере приблизительно 2% клеток человека, не являющихся указанными фидерными клетками человека, представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.

6. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы экспрессируют гомеобокссодержащий ген А13 (НОХА13).

7. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы экспрессируют ген, гомеобокссодержащий ген С6 (НОХС6).

8. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы экспрессируют 8ΘΧ17.

9. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы экспрессируют ΡΌΧ1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из альфа-фетопротеина (ΑΕΡ), 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΕ1 и ΝΕΜ.

10. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанная культура клеток практически свободна от клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток висцеральной энтодермы, клеток париетальной энтодермы и нервных клеток.

11. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10 ΡΩΧ 1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы.

12. Культура клеток согласно параграфу 1, где указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 ΡΩΧ1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы.

13. Культура клеток согласно параграфу 1, где указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 ΡΩΧ1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 4 клетки Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы.

14. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит эмбриональную стволовую клетку.

15. Культура клеток согласно параграфу 14, где указанные эмбриональные стволовые клетки получены из ткани, выбранной из морулы, внутренней массы клеток эмбриона и гонадных валиков эмбриона.

16. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит ретиноид.

17. Культура клеток согласно параграфу 16, в которой ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту (ΚΑ).

18. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит фактор роста фибробластов ЕСЕ-10.

19. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит В27.

20. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит и ΚΑ. и ЕСЕ-10.

- 4 011953

21. Культура клеток согласно параграфу 20, которая дополнительно содержит В27.

22. Популяция клеток, содержащая клетки, где по меньшей мере приблизительно 90% указанных клеток представляют собой ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека, причем указанные ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.

23. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой по меньшей мере приблизительно 95% указанных клеток представляют собой ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки.

24. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой по меньшей мере приблизительно 98% указанных клеток представляют собой ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки.

25. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген ΗΟΧΑ13.

26. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген ΗΟΧ06.

27. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют 8ΟΧ17.

28. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ΡΌΧ1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из ΑΡΡ, 8ΟΧ7, 8ΟΧ1, ΖΚ,Ί И ΝΡΜ.

29. Способ получения клеток Ρ^X1-положительной энтодермы передней трубки, который включает следующие этапы:

получение популяции клеток, содержащей Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы; и добавление к указанной популяции клеток ретиноида в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части указанных ΡΌΧ1-отрицательных клеток энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки являются мультипотентными и способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.

30. Способ согласно параграфу 29, который дополнительно включает этап предоставления времени, достаточного для образования ΡΌΧ-1-положительных клеток энтодермы передней кишки, причем указанное время, достаточное для образования ΡΌΧ-1-положительных клеток энтодермы передней кишки, определяют посредством обнаружения присутствия ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы прямой кишки в указанной популяции клеток.

31. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 2% указанных ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки.

32. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 5% указанных ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки.

33. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 10% указанных ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки.

34. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 25% указанных ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки.

35. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что обнаружение присутствия клеток ΡΌΧ1положительной энтодермы прямой кишки в указанной популяции клеток включает определение экспрессии ΡΌΧ1.

36. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ΡΌΧ1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из альфа-фетопротеина (ΑΡΡ), 8ΟΧ7, 8ΟΧ1, ΖΚ,Ί и ΝΡΜ.

37. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что экспрессию указанного ΡΌΧ1 определяют методом количественной ПЦР.

38. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что экспрессию ΡΌΧ1 определяют иммуноцитохимическим способом.

39. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту.

40. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,01 до 50 мкМ.

41. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,04 до 20 мкМ.

42. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в кон

- 5 011953 центрации приблизительно от 0,1 до 10 мкМ.

43. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно 0,2 до 2,5 мкМ.

44. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,5 до 1,5 мкМ.

45. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации, равной приблизительно 1 мкМ.

46. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют, когда возраст культуры составляет 4 дня.

47. Способ согласно параграфу 29, который дополнительно включает добавление в указанную культуру фактора, выбранного из группы, состоящей из ЕСЕ-10, ЕСЕ-4, активина А, активина В, В27, кондиционированной среды и комбинаций указанных факторов, в количестве, достаточном для того, чтобы увеличить образование ΡΌΧ-1-положительных клеток энтодермы передней кишки.

48. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор выбирают из группы, состоящей из ЕСЕ-10, ЕСЕ-4, активина А и активина В.

49. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 10 до 500 нг/мл.

50. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 20 до 200 нг/мл.

51. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 25 до 75 нг/мл.

52. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации, равной приблизительно 50 нг/мл.

53. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют приблизительно в то же время, что и ретиноид.

54. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой В27.

55. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, ляющем приблизительно от 0,1 до 20% всей среды.

56. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, ляющем приблизительно от 0,2 до 5% всей среды.

57. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, ляющем приблизительно от 0,5 до 2% всей среды.

58. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, ляющем приблизительно 1% всей среды.

59. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют приблизи что что что что

В27

В27 добавляют добавляют добавляют добавляют количестве, количестве, количестве, количестве, составсоставсоставсоставтельно в то же время, что и ретиноид.

60. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой кондиционированную среду.

61. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 10 до 100% всей среды.

62. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 20 до 80% всей среды.

63. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 40 до 60% всей среды.

64. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно 50% всей среды.

65. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют примерно в то же время, что и ретиноид.

66. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду готовят посредством приведения в контакт дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч) со средой для культивирования клеток в течение 24 ч.

67. Способ согласно параграфу 66, отличающийся тем, что указанные ЭКСр в течение приблизительно 5 дней дифференцируются в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из ΚΡΜΙ, дополненной 3% сыворотки, ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А и ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР4.

68. Клетка РОХ1-положительной энтодермы передней кишки, полученная способом согласно параграфу 29.

69. Способ получения популяции клеток, обогащенной РОХ1-положительными клетками энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы:

получение популяции плюрипотентных клеток, в которой по меньшей мере одна клетка из указанной популяции плюрипотентных клеток содержит по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты

- 6 011953 под контролем промотора ΡΌΧ1, причем указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (СЕР) или его биологически активный фрагмент;

дифференцировка указанных плюрипотентных клеток для получения ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки, причем указанные ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки являются мультипотентными и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки; и отделение ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки от ΡΌΧΙ-отрицательных клеток.

70. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что указанная обогащенная популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 95% ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки.

71. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что указанная обогащенная популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 98% ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки.

72. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что этап дифференцировки дополнительно включает добавление к указанным плюрипотентным клеткам по меньшей мере одного фактора роста надсемейства ТСЕр в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку указанных плюрипотентных клеток в ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и добавление к указанным ΡΌΧ1-отрицательным клеткам дефинитивной энтодермы ретиноида в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку указанных ΡΌΧΙ-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки.

73. Способ согласно параграфу 72, отличающийся тем, что указанный ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту.

74. Обогащенная популяция ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки, полученная способом согласно параграфу 69.

75. Способ увеличения экспрессии продукта гена ΡΌΧ1 в §ΟX17-экспрессирующих клетках дефинитивной энтодермы, который включает приведение в контакт указанной клетки дефинитивной энтодермы с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для увеличения экспрессии продукта гена ΡΌΧ1.

76. Способ согласно параграфу 75, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой ретиноид.

77. Способ согласно параграфу 76, отличающийся тем, что указанный фактор дифференцировки представляет собой ретиноевую кислоту.

78. Способ согласно параграфу 75, отличающийся тем, что указанный фактор дифференцировки выбирают из группы, состоящей ЕСЕ-10, ЕСЕ-4, активина А, активина В, В27, кондиционированной среды и комбинации указанных факторов.

79. Способ идентификации фактора дифференцировки, способного стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы:

получение популяции, содержащей Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы;

приведение в контакт указанной популяции, содержащей Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы с потенциальный фактором дифференцировки; и определение того, увеличилась ли экспрессия ΡΌΧ1 в указанной популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии ΡΌΧ1 в указанной популяции клеток до приведения в контакт с таким потенциальным фактором дифференцировки, причем увеличение указанной экспрессии ΡΌΧ1 в указанной популяции клеток указывает на то, что указанный потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1отрицательных клеток в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.

80. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанную экспрессию ΡΌΧ1 определяют способом количественной ПЦР.

81. Способ согласно параграфу 79, который дополнительно включает этап определения экспрессии гена ΗΟΧΑ13 в указанной популяции клеток до и после контакта с указанным потенциальным фактором дифференцировки.

82. Способ согласно параграфу 79, который дополнительно включает этап определения экспрессии гена НОХС6 в указанной популяции клеток до и после контакта с указанным потенциальным фактором дифференцировки.

83. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу.

84. Способ согласно параграфу 83, отличающийся тем, что указанная малая молекула представляет

- 7 011953 собой ретиноид.

85. Способ согласно параграфу 84, отличающийся тем, что указанный ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту.

86. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид.

87. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой фактор роста.

88. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой ЕСЕ-10.

89. Способ идентификации фактора дифференцировки, способного стимулировать дифференцировку ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы:

получение популяции, содержащей ΡΌΧΙ-положительные клетки передней кишки;

приведение в контакт указанной популяции, содержащей ΡΌΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки с потенциальным фактором дифференцировки; и определение того, увеличилась или уменьшилась экспрессия маркера в указанной популяции после контакта с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии того же маркера в указанной популяции до приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, причем увеличение или уменьшение уровня экспрессии указанного маркера в указанной популяции указывает на то, что указанный потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку ΡΌΧΙ-положительных клеток энтодермы передней кишки.

90. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что экспрессию указанного маркера определяют способом количественной ПЦР.

91. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу.

92. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид.

93. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой фактор роста.

94. Вектор, содержащий репортерный ген, который функционально связан с регуляторной областью ΡΌΧ1.

95. Вектор согласно параграфу 94, отличающийся тем, что указанный репортерный ген представляет собой ΕСЕΡ.

96. Клетка, содержащая вектор согласно параграфу 94.

97. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген, функционально связанный с регуляторной областью ΡΌΧ1, встроен в хромосому.

98. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген представляет собой ΕСЕΡ.

99. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген представляет собой ΕСЕΡ.

100. Клетка согласно параграфу 97, которая является плюрипотентной.

101. Клетка согласно параграфу 100, которая представляется собой ЭСКч.

102. Клетка по п.97, которая представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.

103. Клетка по п.97, которая представляет Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки.

104. Кондиционированная среда, приготовленная посредством следующих этапов:

приведение в контакт свежей среды для культивирования клеток с популяцией дифференцированных ЭСКч в течение 24 ч, причем указанные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение 5 дней в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из ΚΡΜΙ, дополненной 3% сыворотки, ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А, и ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР4; и удаление указанной популяции дифференцированных ЭСКч из среды.

105. Кондиционированная среда согласно параграфу 104, в которой свежая среда для культивирования клеток представляет собой ΚΡΜΙ.

106. Кондиционированная среда согласно параграфу 105, в которой ΚΡΜΙ представляет собой ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки.

107. Способ кондиционирования среды, который включает следующие этапы:

приведение в контакт свежей среды для культивирования клеток с популяцией дифференцированных ЭСКч в течение приблизительно 24 ч, причем указанные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение 5 дней в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из ΚΡΜΙ, дополненной 3% сыворотки, ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А и ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР4; и удаление указанной популяции дифференцированных ЭСКч из среды.

108. Способ согласно параграфу 107, в котором свежая среда для культивирования клеток представляет собой ΚΡΜΙ.

109. Способ согласно параграфу 108, в котором ΚΡΜΙ представляет собой ΚΡΜΙΙ с низким содер- 8 011953 жанием выворотки.

Очевидно, что описанные выше способы и композиции относятся к клеткам, культивируемым ίη νίίτο. Однако описанные выше композиции дифференцированных ίη νίίτο клеток можно применять ίη νίνο.

Дополнительные способы реализации настоящего изобретения можно также найти в предварительной заявке на патент США № 60/532004, озаглавленной ΌΕΕΙΝΙΤΙνΕ ΕΝΌΟΌΕΚΜ (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2003 г.; в предварительной заявке на патент США № 60/566293, озаглавленной ΡΌΧ1 ΕΧΡΚΕδδΙΝΟ ΕΝΌΟΌΕΚΜ (ΡΌΧ1-экспрессирующая энтодерма), поданной 27 апреля 2004 г., в предварительной заявке на патент США № 60/586566, озаглавленной ί'ΉΕΜΟΚΙΝΕ СЕБЕ ΞυΡΕΛΕΕ ИБСБЕТОИ РОК. ΤΗΕ ΙδΟΕΑΤΙΟΝ ΟΡ ΌΕΕΙΝΙΤίνΕ ΕΝΌΟΌΕΚΜ (хемокиновый рецептор на поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы), поданной 9 июля 2004 г.; и в предварительной заявке на патент ΠΌΙΑ № 60/587942, озаглавленной СЕБЕ ШКРАСЕ ΡΕίΕΡΤΟΡ ΕΟΚ ΤΗΕ ΙδΟΕΑΤΙΟΝ ΟΕ ΌΕΕΙΝΙΤΙνΕ ΕΝΌΟΌΕΚΜ (поверхностный рецептор клеток в выделении дефинитивной энтодермы), поданной 14 июля 2004 г.; и в предварительной заявке на патент США № 11/021618, озаглавленной ΌΕΕΙΝΙΤΙνΕ ΕΝΌΟΌΕΚΜ (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2004 г.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение предполагаемого пути дифференцировки для получения бета-клеток из ЭСКч. Первый этап этого пути направляет эмбриональную стволовую клетку по линии дифференцировки дефинитивной энтодермы и представляет собой один из наиболее ранних известных этапов дальнейшей дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в энтодерму, из которой развивается поджелудочная железа, эндокринные клетки или островковые/бета-клетки. Второй этап пути демонстрирует превращение δΟX17-положительно/Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы в ΡΌΧΙ-положительную энтодерму передней кишки. Факторы, которые могут опосредовать эти переходы, выделены курсивом. Соответствующие маркеры для определения клеток-мишеней подчеркнуты.

Фиг. 2 - схему расположения консервативных мотивов в кДНК 8ΟΧ17 человека, на которой выделена область, используемая для процедуры иммунизации в компании ΟΕΝΟνΑί (Германия).

Фиг. 3 - древовидную диаграмму отношений, показывающую, что 8ΟΧ17 наиболее близок 8ΟΧ7 и несколько меньше - 8ΟΧ18. Гомологичные белки 8ΟΧ17 у разных видов более близки между собой по сравнению с отношением 8ΟΧ17 к другим членам подсемейства Ε группы 8ΟΧ у одного вида.

Фиг. 4 - изображение результата анализа методом Вестерн-блот с использованием крысиного анти8ΟΧ17 антитела в качестве зонда. Этот результат демонстрирует специфичность данного антигена к белку 8ΟΧ17 человека, уровень экспрессии которого в фибробластах повышен (оссг-схргс55юп) (полоска 1), и отсутствие иммунореактивности с ΕΟΕΡ (зеленый флуоресцирующий белок, полоска 2) и самым близким членом семейства 8ΟΧ, 8ΟΧ7 (полоска 3).

Фиг. 5А-В - микрофотографии, показывающие кластер 8ΟX17-положительных (8ΟΧ17+) клеток, содержащий значительное количество клеток, помеченных одновременно и как ΑΕΡ-положительные (альфа-фетопротеном). Он значительно отличается от других кластеров 8ΟX17-положительных (8ΟΧ17+) клеток (В), в которых наблюдается небольшое количество ΑΕΡ+ клеток, либо они вообще отсутствуют.

Фиг. 6А-С - микрофотографии, показывающие париетальную энтодерму и 8ΟΧ17. На фотографии А показан результат иммуноцитохимического анализа на тромбомодулин (ТМ) человека, который локализован на поверхности клеток париетальной энтодермы, в дифференцированных случайным образом культурах эмбриональных стволовых клеток человека. Фотография В представляет собой поле, идентичное показанному на фотографии А, с двойной меткой на ТМ и 8ΟΧ17. Фотография С представляет собой фазово-контрастное изображение того же поля с ядрами, окрашенными ΌΑΡΙ (4,6-диамидино-20-фенилиндол). Обратите внимание на полую корреляцию окрашенных ядер и метки 8ΟΧ17.

Фиг. 7А-В - гистограммы, демонстрирующие экспрессию гена 8ΟΧ17, определенную по методу количественной ПЦР и количество анти-8ΟX17-положительных клеток, которое определяют при помощи 8ΟX17-специфического антитела. Рисунок А демонстрирует, что активин А повышает экспрессию гена 8ΟΧ17, в то время как ретиноевая кислота резко подавляет экспрессию 8ΟΧ17 по сравнению с недифференцированной контрольной средой (8К20). Рисунок В демонстрирует, что эти изменения имеют идентичный профиль и сходную величину с изменениями числа 8ΟΧ17+ клеток, что указывает на то, что измерение экспрессии гена 8ΟΧ17 методом количественной ПЦР хорошо отражает изменения на уровне отдельной клетки.

Фиг. 8А - гистограмму, которая демонстрирует, что в культуре дифференцирующихся ЭСКч в присутствии активина А сохраняется низкий уровень экспрессии гена ΑΕΡ, в то время как клетки, дифференцирующиеся случайным образом в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, демонстрируют существенную повышающую регуляцию уровня альфа-фетопротеина (ΑΕΡ). Разница в уровнях экспрессии приблизительно семикратная.

Фиг. 8В-С - изображения двух микрофотографий, демонстрирующих, что подавление экспрессии ΑΕΡ активином А имеет место также на уровне одиночной клетки, на что указывает то, что в условиях обработки активином А (внизу) наблюдают очень редкие и меленькие кластеры ΑΕΡ+ клеток по сравне

- 9 011953 нию со случаем, когда в среде содержится только 10% фетальной сыворотки (наверху). Очень редкие и меленькие кластеры АЕР+ клеток по сравнению со случаем, когда в среде содержится только 10% фетальной сыворотки (наверху).

Фиг. 9А-В - рисунки для сравнения, на которых показано определение количества АЕР+ клеток способом поточной цитометрии. Эта фигура демонстрирует, что величина изменения экспрессии гена АЕР (фиг. 8А) в присутствии (справа) и в отсутствие (слева) активина А в точности соответствует числу АЕР + клеток, что является дополнительным подтверждением применимости анализа способом количественной ПЦР для определения изменений, имеющих место на уровне отдельной клетки.

Фиг. 10А-Е - микрофотографии, которые демонстрируют, что воздействие на ЭСКч фактора ио6а1, активина А и активниа В (ЫАА) приводит к существенному увеличению числа 80X17+ клеток в течение 5 дней (А-С). По сравнению относительного количества 80X17+ клеток в общем числе клеток, присутствующих в каждом поле, которое определяли по числу ядер, окрашенных ЭЛР1 (Ό-Е), можно увидеть, что после пятидневной обработки комбинацией ЫАА приблизительно 30-50% всех клеток являются иммунореактивными к 80X17.

Фиг. 11 - гистограмму, которая демонстрирует, что активин А (0, 10, 30 или 100 нг/мл) вызывает зависящее от дозы повышение уровня экспрессии гена 80X17 в дифференцирующихся ЭСКч. Повышенная экспрессия устойчива через 3 дня обработки адгезивных культур, а также держится в течение последующих 1, 3 и 5 дней в суспензионных культурах.

Фиг. 12 А-С - гистограммы, которые демонстрируют влияние активина А на экспрессию МЕКИ (рисунок А), ОАТА4 (рисунок В) и ΗΝΕ36 ( рисунок С). Зависимое от дозы активина А повышение уровней экспрессии наблюдается также для трех других маркеров дефинитивной энтодермы: МЕКЫ, ОАТА4 и ΗΝΕ36. Величина повышения уровня экспрессии в ответ на дозу активина поразительно сходна со значениями, наблюдаемыми для 80X17, что является решительным указанием на то, что активин А определяет популяцию клеток, которая экспрессирует одновременно все четыре гена (80X17+, МАБН. ОАТА4+ и ΗΝΕ3Ε+).

Фиг. 13А-С - гистограммы, которые демонстрируют влияние активина А на экспрессию АЕР (рисунок А), 80X7 (рисунок В) и 8РАКС (панель С). Имеет место зависимое от дозы активина А снижение уровня экспрессии маркера висцеральной энтодермы АЕР. Уровень маркеров недифференцированной энтодермы (80X7) и париетальной энтодермы (8РАКС) либо остается неизменным, либо демонстрирует снижение в определенные моменты времени, что указывает на то, что действие активина А не способствует выделению этих типов клеток внезародышевой энтодермы. Это также подтверждает тот факт, что повышенная экспрессия 80X17, МЕКЛ, ОАТА4 и ΗΝΡ3Ε является следствием увеличения числа клеток дефинитивной энтодермы в ответ на воздействие активина А.

Фиг. 14А-В - гистограммы, демонстрирующие влияние активина А на экспрессию генов ΖΙί'1 (рисунок А) и Вгасйушу (рисунок В). Устойчивая экспрессия маркера нейронов ΖΙί,Ί показывает, что активин А не оказывает дозозависимого влияния на дифференцировку нейронов. Имеет место заметное подавление дифференцировки мезодермы, вызываемое обработкой 100 нг/мл активина А, на что указывает снижение уровня экспрессии гена Ьгасйушу. Это, очевидно, является результатом усиленного образования дефинитивной энтодермы из предшественников мезодермы. При более низких уровнях активина А (10 и 30 нг/мл) экспрессия гена Ьгасйушу сохраняется в более поздние моменты времени дифференцировки по сравнению с контрольными культурами, не обработанными активином А.

Фиг. 15А-В - микрофотографии, показывающие снижение дифференцировки париетальной энтодермы в ответ на обработку активинами. В культуре (А), дифференцирующейся в среде, содержащей только сыворотку, найдены области париетальной энтодермы ТМ¹¹ (высокий уровень экспрессии гена тромбомодулина), в то время как дифференцировка в ТМ+ клетки при введении в среду активинов (В) встречается редко, а общая интенсивность иммунореактивности - ниже.

Фиг. 16А-Э - микрофотографии, показывающие экспрессию маркеров в ответ на обработку активином А и активином В. ЭСКч в течение четырех последовательных дней обрабатывали активином А и активином В и метили антителами к 80X17, АЕР и ТМ. Рисунок А - 80X17; рисунок В - АЕР; рисунок С ТМ и рисунок Ό - фазовый контраст/ОАРЕ Обратите внимание на многочисленность 80X17положительных клеток (А), связанную с полным отсутствием иммунореактивности АЕР (В) и ТМ (С).

Фиг. 17 - микрофотографию, показывающую возникновение дефинитивной энтодермы и висцеральной энтодермы ίη νίΐτο из ЭСКч. Области висцеральной энтодермы определяют по АЕР^ь78ΟX^1ο/-, а области дефинитивной энтодермы демонстрируют полностью противоположный профиль: 8ΟX17/ЛЕР^1ο/-. Данное поле было выбрано из-за близости этих двух областей друг к другу. Однако часто области 8ΟX17^ь7АЕР^1ο/- наблюдаются в абсолютной изоляции от любых областей, содержащих клетки АЕР¹¹, что позволяет сделать предположение о раздельном происхождении клеток дефинитивной энтодермы и клеток висцеральной энтодермы.

Фиг. 18 - схему, изображающую семейство ТОЕЗ лигандов и рецепторов. Факторы, активирующие белки АК 8та6§ и ВК 8та6§ полезны в получении дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток человека. (См. У. Се11рЬу8ю1. 187: 265-76).

Фиг. 19 - гистограмму, показывающую индукцию экспрессии 80X17 в динамике по времени как

- 10 011953 результат обработки отдельными факторами ΤΟΡβ или их комбинациями.

Фиг. 20 - гистограмму, показывающую увеличение числа 80X17+ клеток со временем в результате обработки комбинациями факторов ΤΟΡβ.

Фиг. 21 - гистограмму, показывающую индукцию экспрессии 80X17 в динамике по времени как результат обработки комбинациями факторами ΤΟΡβ.

Фиг. 22 - гистограмму, которая показывает, как активин А индуцирует дозозависимое увеличение числа 80X17+ клеток.

Фиг. 23 - гистограмму, которая показывает, что добавлениеАп13а к обработанным активином А и активином В культурам повышает уровень экспрессии 80X17 по сравнению с уровнями, индуцированными только активином А и активином В.

Фиг. 24А-С - гистограммы, показывающие, что дифференцировка в дефинитивную энтодерму усиливается в условиях с пониженным содержанием фетальной сыворотки. Обработка ЭСКч активинами А и В в среде, содержащей 2% фетальной сыворотки (2АА), дает уровень экспрессии 80X17, в 2-3 раза превышающий уровень, получаемый при такой же обработке в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки (10АА) (рисунок А). Содержание фетальной сыворотки такое же влияние оказывает и на маркер дефинитивной энтодермы МЕКИ (рисунок В), а подавление ΑΡΡ (висцеральная энтодерма) (рисунок С) больше в среде с 2% фетальной сыворотки, чем в среде с 10% фетальной сыворотки.

Фиг. 25Α-Ό - микрофотографии, которые показывают деление клеток 80X17+ в культуре. 80X17иммунореактивные клетки присутствуют на дифференцирующейся границе колонии ЭСКч (С, Ό), они помечены ядерным антигеном пролиферирующих клеток (Ρ0ΝΑ) (рисунок В), но не помечены одновременно ОСТ4 (рисунок 1С). Кроме того, ΌΑΡΙ-мечение ядер клеток 80X17+(стрелки) и клеток ОСТ4+, недифференцированных ЭСКч (стрелки-указатели) (Ό), позволяет увидеть отчетливые картины митоза.

Фиг. 26 - гистограмму, показывающую относительный уровень экспрессии 0X0^4 в дифференцирующихся клетках ЭСКч в различных условиях среды.

Фиг. 27Α-Ό - гистограммы, демонстрирующие, что маркеры из панели маркеров дефинитивной энтодермы имеют сходный профиль экспрессии с 0X0^4 в тех же условиях дифференцировки, что описаны для фиг. 26.

Фиг. 28А-Е - гистограммы, показывающие, что экспрессия маркеров энтодермы (ΒΚΑΟΗΥυΚΎ, М0X1), эктодермы (80X1, ΖΙ01) и висцеральной энтодермы (80X7) демонстрирует обратное отношение к экспрессии 0X0^4 в условиях обработки, показанных на фиг. 26.

Фиг. 29Α-Ρ - микрофотографии, которые показывают относительные различия в 80X17 иммунореактивных клетках в условиях среды, описанных на фиг. 26-28.

Фиг. 30А-С - диаграммы рассеяния поточной цитометрии, которые демонстрируют увеличение числа 0X0^4+ клеток при увеличении концентрации активина А, добавляемого в среду для дифференцировки.

Фиг. 31Α-Ό - гистограммы, которые показывают, что 0X0^4+ клетки, выделенные из культуры, обработанной высокими дозами активина А (А100-СХ+), оказываются даже более обогащенными маркерами дефинитивной энтодермы, чем родительская популяция.

Фиг. 32 - гистограмму, показывающую экспрессию генов в 0X0^4+ и 0X0^4-клетках, разделенных способом проточной сортировки клеток (ΡΑ08), а также экспрессию генов в родительской популяции. Эта гистограмма демонстрирует, что практически всю экспрессию гена 0X0^4. присущую каждой родительской популяции, осуществляют клетки 0X0^4+, а СXСΚ.4-популяции осуществляют очень незначительную часть экспрессии гена 0X0^4, либо вообще не экспрессируют этот ген.

Фиг. 33Α-Ό - гистограммы, которые демонстрируют падение экспрессии генов мезодермы (ΒΚΑΟΗΥυΚΥ, М0X1) эктодермы (ΖΙ01) и висцеральной энтодермы (80X7) в 0X0^4+ клетках, выделенных из популяции, обработанной высокой дозой активина А, в которой экспрессия этих маркеров недефинитивной энтодермы уже подавлена.

Фиг. 34А-М - гистограммы, показывающие профиль экспрессии генов - маркеров, которые можно использовать для идентификации клеток дефинитивной энтодермы. Анализ экспрессии маркеров дефинитивной энтодермы, ΡΟΡ17, ΥΑΡ, 0ΑΕ0Κ, Ρ0X^1, 0МК0Р1 и 0ШР1, показан на рисунках Ο-Ь соответственно. Анализ экспрессии генов-маркеров линий дифференцировки, описанных ниже, 80X17, 80X7, 80X17/80X7, ТМ, ΖΙ01 и М0X1, показан на рисунках Α-Ρ соответственно. На рисунке М показан анализ экспрессии 0X0^4. На рисунках А-М столбец, обозначенный ЭСКч (ΗΕ80), показывает экспрессию генов очищенными эмбриональными стволовыми клетками человека, 2ΝΡ обозначает клетки, обработанные 2% фетальной сыворотки без добавления активина, 0,1А100 обозначает клетки, обработанные 0,1% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А, 1А100 обозначает клетки, обработанные 1% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А; а 2А100 обозначает клетки, обработанные 2% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А.

Фиг. 35 - гистограмму, показывающую относительную экспрессию гена Ρ^X1 в культуре ЭСКч после 4 и 6 дней с активином и без него в присутствии ретиноевой кислоты (ΚΑ) и фактора роста фибробластов (ΡΟΡ-10), добавленных в день 4.

- 11 011953

Фиг. 36А-Р - гистограммы, демонстрирующие относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 и 6 дней с активином и без него в присутствии ретиноевой кислоты (КА) и фактора роста фибробластов (РСР-10), добавленных в день 4. На рисунках показаны относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) 8ΘΧ17, (В) 8ΘΧ7, (С) АРΡ, (Ό) 8ΘΧ1, (Е) ΖΙΟ и (Р) ΝΕΜ.

Фиг. 37А-С - гистограммы, демонстрирующие относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 и 8 дней с активином и без него в присутствии или в отсутствие комбинаций ретиноевой кислоты (КА), фактора роста фибробластов (РСР-10) и фактора роста фибробластов (РСР-4), которые добавляли в день 4. На рисунках показаны относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1, (В) 8ΘΧ7 и (С) ММ.

Фиг. 38А-С - гистограммы, демонстрирующие экспрессию маркерных генов в культуре клеток дефинитивной энтодермы, приведенных в контакт с 50 нг/мл РСР-10 в комбинации с 1 мкМ, 0,2 мкМ или 0,04 мкМ ретиноевой кислоты (КА), которые добавляли в день 4. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1, (В) НОХА3, (С) НОХС6, (Ό) ΗΟXА13, (Е) ΟΌΧ1, (Р) 8ΘΧ1 и (С) ММ.

Фиг. 39А-Е - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 дней и 8 дней с активином и без него в присутствии комбинаций ретиноевой кислоты (КА), фактора роста фибробластов (РСР-10) и одного из следующих компонентов: заменителя сыворотки (8К), фетальной сыворотки крупного рогатого скота (РВ8) или В27. Рисунки показывают относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1, (В) 8ΘΧ7, (С) АРК, (Ό) ΖΙΟ и (Е) ММ.

Фиг. 40А-В - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов поджелудочной железы (ΡΌΧ1, НПР6) и печени (НПР6) в культуре ЭСКч после 6 дней (непосредственно перед добавлением ретиноевой кислоты) и на 9 день (через 3 дня после воздействия ретиноевой кислоты). В эксперимент были включены разнообразные условия для сравнения добавления активина В в дозах 10 нг/мл (а10), 25 нг/мл (а25) или 50 нг/мл (а50) в присутствии либо 25 нг/мл (А25), либо 50 нг/мл (А50) активина А. Условия отсутствия активина А и активина В (ΝΕ) служат в качестве отрицательного контроля образования дефинитивной энтодермы и ΡΌΧ1-положительной энтодермы. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1 и (В) НШ>.

Фиг. 41А-С - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч с нг/мл (А100), 50 нг/мл (А50) или без (ΝΈ) активина А на 5 день (непосредственно перед добавлением ретиноевой кислоты) и на 2, 4 и 6 дни после воздействия ретиноевой кислоты (дни 7, 9 и 11 соответственно). Процентная доля, указанная под каждым столбиком, обозначает дозу фетальной сыворотки в 3-5 дни дифференцировки. Начиная с дня 7, клетки, обработанные ретиноевой кислотой (К), выращивали в среде КГМ1, содержащей 0,5% фетальной сыворотки. Концентрация ретиноевой кислоты составляла 2 мкМ в день 7, 1 мкМ в день 9 и 0,2 мкМ в день 11. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1, (В) ΖΙΟ. (С) 8ΘΧ7.

Фиг. 42А-В - диаграммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч, обработанных активином А при низкой концентрации фетальной сыворотки с целью стимулировать дефинитивную энтодерму (день 5) и затем свежей (А25К) средой, содержащей 25 нг/мл активина А и ретиноевой кислотой, либо различными кондиционированными средами (МЕРСМ, СМ#2, СМ#3 и СМ#4) и ретиноевой кислотой с целью стимулировать Ρ^X1-экспрессирующую энтодерму. Экспрессию маркеров определяли в дни 5, 6, 7, 8 и 9. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) ΡΌΧ1; (В) ΟΟΧ1.

Фиг. 43 - гистограмму, которая демонстрирует относительную экспрессию ΡΌΧ1 в культуре ЭСКч, обработанной активином А при низкой концентрации фетальной сыворотки с целью стимулировать дефинитивную энтодерму, и затем свежей средой, содержащей активин А или ретиноевую кислоту (А25К), либо различными количествами ретиноевой кислоты в кондиционированной среде, разведенной в свежей среде. Во всех случаях общий объем сыворотки составлял 5 мл.

Фиг. 44 - результат анализа способом Вестерн-блот, демонстрирующий ΡΌΧ1, полученный посредством иммунопреципитации из обработанных ретиноевой кислотой клеток дефинитивной энтодермы на 3 (68) и 4 (69) дни после добавления ретиноевой кислоты и 50 нг/мл активина А.

Фиг. 45 - сводную гистограмму, отражающую результаты активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (РАС8) ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки, генетически меченых репортерным геном ЕСРΡ под контролем промотора ΡΌΧ1.

Фиг. 46 - гистограмму, демонстрирующую относительные уровни экспрессии ΡΌΧ1, нормированные по генам «домашнего хозяйства» (коикекеершд депек), для отсортированных популяций живых клеток (Ь1уе), ЕСРΡ-отрицательных клеток (№д) и ЕСРΡ-положительных клеток (СРΡ+).

Фиг. 47 - гистограмму, демонстрирующую относительные уровни экспрессии ΡΌΧ1, нормированные по генам «домашнего хозяйства» (коикекеершд), для отсортированных популяций живых клеток, (Еще), ЕСРΡ-отрицательных клеток (№д), половину популяции ЕСРΡ-положительных клеток с самой низкой интенсивностью сигнала ЕСРΡ (Ьо) и половины популяции ЕСРΡ-положительных клеток с самой высокой интенсивностью сигнала ЕСРΡ (Н1).

- 12 011953

Фиг. 48А-Е - гистограммы, демонстрирующие относительные уровни экспрессии, нормированные по генам «домашнего хозяйства» (йошекеертд), пяти маркеров панкреатической энтодермы в отсортированных популяциях живых клеток (Ь1уе), ЕСЕР-отрицательных клеток (Мед) и ЕСЕР-положительных клеток (СЕР+). Рисунки: А - ΝΚΧ2.2, В - 6ЬиТ2, С - ΗΝΕ3β, Ό - КК.Т19 И Е - ΗΝΕ4α.

Фиг. 49 - гистограммы, демонстрирующие относительные уровни экспрессии, нормированные по генам «домашнего хозяйства» (йошекеершд), двух маркеров непанкреатической энтодермы (Мед) и ЕСЕР-положительных клеток (СЕР+). Рисунки: А - ΖΙΕ1 и В - СЕАР.

Подробное описание изобретения

Критический этап раннего развития человеческого организма, называемый гаструляцией, начинается через 2-3 недели после оплодотворения. Гаструляция исключительно важна, поскольку именно в это время выделяются и организуются три первичных зародышевых листка (Ьи е! а1., 2001; 5>с1юеп\со1Г. διηίΐΐι. 2000). Из эктодермы впоследствии образуются наружные покровы тела и вся нервная система, в то время как сердце, кровь, скелетные мышцы и другие соединительные ткани являются производными мезодермы. Дефинитивной энтодермой называют зародышевый листок, ответственный за образование всей кишечной трубки, которая включает пищевод, желудок, толстый и тонкий кишечник, а также органы, которые являются производными кишечной трубки, такие как легкие, печень, тимус, паращитовидные железы, щитовидная железа, желчный пузырь и поджелудочная железа (Сгарт-Войоп, Ме1!оп, 2000; К1те1шап, СпГГш, 2000; ТгетЫау е! а1., 2000; Ае1к, МеИоп, 1999; Ае1к, МеЙоп, 2000). Необходимо различать дефинитивную энтодерму и совершенно отдельную линию дифференцировки клеток, называемой первичной энтодермой. Первичная энтодерма в первую очередь отвечает за образование внезародышевых тканей, главным образом - париетальной и висцеральной частей энтодермы желточного мешка плаценты и материала внеклеточного матрикса оболочки Райхерта.

Образование дефинитивной энтодермы в ходе процесса гаструляции начинается с миграции клеток, при которой клетки мезэнтодермы (клетки, из которых может образоваться мезодерма или энтодерма) мигрируют через структуру, называемую первичной полоской. Дефинитивная энтодерма образуется из клеток, которые мигрируют через переднюю часть полоски и через узелок (специализированная структура в передней области полоски). После миграции дефинитивная энтодерма в первую очередь заполняет переднюю часть кишечной трубки, а в последнюю очередь образует задний конец кишечной трубки.

Экспрессия гена ΡϋΧ1 в процессе развития

РЭХ1 (называемый также 8ТЕ-1, ΙΌΧ-1 и 1РЕ-1) представляет собой фактор транскрипции, необходимый для развития поджелудочной железы и ростральной двенадцатиперстной кишки. РЭХ1 начинает экспрессироваться в панкреатической энтодерме, которая образуется из энтодермы задней части передней (головной) кишки и из которой образуются как экзокринные, так и эндокринные клетки, начиная с Е8.5 (у мышей). Позднее, экспрессия РЭХ1 ограничена бета-клетками и частью дельта-клеток. Этот профиль экспрессии сохраняется во взрослом организме. РЭХ1 также экспрессируется в дуоденальной энтодерме в процессе раннего развития, приблизительно во время образования поджелудочной железы, затем в дуоденальных энтероцитах и в энтероэндокринных клетках, в антральном отделе желудка, а также в общем желчном, пузырном и желчных протоках. При ограничении экспрессии поджелудочной железой эта область экспрессии также ограничивается, главным образом, ростральной двенадцатиперстной кишкой.

ΡϋΧΙ-Положительные клетки и связанные с ними способы

Примеры реализации настоящего изобретения относятся к определенным новым способам получения РЭХ1 -положительных клеток энтодермы, в которых РЭХ1 -положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней/средней частей кишечной трубки (РЭХ1 -положительная энтодерма передней кишки/средней кишки). В настоящей заявке термин мультипотентная или мультипотентная клетка относится к типу клеток, которые могут дать начало ограниченному числу других отдельных типов клеток. В настоящей заявке термин передняя кишка/средняя кишка относится к клеткам передней части кишечной трубки, а также к клеткам средней части кишечной трубки, включая клетки в области границы передняя кишка/средняя кишка.

Некоторые предпочтительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к способам получения РЭХ1 -положительных клеток энтодермы прямой кишки. В некоторых примерах реализации эти РЭХ1 -положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки (РЭХ1-положительной энтодермы передней кишки).

Дополнительные предпочтительные способы реализации относятся к получению РЭХ1положительных клеток энтодермы задней части передней кишки. В некоторых примерах реализации эти РЭХ1-положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из задней части области передней кишки кишечной трубки.

РЭХ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, такие как те, которые получают описанными здесь способами, можно применять для получения полностью дифференцированных инсулин

- 13 011953 продуцирующих бета-клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки получают посредством дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, которые практически не экспрессируют ΡΌΧ1 (ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, также называемой здесь дефинитивной энтодермой) с образованием ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки. Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы можно получить посредством дифференцировки плюрипотентных клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, проводимой, как описано в настоящей заявке или любыми другими известными способами. Удобный и высокоэффективный способ получения Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы из плюрипотентных клеток описан в патенте США № 11/021618, озаглавленном ЭЕЕЮТТШЕ ΕΝΏΟΌΕΚΜ (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2004 г.

Способы получения Ρ^X1-положительных клеток обеспечивают основу для эффективного получения ацинусных клеток, клеток протоков и островковых клеток из плюрипотентных клеток. В определенных предпочтительных способах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека получают из Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы человека, которые, в свою очередь, получают из ЭСКч. Эти ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека можно затем применять для получения функциональных инсулинпродуцирующих бета-клеток. Для получения инсулинпродуцирующих β-клеток, в количествах, которые могут быть полезны, желательно обеспечить высокую эффективность дифференцировки на каждом этапе дифференцировки, предшествующем образованию клеток поджелудочной железы. Поскольку дифференцировка ΡΌΧ1отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляет собой ранний этап пути получения функциональных островковых/бета-клеток (как показано на фиг. 1), высокая эффективность этого этапа является особенно желательной.

Поскольку желательно, чтобы дифференцировка Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки была эффективной, некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к ίη νίΐΓΟ методике, результатом которой является превращение приблизительно 2-25% ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Обычно такие способы включают применение определенных условий культивирования и факторов роста в установленной временной последовательности. Дальнейшего обогащения популяции клеток Ρ^X1-положительными клетками энтодермы передней кишки можно достичь путем выделения и/или очистки Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки от(из) других клеток популяции посредством использования реагента, который специфически связывает ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки. В качестве альтернативы ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки можно пометить репортерным геном, таким как ген флуоресцирующего зеленого белка (СΕΡ), что позволяет определять экспрессию ΡΌΧ1. Такие клетки с флуоресцентной меткой можно затем очищать способом активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (ЕАС8). Другие аспекты настоящего изобретения относятся к культурам клеток и обогащенным популяциям клеток, содержащим Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки, а также к способам идентификации факторов, полезных в дифференцировке и в образовании ΡΌΧ1-положительной энтодермы передней кишки.

Чтобы определить количество ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы в культуре клеток или популяции клеток, желательно иметь способ отличать их от других клеток в культуре или популяции. Соответственно, определенные примеры реализации настоящего изобретения относятся к маркерам клеток, присутствие, отсутствие и/или относительные уровни экспрессии которых указывают на ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки, а к также способам обнаружения и определения экспрессии таких маркеров. В настоящей заявке экспрессия обозначает продуцирование продукта или вещества, а также уровень или количество продуцирования продукта или вещества. Таким образом, определение экспрессии конкретных маркеров обозначает определение относительного или абсолютного количества экспрессируемого маркера или определение присутствия или отсутствия маркера. В настоящей заявке термин маркер обозначает любую молекулу, которую можно наблюдать или обнаруживать. Например, маркер может включать, без ограничения, нуклеиновую кислоту, такую как транскрипт конкретного гена, полипептид, являющийся продуктом гена, полипептид, не являющийся продуктом гена, гликопротеин, углевод, гликолипид, липид, липопротеин или молекулу малого размера (например, молекулы с молекулярной массой менее 10,000 а.е.м.).

В некоторых способах реализации настоящего изобретения присутствие, отсутствие и/или уровень экспрессии маркера определяют способом количественной ПЦР. Например, количество транскрипта, образуемого определенными генетическими макрерами, такими как ΡΌΧ1, 8ΟΧ17, 8ΟΧ7, 8ΟΧ1, ΖΙΠ1, №Μ, альфа-фетопротеин (ΑΕΡ), гомеобокс А13 (НОХА13), гомеобокс С6 (НОХС6), и/или другими маркерами, описанными в настоящей заявке, определяют способом количественной ПЦР. В других примерах реализации для определения белков, экспрессируемых вышеупомянутыми генами, применяют иммуноцитохимический подход. В других способах реализации для определения количества или относительных долей таких маркеров используют и способы иммуногистохимии и способ количественной ПЦР.

Применение описанных в настоящей заявке способов дифференцировки и обнаружения позволяет

- 14 011953 идентифицировать ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, а также определять долю Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток. Например, в некоторых способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии гена ΡΌΧ1 получаемыми ΡΌΧ1-положительными клетками энтодермы передней кишки или популяциями ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере на 2 порядка величины выше, чем у Ρ^X1-отрицательных клеток или популяций клеток. В других способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии гена ΡΌΧ1 получаемыми Ρ^X1-положительными клетками энтодермы передней кишки или популяциями Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере на 2 порядка величины выше, чем у Ρ^X1-отрицательных клеток или популяций клеток. В дальнейших способах реализации получаемые Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки или популяции Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки экспрессируют один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из ΡΌΧ1, 8ΟΧ17, НОХА13 и НОХС6 на уровне, который на 2 или более чем на 2 порядка величины выше, чем у Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы или популяций клеток.

Композиции и способы, описанные в настоящей заявке, имеют несколько полезных свойств. Например, культуры клеток и популяции клеток, содержащие Ρ^X1-положительную энтодерму, а также способы получения таких культур клеток и популяций клеток, можно применять для моделирования ранних стадий развития человека. Кроме того, описанные в настоящей заявке композиции и способы также служат для терапевтического вмешательства при таких болезненных состояниях, как сахарный диабет. Например, поскольку Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки служат источником лишь ограниченного числа тканей, их можно использовать для образования чистых типов тканей или клеток.

Получение ΡϋΧΙ-отрицательной дефинитивной энтодермы (дефинитивной энтодермы) из плюрипотентных клеток

Культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки, получают из плюрипотентных клеток посредством предварительного получения ΡΌΧ1отрицательной дефинитивной энтодермы (называемой также дефинитивной энтодермой). Способы дифференцировки плюрипотентных клеток с целью получения культур клеток и обогащенных популяций клеток, содержащих дефинитивную энтодерму, кратко описаны ниже, а подробно - в патенте США № 11/021618, озаглавленном ΌΕΕΓΝΓΠνΕ ΕΝΏΟΌΕΒΜ (дефинитивная энтодерма), поданном 23 декабря 2004 г. В некоторых из этих способов плюрипотентные клетки, которые используют в качестве исходного материала, представляют собой стволовые клетки. В определенных способах культуры клеток дефинитивной энтодермы и обогащенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы, получают из эмбриональных стволовых клеток. «Эмбриональными» называется здесь ряд стадий развития организма, начиная с единственной клетки зиготы и заканчивая многоклеточной структурой, которая уже не содержит других плюрипотентных или тотипотентных клеток, кроме развитых гамет. Кроме эмбрионов, образовавшихся в результате слияния гамет, термин «эмбриональный» относится к эмбрионам, возникшим в результате переноса ядер соматических клеток. В предпочтительном способе получения клеток дефинитивной энтодермы в качестве исходного материала для клеток дефинитивной энтодермы применяют эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСКч). Такие плюрипотентные клетки могут представлять собой клетки, взятые из морулы, внутренней клеточной массы эмбриона, или клетки, полученные из гонадных валиков эмбриона. Эмбриональные стволовые клетки человека можно поддерживать в культуре в плюрипотентном состоянии без существенной дифференцировки при помощи хорошо известных в данной области способов. Такие способы описаны, например, в патентах США №№ 5453357, 5670372,5690926, 5843780, 6200806 и 6251671.

В некоторых способах получения клеток дефинитивной энтодермы ЭСКч поддерживают на слое фидерных клеток. В таких способах можно использовать любой фидерный слой, позволяющий поддерживать ЭСКч в плюрипотентном состоянии. Примером обычно используемых для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека фидерных слоев является слой фибробластов мыши. Позднее был разработан слой фидерных фибробластов человека для культивирования ЭСКч (см. заявку на патент США № 2002/0072117). Альтернативные способы получения дефинитивной энтодермы позволяют поддерживать плюрипотентные ЭСКч без фидерного слоя. Способы поддержания ЭСКч без фидерного слоя описаны в заявке на патент США № 2003/0175956.

Используемые в настоящем изобретении эмбриональные стволовые клетки человека можно поддерживать в культуре с добавлением сыворотки либо без нее. В некоторых процедурах поддержания эмбриональных стволовых клеток применяют заменители сыворотки. В других применяют методики культивирования без сыворотки, например, описанные в заявке на патент США № 2003/0190748.

Стволовые клетки поддерживают в культуре в плюрипотентном состоянии путем повторяющегося пересева до тех пор, пока не станет желательной их дифференцировка в дефинитивную энтодерму. В некоторых способах дифференцировки в клетки дефинитивной энтодермы достигают, добавляя в культуру стволовых клеток факторы роста надсемейства трансформирующих факторов роста бета (ТСЕΡ) в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку в дефинитивную энтодерму.

- 15 011953

Факторы роста, которые можно применять для получения дефинитивной энтодермы, выбирают из подгрупп №6а1/активин или белка морфогенеза костей (ΒΜΡ). В некоторых предпочтительных способах дифференцировки фактор роста выбирают из группы, состоящей из белка Νοάαΐ. активина А, активина В и ВМР4. Кроме того, для получения клеток дефинитивной энтодермы можно применять фактор роста \Уп13а и другие члены семейства \Уп1. В определенных способах дифференцировки можно применять комбинации описанных выше факторов роста.

В некоторых воплощениях описанных здесь способов дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы к клеткам добавляют упомянутые выше факторы таким образом, чтобы факторы роста присутствовали в культуре в концентрациях, достаточных для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части стволовых клеток в дефинитивную энтодерму. В некоторых способах упомянутые выше факторы роста присутствуют в культуре в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 5 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 2000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 3000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 4000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 5000 нг/мл или больше чем приблизительно 5000 нг/мл.

В определенных способах упомянутые выше факторы роста после добавления в культуру клеток удаляют. Например, можно удалять факторы не позднее приблизительно одного дня, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней, приблизительно шести дней, приблизительно семи дней, приблизительно восьми дней, приблизительно девяти дней или приблизительно десяти дней после добавления. В предпочтительных способах реализации изобретения факторы роста удаляют через приблизительно четыре дня после добавления.

Культуры клеток дефинитивной энтодермы можно выращивать в среде с пониженным содержанием сыворотки или без сыворотки. В определенных условиях культивирования концентрация сыворотки может оставлять приблизительно от 0,05до 20% об./об. Например, в определенных способах дифференцировки концентрация сыворотки в среде может быть меньше приблизительно 0,05% (об./об.), меньше приблизительно 0,1% (об./об.), меньше приблизительно 0,2% (об./об.), меньше приблизительно 0,3% (об./об.), меньше приблизительно 0,4% (об./об.), меньше приблизительно 0,5% (об./об.), меньше приблизительно 0,6% (об./об.), меньше приблизительно 0,7% (об./об.), меньше приблизительно 0,8% (об./об.), меньше приблизительно 0,9% (об./об.), меньше приблизительно 1% (об./об.), меньше приблизительно 2% (об./об.), меньше приблизительно 3% (об./об.), меньше приблизительно 4% (об./об.), меньше приблизительно 5% (об./об.), меньше приблизительно 6% (об./об.), меньше приблизительно 7% (об./об.), меньше приблизительно 8% (об./об.), меньше приблизительно 9% (об./об.), меньше приблизительно 10% (об./об.), меньше приблизительно 15% (об./об.) или меньше приблизительно 20% (об./об.). В некоторых способах клетки дефинитивной энтодермы выращивают без сыворотки или с заменителем сыворотки. В других способах клетки дефинитивной энтодермы выращивают в присутствии В27. В таких способах реализации концентрация добавки может составлять приблизительно от 0,2 до 20% об./об.

Мониторинг дифференцировки плюрипотентных клеток в ΡϋΧΙ-отрицательную дефинитивную энтодерму (дефинитивную энтодерму)

За развитием культуры ЭСКч в дефинитивную энтодерму можно следить, определяя экспрессию маркеров, характерных для дефинитивной энтодермы. В некоторых способах экспрессию конкретных маркеров определяют, устанавливая присутствие или отсутствие этого маркера. В качестве альтернативы, экспрессию конкретных маркеров можно определять путем измерения уровня этого маркера в культуре клеток или популяции клеток. В таких способах измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Один из способов количественной оценки экспрессии маркера с генов этого маркера осуществляют посредством применения количественной ПЦР. Способы выполнения количественной ПЦР хорошо известны в данной области. Для количественной оценки экспрессии гена маркера можно также применять другие способы, известные в данной области. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно регистрировать при помощи антител, специфических к продуктам гена интересующего исследователя маркера. В некоторых способах определяют как экспрессию маркерных генов, характерных для дефинитивной энтодермы, так и отсутствие значительной экспрессии генов маркеров, характерных для ЭСКч и других типов клеток.

Как описано в приведенных ниже примерах, надежным маркером дефинитивной энтодермы является ген 8ΟΧ17. Поэтому клетки дефинитивной энтодермы, полученные описанными здесь способами, экспрессируют маркерный ген 8ΟΧ17, продуцируя продукт гена 8ΟΧ17. Другие маркеры дефинитивной энтодермы: ΜΙΧΜ, ΟΑΤΑ4, ΗΝΡ3ΐ>, О8С, ЕОЕ17, \Λ\Έ САЬСВ, ΟΜΚΟΒ1 и ΟΚ1Ρ1. Поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген 8ΟΧ17 на более высоком уровне, чем маркерный ген 8ΟΧ7, который характерен для примитивной и висцеральной энтодермы (см. табл. 1), в некоторых способах отслеживают экспрессию обоих маркеров: 8ΟΧ17 и 8ΟΧ7. В других способах отслежива

- 16 011953 ют экспрессию маркерного гена 8ΘΧ17 и маркерного гена ОСТ4, который является характеристикой ЭСКч. Кроме того, поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген 8ΘΧ17 на более высоком уровне, чем маркерные гены ΑΕΡ, δΡΆΚΟ и ген тромбомодулина (ТМ), можно также отслеживать экспрессию этих генов.

Ген 0Χ0Κ4 кодирует поверхностный рецептор хемокинов, лигандом которого является хемоаттрактант 8ИЕ-1. Считают, что несущие рецептор 0Χ0Κ4 клетки во взрослом организме играют решающую роль в миграции гематопоэтических клеток в костный мозг, в направленной миграции лимфоцитов и в дифференцировке различных линий В-клеток и макрофагов крови [К1т., С, Вгохтеуег, Η. 1. Ьеикосу1е Вю1. 65,6-15 (1999)]. Рецептор 0Χ0Κ4 также функционирует как корецептор для проникновения ВИЧ-1 в Т-лимфоциты [Еепд, Υ., е! а1. 8с1епсе, 272, 872-877 (1996)]. В результате обширной серии исследований, проведенной [ΜΥΐΉίΗ, К.Е. е! а1. Иеу. Вю1оду 213, 442-456 (1999)], проследили экспрессию рецептора хемокинов - ί’Χί’Ε4 и его единственного лиганда 8ИЕ-1 [К1т, С., Вгохтуег, Н., 1. Ьеикосу1е Вю1. 65,6-15 (1999)], на протяжении раннего развития и взрослой жизни мыши. Взаимодействие ΟΧΚ4/8ΌΕ1 в процессе развития стало очевидным после того, как продемонстрировали, что разрушение любого из соответствующих этим белкам генов у трансгенных мышей [Иадакага е! а1. ИаШге, 382, 35-638 (1996)], Μа, О.. е! а1. ΙιηιηιιπίΚ. 10, 463-471 (1999)] приводило к смерти эмбрионов на поздних стадиях развития. Μ^ιΟΕ е! а1. с использованием защиты от рибонуклеаз и методик гибридизации ίη δίΐιι продемонстрировали, что ΟΧΟΚ4 представляет собой наиболее распространенную мРНК рецепторов хемокинов, обнаруживаемую на ранних стадиях гаструляции зародыша (Е7.5). В эмбрионе на стадии гаструляции передача сигнала комплексами ΟΧΚ4/8ΌΕ1, видимо, играет роль главным образом в миграции клеток первичной полоски зародышевого листка и имеет место в дефинитивной энтодерме, мезодерме и внезародышевой мезодерме, существующих на этом этапе. В эмбрионах мыши Е7.2-7.8 присутствие ί.'Χί.Έ4 и альфа-фетопротеина являются взаимоисключающим, указывая на отсутствие экспрессии в висцеральной энтодерме [ΜΥι^Ε, К. Е. е! а1. Иеу. Вю1оду 213, 442-456 (1999)].

Поскольку клетки дефинитивной энтодермы, полученные посредством дифференцировки плюрипотентных клеток, экспрессируют маркерный ген ΟΧΟΚ4, можно измерять экспрессию ΟΧΟΚ4, чтобы прослеживать образование клеток дефинитивной энтодермы. Дополнительно полученные описанными здесь способами клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют другие маркеры дефинитивной энтодермы, включая, без ограничения, 8ΘΧ17, ΜΙΧΕ1, САТА4, ΗΝΕ3ΐ>, С8С, ЕСЕ17, \Л\Т/ СА1.СК ГОАОВ ί.'ΜΙ<ΘΕ1 и ΟΚΙΡ1. Поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген СXСΚ4 на более высоком уровне, чем маркерный ген 8ΘΧ7, можно исследовать экспрессию обоих маркерных генов СХСР4 и 8ΘΧ7. В других способах одновременно отслеживают экспрессию маркерного гена СXСΚ4 и маркерного гена ОСТ4. Кроме того, поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген СXСΚ4 на более высоком уровне, чем маркерные гены ΑΕΡ, δΡΑΚΠ и ген тромбомодулина (ТМ), также можно отслеживать экспрессию этих маркерных генов.

Очевидно, что экспрессия СXСΚ4 в клетках энтодермы не исключает экспрессии 8ΘΧ17. Поэтому полученные описанными здесь способами клетки дефинитивной энтодермы будут экспрессировать 8ΘΧ17 и СXСΚ4 на значительном уровне, но не будут экспрессировать на значительном уровне ΑΕΡ, ΤΜ, δΡΑΚΠ и ΡΌΧ1.

Обогащение, выделение и/или очистка дефинитивной энтодермы

Полученные любым из описанных выше способом клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать, выделять и/или очищать, используя аффинные метки, специфичные к таким клеткам. Примерами аффинных меток, специфичных к дефинитивной энтодерме, являются антитела, лиганды или другие связывающие агенты, специфичные к молекуле-маркеру, например к полипептиду, присутствующему на поверхности клеток дефинитивной энтодермы, причем молекула-маркер лишь в незначительных количествах представлена на клетках других типов, которые можно обнаружить в полученных описанными здесь способами культурах. В некоторых способах для обогащения, выделения или очистки клеток дефинитивной энтодермы в качестве аффинной метки используют антитело, которое связывается с рецептором СXΚС4. В других способах реализации в качестве аффинных меток можно также использовать хемокин 8ИЕ-1 или другие молекулы на основе 8ИЕ-1. Такие молекулы включают, без ограничения, фрагменты 8ИЕ-1, конструкты слияния 8ИЕ-1 и его миметики.

Способы получения антител и применения их для выделения клеток известны в данной области. Такие способы можно применять с использованием антител и описанных здесь клеток дефинитивной энтодермы. В одном из способов реализации антитело, которое связывается с СXСΚ4, присоединяют к магнитной частице и затем позволяют ему связываться с клетками дефинитивной энтодермы в культуре клеток, которую предварительно обработали ферментами, чтобы уменьшить силу сцепления клеток между собой и с субстратом. Затем комплексы клетка/антитело/магнитная частица подвергают воздействию переменного магнитного поля. Магнитное поле используют для отделения связанных с магнитными частицами клеток дефинитивной энтодермы от не связанных с магнитными частицами клеток. После физического отделения клеток дефинитивной энтодермы от других клеток культуры, связь с антителом нарушают, а клетки пересевают на подходящую среду для культивирования тканей.

Можно также применять дополнительные способы получения обогащенных, выделенных или очи

- 17 011953 щенных культур или популяций клеток дефинитивной энтодермы. Например, в некоторых способах реализации антитела к СХСК.4 инкубируют с культурой клеток, содержащей клетки дефинитивной энтодермы, которую предварительно обработали, чтобы уменьшить силу сцепления клеток между собой и с субстратом. Затем клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют. Затем суспензию клеток инкубируют со вторым антителом, таким как антитело, конъюгированное с флуоресцентной меткой Е1ТС, которое способно к связыванию с первым антителом. Затем клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют в буфере. Затем суспензию клеток анализируют и сортируют на анализаторе, использующем способ активированной флуоресценции сортировки клеток в потоке (ЕЛС8). СХС114-положительные клетки собирают отдельно от СХС 114-отрицательных клеток, выделяя, таким образом, эти клетки. Если это желательно, композиции из выделенных клеток можно дополнительно очистить, используя способ, основанный на разнице в аффинности, или проводя дополнительные процедуры сортировки с использованием тех же или других маркеров, специфичных к дефинитивной энтодерме.

В других способах клетки дефинитивной энтодермы обогащают, выделяют и/или очищают при помощи лиганда СХСЕ4 или другой молекулы, связывающейся с этим рецептором. В некоторых способах такая молекула представляет собой 8ОЕ-1, его фрагмент, слитый конструкт или миметик.

В предпочтительных способах клетки дефинитивной энтодермы обогащают, выделяют и/или очищают от других клеток, не относящихся к дефинитивной энтодерме, после того как культуры стволовых клеток стимулируют к дифференцировке по линии клеток дефинитивной энтодермы. Очевидно, что описанные выше процедуры обогащения, выделения и очистки можно применять к такой культуре на любой стадии дифференцировки.

В дополнение к описанным выше процедурам, клетки дефинитивной энтодермы можно также выделять при помощи других способов выделения клеток. Дополнительно клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать или выделять способом серийного субкультивирования, культивируя их в условиях, которые стимулируют селективное выживание или селективный рост указанных клеток дефинитивной энтодермы.

При использовании описанных здесь способов обогащенные, выделенные и/или очищенные популяции клеток дефинитивной энтодермы или тканей можно получать ίη νίίτο из культур или популяций плюрипотентных клеток, таких как культуры или популяции стволовых клеток, которые претерпели хотя бы некоторую дифференцировку. В некоторых способах клетки претерпевают случайную дифференцировку. Однако в предпочтительном способе дифференцировку клеток направляют так, чтобы они дифференцировались главным образом в клетки дефинитивной энтодермы. Некоторые предпочтительные способы обогащения, выделения и/или очистки относятся к получению ίη νίίτο дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток человека. Применяя описанные здесь способы, можно обогащать культуры клеток по содержанию дефинитивной энтодермы, повышая его в по меньшей мере приблизительно от 2 раз до 1000 раз по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимся обработке.

Композиции, содержащие ΡϋΧΙ-отрицательную дефинитивную энтодерму (дефинитивную энтодерму)

Композиции клеток, полученные описанными выше способами, включают культуры клеток, которые содержат дефинитивную энтодерму, и популяции клеток, обогащенные дефинитивной энтодермой. Например, можно получить культуры клеток, которые содержат клетки дефинитивной энтодермы, в которых по меньшей мере приблизительно 50-80% клеток в культуре представляют собой клетки дефинитивной энтодермы. Поскольку эффективность способа дифференцировки можно регулировать, изменяя определенные параметры, которые включают, без ограничения, условия выращивания клеток, концентрации факторов роста и продолжительность этапов культивирования, описанные здесь процедуры дифференцировки могут обеспечивать приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более чем приблизительно 95% превращение плюрипотентных клеток в дефинитивную энтодерму. Способы, в которых применяют выделение клеток дефинитивной энтодермы, например, при помощи аффинного реагента, который связывает рецептор СХСК.4, позволяют получать практически чистые популяции клеток дефинитивной энтодермы.

Получение ΡϋΧΙ-положительной энтодермы передней кишки из ΡϋΧΙ-отрицательной дефинитивной энтодермы

Описанные здесь культуры РОХ1-положительных клеток энтодермы передней кишки и популяции, содержащие РОХ 1-положительные клетки энтодермы передней кишки, получают из РЭХ1отрицательной энтодермы, которую получают из плюрипотентных клеток описанными выше способами. В предпочтительном способе в качестве исходного материала применяют эмбриональные стволовые клетки человека. В одном примере реализации ЭСКч вначале превращают в РОХ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, которые затем превращают в РПХ1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Однако очевидно, что исходным материалом для получения РОХ1-положительной энтодер

- 18 011953 мы передней кишки могут служить не только клетки дефинитивной энтодермы, полученные при использовании способов дифференцировки плюрипотентных клеток. Точнее, ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы можно применять в описанных здесь способах вне зависимости от их происхождения.

В некоторых примерах реализации настоящего изобретения культуры клеток или популяции клеток, содержащие ΡΩΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, можно использовать для дальнейшей дифференцировки в культуры клеток и/или обогащенные популяции клеток, содержащие ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки. Например, можно применять культуры клеток или популяции клеток, содержащие Ρ^X1-отрицательные, §ΟX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы человека. В некоторых примерах реализации культура клеток или популяция клеток может содержать также факторы дифференцировки, такие как активины, белки Ыоба1 и/или белки морфогенеза костей (ΒΜΡ), оставшиеся от предыдущих этапов дифференцировки (т.е. этапа дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы). В других примерах реализации факторы, которые применяли на предыдущем этапе дифференцировки, удаляют из культуры клеток или популяции клеток перед тем, как добавить факторы, применяемые для дифференцировки ΡΌΧ1-отрицательных, §ΟX17-положительных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В других примерах реализации популяции клеток, обогащенные Ρ^X1-отрицательными, §ΟX17-положительными клетками дефинитивной энтодермы, используют в качестве источника получения Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки.

Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы в культуре подвергают дифференцировке в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы посредством добавления в культуру клеток, содержащую Ρ^X1-отрицательные, §ΟX17-пололижительные клетки дефинитивной энтодермы, фактора дифференцировки, который стимулирует дифференцировку этих клеток в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки (фактор дифференцировки передней кишки). В некоторых способах реализации настоящего изобретения факторы дифференцировки передней кишки представляют собой ретиноид, такой как ретиноевая кислота (КА). В некоторых примерах реализации ретиноид применяют в комбинации с фактором роста фибробластов, таким как ЕСЕ-4 или ЕСЕ-10. В других примерах реализации ретиноид применяют в комбинации с надсемейством фактором роста ТСЕв/или кондиционированной средой.

Под кондиционированной средой понимают среду, которая была модифицирована по сравнению с базовой средой. Например, кондиционирование среды может означать увеличение или снижение уровня молекул, таких как питательные вещества и/или факторы роста, по сравнению с исходными уровнями в базовой среде. В некоторых примерах реализации среду кондиционируют, выращивая или поддерживая в этой вреде клетки определенных типов в определенных условиях в течение определенных периодов времени. Например, среду можно кондиционировать, выращивая, поддерживая или проводя дифференцировку ЭСКч в среде определенного состава при определенной температуре в течение определенного количества часов. Для специалиста в данной области очевидно, что многочисленные комбинации клеток, типов сред, продолжительностей и условий позволяют получить практически бесконечный набор кондиционированных сред. В некоторых способах реализации настоящего изобретения кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде, содержащей приблизительно от 1 до 20% сыворотки. В других способах реализации кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде, содержащей от приблизительно 1 до приблизительно 1000 нг/мл активина А. В других способах реализации кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде, содержащей приблизительно от 1 до 1000 нг/мл ВМР4. В предпочтительном способе реализации кондиционированную среду готовят, выращивая или поддерживая ЭСКч в среде, такой как ΚΡΜΙ, содержащей приблизительно 25 нг/мл активина А и приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты, в течение 24 ч.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения клетки, которые применяют для кондиционирования среды для повышения дифференцировки Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительную энтодерму передней кишки, представляют собой клетки, полученные в результате дифференцировки плюрипотентных клеток, таких как ЭСКч, в течение периода продолжительностью приблизительно 5 дней в среде, такой как ΚΡΜΙ, содержащей приблизительно от 0 до 20% сыворотки и/или один или более факторов роста/дифференцировки из надсемейства ТСЕв. Факторы дифференцировки, такие как активин А и ВМР4, добавляют в концентрациях, лежащих в пределах приблизительно от 1 до 1000 нг/мл. В определенных способах реализации настоящего изобретения клетки, которые применяют для кондиционирования среды, получают в результате дифференцировки ЭСКч в течение периода продолжительностью приблизительно 5 дней в среде ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки. Согласно некоторым примерам реализации настоящего изобретения, ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки называют среду с низким содержанием сыворотки, причем концентрацию сыворотки постепенно увеличивают на протяжении определенного периода времени. Например, в одном примере реализации, концентрация фетальной сыворотки крупного рогатого скота (фетальной сыворотки) в ΚΡΜΙ с низким со

- 19 011953 держанием сыворотки составляет приблизительно 0,2% фетальной сыворотки в первый день выращивания клеток, приблизительно 0,5% фетальной сыворотки во второй день выращивания клеток и 2% фетальной сыворотки с третьего по пятый дни выращивания клеток. В другом способе реализации концентрация фетальной сыворотки крупного рогатого скота в ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки составляет приблизительно 0% в первый день, приблизительно 0,2% во второй день и приблизительно 2% в дни 3-6. В определенных предпочтительных способах реализации ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки дополняют одним или более фактором дифференцировки, такими как активин А и ВМР4. Кроме применения в получении клеток, применяемых для кондиционирования среды, ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки можно также применять в качестве среды для получения путем дифференцировки ΡΌΧ1полжительных клеток энтодермы передней кишки из Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы.

Для среднего специалиста в данной области очевидно, что кондиционированную среду можно приготовить не из ΚΡΜΙ, а из другой среды, при условии, что такая среда не мешает росту или поддержанию Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки. Также очевидно, что для кондиционирования среды можно применять клетки различных типов. В тех способах реализации, где для кондиционирования среды применяют недавно дифференцированные клетки, дифференцировка таких клеток может проходить в среде, отличной от ΚΡΜΙ, при условии, что такая среда не подавляет рост или поддержание таких клеток. Кроме того, для специалиста в данной области, очевидно, что ни продолжительность кондиционирования, ни продолжительность приготовления клеток, применяемых для кондиционирования, не должны обязательно составлять 24 ч и 5 дней соответственно, поскольку для достижения описанных здесь эффектов может быть достаточно других промежутков времени.

В целом, применение ретиноида в комбинации с фактором роста фибробластов, членом надсемейства факторов роста ΤΟΡβ, кондиционированной средой или комбинации любых из этих факторов дифференцировки передней кишки обеспечивает более значительную дифференцировку ΡΌΧ1отрицательной дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительную энтодерму передней кишки, чем применение только ретиноида. В предпочтительных способах реализации в культуру Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы добавляют и ретиноевую кислоту и ΡΟΡ-10. В другом предпочтительном способе реализации ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы подвергают дифференцировке в культуре, содержащей кондиционированную среду, активин А, активин В и ретиноевую кислоту.

Что касается примеров реализации некоторых описанных здесь способов дифференцировки, то вышеупомянутые факторы дифференцировки передней кишки добавляют к клеткам таким образом, чтобы эти факторы присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части культуры ΡΌΧ-1 отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки. При использовании применительно к культурам клеток и/или популяциям клеток термин часть обозначает любое ненулевое количество клеток культуры клеток или популяции клеток, лежащее в пределах от одной клетки до полной культуры клеток или популяции клеток.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения ретиноид добавляют к клеткам в культуре клеток таким образом, чтобы он присутствовал в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 0,01 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,02 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,04 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,08 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 10 мкМ, по меньшей мере приблизительно 20 мкМ, по меньшей мере приблизительно 30 мкМ, по меньшей мере приблизительно 40 мкМ или по меньшей мере приблизительно 50 мкМ. В настоящей заявке термин ретиноид относится к ретинолу, ретиналю или ретиноевой кислоте, а также к производным любого из этих соединений. В предпочтительном способе реализации ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту.

В других способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствуют один или

- 20 011953 более факторов роста фибробластов. Например, в некоторых примерах реализации в культуре клеток может присутствовать ЕСЕ-4 в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В дальнейших способах реализации настоящего изобретения ЕСЕ-10 присутствует в культуре клеток в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В некоторых примерах реализации в культуру клеток добавляют, помимо ретиноевой кислоты, либо ЕСЕ-4, либо ЕСЕ-10, но не оба эти фактора одновременно. В предпочтительном способе реализации в культуре клеток присутствуют ретиноевая кислота в количестве 1 мкМ и ЕСЕ-10 в концентрации 50 нг/мл.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствуют факторы роста надсемейства ТСЕΡ и/или кондиционированная среда. Эту факторы дифференцировки можно применять в комбинации с ретиноевой кислотой и/или другими факторами дифференцировки передней кишки, включая, без ограничения, ЕСЕ-4 и ЕСЕ-10. Например, в некоторых примерах реализации в культуре клеток могут присутствовать активин А и/или активин В в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 5 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В дальнейших способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствует кондиционированная среда в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 100% от всей среды. В некоторых примерах реализации в культуру клеток помимо ретиноевой кислоты добавляют активин А, активин В и кондиционированную среду. В предпочтительном способе реализации Ρ^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы подвергают дифференцировке в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки в культурах, содержащих приблизительно 1 мкМ ретиноевой кислоты, приблизительно 25 нг/мл активина А и среду ΒΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, которую кондиционировали в течение приблизительно 24 ч при помощи дифференцированных ЭСКч, причем дифференцированные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение приблизительно 5 дней в среде ΚΡΜΙ с низким содержанием сыворотки, содержащей приблизительно 100 нг/мл активина А. В другом предпочтительном способе реализации в культуре присутствуют также активин В и/или ЕСЕ-10 в концентрации 25 и 50 нг/мл соответственно.

В определенных способах реализации настоящего изобретения вышеупомянутые факторы дифференцировки передней кишки после добавления удаляют из культуры клеток. Например, факторы дифференцировки передней кишки можно удалять в пределах приблизительно одного дня, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней, приблизительно шести дней, приблизительно семи дней, приблизительно восьми дней, приблизительно девяти дней или приблизительно десяти дней после добавления.

Культуры Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки можно выращивать в среде, содержащей разбавленную сыворотку. Концентрации сыворотки могут лежать в пределах приблизительно от 0,05% (об./об.) до 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают с заменителем сыворотки. Например, в определенных примерах реализации концентрация сыворотки в среде может быть меньше приблизительно 0,05% (об./об.), меньше приблизительно 0,1% (об./об.), меньше приблизительно 0,2% (об./об.), меньше приблизительно 0,3% (об./об.), меньше приблизительно 0,4% (об./об.), меньше приблизительно 0,5% (об./об.), меньше приблизительно 0,6% (об./об.), меньше приблизительно 0,7% (об./об.), меньше приблизительно 0,8% (об./об.), меньше приблизительно 0,9% (об./об.), меньше приблизительно 1% (об./об.), меньше приблизительно 2% (об./об.), меньше приблизительно 3% (об./об.), меньше приблизительно 4% (об./об.), меньше приблизительно 5% (об./об.), меньше приблизительно 6% (об./об.), меньше приблизительно 7% (об./об.), меньше приблизительно 8% (об./об.), меньше приблизительно 9% (об./об.), меньше приблизительно 10% (об./об.), меньше приблизительно 15% (об./об.) или меньше приблизительно 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают без сыворотки. В других примерах реализации ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки выра

- 21 011953 щивают с заменителем сыворотки.

В других способах реализации Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают в присутствии В27. В таких способах реализации В27 можно добавлять в культуру в концентрациях, лежащих в пределах от приблизительно 0,1% (об./об.) до приблизительно 20% (об./об.) или в концентрациях больше приблизительно 20% (об./об.). В определенных примерах реализации концентрация В27 в среде составляет приблизительно 0,1% (об./об.), приблизительно 0,2% (об./об.), приблизительно 0,3% (об./об.), приблизительно 0,4% (об./об.), приблизительно 0,5% (об./об.), приблизительно 0,6% (об./об.), приблизительно 0,7% (об./об.), приблизительно 0,8% (об./об.), приблизительно 0,9% (об./об.), приблизительно 1% (об./об.), приблизительно 2% (об./об.), приблизительно 3% (об./об.), приблизительно 4% (об./об.), приблизительно 5% (об./об.), приблизительно 6% (об./об.), приблизительно 7% (об./об.), приблизительно 8% (об./об.), приблизительно 9% (об./об.), приблизительно 10% (об./об.), приблизительно 15% (об./об.) или приблизительно 20% (об./об.). В качестве альтернативы концентрацию добавки В27 можно измерять в терминах множителей (кратности) концентрации коммерчески доступного маточного раствора В27. Например, В27 можно приобрести в 1пуйгодеп (Карлсбад, Калифорния, США) в виде 50Х маточного раствора. Добавление определенного количества этого маточного раствора к определенному объему среды для выращивания дает среду, дополненную желаемым количеством В27. Например, добавление 10 мл 50Х маточного раствора к В27 90 мл среды для выращивания дает среду для выращивания, дополненную 5Х В27. Концентрация добавки В27 в среде может составлять приблизительно 0,1Х, приблизительно 0,2Х, приблизительно 0,3Х, приблизительно 0,4Х, приблизительно 0,5Х, приблизительно 0,6Х, приблизительно 0,7Х, приблизительно 0,8Х, приблизительно 0,9Х, приблизительно ^, приблизительно 1,1Х, приблизительно 1,2Х, приблизительно 1,3Х, приблизительно 1,4Х, приблизительно 1,5Х, приблизительно 1,6Х, приблизительно 1,7Х, приблизительно 1,8Х, приблизительно 1,9Х, приблизительно 2Х, приблизительно 2,5Х, приблизительно 3Х, приблизительно 3,5Х, приблизительно 4Х, приблизительно 4,5Х, приблизительно 5Х, приблизительно 6Х, приблизительно 7Х, приблизительно 8Х, приблизительно 9Х, приблизительно 10Х, приблизительно 11Х, приблизительно 12Х, приблизительно 13Х, приблизительно 14Х, приблизительно 15Х, приблизительно 16Х, приблизительно 17Х, приблизительно 18Х, приблизительно 19Х, приблизительно 20Х или быть больше приблизительно 20Х.

Мониторинг дифференцировки ΡϋΧΙ-отрицательной дефинитивной энтодермы в ΡϋΧΙ-положительную энтодерму

Так же как и в случае дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы, за ходом дифференцировки Ρ^X1-отрицательной, 8ΟX17-положительной дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительную энтодерму передней кишки можно следить посредством определения экспрессии маркеров, характерных для этих типов клеток. Такой мониторинг позволяет определить количество времени, необходимое для получения желаемого количества Ρ^X1-положительной энтодермы передней кишки в разнообразных условиях, например для одной или более концентраций фактора дифференцировки, и для различных внешних условий. В предпочтительных способах реализации время, достаточное для получения желаемого количества Ρ^X1-положительной энтодермы передней кишки, определяют посредством определения экспрессии РОУЕ В некоторых способах реализации настоящего изобретения экспрессию конкретных маркеров определяют посредством регистрации присутствия или отсутствия этого маркера. В некоторых способах реализации настоящего изобретения экспрессию конкретных маркеров можно определять посредством измерения количества (уровня), в котором этот маркер присутствует в клетках культуры клеток или популяции клеток, в таких способах реализации измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Как описано выше, предпочтительным способом количественного определения маркеров экспрессии, продуцируемых маркерными генами, является применение количественной ПЦР. В конкретных способах реализации ПЦР применяют для того, чтобы следить за ходом дифференцировки культуры Ρ^X1-отрицательной, 8ΟX17-положительной дефинитивной энтодермы в РЭУ1 -положительные клетки энтодермы передней кишки, посредством количественного определения экспрессии маркерных генов, характерных для Ρ^X1-положительной энтодермы передней кишки, и отсутствие экспрессии маркерных генов, характеризующих другие типы клеток. Для измерения экспрессии маркерных генов можно также применять другие известные в данной области способы. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно определять при помощи антител, специфичных к продукту интересующего исследователя маркерного гена. В некоторых способах реализации настоящего изобретения определяют экспрессию маркерных генов, характерных для РОУП положительной энтодермы передней кишки, а также отсутствие значительного уровня экспрессии маркерных генов, характерных для Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы, ЭСКч и других типов клеток.

Как описано в приведенных ниже примерах, Ρ^X1 представляет собой маркерный ген, ассоциированный с Ρ^X1-положительной энтодермой передней кишки. Поэтому в некоторых способах реализации настоящего изобретения определяют экспрессию Ρ^X1. В других примерах реализации определяют также экспрессию других маркеров, которые экспрессирует Ρ^X1-положительная энтодерма передней кишки, включая, без ограничения, 80X17, НОХА13 и/или НОХС6. Поскольку другие типы клеток (например, висцеральная энтодерма и нервная эктодерма) также могут экспрессировать Ρ^X1, некоторые при

- 22 011953 меры реализации настоящего изобретения относятся к демонстрации отсутствия или отсутствия значительного уровня экспрессии маркерного гена, который ассоциирован с висцеральной энтодермой и/или нервной эктодермой. Например, в некоторых примерах реализации определяют экспрессию маркеров, включая, без ограничения, ΞΟΧ7, ΑΕΡ, 8ΟΧ1. ΖΙΟ и/или ΝΕΜ, которые экспрессируются висцеральной энтодермой и/или нервной эктодермой.

В некоторых примерах реализации полученные описанными здесь способами культуры ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки практически свободны от клеток, которые экспрессируют маркерные гены 8ΟΧ7. ΑΕΡ, 8ΟΧ1. ΖΙΟ или ΝΕΜ. В определенных примерах реализации полученные описанными здесь способами культуры Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки практически свободны от клеток висцеральной энтодермы, париетальной энтодермы и/или нервных клеток.

Обогащение, выделение и/или очистка ΡϋΧΙ-положительной энтодермы

Что касается дополнительных аспектов настоящего изобретения, Ρ^X1-положительные клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать, выделять и/или очищать. В некоторых способах реализации настоящего изобретения популяции клеток, обогащенные Ρ^X1-положительными клетками энтодермы передней кишки, получают посредством выделения таких клеток из культур клеток.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения Ρ^X1-положительные клетки дефинитивной энтодермы метят флуоресцентной меткой, а затем отделяют от немеченых клеток на анализаторе, использующем способ активированной флуоресценции сортировки клеток в потоке (ΕΑС8). В таких способах реализации для того, чтобы метить Ρ^X1-положительные клетки, применяют нуклеиновую кислоту, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок (ΟΕΡ), или другую нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый ген флуоресцирующего маркера. Например, в некоторых примерах реализации в плюрипотентную клетку, предпочтительно эмбриональную стволовую клетку человека, вводят по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты, кодирующей ΟΕΡ или его биологически активный фрагмент, причем располагают его в 3'-5' направлении от промотора ΡΌΧ1, чтобы экспрессия продукта ΟΕΡ или его биологически активного фрагмента находилась под контролем промотора ΡΌΧ1. В некоторых примерах реализации целую кодирующую область, которая кодирует ΡΌΧ1, заменяют на нуклеиновую кислоту, кодирующую ΟΕΡ или его биологически активный фрагмент. В других примерах реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую ΟΕΡ или его биологически активный фрагмент, лигируют с сохранением рамки считывания с по меньшей мере одной частью нуклеиновой кислоты, кодирующей ΡΌΧ1, формируя, таким образом, гибридный белок. В таких способах реализации гибридный белок сохраняет флуоресцентную активность, аналогичную активности ΟΕΡ.

Клетки с флуоресцентной меткой, такие как описанные выше клетки, дифференцируются в клетки дефинитивной энтодермы, а затем в Ρ^X1-положительную энтодерму передней кишки, как было описано выше. Благодаря тому, что Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген флуоресцентного маркера, а Ρ^X1-отрицательные клетки - нет, эти два типа клеток можно разделить. В некоторых примерах реализации суспензии клеток, содержащие смесь ΡΌΧ1-положительных клеток, меченых флуоресцентной меткой, и немеченых Ρ^X1-отрицательных клеток, сортируют способом активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (ΕΑС8). Ρ^X1-положительные клетки собирают отдельно от Ρ^X1-отрицательных клеток, что обеспечивает отделение таких типов клеток. Если это желательно, композиции выделенных клеток можно очищать дальше посредством дополнительных циклов сортировки с использованием тех же или других маркеров, специфичных к ΡΌΧ1-положительной энтодерме передней кишки.

В дополнение к описанным выше процедурам Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки можно также выделять при помощи других методик выделения клеток. Дополнительно ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки также можно обогащать или выделять способом серийного субкультивирования в условиях, которые стимулируют селективное выживание или селективный рост указанных Ρ^X1-положительных клеток дефинитивной энтодермы.

Очевидно, что описанные выше процедуры обогащения, выделения и очистки можно применять для культур на любой стадии дифференцировки.

При использовании описанных здесь способов обогащенные, выделенные и/или очищенные популяции Ρ^X1-положительных клеток дефинитивной энтодермы и/или тканей можно получать ίη νίίτο из культур или популяций Ρ^X1-отрицательных, 8ΟX17-положительных клеток дефинитивной энтодермы, которые претерпели хотя бы некоторую дифференцировку. В некоторых примерах реализации эти клетки претерпевают случайную дифференцировку. В предпочтительном способе реализации, однако, дифференцировку клеток направляют так, чтобы они дифференцировались главным образом в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки. Некоторые предпочтительные способы обогащения, выделения и/или очистки относятся к получению ίη νίίτο ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки из эмбриональных стволовых клеток человека.

Применяя описанные здесь способы, можно обогащать популяции клеток или культуры клеток по содержанию Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере приблизительно от 2 раз до приблизительно 1000 раз по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не под

- 23 011953 вергавшимся обработке. В некоторых примерах реализации можно произвести приблизительно 5-500кратное обогащение РОУГло-ложит-ельными клетками энтодермы передней кишки по сравнению с культурами клеток и популяциями клеток, не подвергавшимися обработке. В других примерах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 10-200-кратное обогащение по РОА!положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В других способах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 20-100-кратное обогащение по Р^X1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В других способах реализации можно произвести приблизительно по меньшей мере приблизительно 40-80-кратное обогащение по Р^X1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В определенных примерах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 2-20-кратное обогащение по Р^X1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке.

Композиции, содержащие ΡϋΧΙ-положительную энтодерму передней кишки

Некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим Р^X1-положительные клетки дефинитивной энтодермы, в которых Р^X1-положительные клетки дефинитивной энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки (Р^X1-положительной энтодермы передней кишки). Согласно определенным способам реализации Р^X1-положительная энтодерма представляет собой клетки млекопитающих, а в предпочтительном способе реализации клетки дефинитивной энтодермы представляют собой клетки человека.

Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки одного или более типов, выбранных из группы, состоящей из ЭСКч, Р^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, Р^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки и клеток мезодермы. В некоторых примерах реализации ЭСКч составляют меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре. В других примерах реализации Р^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы составляют меньше приблизительно 90%, меньше приблизительно 85%, меньше приблизительно 80%, меньше приблизительно 75%, меньше приблизительно 70%, меньше приблизительно 65%, меньше приблизительно 60%, меньше приблизительно 55%, меньше приблизительно 50%, меньше приблизительно 45%, меньше приблизительно 40%, меньше приблизительно 35%, меньше приблизительно 30%, меньше приблизительно 25%, меньше приблизительно 20%, меньше приблизительно 15%, меньше приблизительно 12%, меньше приблизительно 10%, меньше приблизительно 8%, меньше приблизительно 6%, меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре. В других примерах реализации клетки мезодермы составляют меньше приблизительно 90%, меньше приблизительно 85%, меньше приблизительно 80%, меньше приблизительно 75%, меньше приблизительно 70%, меньше приблизительно 65%, меньше приблизительно 60%, меньше приблизительно 55%, меньше приблизительно 50%, меньше приблизительно 45%, меньше приблизительно 40%, меньше приблизительно 35%, меньше приблизительно 30%, меньше приблизительно 25%, меньше приблизительно 20%, меньше приблизительно 15%, меньше приблизительно 12%, меньше приблизительно 10%, меньше приблизительно 8%, меньше приблизительно 6%, меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре.

Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, полученным описанными здесь способами, в которых Р^X1положительная энтодерма составляет основной тип клеток. В некоторых примерах реализации описанные в настоящей заявке способы позволяют получать культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 52% или по меньшей мере приблизительно 51% Р^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации клетки культуры клеток или популяции клеток представляют собой клетки человека. В других примерах реализации описанные здесь способы позволяют получать культуры клеток или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно

- 24 011953

45%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 24%, по меньшей мере приблизительно 23%, по меньшей мере приблизительно 22%, по меньшей мере приблизительно 21%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 19%, по меньшей мере приблизительно 18%, по меньшей мере приблизительно 17%, по меньшей мере приблизительно 16%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 14%, по меньшей мере приблизительно 13%, по меньшей мере приблизительно 12%, по меньшей мере приблизительно 11%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 9%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 7%, по меньшей мере приблизительно 6%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 3%, по меньшей мере приблизительно 2% или по меньшей мере приблизительно 1% Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации клетки культур клеток или популяций клеток представляют собой клетки человека. В некоторых примерах реализации процентную долю Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток рассчитывают без учета оставшихся в культуре фидерных клеток.

Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, которые содержат смеси Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки и ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. Например, можно получить культуру клеток или популяцию клеток, содержащую по меньшей мере приблизительно 5 ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 95 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. В других примерах реализации можно получить культуры клеток или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 95 Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. Кроме того, предусмотрены популяции, содержащие ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки и ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы в других соотношениях. Например, предусмотрены композиции, содержащие по меньшей мере приблизительно 1 ΡΌΧ1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждый 1000000 ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 100000 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10000 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 ΡΌΧ1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 1000 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 500 ΡΌΧ1отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 ΡΌΧ1положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 100 ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 4 ΡΌΧ1-отрицательных клетки дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 2 ΡΌΧ1отрицательных клетки дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 ΡΌΧ1положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 Ρ^X1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 2 Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 Ρ^X1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 4 Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 Ρ^X1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 5 Ρ^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 10 ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 20 ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 50 ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 Ρ^X1-отрицателную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 100 ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1000 ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 10000 ΡΌΧ1положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 100000 ΡΌΧ1-положительных кле

- 25 011953 ток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 ΡΌΧ1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы и по меньшей мере приблизительно 1000000 ΡΌΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 Ρ^X1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения ΡΌΧ1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, из которых получают Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки, образуются из плюрипотентных клеток человека, таких как плюрипотентные стволовые клетки человека. В определенных примерах реализации плюрипотентные стволовые клетки человека получают из морулы, внутренней клеточной массы эмбриона или из гонадных валиков эмбриона. В определенных примерах реализации плюрипотентные стволовые клетки человека получают из гонадной или зародышевой тканей многоклеточной структуры, которая развивается после стадии эмбриона.

Другие способы реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки человека, включая Ρ^X1-положительную энтодерму передней кишки человека, в которой уровень экспрессии маркера ΡΌΧ1 выше уровней экспрессии маркеров АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или №М по меньшей мере приблизительно в 2% клеток человека. В других примерах реализации уровень экспрессии маркера ΡΌΧ1 выше уровня экспрессии маркера АР₽, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или NРΜ по меньшей мере приблизительно в 5% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток человека или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации процентную долю клеток человека в культурах клеток или популяциях клеток, в которых уровень экспрессии ΡΌΧ1 выше уровня экспрессии маркера АРТ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или ММ, рассчитывают без учета фидерных клеток.

Очевидно, что некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из 8ΘΧ17, НОХА13 и НОХС6, выше уровня экспрессии маркера АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или ММ в от по меньшей мере приблизительно 2 до более чем по меньшей мере приблизительно 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из 8ΘΧ17, НОХА13 и НОХС6, выше уровня экспрессии маркера АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или NРΜ по меньшей мере приблизительно в 5% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток человека или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации процентную долю клеток человека, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из 8ΘΧ17, НОХА13 и НОХС6, выше уровня экспрессии маркера АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или ММ, в популяциях или культурах клеток рассчитывают без учета фидерных клеток.

Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки энтодермы млекопитающих, такие как клетки энтодермы человека, в которых уровень экспрессии маркера ΡΌΧ1 выше уровня экспрессии маркера АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или ММ по меньшей мере приблизительно в 2% клеток энтодермы. В других примерах реализации уровень экспрессии маркера ΡΌΧ1 выше уровня экспрессии маркера АРΡ, 8ΘΧ7, 8ΘΧ1, ΖΙΟ и/или NРΜ по меньшей мере приблизительно в 5% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток энтодермы, по мень

- 26 011953 шей мере приблизительно в 45% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток энтодермы или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток энтодермы.

Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки энтодермы млекопитающих, таким как клетки энтодермы млекопитающих, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из 80X17, НОХА13 и НОХС6, выше, чем уровень экспрессии маркера АЕР, 80X7, 80X1, ΖΙΟ1 и/или ΝΕΜ по меньшей мере приблизительно в 2% клеток энтодермы. В других примерах реализации уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из 80X17, Н0ХА13 и НОХС6, выше, чем уровень экспрессии АЕР, 80X7, 80X1, ΖΙ01 и/или ΝΕΜ по меньшей мере приблизительно в 5% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток энтодермы или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток энтодермы.

Применяя описанные здесь способы, можно получить композиции, содержащие £0X1положительные клетки энтодермы передней кишки, практически свободные от других типов клеток. В отношении клеток в культурах клеток или популяциях клеток термин практически свободный от означает, что конкретный тип клеток, от которого свободна популяция клеток или культура клеток, присутствует в количестве меньше приблизительно 5% общего числа клеток, присутствующих в культуре клеток или популяции клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения популяции или культуры £0X1-положительных клеток передней кишки, полученные описанными здесь способами, практически свободны от клеток, в которых значительны уровни экспрессии маркерных генов АЕР, 80X7, 80X1, ΖΙΟ1 и/или ΝΕΜ.

В одном из способов реализации настоящего изобретения £0X1-положительные клетки передней кишки описаны на основании экспрессии маркерных генов следующим образом: £0X1 Ыдй (высокий уровень), АЕР 1ο\ν (низкий уровень), 80X7 1ο\ν. 80X1 1ο\ν. ΖΙΟ1 1ο\ν и ΝΕΜ 1ο\ν.

Увеличение экспрессии ΡϋΧ1 в 80Х17-положительной клетке дефинитивной энтодермы

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способу повышения уровня экспрессии продукта гена £0X1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы. В таких способах реализации 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для того, чтобы повысить уровень экспрессии продукта гена £0X1. 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, которые приводят в контакт с фактором дифференцировки, могут быть £0X1отрицательными или £0X1-положительными. В некоторых примерах реализации фактор дифференцировки может представлять собой ретиноид. В определенных примерах реализации 80X17положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с ретиноидом в концентрации приблизительно от 0,01 до 50 мкМ. В предпочтительном способе реализации ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту.

В других способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии продукта гена £0X1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, повышают посредством приведения в контакт 80X17-положительных клеток с фактором дифференцировки из семейства факторов роста фибробластов. Такие факторы дифференцировки можно применять либо отдельно, либо в комбинации с ретиноевой кислотой. В некоторых примерах реализации 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с фактором роста фибробластов в концентрации приблизительно от 10 до 1000 нг/мл. В предпочтительном способе реализации фактор роста фибробластов представляет собой ЕОЕ-10.

В некоторых способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии продукта гена £0X1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих 8ОX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, повышают посредством приведения в контакт 8ОX17-положительных клеток с В27. Этот фактор дифференцировки можно применять либо самостоятельно, либо в комбинации с ретинои

- 27 011953 дом и факторами дифференцировки семейства ЕСЕ (т.е. в комбинации с одним из этих компонентов или обоими). В некоторых примерах реализации 8ΟΧ 17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с В27 в количестве, составляющем приблизительно от 0,1 до 20% (об./об.). В предпочтительном способе реализации §ΟX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с ретиноевой кислотой, ЕСЕ-10 и В27.

Способы повышения уровня экспрессии продукта гена ΡΌΧ1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих 8ΟΧ 17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, можно осуществить в среде для выращивания, содержащей пониженное количество сыворотки или в среде без сыворотки. В некоторых примерах реализации концентрации сыворотки лежат в пределах приблизительно от 0,05 до 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации §ΟX17-положительные клетки выращивают с заменителем сыворотки.

Идентификация факторов, способных стимулировать дифференцировку ΡϋΧΙ-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡϋΧΙ-положительные клетки энтодермы передней кишки

Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к способам идентификации одного или более факторов дифференцировки, способных стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В таких способах получают культуру клеток или популяцию клеток, содержащую ΡΌΧ1отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и определяют экспрессию ΡΌΧ1 в этой культуре клеток или популяции клеток. После определения экспрессии ΡΌΧ1 клетки культуры клеток или популяции клеток приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации экспрессию ΡΌΧ1 определяют во время контактирования или через небольшой промежуток времени после приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. Затем экспрессию ΡΌΧ1 определяют после контакта с потенциальным фактором дифференцировки один или более раз. Если после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки уровень экспрессии ΡΌΧ1 увеличился по сравнению с уровнем экспрессии до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку ΡΩΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки дефинитивной энтодермы.

В некоторых примерах реализации описанные выше способы идентификации факторов, способных стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в ΡΌΧ1положительные клетки энтодермы передней кишки, включают также определение экспрессии гена НОХА13 и/или гена НОХС6 в культуре клеток или популяции клеток. В таких примерах реализации экспрессию НОХА13 и/или НОХС6 определяют как до, так и после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. Если уровень экспрессии ΡΌΧ1 и НОХА13 после контакта с потенциальным фактором дифференцировки повышается по сравнению с уровнем экспрессии ΡΌΧ1 и НОХА13 до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку ΡΌΧ1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Аналогично, если уровень экспрессии ΡΌΧ1 и НОХС6 после контакта с потенциальным фактором дифференцировки увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии ΡΌΧ1 и НОХС6 до контакта с потенциальным фактором, данный потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В предпочтительном способе реализации потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки посредством определения экспрессии ΡΌΧ1, ΗΟΧΑ13 и НОХС6 как до, так и после контакта клеток культуры клеток или популяции клеток с потенциальным фактором дифференцировки. В предпочтительных способах реализации экспрессию ΡΌΧ1, НОХА13 и/или НОХС6 определяют способом количественной ПЦР.

Очевидно, что в некоторых примерах реализации экспрессию одного или более генов из ΡΌΧ1, НОХА13 и НОХС6 можно определять во время контактирования или через небольшой промежуток времени после контакта клеток культуры клеток или популяции клеток с потенциальным фактором дифференцировки, а не до приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки. В таких примерах реализации экспрессию одного или более генов из ΡΌΧ1, НОХА13 и ΗΟΧΠ6 во время контактирования клеток с потенциальным фактором дифференцировки или через небольшой промежуток времени после него сравнивают с уровнями экспрессии одного или более из генов ΡΌΧ1, НОХА13 и НОХС6, определенными один или более раз после контакта клеток с потенциальными факторами дифференцировки.

В некоторых примерах реализации описанных выше способов продолжительность одного или более промежутков времени после приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, через которые определяют экспрессию ΡΌΧ1, может лежать в пределах приблизительно от 1 ч до 10 дней. Например, экспрессию ΡΌΧ1 приблизительно через 1 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 ч после приведения в контакт клеток с потен

- 28 011953 циальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 12 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 16 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 24 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 3 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 5 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 7 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 9 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки или более чем через 10 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки.

Потенциальные факторы дифференцировки для применения в описанных здесь способах можно выбрать из соединений, таких как полипептиды и малые молекулы. Например, потенциальные полипептиды могут включать, без ограничения, факторы роста, цитокины, хемокины, белки внеклеточного матрикса и синтетические пептиды. В предпочтительном способе реализации фактор роста принадлежит к семейству ЕСЕ (факторов роста фибробластов), например ЕСЕ-10. Потенциальные малые молекулы включают, без ограничения, соединения, полученные путем комбинаторного химического синтеза, и природные продукты, такие как стероиды, изопреноиды, терпеноиды, фенилпропаноиды, алкалоиды и флавиноиды. Для среднего специалиста в данной области очевидно, что для применения в описанных здесь способах подходят тысячи классов природных и синтетических малых молекул, не ограниченных приведенными выше примерами. Обычно, молекулы небольшого размера будут иметь молекулярную массу менее 10,000 а.е.м. В предпочтительном способе реализации молекула небольшого размера представляет собой ретиноид, например ретиноевую кислоту.

Идентификация факторов, способных стимулировать дифференцировку ΡϋΧΙ-положительных клеток дефинитивной энтодермы

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам идентификации одного или более факторов дифференцировки, способным стимулировать дифференцировку РОХ1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В таких способах получают культуру клеток или популяцию клеток, содержащую РОХ 1-положительные клетки энтодермы передней кишки, и определяют экспрессию какоголибо маркера в такой популяции клеток или колонии клеток. После определения экспрессии маркера культуру клеток или популяцию клеток приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации экспрессию маркера определяют во время контактирования или через небольшой промежуток времени после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. Затем экспрессию того же маркера определяют один или более раз после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки. Если уровень экспрессии маркера увеличивается или уменьшается после контакта с потенциальным фактором дифференцировки, по сравнению с уровнем экспрессии этого маркера до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку РЭХ1 -положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации экспрессию маркеров определяют способом количественной ПЦР.

В некоторых примерах реализации описанных выше способов продолжительность одного или более промежутков времени, через которые определяют экспрессию маркера после приведения клеток в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, может лежать в пределах приблизительно от 1 ч до 10 дней. Например, экспрессию маркера можно определять через 1 ч после приведения клеток в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 12 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 16 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 24 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 3 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизи

- 29 011953 тельно через 4 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 5 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 7 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 9 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки или более чем через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки.

Как было описано ранее, потенциальные факторы дифференцировки для применения в описанных здесь способах можно выбрать из соединений, таких как полипептиды и молекулы небольшого размера.

Хотя каждый из описанных здесь способов был описан для ΡΩΧ1-положительных клеток энтодермы передней кишки, очевидно, что в определенных примерах реализации эти способы можно применять для получения композиций, содержащих Ρ^X1-положительные клетки передней кишки/средней кишки, которые описаны здесь, и/или Ρ^X1-положительных клеток энтодермы задней части передней кишки, которые описаны здесь. Более того, любые типы Ρ^X1-положительных клеток эктодермы, раскрытые в этом описании, можно применять для описанных здесь способов скрининга.

Ознакомившись с общим описанием этого изобретения, более полное понимание можно получить, обратившись к нескольким конкретным примерам, которые включены в настоящее описание только в качестве иллюстраций и не призваны ограничивать объем изобретения.

Примеры

Многие из приведенных ниже примеров описывают применение плюрипотентных клеток человека. Способы получения плюрипотентных клеток хорошо известны в данной области и были описаны во многих научных публикациях, включая патенты США №№ 5453357, 5670372, 5690926, 6090622, 6200806 и 6251671 а также заявку на патент США № 2004/0229350.

Пример 1. ЭС клетки человека.

Для исследований развития энтодермы использовали эмбриональные стволовые клетки человека, которые являются плюрипотентными и обладают, по-видимому, способностью неограниченно делиться в культуре, сохраняя нормальный кариотип. ЭС клетки получили из внутренней клеточной массы эмбриона возрастом 5 дней при использовании иммунологических или механических методов выделения. В частности, линию эмбриональных стволовых клеток человека 11Е8Су1-25 получили из лишнего замороженного эмбриона, полученного в цикле оплодотворения ίη νίΙΐΌ после получения информированного согласия пациента. После размораживания вылупившуюся бластоцисту помещали в чашку на эмбриональные фибробласты мыши в среде для ЭС клеток (среда ΌΜΕΜ, 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, незаменимые аминокислоты, бета-меркаптоэтанол, добавка ΙΤδ). Эмбрион адгезировался на чашке для культивирования, и через приблизительно две недели области недифференцированных ЭСКч переносили на новые чашки с мышиными эмбриональными фибробластами. Перенос выполняли при помощи механического отрезания и кратковременного расщепления диспазой с последующим механическим отделением кластеров клеток, промывкой и переносом на другую чашку. В качестве исходного материала для получения дефинитивной энтодермы применяли линию эмбриональных стволовых клеток человека НЕ8Су1-25.

Для специалиста в данной области очевидно, что в качестве исходного материала для описанных здесь процедур дифференцировки можно также использовать стволовые клетки или другие плюрипотентные клетки. Например, в качестве исходного плюрипотентного клеточного материала можно использовать клетки, полученные из гонадных валиков эмбриона, которые можно выделять известными в данной области способами.

Пример 2. Описание 11Е8Су1-25.

Линия эмбриональных стволовых клеток человека 11Е8Су1-25 сохраняла нормальные морфологию, кариотип, свойства роста и самообновление на протяжении 18 месяцев в культуре. Эта линия клеток демонстрирует мощную иммунореактивность к антигенам ОСТ4, 88ΕΑ-4 и ΤΚΑ-1-60, каждый из которых является характеристическим для недифференцированных ЭСКч, а также демонстрирует алкалинфосфатазную активность и морфологию, идентичные активности и морфологии других устойчивых линий ЭСКч. Кроме того, эта линия эмбриональных стволовых клеток человека, ЬЕ§Су1-25, также легко образует эмбриоидные тельца. Плюрипотентную природу линии 11Е8Су1-25 демонстрирует то, что она дифференцируется в клетки разных типов, присутствующих в трех основных зародышевых листках. Получение эктодермы демонстрировали при помощи количественной ПЦР на ΖΙΟ, а также иммунохимического анализа на нестин и маркеры более зрелых нейронов. Иммуноцитохимическое окрашивание на βΙΙΙ тубулин наблюдали в кластерах удлиненных клеток, отличающих ранние нейроны. Ранее мы обработали эмбриоидные тельца в суспензии ретиноевой кислотой, чтобы стимулировать дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в висцеральную энтодерму (ВЭ) - внезародышевую линию. Обработанные клетки экспрессировали высокие уровни альфа-фетопротеина (ΑΕΡ) и 8ΘΧ7 - двух маркеров висцеральной энтодермы к 54 ч после обработки. Как показало иммуноцитохимическое окрашивание, отдельные участки клеток, дифференцировавшихся в монослое, экспрессировали альфа-фетопротеин. Как

- 30 011953 будет описано ниже, клеточная линия НЕ8СуТ-25 также была способна к образованию дефинитивной энтодермы, что подтвердили способами количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и иммуноцитохимического анализа на 80Χ17, в отсутствие экспрессии ΑΓΡ. Для того чтобы продемонстрировать дифференцировку в мезодерму, проводили анализ экспрессии гена Вгасйушу в дифференцирующемся эмбриоидном тельце в нескольких временных точек. В ходе эксперимента экспрессия Вгасйушу постепенно повышалась. В свете вышесказанного, можно утверждать, что линия 11Е8СуТ-25 является плюрипотентной, что подтверждает ее способность образовывать клетки, представляющие все три зародышевых листка.

Пример 3. Получение антител 8ΘΧ17.

Главным препятствием для идентификации дефинитивной энтодермы в культурах ЭСКч является отсутствие соответствующих средств. Поэтому мы взялись за получение антител к белку 8ΘΧ17 человека.

Маркер 8ΘΧ17 экспрессируется в энтодерме и во всех ее формах, образующихся в процессе гаструляции, его экспрессия сохраняется также в кишечной трубке (хотя уровень экспрессии трубки изменяется (от переднего к заднему концу)) приблизительно до момента начала органогенеза. 8ΘΧ17 экспрессируется также в группе клеток внезародышевой энтодермы. В мезодерме и эктодерме экспрессии этого белка не наблюдали. Было обнаружено, что 8ΘΧ17, при совместном использовании с маркерами внезародышевых линий дифференцировки, является подходящим маркером дефинитивной энтодермы.

Как подробно описано в данной заявке, антитела к 8ΘΧ17 использовали для того, чтобы отдельно изучить влияние различных способов обработки и процедур дифференцировки, направленных на получение 8ΟX17-положительных клеток дефинитивной энтодермы. Эти эксперименты подробно описаны в настоящей заявке. Чтобы исключить продуцирование висцеральной и париетальной энтодермой (внезародышевой энтодермы) применяли также другие антитела, взаимодействующие с альфа-фетопротеином, 8ΡΑΚ€ и тромбомодулином.

Для того чтобы получить антитела к 8ΘΧ17, использовали часть 8ΘΧ17 человека (последовательность 8ЕО ГО N0: 1), соответствующую аминокислотам 172-414 (последовательность 8Е0 N0: 2), расположенную на С-конце белка 80Χ17 (фиг. 2). Эту часть белка использовали в компании СЕN0VАС (Фрайберг, Германия), занимающейся производством антител, для генной иммунизации мышей согласно процедурам, разработанным в этой компании. Описание процедур генной иммунизации можно найти в патентах США №№ 5830876, 5817637, 6165993 и 6261 281, а также в международных патентных публикациях №№ А0 00/29442 и АО 99/13915.

В непатентных источниках описаны также другие подходящие способы генной иммунизации. Например, Валу е! а1. описывают получение моноклональных антител путем генной иммунизации в Вю!ес11шс.|пек 16: 616-620,1994. Конкретные примеры методов генной иммунизации с целью получения антител к конкретным белкам можно найти, например, в СоЧадНа е! а1., (1998) - Сепейс бптишхабоп адабчк! !бе йцтап Шугоборт гесер!ог саикек !буго1б1бк апб а11о\ук ргобисбоп оГ топос1опа1 апбЬоб1ек гесодшхбчд !бе пабуе гесер!ог (генетическая иммунизация против рецепторов вызывает тироидит и позволяет получать моноклональные антитела, распознающие нативный рецептор), 1. Iттипо1 160: 1458-1465; К11ра!г1ск е! а1. (1998) - Сепе дип бебуегеб ΌΝΑ-Ьакеб битишхабопк теб)а!е гар1б ргобисбоп оГ типпе топос1опа1 апбЬоб1ек !о !бе Е1!-3 гесер!ог (ДНК-иммунизация методом «генной пушки» вызывает быструю наработку мышиных моноклональных антител к рецептору Е1!-3), НуЬпбота 17: 569-576; 8сбто1ке е! а1., (1998) - Шепбйсабоп оГ бераббк С уник раг!1с1ек т битап кегит Ьу Е2-крес1Пс топос1опа1 апбЬоб1ек депега!еб Ьу ΌΝΑ бптишхабоп (определение вирусных частиц гепатита С в сыворотке крови человека при помощи Е2-специфичных моноклональных антител, полученных методом иммунизации ДНК), У1го1. 72: 4541-4545; Кгакетапп е! а1., (1999) - Сепегабоп оГ топос1опа1 апбЬоб1ек адабчк! рго!еб1к тейб ап ипсопуепбопа1 пис1ею ас1б-Ьакеб бптишхабоп к!га!еду (наработка моноклональных антител к белкам с использованием нестандартной стратегии иммунизации нуклеиновой кислотой), 1. Вю!есбпо1 73: 119-129; и в иНу1еп е! а1. (1996) Сепегабоп оГ а топос1опа1 апбЬобу !о а бейпеб рогбоп оГ !бе НебоЬас!ег ру1оп уасио1абпд су!о!охп1 Ьу ΌΝΑ бптишхабоп (наработка моноклональных антител к определенным частям вакуолизирующего цитотоксина Не1юЬас!ег ру1ой путем ДНК-иммунизации), 1. Вю!есбпо1 51: 191-194.

Как показано на древовидной диаграмме отношений (фиг. 3), 80Χ7 и 80Χ18 являются самыми близкими «родственниками» 80Χ17. Мы использовали полипептид 80Χ7 человека в качестве отрицательного контроля для демонстрации того, что антитело 80Χ17 специфично к 80Χ17 и не реагирует с ближайшими родственниками этого семейства. В частности, для того чтобы продемонстрировать, что антитело, полученное путем генной иммунизации, специфично к 80Χ17, экспрессировали 80Χ7 и другие белки в фибробластах человека, а затем исследовали на кросс-реактивность способами Вестерн-блот и иммуноцитохимического окрашивания. Например, для получения векторов экспрессии 80Χ17, 80Χ7 и ЕСЕΡ применяли следующие методы: их трансфецировали в фибробласты человека и анализировали способом Вестерн-блот. Для получения 80Χ17, 80Χ7 и ЕСЕΡ использовали вектора экспрессии рСΜV6 (0пСепе ТесНпо1од1ек. Шс., Роквилль, Мэрилэнд, США), рСΜV-8ΡОКТ6 (Шухбодеп, Карлсбад, Калифорния, США) и (С1опе!есб, Пало-Альто, Калифорния, США) соответственно. Для получения белка иммортализованные при помощи теломеразы человеческие фибробласты ΜΌΧ временно трансфецировали су

- 31 011953 перскрученной ДНК в присутствии Ь1ро£ес1атше 2000 Цпуйгодеп, Карлсбад, Калифорния, США). Цельные клеточные лизаты собирали через 36 ч после трансфекции в 50 мл ΤΚΙ8-ΗΟ (рН 8), 150 мМ ЫаС1, 0,1% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0,5% деоксихолата, содержащим смесь ингибиторов протеаз (Коске О|адпо511С5 Согрогайоп, Индианаполис, Индиана, США). Клеточные белки после анализа методом Вестерн-блот (100 мкг), разделенные при помощи ПАГ с додецилсульфатом натрия (8Ό8-ΡΆ6Ε) на ηιιΡΛΟΕ (4-12% градиент полиакриламила, Шуйгодеп, Карлсбад, Калифорния, США) и перенесенные посредством электро-блоттинга на ΡΌνΡ-мембраны (Негси1е§, Калифорния, США) исследовали, используя в качестве зонда разбавленную в соотношении 1/1000 крысиную антисыворотку к 8ΘΧ17 в 10 мМ ΤΚΙ8-ΗΟ1 (рН 8), 150 мМ ИаС1, 10% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% Τ\\^η-20 (81дта, Сент-Луис, Миссури, США), а затем - алкалиновую фосфатазу, конъюгированную с антикрысиным ЦС Цаскъоп IттиηоΚе5еагс11 ЬаЬогайпек, Вест-Гроув, Пенсильвания, США), и проявляли при помощи окрашивания алкалиновой фосфатазой Vесΐо^ В1аск ^ес1ог ЬаЬога1ог1е8, Берлингейм, Калифорния, США). Использовали стандарты размеров белков с разнообразными цветными маркерами (81дта, Сент-Луис, Миссури, США).

На фиг. 4 показан результат анализа способом Вестерн-блот белковых экстрактов, сделанных из фибробластов человека, трансфецированных 8ΘΧ17, 8ΘΧ7 или Ε6ΡΡ, в качестве зонда использовали антитело к 8ΘΧ17. Только белковые экстракты из трансфецированных клеток давали полоску ~51 КДа, что достаточно близко к предсказанной молекулярной массе белка 8ΘΧ17 человека (46 КДа). Антитело 8ΘΧ17 не реагировало с экстрактами, полученными из клеток, трансфецированных 8ΘΧ7 человека или ΕΟΡΡ. Кроме того, антитела к 8ΘΧ17 метили ядра фибробластов человека, трансфецированными экспрессионным конструктами 118ΘΧ17, но не метили клетки, трансфецированные только ΕΟΡΡ. Следовательно, антитело к 8ΘΧ17 демонстрирует специфичность (иммуноцитохимия).

Пример 4. Оценка антитела к 8ΘΧ17 как маркера дефинитивной энтодермы.

Чтобы подтвердить, что антитело 8ΘΧ17 специфично к белку 8ΘΧ17 человека и, кроме того, является меткой дефинитивной энтодермы, частично дифференцированные ЭСКч метили одновременно антителами к 8ΘΧ17 и ΆΡΡ. Было показано, что в висцеральной энтодерме экспрессируются 8ΘΧ17 и 8ΘΧ7, которые являются близкими членами подгруппы Ρ семейства 8ΘΧ (фиг. 3), а также ΆΡΡ. Однако уровень экспрессии ΆΡΡ и 8ΘΧ7 в дефинитивной энтодерме недостаточно высок для того, чтобы его можно было определить иммуноцитохимическим способом, и, следовательно, их можно применять в качестве отрицательных маркеров настоящих клеток дефинитивной энтодермы. Было показано, что антитело 8ΘΧ17 метит популяции клеток, существующих в форме отдельных групп клеток или смешанных с ΆΡΡ-положительными клетками. В частности, на фиг. 5А показано, что небольшое число клеток, экспрессирующих 8ΘΧ17 (8ΘΧ17+), было также помечено ΆΡΡ; но также были обнаружены области, где среди 8ΘΧ17+ клеток присутствовало лишь незначительно число ΆΡΡ+ клеток, либо ΆΡΡ+ клетки отсутствовали (фиг. 5В). Аналогично, поскольку сообщалось, что париетальная энтодерма также экспрессирует 8ΘΧ17, для выявления клеток париетальной энтодермы можно также использовать антитела - метки на белок 8ΘΧ17 вместе с маркерами париетальной энтодермы: 8ΡΆΚΟ и/или тромбомодулин (ТМ). Как показано на фиг. 6А-С путем ненаправленной дифференцировки ЭС клеток человека получали клетки париетальной энтодермы, которые метят одновременно антитела к 8ΘΧ17 и тромбомодулину.

Результаты описанных выше экспериментов позволяют утверждать, что клетки дефинитивной энтодермы можно выявлять по следующему профилю маркеров: 8ΟΧ17^Η7ΆΡΡ¹7[ΤΜ¹° или δΡΆΚ^]. Другими словами, экспрессия маркера 8ΟΧ17 происходит на более высоком уровне, чем экспрессия маркера ΆΡΡ, который характеризуют висцеральную энтодерму, и маркеров ТМ или δΡΆΚΟ, которые характеризуют париетальную энтодерму. Соответственно, клетки, положительные по 8ΟΧ17, но отрицательные по ΆΡΡ и отрицательные по ТМ или δΡΆΚ^ представляют собой дефинитивную энтодерму.

Для получения других свидетельств того, что профиль маркеров δΟX17^ь7ΆΡΡ¹7ΤΜ¹7δΡΆΚС^1о указывает на дефинитивную энтодерму, провели количественное сравнение экспрессии генов δΟΧ17 и ΆΡΡ с относительным числом клеток, меченых антителами. Как показано на фиг. 7А, ЭСКч обрабатывали ретиноевой кислотой (стимулятор висцеральной энтодермы) или активином А (стимулятор дефинитивной энтодермы), что приводило к 10-кратной разнице в уровне экспрессии мРНК δΟΧ17. Этот результат отражал 10-кратную разницу в количестве клеток, помеченных антителом δΟΧ17 (фиг. 7В). Кроме того, как показано на фиг. 8А, обработка ЭСКч активином А подавляла экспрессию гена ΆΡΡ (альфафетопротеина): разница с экспрессией в необработанных клетках - 6,8 раз. Визуально это выражалось в резком снижении числа клеток, меченых ΆΡΡ, в этих культурах, что показано на фиг. 8В-С. В целях дальнейшего количественного анализа было показано, что это приблизительно 7-кратное снижение экспрессии гена ΆΡΡ было результатом аналогичного 7-кратного уменьшения клеток, меченых антителами к ΆΡΡ, установленного при помощи поточной цитофотометрии (фиг. 9Ά-8). Этот результат чрезвычайно важен, поскольку он указывает, что количественные изменения экспрессии гена, выявленные методом количественной ПЦР, отражают изменения особенностей типа клеток, которые можно наблюдать при помощи окрашивания антителами.

Инкубация ЭСКч в присутствии членов семейства Ыо6а1 (Хо6а1, активин А и активин В - ΝΆΆ) приводила по прошествии некоторого времени к существенному увеличению числа клеток, которые метят антитела δΟΧ17. На 5 день непрерывной обработки активином более 50% клеток оказывались мече

- 32 011953 ными 8ОХ17 (фиг. 10А-Е). После 5 дней обработки активином меченых АРР клеток было мало, либо они отсутствовали.

В результате, антитела, полученные к 242 аминокислотам С-конца белка 8ОХ17, на иммуноблоте (Вестерн-блот) идентифицировали белок 8ОХ17, но не распознавали 8ОХ7, который является наиболее близким к 8ОХ17 членом семейства 8ОХ. Антитело 8ОХ17 распознавало подгруппу клеток в дифференцирующихся культурах ЭСКч, основную часть которых (более 95% меченых клеток) составляли клетки 8ох17+/АЕР^1о/-, а небольшую часть (<5%) - клетки, меченые одновременно по 8ОХ17 и АЕР (висцеральная энтодерма). Обработка культур ЭСКч активинами приводила заметному увеличению экспрессии гена, а также числа клеток, меченых по 8ОХ17, и резко подавляла экспрессию мРНК альфа-фетопротеина и число клеток, меченых антителом к АЕР.

Пример 5. Анализ экспрессии генов посредством количественной ПЦР.

В следующих экспериментах для выявления влияния различных способов обработки на дифференцировку ЭСКч использовали главным образом метод количественной ПЦР в реальном времени. В частности, способом количественной ПЦР проводили измерения экспрессии множественных маркерных генов в режиме реального времени в множественные моменты времени. Для лучшего понимания общей динамики популяций клеток исследовали маркерные гены, отличающие как желательные, так и нежелательные типы клеток. Сильная сторона анализа при помощи количественной ПЦР заключается в его исключительной чувствительности и относительной легкости разработки необходимых маркеров, поскольку геномные последовательности легко доступны. Кроме того, исключительная чувствительность количественной ПЦР позволяет детектировать экспрессию гена в сравнительно небольшом числе клеток внутри значительно большей популяции. Дополнительно, возможность определять очень низкие уровни экспрессии генов дает указания на «склонность к дифференцировке по той или иной линии» в популяции. Склонность к какому-либо конкретному пути дифференцировки, предшествующую выделению соответствующих клеточных фенотипов, невозможно распознать иммунохимическими методами. По этой причине количественная ПЦР обеспечивает способ анализа, который по меньшей мере в некоторой степени, а, возможно, и значительно превосходит иммунохимические методики в отслеживании успеха различных способов обработки, которые должны вызвать дифференцировку. Дополнительно, количественная ПЦР обеспечивает механизм оценки успеха протокола дифференцировки в количественном формате для средних масштабов производительности.

В данном случае применяли подход, заключающийся в проведении сравнительного подсчета с использованием реагента 8ΥΒΚ Сгееп на анализаторе Ко1ог Сепе 3000 (СогЬей Кекеагсй) и двухступенчатой ПЦР в реальном времени. Такой подход позволил наработать образцы кДНК для проведения в будущем анализа дополнительных маркерных генов, что позволяет избежать различий в обратной транскрипции между образцами.

Праймеры были подобраны таким образом, чтобы они, где это возможно, перекрывали границы или охватывали интроны размером по меньшей мере 800 пар оснований, поскольку эмпирически было установлено, что это предохраняет амплификацию от контаминирующей геномной ДНК. При использовании генов, которые на содержат интроны или имеют псевдогены, проводили обработку образцов РНК дезоксирибонуклеазой 1.

Мы рутинно использовали количественную ПЦР для измерения экспрессии множественных маркеров целевых и нецелевых типов клеток с целью получить общий профиль экспрессии генов в образцах клеток. Маркеры, относящиеся к ранним фазам дифференцировки ЭСКч (а именно - эктодерме, мезодерме, дефинитивной энтодерме и внезародышевой энтодерме), для которых доступны утвержденные наборы праймеров, перечислены ниже в табл. 1. Т1е 1итап кресШсйу оГ Леке рптег ке!к 1ак а1ко Ьееп йетопк1га1ей. Также была продемонстрирована специфичность этих маркеров к клеткам человека. Это важно, поскольку ЭСКч часто выращивают на слоях фидерных клеток мышей. В большинстве случаев для каждого набора условий брали по три образца и анализировали их в дупликатах, чтобы оценить биологическую вариабельность, связанную с каждым количественным анализом.

Чтобы получить матрицу для ПЦР, выделяли общую РНК, используя набор КМеаку Ю1адеп), и проводили количественный анализ при использовании ШЬоСгееп (Мо1еси1аг РгоЬек). Обратную транскрипцию с 350-500 нг общей РНК проводили, используя набор для обратной транскрипции (ВюКай), содержащий смесь праймера ойдо-йТ и случайных праймеров. Дозу каждой реакционной смеси объемом 20 мкл последовательно разбавляли до общего объема 100 мкл, из которого 3 мкл использовали для приготовления доз реакционной смеси, содержащих 400 нМ прямых и обратных праймеров и 5 мкл 2Х смеси 8ΥΒΚ Сгееп так!ег т1х (О1адеп), объемом 10 мкл для количественной ПЦР. Использовали параметры цикла с двумя этапами: денатурация в течение 5 с при 85-94°С (специально подобрана с учетом температуры плавления ампликона для каждого набора праймеров), затем - 45 с отжига/удлинения при 60°С. Флуоресценцию считывали в течение последних 15 с каждой фазы удлинения. Для получения кривой стандартов использовали 3 точки (10-кратные разведения) для каждого прогона и на основании этих кривых пересчитывали пороговые циклы (С!'к) в количественные значения. Нормировали расчетные по облигатным генам («домашнего хозяйства») и вычисляли среднее и стандартные отклонения для трипликатов образцов. После завершения циклов ПЦР проводили анализ кривой плавления, чтобы удостовериться

- 33 011953 в специфичности реакции. На наличие единственного специфического продукта указывает единственный пик в положении Т_т, соответствующей ампликонам ПЦР. Дополнительно, в качестве отрицательного контроля использовали реакции, проводимые без обратной транскриптазы, в которых не происходила амплификация.

Первым этапом разработки методики количественной ПЦР было тестирование подходящих генов домашнего хозяйства (НС) в экспериментальной системе. Поскольку эти гены используют для стандартизации образцов по количеству РНК, целостности ФНК и эффективности ПЦФ в реальном времени, было важно, чтобы НС демонстрировали постоянный по времени уровень экспрессии во всех типах образцов, поскольку иначе нормировка бессмысленна. Мы измеряли уровни экспрессии следующих генов: циклофилина С (Сус1орЫйи С), гипоксантина фосфорибозилтрансферазы 1 (ΗΡΚΠ), бета-2микроглобулина, гидроксиметилбиан синтазы (ΗΜΒ8), ТАТА-связывающего белка (ТВР) и глюкоронидазы бета (СИ8) в дифференцирующихся ЭСКч. Полученные результаты показали, что уровень экспрессии гена бета-2-микроглобулина повышался по ходу дифференцировки. Поэтому мы исключили использование этого гена для нормировки. Другие гены продемонстрировали уровни экспрессии, которые были постоянными во времени и не зависели от способа обработки. Обычно мы использовали гены Сус1орЫ1ш С и СИ8 для расчета коэффициента нормировки. Использование нескольких генов «домашнего хозяйства» одновременно снижает вариабельность, связанную с процессом нормировки, и увеличивает достоверность полученных значений относительных уровней экспрессии генов.

После получения генов для нормировки проводили количественную ПЦР для определения относительных уровней экспрессии генов в образцах, полученных в результате различных видов экспериментальной обработки. Для применения выбрали маркерные гены, уровень экспрессии которых повышен в отдельных популяциях, представляющих ранние зародышевые листки, и, в частности, обратили особое внимание на группу генов, которые по-разному экспрессируются в дефинитивной энтодерме и во внезародышевой энтодерме. Эти гены, а также профили уровня их экспрессии представлены в табл. 1.

Таблица1

Зародышевый слой	Ген	Домены экспрессии

Энтодерма	80X17	дефинитивная, висцеральная и париетальная энтодерма
	М1ХЫ	энтодерма и мезодерма
	САТА4	дефинитивная и первичная энтодерма
	НИГЗЬ	дефинитивная энтодерма и первичная энтодерма, мезодерма и нервная пластинка
	08С	энтодерма и мезодерма
Внезародышевые клетки	80X7	висцеральная энтодерма
	АГР	висцеральная энтодерма, печень
	8РАКС	париетальная энтодерма
	тм	париетальная энтодермаЛгрофобласт
Эктодерма	ΖΙ01	нервная трубка, предшественники нервной ткани
Мезодерма	ВКАСН	ранняя мезодерма

Поскольку многие гены экспрессируются в более чем одном зародышевом листке, полезно сравни- 34 011953 вать уровни экспрессии разных генов в одном эксперименте. 80X17 эксперессируется в дефинитивной энтодерме и, в меньшей степени, в висцеральной и париетальной энтодерме. 80X7 и АРР эксперссируются в висцеральной энтодерме на этом раннем этапе развития. 8РАК.С и ТМ эксперссируются в париетальной энтодерме, а Вгасйушу эксперссируется в ранней мезодерме.

Было предсказано, что клетки дефинитивной энтодермы будут экспрессировать на высоком уровне мРНК 80X17 и на низком мРНК АРР и 80X7 (висцеральная энтодерма), 8РАК.С (париетальная энтодерма) и Вгасйушу (мезодерма). Кроме того, использовали 21С1, чтобы исключить также стимуляцию ранней эктодермы. Наконец, 0АТА4 и ΗΝΡ36 эксперссировались как в дефинитивной, так и во внезародышевой энтодерме, что коррелирует с экспрессией 80X17 в дефинитивной энтодерме (табл. 1). На фиг. 11-14 показаны типичные эксперименты, которые демонстрируют, как маркерные гены, описанные в табл. 1, коррелируют друг с другом в различных образцах, подчеркивая специфические профили диффренцировки в дефинитивную энтодерму, а также в клетки мезодермального и нервного типов.

Принимая во внимание приведенные выше данные, очевидно, что увеличение доз активина приведет к увеличению экспрессии гена 80X17. Кроме того, экспрессия 80X17 характеризует главным образом дефинитивную энтодерму, в отличие от внезародышевой энтодермы. Этот вывод основан на следующем наблюдении: экспрессия гена 80X17 обратно пропорциональна экспрессии генов АРР, 80X7 и 8РАРС.

Пример 6. Направленная дифференцировка ЭС клеток в дефинитивную энтодерму.

Культуры ЭС клеток человека дифференцируются случайным образом, если их культивируют в условиях, активно не поддерживающих недифференцированное состояние этих клеток. Такая гетерогенная дифференцировка приводит к образованию клеток внезародышевой энтодермы, состоящей как из париетальной, так и из висцеральной энтодермы (экспрессия АРР, 8РАРС и 80X7), а также ранних производных эктодермы и мезодермы, на что указывает экспрессия ΖΙ01 и ΝοδΙίη (эктодерма) и Вгасйушу (мезодерма). Возникновение клеток дефинитивной энтодермы обычно не исследовали и не определяли из-за отсутствия в культурах связывающихся с антителами специфических маркеров. Поэтому, а также вследствие отсутствия других средств, ранние этапы возникновения дефинитивной энтодермы в культурах ЭС клеток не были хорошо изучены. Поскольку не было хорошего реагента - антитела к клеткам дефинитивной энтодермы, исследования были сосредоточены на эктодерме и внезародышевой энтодерме. В целом, в дифферинцированных случайным образом культурах ЭС клеток число внезародышевых и нейроэктодермальных клеток значительно превышает число 80X17' клеток дефинитивной энтодермы.

В процессе роста колоний недифференцированных ЭС клеток человека на подложке из фидерных фибробластов, клетки на краю колонии принимают форму, отличающуюся от клеток, находящихся внутри колонии. Многие из клеток, возникающих у края колонии, отличаются более крупными и менее единообразными телами, а также повышенными уровнями экспрессии ОСТ4. Было показано, что в начале дифференцировки ЭС клеток в них изменяется уровень экспрессии ОСТ4, причем он может как повышаться, так и понижаться по сравнению с недифференцированными ЭС клетками. Изменение уровня экспрессии ОСТ4 в большую или меньшую сторону по сравнению с порогом недифференцированных клеток может быть признаком начальных стадий дифференцировки, выводящей клетки из плюрипотентного состояния.

При исследовании недифференцированных колоний путем иммуноцитохимического анализа 80X17 были обнаружены расположенные случайным образом на периферии и в местах слияния недифференцированных колоний ЭСКч редкие небольшие (10-15 клеток) кластеры 8ΟX17-положительных клеток. Как было упомянуто выше, рассеянные зоны на внешних границах колонии, видимо, содержат клетки, которые одними из первых дифференцируются, теряя классическую морфологию, свойственную ЭСК, по мере того как размер колонии увеличивается, и число клеток в ней растет. В более молодых, меньших по размеру и полностью недифференцированных колониях Υ (<1 мм; возраст: 4-5 дней) не было обнаружено 8ΟX17-положительных клеток, ни внутри, ни по краям колонии. А некоторые из более «старых» и крупных колоний (диаметр 1-2 мм, возраст >5 дней) содержали на периферии или внутри колонии отдельные зоны 8ΟX17-положительных, АРР-отрицательных клеток, отошедших в процессе дифференцировки от классического строения ЭСКч, описанного ранее. Поскольку это была первая разработка эффективного антитела к 80X17, появление клеток дефинитивной энтодермы в таких ранних «недифференцированных» культурах ЭСКч никогда ранее не демонстрировали.

Поскольку существует отрицательная корреляция между уровнями экспрессии генов 80X17 и 8РАК.С, определяемых методом количественной ПЦР, абсолютное большинство этих 8ΟX17-положительных, АРРотрицательных клеток должны быть отрицательными по маркерам париетальной энтодермы (что определяется при помощи одновременного мечения антителам). Это продемонстрировали отдельно для экспрессирующих ТМ клеток париетальной энтодермы (показано на фиг. 15А-В). Воздействие факторов из семейства Νοάαΐ. активинов А и В, приводило к резкому снижению интенсивности экспрессии ТМ и числа ТМположительных клеток. Результат применения тройного мечения антителами 80X17, АРР и ТМ обработанной активином культуры показал, что существуют кластеры 8ΟX17-положительных клеток, отрицательных по АРР и ТМ (фиг. 16А-Э). Это были указания на первые 8ΟX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы в дифференцирующихся культурах ЭСКч (фиг. 16А-Э и 17).

- 35 011953

При помощи антител 80X17 и количественной ПЦР, которые были описаны выше, мы исследовали ряд процедур, эффективно программирующих образование клеток 8ОХ17^Ь1/АРР¹78РАКС/ТМ¹° из ЭСКч. Мы применяли разнообразные протоколы дифференцировки, призванные увеличить число этих клеток и их пролиферативную способность, которые на популяционном уровне измеряют путем анализа экспрессии гена 80X17 методом количественной ПЦР, а на уровне отдельных клеток - путем мечения белка 80X17 антителами.

Мы были первыми, кто исследовал эффект факторов роста из семейства ΤΟΡβ, таких как Хоба1/активин/фактор морфогенеза костей, для применения в получении клеток дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток в культурах клеток ίη νίίτο. В типичных экспериментах активин А, активин В, фактор морфогенеза костей или комбинации этих факторов роста добавляли в культуры недифференцированных стволовых клеток человека линии 11Е8Су1-25. чтобы запустить процесс дифференцировки.

Как показано на фиг. 19, добавление активина А в концентрации 100 нг/мл приводило к 19кратному усилению экспрессии гена 80X17 по сравнению с недифференцированными ЭСКч на 4 день дифференцировки. Добавление активина В, второго члена семейства активинов, в сочетании с активином А, вызывало 37-кратное повышение уровня экспрессии гена 80X17 по сравнению с недифференцированными ЭСКч к 4 дню обработки комбинацией активинов. Наконец, добавление третьего члена семейства ΤΟΡβ из подгрупп ХобаРактивин/фактор морфогенеза костей, ВМР4, совместно с активином А и активином В, увеличивало уровень экспрессии 80X17 в 57 раз по сравнению с недифференцированными ЭСКч на 4 день дифференцировки (фиг. 19). При сравнении индукции 80X17 активинами и ВМР с контролями, не содержавшими в среде факторов роста, обнаружили 5-, 10- и 15-кратное усиление в день 4. К пятому дню тройная обработки активинами А, В и ВМР, уровень экспрессии 80X17 были уже в 70 раз выше, чем в ЭСКч. Эти данные указывают на то, что увеличение дозы факторов роста ЫобаРактивин семейства ТОРР приводит к увеличению уровня экспрессии 80X17.

Νοάηΐ и родственные молекулы активина А, В и ВМР содействуют экспрессии 80X17 и образованию дефинитивной энтодермы ίη νίνο и ίη νίίτο. Кроме того, добавление ВМР приводит к дополнительной индукции 80X17. Это происходит, возможно, благодаря дополнительной индукции СпрЮ, корецептора белка Νοάαΐ.

Мы продемонстрировали, что комбинация активинов А и В с ВМР4 дает дополнительное увеличение индукции 80X17 и, следовательно, образование дефинитивной энтодермы. Добавление ВМР4 на протяжении более продолжительных периодов (>4 дней), в комбинации с активином А и В, может индуцировать 80X17 в париетальной и висцеральной энтодерме так же, как в дефинитивной энтодерме. Соответственно, в некоторых способах реализации настоящего изобретения важно прекращать обработку ВМР4 в пределах 4 дней с момента добавления.

Чтобы выяснить влияние обработки фактором ТОРР на уровне отдельной клетки, исследовали период действия добавления фактора ΤΟΡβ, используя мечение антителом 80X17. Как было показано ранее на фиг. 10А-Р, имело место резкое увеличение меченых 80X17 клеток с течением времени. Подсчет относительного числа (фиг. 20) показывает более чем 20-кратное увеличение клеток, меченых по 80X17. Этот результат указывает на то, что на протяжении воздействия фактора ΤΟΡβ растет как уровень экспрессии гена 80X17, так и число клеток. Как показано на фиг. 21, после 4 дней обработки ΝοΦιΕ активином А, активином В и ВМР4, уровень индукции 80X17 достиг 168-кратного увеличения по сравнению с недифференцированными ЭСКч. Фиг. 22 показывает, что относительное число 8ОX17-положительных клеток также зависит от дозы. Дозы активина А, равные 100 нг/мл и больше, могут вызвать мощную индукцию экспрессии гена 80X17 и увеличение числа клеток.

В дополнение к членам семейства ТОРР в выделении и/или поддержании дефинитивной энтодермы могут участвовать молекулы семейства \Уп1. Применение молекул семейства \Рп1 также благоприятно сказывалось на дифференцировке ЭСКч в дейинитивную энтодерму, на что указывал повышенный уровень экспрессии гена 80X17 в образцах, которые обрабатывали активином и ^п13а, по сравнению с образцами, обработанными только активином (фиг. 23).

Все описанные выше эксперименты проводили с использованием среды для культивирования тканей, содержащей 10% сыворотки с добавлением факторов. Мы неожиданно обнаружили, что концентрация сыворотки влияла на уровень экспрессии 80X17 в присутствии добавленных активинов (фиг. 24 АС). При снижении содержания сыворотки с 10 до 2% экспрессия 80X17 утраивалась в присутствии активинов А и В.

Наконец, мы продемонстрировали, что стимулированные активином 80X17+ клетки делятся в культуре (фиг. 25А-Э). Стрелки указывают на клетки, меченые 8ОX17/РСNА/^АРI, которые находятся в состоянии митоза, о чем свидетельствуют характер меченых РСХА/0АР1 митотических пластинок и результат фазово-контрастного исследования митоза.

Пример 7. Экспрессия хемокинового рецептора 4 коррелирует с маркерами дефинитивной энтодермы, но не с маркерами мезодермы, эктодермы и висцеральной энтодермы.

Как было описано выше, дифференцировку ЭСКч можно направить по линии зародышевого слоя

- 36 011953 дефинитивной энтодермы путем применения цитокинов семейства ΤΟΡΒ, а именно подсемейства пойа1/активин. Кроме того, мы показали, что доля фетальной сыворотки крупного рогатого скота в среде для дифференцировки культуры влияет на эффективность дифференцировки ЭСКч в дефинитивную энтодерму. Это влияние таково, что при данной концентрации активина А в среде повышенные уровни фетальной сыворотки ингибируют максимальную дифференцировку в дефинитивную энтодерму. В отсутствие экзогенного активина А дифференцировка ЭСКч по пути дефинитивной энтодермы очень неэффективна, а концентрация фетальной сыворотки оказывает намного более слабое влияние на процесс дифференцировки ЭСКч.

В этих экспериментах дифференцировку ЭСКч вызывают, выращивая их на среде ΚΡΜΙ (1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния, США, № по каталогу 61870-036), дополненной 0,5, 2,0 или 10% фетальной сыворотки, либо с добавлением 100 нг/мл активина А, либо без него, в течение 6 дней. Кроме того, в течение первых трех дней дифференцировки использовали градиент от 0,5 до 2,0% фетальной сыворотки в соединении со 100 нг/мл активина А. Через 6 дней собирали образцы культуры, выращиваемой в каждом наборе условий, в репликатах и анализировали экспрессию генов методом количественной ПЦР в реальном времени. Остальные клетки фиксировали для иммунофлуоресцентного детектирования белка 80X17.

Уровни экспрессии 0X0^4 существенно различались в 7 наборах используемых условий культивирования (фиг. 26). В целом, уровень экспрессии 0X0^4 был высоким в культурах, обработанных активином А (А100), и низким в тех культурах, которые не получали экзогенного активина Α (ΝΡ). Кроме того, среди культур, обработанных А100, самый высокий уровень экспрессии 0X0^4 был при самой низкой концентрации фетальной сыворотки. Имело место заметное снижение уровня 0X0^4 в условиях с 10% фетальной сыворотки, причем относительный уровень экспрессии был выше в культурах, не обрабатываемых активином Α (ΝΡ).

Как было описано выше, экспрессия генов 80X17, Ο80, МЕКИ и ΗΝΕ3Η характеризует клетки как клетки дефинитивной энтодермы. Относительная экспрессия этих четырех генов в 7 наборах условий дифференцировки отражает экспрессию 0X0^4 (фиг. 27Α-Ό). Это указывает на то, что 0X0^4 также является маркером дефинитивной энтодермы.

Линии дифференцировки эктодермы и энтодермы можно отличить от дефинитивной энтодермы по экспрессии различных маркеров. Ранняя мезодерма экспрессирует Втасйушу и МОХ1, а возникающая нейроэктодерма экспрессирует 80X1 и ΖΙ01. Фиг. 28Α-Ό демонстрируют, что в культурах, которые не обрабатывали экзогенным активином А, повышен уровень экспрессии генов мезодермы и эктодермы, а среди культур, обработанных Активином А, в условиях с 10% фетальной сыворотки также были повышены уровни экспрессии маркеров мезодермы и эктодермы. Эти профили экспрессии противоположны экспрессии 0X0^4 и указывают на то, что уровни экспрессии 0X0^4 не были высокими в мезодерме или эктодерме, полученных из ЭСКч, на этой стадии развития.

На ранних стадиях развития млекопитающих также происходит дифференцировка внезародышевых линий клеток. Особенное значение для настоящего изобретения имеет дифференцировка висцеральной энтодермы, к которой экспрессируются многие гены, экспрессирующиеся также в дефинитивной энтодерме, включая 80X17. Чтобы отличить дефинитивную энтодерму от внезародышевой висцеральной энтодермы, следует исследовать маркер, по-разному экспрессирующийся в этих двух группах клеток. 80X7 представляет собой маркер, который экспрессируется в висцеральной энтодерме, но не экспрессируется в линии клеток дефинитивной энтодермы. Следовательно, культуры, в которых наблюдается устойчивая экспрессия гена 80X17 при отсутствии экспрессии 80X7, видимо, содержат дефинитивную, а не висцеральную энтодерму. На фиг. 28Е показано, что уровень экспрессии 80X7 высок в культурах, которые не получали активина А, экспрессия 80X7 также была повышена даже в присутствии активина А, если среда содержала 10% фетальной сыворотки. Этот рисунок экспрессии противоположен профилю экспрессии 0X0^4, что позволяет предположить, что уровень экспрессии 0X0^4 в висцеральной энтодермы невысок.

Определяли относительное число 8ΟX17-иммунореактивных клеток, присутствующих в культурах, дифференцирующихся в различных условиях, описанных выше. Когда ЭСКч дифференцировались в присутствии высокой дозы активина А и при низкой концентрации фетальной сыворотки (0,5-2,0%), 80X17+ клетки были распределены по всей культуре. Если использовали высокие дозы активина А, а фетальную сыворотку вводили в концентрации 10% (об./об.), такие клетки появлялись значительно реже и всегда в форме изолированных кластеров, а не были равномерно распределены по культуре (фиг. 29А и С, а также В и Е). Дальнейшее уменьшение числа 80X17+ клеток наблюдали в культурах, к которым не добавляли активин А. В этих условиях 80X17+ клетки также появлялись кластерами, но эти кластеры были меньше, и они были гораздо более редки, чем при обработке высокими дозами активина А и низкими дозами фетальной сыворотки (фиг. 29С и Ρ). Эти результаты показывают, что профили экспрессии 0X0^4 не только соответствуют экспрессии генов дефинитивной энтодермы, но и числу клеток дефинитивной энтодермы при каждом наборе условий.

Пример 8. Условия дифференцировки, которые увеличивают долю дефинитивной энтодермы СXСЯ4-положительных клеток.

- 37 011953

Доза активина А также влияет на эффективность получения клеток дефинитивной энтодермы из ЭСКч. Этот пример демонстрирует, что увеличение дозы активина А увеличивает долю СXКX4+ клеток в культуре.

ЭСКч подвергали дифференцировке в среде КЕМЕ дополненной 0,5-2% фетальной сыворотки (содержание увеличивалось с 0,5 до 1,0% и до 2,0% в течение первых трех дней дифференцировки) и либо 0,10 либо 100 на/мл активина А. После 7 дней дифференцировки клетки разделяли в фосфатном буферном растворе без Са²⁺/Мд²⁺, содержащем 2% ФБР и 2 мМ ЭДТА, в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки отфильтровывали через нейлоновый фильтр с размером отверстий 35 мкм, подсчитывали их количество и осаждали. Осадок ресуспендировали в небольшом объеме смеси 50% нормальной сыворотки крови человека/50% нормальной сыворотки крови осла и инкубировали в течение 2 мин на льду, чтобы блокировать сайты неспецифического связывания антител. К этой смеси добавляли анти-СXСК4 антитела мыши (АЬсат, № по каталогу аЫ0403-100) (1 мкл на 50 мкл смеси, содержащей приблизительно 10⁵ клеток) и оставляли для мечения на 45 мин на льду. Клетки промывали, добавляя 5 мл ФБР, содержащего 2% сыворотки крови человека (буфер), и осаждали. Вторую промывку 5 мл буфера проводили, когда клетки ресуспендировали в 50 мкл буфера на 10⁵ клеток. Добавляли вторичное антитело (конъюгированное с флуоресцентной меткой РГГС антимышиное антитело мыши; басккоп IттиηоКекеагсй, № по каталогу 715-096-151) в конечной концентрации 5 мкг/мл и оставляли для мечения на 30 мин, после чего дважды промывали буфером, как описано выше. Клетки ресуспендировали в буфере в концентрации 5х10⁵, а затем анализировали и разделяли на анализаторе РАС8 Уапбаде и на оборудовании для поточной цитометрии (Исследовательский институт 8спрр5 Кекеагсй ИъЦЦЦе). Клетки собирали непосредственно в лизирующий буфер (01адеп) для последующего выделения тотальной РНК для анализа экспрессии генов методом количественной ПЦР в реальном времени.

Наблюдали существенное возрастание числа СXСК4+ клеток, которое определяли при помощи проточной цитометрии, при увеличении дозы Активина А в среде для дифференцировки (фиг. 30А-С). СXСК4+ клетки - это клетки, попадающие в диапазон К4, который устанавливали при помощи контроля с использованием только вторых антител, для которого 0,2% событий попадало в диапазон К4. Увеличивающееся число СXСК4+ клеток коррелирует с устойчивым увеличением экспрессии генов дефинитивной энтодермы при увеличении дозы активина А (фиг. 31А-Э).

Пример 9. Выделение СXСК4-положительных клеток увеличивает экспрессию генов дефинитивной энтодермы и снижает число клеток, экспрессирующих маркеры мезодермы, эктодермы и висцеральной энтодермы.

СXСК4+, СXСК4- клетки, идентифицированные в примере 8, описанном выше, собирали и анализировали относительную экспрессию генов в них и в родительских популяциях одновременно.

Относительные уровни экспрессии гена СXСК4 существенно возрастали при увеличении дозы активина А (фиг. 32). Это очень хорошо коррелировало с дозозависимым увеличением числа СXСК4+ клеток (фиг. 30А-С). Также очевидно, что выделение СXСК4+ клеток из каждой популяции объясняло практически всю экспрессию гена СXСК4 в этой популяции. Это демонстрирует эффективность сортировки в потоке (РАС8) при сборе этих клеток.

Анализ экспрессии генов показал, СXСК4+ отвечают не только за большую часть экспрессии гена СXСК4, но и за экспрессию генов других маркеров дефинитивной энтодермы. Как показано на фиг. 31АΌ, СXСК4+ также обогащены по сравнению с родительской популяцией по генам 8ΘΧ17, С8С, ΗΝΕ3Β. и МКЛ. Кроме того, фракция СXСК4- клеток экспрессировала очень мало этих маркеров дефинитивной энтодермы. Более того, СXСК4+ и СXСК4- популяции демонстрировали противоположные профили экспрессии маркеров мезодермы, эктодермы и внезародышевой энтодермы. Фиг. 33Λ-Ό показывают, что в СXСК4+ клетках экспрессия генов Вгасйушу, ΜΟX1, ΖΙΟ и 8ΘΧ7 была понижена по сравнению с родительской популяцией. Экспрессия этих маркеров в родительской популяции А100 уже понижена по сравнению с популяциями, растущими в условиях с низкими дозами активина А или без активина А. Эти результаты показывают, что выделение СXСК4+ из ЭСКч, дифференцировавшихся в присутствии высокого количества активина А, дает существенно обогащенную и практически чистую популяцию.

Пример 10. Определение количества клеток дефинитивной энтодермы и популяции клеток при помощи СXК4.

Для того чтобы подтвердить достоверность определения доли клеток дефинитивной энтодермы, присутствующей в культуре клеток или популяции клеток, проведенного, как описано ранее в данной заявке, и в предварительной заявке на патент США № 60/532004, озаглавленной ИЕРЮТПУЕ ΕΝΏΘИЕКМ (дефинитивная энтодерма), зарегистрированной 23 декабря 2003 г., которая полностью включена в настоящее описание по ссылке, клетки, экспрессирующие СXСК4 и другие маркеры дефинитивной энтодермы, анализировали методом сортировки клеток, активированной флуоресценцией (РАС8).

Используя способы, аналогичные описанным выше в примерах, проводили дифференцировку ЭСКч для получения дефинитивной энтодермы. В частности, повышенные выход и частоту, демонстрируемые дифференцирующейся культурой, концентрацию сыворотки в среде контролировали следующим образом: 0,2% ФБР в день 1, 1,0% ФБР в день 2 и 2,0% РВ8 в дни 3-6. Дифференцированные культуры сортировали методом сортировки активированных флуоресценцией клеток, используя три поверхностных эпи

- 38 011953 топа: Е-кадгерин, СXСΚ4 и тромбомодулин. Популяции клеток после сортировки анализировали методом количественной ПЦР, чтобы определить относительные уровни экспрессии маркеров дефинитивной и внезародышевой энтодермы, а также других типов клеток. Сортировка клеток СXСΚ4, взятых из диффернцировавшихся оптимальным образом культур, приводила к выделению клеток дефинитивной энтодермы с чистотой более >98%.

В табл. 2 показаны результаты анализа маркеров в культуре клеток дефинитивной энтодермы, полученной из ЭСКч, проведенного описанными здесь способами.

Таблица 2 Состав культур клеток дефинитивной энтодермы

Маркер(ы)	Процент в культуре	Процент дефинитивной энтодермы	Процент внезародышевой энтодермы	Процент ЭС клеток человека
80X17	70-80	100
Тромбомодулин
	<2	0	75
АЕР	<1	0	25
СХСК4	70-80	100	0
ЕСАЭ	10	0		100
другой (ЕСАО
отр.)	10-20

Всего 100 100 100 100

В частности, табл. 2 показывает, что СXСΚ4- и 8ΟX17-положительные клетки (энтодерма) составляли 70-80% клеток культуры клеток. Из этих клеток, экспрессирующих δΟΧ17, менее 2% экспрессировали ТМ (тромбомодулин) (париетальная энтодерма) и менее 1% экспрессировали АФП (висцеральная энтодерма). Если вычесть долю ТМ-положительных и АФП-положительных клеток (комбинация париетальной и висцеральной энтодермы; всего 3%) из доли 8ΟX17/СXСΚ4-положительных клеток, можно увидеть, что приблизительно от 67 до 77% клеток в культуре представляют собой дефинитивную энтодерму. Приблизительно 10% клеток были положительными по Е-кадгерину (ΕСΑ^), который является маркером ЭСКч, и приблизительно 10-20% клеток представляли собой клетки других типов.

Мы обнаружили, что можно повысить степень чистоты клеток дефинитивной энтодермы в дифференцирующихся культурах клеток, получаемых перед разделением методом ΕΑСδ, по сравнению с описанными выше процедурами с использованием низких концентраций сыворотки путем поддержании концентрации ФБР на уровне <0,5% на протяжении 5-6-дневной процедуры дифференцировки. Однако поддержание культуры клеток при <0,5% на протяжении 5-6-дневной процедуры дифференцировки также приводит к снижению общего числа получаемых клеток дефинитивной энтодермы.

Клетки дефинитивной энтодермы, полученные описанными здесь способами, поддерживали и размножали в культуре в присутствии активина на протяжении более чем 50 дней, без существенной дифференцировки. В таких случаях экспрессия δΟΧ17, СXСΚ4, ΜΙΧΕ1, СΑΤΑ4, ΗΝΕ3 сохраняется в течение периода культивирования. Кроме того, ΤΜ, 8ΡΑΚ£, ΑΕΡ, δΟΧ7, ΖΙΟ и ВΚΑСΗ в этих культурах не были выявлены. Очевидно, такие культуры можно поддерживать и размножать без существенной дифференцировки на протяжении периодов времени, значительно более продолжительных чем 50 дней.

Пример 11. Дополнительные маркеры клеток дефинитивной энтодермы.

В описанном ниже эксперименте из очищенной дефинитивной энтодермы и эмбриональных стволовых клеток человека выделяли РНК. Затем анализировали экспрессию генов путем анализа РНК из каждой очищенной популяции при помощи генных чипов. Для дальнейшего исследования потенциала генов, экспрессируемых в дефинитивной энтодерме, но не экспрессируемых в эмбриональных стволовых клетках, в качестве маркеров дефинитивной энтодермы, проводили количественную ПЦР.

Эмбриональные стволовые клетки человека ЭСКч поддерживали в среде ΌΜΕΜ/Ε12, дополненной 20% заменителя сыворотки Кпос1сОи!, 4 нг/мл основной формы рекомбинантного фактора роста фибробластов (ВЕСЕ), 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, Ь-глутамином, не незаменимыми аминокислотами и пенициллином/стрептомицином. ЭСКч дифференцировались в дефинитивную энтодерму в результате культивирования в течение 5 дней в среде ΚΡΜΙ, дополненной 100 нг/мл рекомбинантного активина А, фетальной сывороткой крупного рогатого скота и пенициллином/стрептомицином. Концентрацию фетальной сыворотки меняли каждый день следующим образом: 0,1% (первый день), 0,2% (второй день), 2% (дни 3-5).

Для того чтобы получить очищенные популяции ЭСКч и дефинитивной энтодермы для анализа

- 39 011953 экспрессии генов, клетки выделяли методом сортировки активированных флуоресценцией клеток (ЕАС8). Иммуно-очистку проводили при помощи антигена 88ЕЛ4 (Κ&Ό 8ув!етв, № по каталогу ЕАВ1435Р) для получения ЭСКч, и при помощи СХСК4 (Κ&Ό 8ув!етв, № по каталогу ЕАВ170Р) для получения дефинитивной энтодермы. Клетки разделяли в смеси трипсин/ЭДТА (Ιηνίίτο^η, № по каталогу 25300-054), промывали в фосфатном буферном растворе (ФБР), содержащем 2% сыворотки крови человека и ресуспендировали в 100% сыворотки крови человека на льду, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Окрашивание проводили в течение 30 мин на льду путем добавления 200 мкг антитела, конъюгированного с фикоэритрином, к 5х10⁶ клеток в 800 мкл сыворотки крови человека. Клетки дважды промывали в 8 мл буфера ФБР и ресуспендировали в 1 мл того же буфера. Выделение метода ЕАС8 на оборудовании института ТНе Зспррв КевеагсЕ ΙηδΙίΙιιΝ ЕАС8 Уайаде (ΒΌ В^аемев). Клетки собирали непосредственно в лизирующий буфер КЕТ и выделяли РНК, используя рибонуклеазу и следуя инструкциям производителя (^адеи).

Очищенную РНК подвергали анализу экспрессии в дупликатах (Εχρκββίοη Аηа1уδ^δ, ОигЕат, Северная Каролина, США) на оборудовании Айуте!пх при использовании матриц олигонуклеотидов высокой плотности И133 Р1ив 2,0. Представленные результаты представляют собой групповое сравнение, которое выделяет гены, по-разному экспрессирующиеся в двух популяциях - ЭСКч и в дефинитивной энтодерме. В качестве возможных маркеров, хорошо характеризующих дефинитивную энтодерму, выбирали гены, которые демонстрировали устойчивое увеличение уровня экспрессии по сравнению с ЭСКч. Выбранные гены анализировали методом количественной ПЦР, как было описано выше, чтобы подтвердить изменения экспрессии генов, выявленные на генных чипах, а также для того, чтобы исследовать профиль экспрессии этих генов в ходе дифференцировки ЭСКч.

На фиг. 34А-М показаны результаты экспрессии генов для определенных маркеров. Показаны результаты для культур клеток, которые анализировали через 1, 3 и 5 дней после добавления 100 нг/мл активина А, экспрессирующей СХСК4 дефинитивной энтодермы, очищенной к концу пятого дня процедуры дифференцировки (СХОЕ), и в очищенных эмбриональных стволовых клетках человека (ЭСКч). Сравнение фиг. 34С и С-Μ показывает, что шесть маркерных генов ЕСЕ17, У^Е, САЬСК, СМКОК1 и СК1Р1 демонстрируют профили экспрессии, практически идентичные друг другу, а также профилям экспрессии СХСК4 и 8ОХ17/8ОХ7. Как было описано выше, 8ОХ17 экспрессируется как в дефинитивной энтодерме, так и в экспрессирующей 8ОХ7 внезародышевой энтодерме. Поскольку 8ОХ7 не экспрессируется в дефинитивной энтодерме, отношение 8ОХ17/8ОХ7 является надежной оценкой вклада дефинитивной энтодермы в экспрессию 8ОХ17, зафиксированной в целой популяции, энтодермы в экспрессию 8ОХ17, зафиксированной в целой популяции. Сходство рисунков С-Ь и Μ с рисунком С указывает на то, что ЕСЕ17, У^Е, САЬСК и СК1Р1, очевидно, являются маркерами дефинитивной энтодермы, и что они являются подходящими маркерами дефинитивной энтодермы, и что их экспрессия в клетках внезародышевой энтодермы незначительна.

Очевидно, что результаты, полученные при помощи количественной ПЦР, можно подтвердить при помощи иммуноцитохимии.

Пример 12. Ретиноевая кислота и ЕСЕ-10 стимулируют образование РЭХЕ в частности, в культурах дефинитивной энтодермы.

Следующий эксперимент демонстрирует, что ретиноевая кислота и ЕСЕ-10 стимулируют экспрессию РЭХ1 в клетках дефинитивной энтодермы.

Эмбриональные стволовые клетки человека культивировали с активинами или без них в течение 4 дней. На четвертый день в культуру клеток добавляли 1 мкМ ретиноевой кислоты и 50 нг/мл ЕСЕ-10. Через 48 ч после добавления ретиноевой кислоты/ЕСЕ-10 определяли экспрессию маркерного гена РЭХ1 и других маркерных генов посредством количественной ПЦР.

Обработка дефинитивной энтодермы ретиноевой кислотой вызывала устойчивое повышение экспрессии гена РЭХ1 (см. фиг. 35) без повышения экспрессии генов маркеров висцеральной энтодермы (8ОХ7, АЕР), нервных клеток (8ОХ1, 21С1) или нейронов (^Μ) (см. фиг. 36А-Е). В результате стимуляции экспрессия гена РЭХ1 повысилась до уровня, приблизительно в 500 раз превышающего уровень, который наблюдали в дефинитивной энтодерме через 48 ч после добавления 1 мкМ ретиноевой кислоты и 50 нг/мл ЕСЕ-10. Кроме того, эти результаты показывают, что существенная стимуляция РЭХ1 имела место только в тех культурах клеток, которые предварительно подвергали дифференцировке в дефинитивную энтодерму (8ОХ17), на что указывает тот факт, что в обработанных активином культурах клеток обнаружили в 160 раз более высокий уровень экспрессии РОХЕ чем в культурах, которые не обрабатывали активином перед применением ретиноевой кислоты.

Пример 13. ЕСЕ-10 обеспечивает дополнительное увеличение экспрессии РОХ1 по сравнению с ретиноевой кислотой, применяемой отдельно.

Этот пример показывает, что комбинация ретиноевой кислоты и ЕСЕ-10 стимулирует экспрессию РОХ1 в большей степени, чем только ретиноевая кислота.

Как и в предыдущем примере, ЭСКч культивировали с активинами или без них в течение четырех дней. На четвертый день клетки обрабатывали одним из следующих веществ: 1 мкМ ретиноевой кислоты (в отсутствие других веществ); 1 мкМ ретиноевой кислоты в комбинации с ЕСЕ-4, либо с ЕСЕ-10; или 1

- 40 011953 мкМ ретиноевой кислоты в комбинации с обоими факторами ЕСЕ-4 и ЕСЕ-10. Экспрессию ΡΌΧ1, 8ΟΧ7 и ΝΡΜ измеряли посредством количественной ПЦР через девяносто часов после добавления ретиноевой кислоты или комбинации ретиноевая кислота/ЕСЕ.

Обработка культур ЭСКч активином с последующей обработкой ретиноевой кислотой вызывала 60кратное увеличение экспрессии гена ΡΌΧ1. Дополнение обработки ретиноевой кислотой добавлением ЕСЕ-4 вызывало несколько более высокую экспрессию ΡΌΧ1 (приблизительно в 3 раза выше, чем одна ретиноевая кислота). Однако добавление одновременно ЕСЕ-10 и ретиноевой кислоты приводило к еще большей стимуляции экспрессии ΡΌΧ1 по сравнению с обработкой только ретиноевой кислотой (60кратное увеличение по сравнению с фиг. 37А). Эта очень устойчивая стимуляция ΡΌΧ1 в 1400-раз превосходила стимуляцию без обработки активином и/или обработку комбинацией ретиноевая кислоты/ЕСЕ. Интересно, что добавление ЕСЕ-4 и ЕСЕ-10 одновременно уничтожало положительный эффект ЕСЕ-10, давая лишь умеренное повышение уровня ΡΌΧ1 за счет добавления ЕСЕ-4.

Добавление комбинаций ретиноевая кислота/ЕСЕ-4 или ретиноевая кислота/ЕСЕ-10 не приводило к повышению уровня экспрессии маркерных генов, не связанных с энтодермой передней кишки, по сравнению с клетками, которые не подвергали воздействию комбинаций ретиноевая кислота/ЕСЕ (см. фиг. 37В-С).

Пример 14. Доза ретиноевой кислоты влияет на положение на передне-задней оси (А-Р) ίη νίίΓΟ.

Чтобы определить, влияет ли доза ретиноевой кислоты на положение А-Р в культурах клеток ίη νίίτο, провели следующие эксперименты.

Эмбриональные стволовые клетки человека культивировали с активинами или без них в течение четырех дней. На четвертый день в культуру добавляли ЕСЕ-10 в концентрации 50 нг/мл в комбинации с ретиноевой кислотой в количестве 0,04, 0,2 или 1,0 мкМ. Экспрессию гена маркера ΡΌΧ1, а также других маркеров, не специфичных для энтодермы передней кишки, измеряли посредством количественной ПЦР.

Добавление различных доз ретиноевой кислоты в комбинации с ЕСЕ-10 в концентрации 50 нг/мл давало дифференциальные профили экспрессии, которые коррелировали со специфическими профилями положения на передне-задней оси. Самая высокая доза ретиноевой кислоты (1 мкМ) стимулировала главным образом экспрессию маркера энтодермы передней части (НОХАЗ), а также давала наиболее устойчивое увеличение по ΡΌΧ1 (фиг. 38А-В). Средняя доза ретиноевой кислоты (0,2 мкМ) стимулировала маркеры энтодермы средней кишки ^ΌΧ1, НОХС6) (см. фиг. 38С и 41Е), в то время как самая низкая доза ретиноевой кислоты (0,04 мкМ) стимулировала главным образом маркер энтодермы задней кишки (НОХА13) (см. фиг. 38Ό). Доза ретиноевой кислоты не оказывала существенного влияния на относительную экспрессию маркеров нервных клеток (8ΟΧ1) или нейронов (ΝΡΜ) (см. фиг. 38Е-С). Этот пример освещает применение ретиноевой кислоты в качестве морфогена ίη ν Иго и, в частности, в качестве морфогена форм энтодермы, производных от дифференцирующихся ЭСКч.

Пример 15. Применение добавки В27 усиливает экспрессию ΡΌΧ1.

На экспрессию ΡΌΧ1 в дефинитивной энтодерме можно влиять посредством применения ряда факторов, и также условий выращивания/дифференцировки клеток. В описанном ниже эксперименте мы показали, что добавка В27 усиливает экспрессию ΡΌΧ1 в клетках дефинитивной энтодермы.

Дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму стимулировали посредством обработки недифференцированных ЭС клеток человека, выращиваемых на фидерных фибробластах мыши с высокими дозами активина А (100-200 нг/мл в 0,5-2% фетальной сыворотιαι/ΌΜΕΜ/Ε12) в течение 4 дней. Контроль без активина А выращивали в 0,5-2% эмбриональной сыворотки/^ΜΕΜ/Е12 без добавления активина А. Через 4 дня к культурам добавляли либо 2% фетальной сыворотки без активина А (попе) и 2% заменителя сыворотки без активина Α (8К.). либо 50 нг/мл активина А совместно с 2 мкМ ретиноевой кислоты и 50 нг/мл ЕСЕ-10 ΌΜΕΜ с 2% фетальной сыворотки /Е12 (попе, +ЕВ8, +В27) или в 2% заменителя сыворотки (8К). Добавку В27 (С1Ьсо/ВКЬ) добавляли в разведении 1/50 непосредственно в ΌΜΕΜ с 2% фетальной сыворотки /Е12 (+В27). Для каждой точки брали образцы клеток в дупликатах и выделяли тотальную РНК для анализа посредством ПЦР, который проводили, как описано ранее.

Фиг. 39А-Е демонстрирует, что добавка В27 без сыворотки обеспечивала дополнительное преимущество для стимуляции экспрессии гена ΡΌΧ1 без стимуляции увеличения экспрессии маркерных генов, не специфичных для энтодермы передней кишки, по сравнению с экспрессией этих маркерных генов в клетках, выращенных без сыворотки.

Пример 16. Применение активина В для усиления стимуляции ΡΌΧ1.

Этот пример показывает, что применение активина В усиливает дифференцировку ΡΌΧΙотрицательных клеток в ΡΌΧΙ-положительные клетки в ίη νίίΐΌ культуре клеток.

Дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму стимулировали посредством обработки недифференцированных ЭСКч, выращиваемых на фидерных фибробластах мыши, высокими дозами активина А (50 нг/мл) в ΚΡΜΓ с низким содержанием сыворотки в течение 6 дней. Доза фетальной сыворотки составляла 0% в первый день, 0,2% во второй день и 2% в дни 3-6. Отрицательный контроль образования дефинитивной энтодермы (ΝΡ) получали в ΚΡΜΙ с 2% фетальной сыворотки без добавления активина А. Для того чтобы стимулировать экспрессию ΡΌΧ1, в каждую из

- 41 011953 культур в день 6 добавляли ретиноевую кислоту в количестве 2 мкМ в среде КРМ1 с 2% фетальной сыворотки. В культуры, обработанные активином А, в дни с первого по пятый добавляли активин А и активин В в различных комбинациях дозирования либо продолжали обработку одним активином А в концентрации 50 нг/мл. В контрольную культуру без активина А (ЫЕ) не добавляли ни активин А, ни активин В. Такую обработку ретиноевой кислотой/активинами проводили в течение 3 дней, после чего измеряли экспрессию гена Р^X1 способом количественной ПЦР по образцам клеток в дупликатах.

Фиг. 40А показывает, что добавление активина В в дозах, лежащих в пределах от 10-50 нг/мл (а10, а25 и а50) в присутствии 25 нг/мл (А25) или 50 нг/мл (А50) активина А, увеличивает уровень экспрессии Р^X1 по меньшей мере в 2 раза по сравнению с культурой, в которую добавляли только активин А в концентрации 50 нг/мл. Увеличение количества Р^X1 в результате добавления активина В происходило без увеличения экспрессии НЫЕ6 (см. фиг. 40В), который является на этой стадии развития маркером печени, а также поджелудочной железы. Этот результат позволяет сделать предположение об увеличении доли клеток, дифференцирующихся в клетки поджелудочной железы по сравнению с клетками печени.

Пример 17. Применение дозы сыворотки для усиления стимуляции Р^X1.

На экспрессию Р^X1 в дефинитивной энтодерме влияет количество сыворотки, присутствующее в культуре клеток на протяжении процесса дифференцировки. Следующий эксперимент показывает, что уровень сыворотки в культуре в ходе дифференцировки ЭСКч в Р^X1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы влияет на экспрессию Р^X1 в ходе дальнейшей дифференцировки этих клеток в Р^X1-положительную энтодерму.

Дифференцировку эмриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму стимулировали посредством обработки недифференцированных ЭСКч, выращенных на слое фидерных фибробластов высокими дозами активина А (100 нг/мл) в среде КРМ1 с низким содержанием сыворотки в течение 5 дней. Доза фетальной сыворотки составляла 0,1% в первый день, 0,5% во второй день и 0,5%, или 2%, или 10% в дни 3-5. Ежедневная дозировка КРМ1 с фетальной сывороткой для контроля без активина А (ЫЕ) была такой же, но без добавления активина А. Экспрессию Р^X1 стимулировали, начиная с 6 дня, посредством добавления ретиноевой кислоты. Ретиноевую кислоту добавляли в культуру по следующей схеме: 2 мкМ в КРМ1 с 0,5% фетальной сыворотке в дни 6-7, 1 мкМ в день 8 и 0,2 мкМ в дни 911. В ходе обработки ретиноевой кислотой дозу активина А снижали до 50 нг/мл, а в контроль без активина А (ЫЕ) активин А не добавляли.

Фиг. 41А показывает, что добавление эмбриональной сыворотки на протяжении 3-дневного периода стимуляции дефинитивной энтодермы (дни 3, 4 и 5) обладало устойчивой способностью стимулировать экспрессию гена Р^X1 на протяжении обработки ретиноевой кислотой. При этом значительных изменений характера экспрессии генов ΖΙί1 (фиг. 41В) или 80X7 (фиг. 41С) отмечено не было.

Пример 18. Применения кондиционированной среды для усиления стимуляции Р^X1.

Мы также исследовали другие факторы и условия выращивания, которые влияют на экспрессию Р^X1 в клетках дефинитивной энтодермы. Следующий эксперимент показывает влияние кондиционированной среды на дифференцировку Р^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в Р^X1положительные клетки энтодермы.

Дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму стимулировали посредством обработки недифференцированных ЭСКч, выращенных на слое фидерных фибробластов высокими дозами активина А (100 нг/мл) в среде КРМ1 с низким содержанием сыворотки в течение 5 дней. Доза фетальной сыворотки составляла 0,2% в первый день, 0,5% во второй день и 2% в дни 3-5.

Дифференцировку культур дефинитивной энтодермы, полученных в результате обработки активином А в течение 5 дней, в Р^X1-экспрессирующую энтодерму стимулировали посредством добавления ретиноевой кислоты в среде КРМ1 с 2% фетальной сыворотки, содержащей активин А в концентрации 25 нг/мл, в течение четырех дней. Количество ретиноевой кислоты составляло 2 мкМ в первые два дня добавления, 1 мкМ на третий день и 0,5 мкМ на четвертый день. В эту базовую среду для стимуляции Р^X1 добавляли свежую среду (2А25К) или среду после кондиционирования в течение 24 ч путем контакта с разными популяциями клеток. Кондиционированную среду (СМ) получали при использовании либо фибробластов эмбрионов мыши (МЕЕСМ), либо ЭСКч, которые предварительно подвергали дифференцировке в течение 5 дней в одном из видов условий: 1) КРМ1 с 3% фетальной сыворотки (СМ2), или и) активин А (СМ3), или ш) белок морфогенеза костей 4 (ВМР4) (СМ4). Активин А или ВМР4 добавляли в среду в концентрации 100 нг/мл при режиме дозирования фетальной сыворотки, совпадающем в описанным выше (0,2%, 0,5%, 2%). Эти три схемы дифференцировки давали три очень различающиеся между собой популяции клеток человека, при помощи которых кондиционировали среду для стимуляции Р^X1. В среде с 3 % фетальной сыворотки без добавления факторов роста (ЫЕ) получили гетерогенную популяцию, содержащую большую долю клеток внезародышевой энтодермы, клетки эктодермы и мезодермы. Культура, обработанная активином А (А 100), дала большую долю дефинитивной энтодермы, а культура, обработанная ВМР4, (В100), дает, главным образом, трофэктодерму и некоторое количество внезародышевой энтодермы.

- 42 011953

Фиг. 42 А показывает, что за первые два дня обработки ретиноевой кислотой стимуляция ΡΌΧ1 была практически одинаковой в свежей и кондиционированной средах. Однако к третьему дню экспрессия ΡΌΧ1 в свежей среде и среде, кондиционированной посредством обработки мышиными фибробластами ΜΕΕ, начала снижаться. Дифференцированные ЭСКч давали кондиционированную среду, которая обеспечивала поддержание или дельнейшее увеличение экспрессии гена ΡΌΧ1 до уровней в от 3 до 4 раз выше, чем в свежей среде. Эффект поддержания высокого уровня экспрессии ΡΌΧ1 в среде, кондиционированной ЭСКч, еще более усилился на четвертый день обработки ретиноевой кислотой, благодаря чему уровень экспрессии достиг значений в 6-7 раз выше, чем в свежей среде. Фиг. 42В показывает, что обработка различными кондиционированными средами давала намного более низкие уровни экспрессии гена ΟΌΧ1 - гена, который не экспрессируется в области Ρ^X1-экспессирующей энтодермы. Это указывает на то, что обработка дефинитивной энтодермы кондиционированной средой, полученной при помощи культур ЭСКч, в значительной степени повышает общую чистоту ΡΌΧ1-экспрессирующей энтодермы.

Фиг. 43 показывает, что экспрессия гена ΡΌΧ1 демонстрировала положительный эффект дозы в отношении количества кондиционированной среды, применяемой к клеткам дефинитивной энтодермы. Общий объем среды, добавляемый в каждую чашку, составлял 5 мл, а указанное значение кондиционированной среды (см. фиг. 43) разбавляли в свежей среде (Α25Κ). Интересно, что даже всего 1 мл кондиционированной среды, добавленной в 4 мл свежей среды, сохраняет способность стимулировать и поддерживать более высокие уровни экспрессии ΡΌΧ1, чем 5 мл свежей среды без добавок. Это позволяет предположить, что положительное влияние кондиционированной среды на стимуляцию ΡΌΧ1экспрессирующей энтодермы зависит от высвобождения из клеток в кондиционированную среду некоторого вещества или веществ, и что это вещество (вещества) дозозависимым образом усиливает образование Ρ^X1-экспрессирующей энтодермы.

Пример 19. Оценка антител, которые связывают ΡΌΧ1.

Антитела, которые связывают ΡΌΧ1, представляют собой удобный инструмент для мониторинга стимулирования экспрессии ΡΌΧ1 в популяциях клеток. Этот пример показывает, что поликлональные антитела ΙβΥ кролика к ΡΌΧ1 можно применять для обнаружения присутствия этого белка.

В этом эксперименте посредством анализа способом Вестерн-блот оценивали Ι§Υ анти-Ρ^X1 (ΙβΥ α-ΡΌΧ1) антитело, связывающее ΡΌΧ1 в лизатах клеток. В этом способе анализа сравнивали связывание антитела ΙβΥ α-ΡΌΧ1 с 50 мкг цельного лизата клеток из фибробластов человека ΜΌΧ12 или клеток ΜΌΧ12, трансфецированных за 24 ч до проведения анализа вектором экспрессии ΡΌΧ1. Клеточные белки после анализа методом Вестерн-блот (100 мкг), разделенные при помощи ПАР с додецилсульфатом натрия (8Ό8-ΡΑΟΕ), переносили при помощи электро-блоттинга на мембрану и исследовали, используя в качестве зонда ΙβΥ α-ΡΌΧ1 первичную антисыворотку, после чего следовала обработка щелочной фосфатазой, конъюгированной с вторичными антителами анти-ΙβΥ кролика (КЬ α-Ι§Υ). На отдельные полоски мембраны наносили различные разведения первичных и вторичных антител в следующих комбинациях: А (500х разведение первичных, 10,000х разведение вторичных), В (2,000х, 10,000х), С (500х, 40,000х), Ό (2,000х, 40,000), Е (8,000х, 40,000х).

Определяли связывание в клетках, трансфецированных вектором экспрессии ΡΌΧ1 (ΡΌΧ1положительных), при всех возможных комбинациях исследуемых антител. Связывание наблюдали только в не подвергавшихся трансфекции (Ρ^X1-отрицательных) фибробластах при одновременном использовании самых высоких концентраций как первичного, так и вторичного антител (комбинация А). Такое неспецифическое связывание характеризовалось регистрацией дополнительной полосы с молекулярным весом, несколько превышающем вес ΡΌΧ1, как в подвергшихся трансфекции фибробластах, так и в фибробластах, которые трансфекции не подвергали.

Во втором эксперименте связывание поликлональным анти-Ρ^X1 (КЬ α-ΡΌΧ1) антителом кролика ΡΌΧ1 исследовали иммуноцитохимическим способом. Для того чтобы получить ΡΌΧ1экспрессирующую клетку для такого эксперимента, клетки ΜΞΙ-ν (АТСС # СКЬ-2460) подвергали временной трансфекции вектором экспрессии ΡΌΧ1-ΕΟΕΡ (сконструированным при использовании ρΕΟΕΡΝΙ, СкШесй). Трансфецированные клетки метили КЬ α-ΡΌΧ1 антисывороткой α-ΕΟΕΡ. Трансфецированные клетки визуализировали по флуоресценции ΕΟΕΡ, а также посредством иммуноцитохимического анализа на α-ΕΟΕΡ, в котором использовали вторичное антитело, конъюгированное с Су 5. Иммунофлуоресценцию ΡΌΧ1 визуализировали посредством применения α-КЬ вторичного антитела, конъюгированного с Су3.

Участки связывания КЬ α-ΡΌΧ1 и α-ΕΟΡΕ антител совпадали с экспрессией ΟΡΕ.

Пример 20. Имуноцитохимическое исследование ткани поджелудочной железы человека.

Этот пример показывает, что антитела, обладающие специфичностью к ΡΌΧ1, можно применять для идентификации Ρ^X1-положительных клеток способом иммуноцитохимии.

В первом эксперименте залитые в парафин срезы поджелудочной железы человека окрашивали на инсулин при помощи антиинсулинового (Ορ α-Ιηδ) первичного антитела морской свинки в разведении 1/200, после чего следовала обработка вторичными антителами собаки против антител морской свинки

- 43 011953 (О «-Ορ), конъюгированными с Су2 в разведении 1/100. Во втором эксперименте те же залитые в парафин срезы поджелудочной железы человека окрашивали на £0X1 при помощи первичных антител ΙβΥ «-£0X1 в разведении 1/4000, после чего следовала обработка вторичным антителом £Ь α-Ι§Υ, конъгированным с АЕ555, в разведении 1/300. Затем изображения, полученные в результате первого и второго экспериментов, совмещали. В третьем эксперименте клетки, окрашенные антителами Ι§Υ «-£0X1, окрашивали также ϋΛ£Ι (4,6-диамидино-20-фенил-индол).

Анализ срезов поджелудочной железы человека выявил присутствие интенсивного окрашивания островков Лангерганса. Хотя наиболее сильный сигнал £0X1 регистрировали от островков (инсулинположительных), слабое окрашивание наблюдали также в ацинарной такни (инсулин-отрицательная). Совместное окрашивание ОАП и £0X1 показывает, что £0X1 локализован в основном, но не исключительно, в ядре.

Пример 21. Иммунопреципитация £0X1 из клеток, обработанных ретиноевой кислотой.

Чтобы получить дополнительные подтверждения экспрессии £0X1 в клетках дефинитивной энтодермы, которые подвергли дифференцировке в присутствии ретиноевой кислоты, и отсутствия £0X1 в клетках дефинитивной энтодермы, которые не подвергали дифференцировке в присутствии ретиноевой кислоты, применяли анти-Р^X1 (£Ь «-£0X1) антитело кролика, при помощи которого проводили иммунопреципитацию £0X1 из обоих типов клеток (клеток дефинитивной энтодермы, которые подвергли дифференцировке в присутствии ретиноевой кислоты, и клеток дефинитивной энтодермы, которые не подвергали дифференцировке в присутствии ретиноевой кислоты). Иммунопреципитированную £0X1 регистрировали способом Вестерн-блот при использовании Ι§Υ «-£0X1 антитела.

Чтобы получить лизаты клеток дифференцированной и недифференцированной дефинитивной энтодермы для проведения иммунопрефипитации, ЭСКч в течение 5 дней обрабатывали активином А в концентрации 100 нг/мл в среде с низким содержанием сыворотки (дефинитивная энтодерма), после чего следовала обработка активином А в концентрации 50 нг/мл и 2 мкл ретиноевой кислоты (полностью транс-конфигурация) в течение двух дней, 1 мкМ ретиноевой кислоты в течение одного дня и 0,2 мкМ ретиноевой кислоты в течение одного дня (Р^X1-положительная энтодерма передней кишки). В качестве положительных контролей готовили лизаты клеток из клеток Μ8Ι-ν (АТСС # СКЕ-2460), трансфецированных вектором экспрессии £0X1. £0X1 иммунопреципитировали путем добавления £Ь «-£0X1 и вторичных антител, специфичных к антителам кролика, к каждому лизату. Преципитат собирали посредством центрифугирования. Иммунопреципитаты растворяли в буфере, содержащем додецилсульфат натрия, и затем загружали на полиакриламидный гель. После разделения белки переносили на мембрану способом иммуноблоттинга и подвергали контакту с зондом - первичным антителом Ι§Υ «-£0X1, после чего следовал контакт с мечеными вторичными антителами.

Иммунопреципитаты, собранные из клеток положительного контроля Μ8Ι-ν, а также из клеток, собранных в день 8 (полоска 68, три дня после начала обработки ретиноевой кислотой) и день 9 (полоска 69, четыре дня после начала обработки ретиноевой кислотой), оказались положительными по белку £0X1 (фиг. 44). Преципитаты, полученные из клеток недифференцированной дефинитивной энтодермы (т.е. клетки после 5 дней обработки активином А, обозначенные (А) на фиг. 44) и недифференцированных ЭСКч (т.е. клетки, не подвергавшиеся обработке и собранные на 5 день, обозначенные (ΝΡ) на фиг. 44), были отрицательными по белку £0X1.

Пример 22. Получение трансгенных линий ЭСКч с геном ЕСЕ£ и промотором £0X1.

Для того чтобы получить маркер £0X1 для выделения клеток, осуществили генетическое мечение Р^X1-положительных клеток энтодермы передней кишки экспрессируемым репортерным геном. Этот пример описывает конструирование вектора, содержащего репортерную кассету, которая содержит репортерный ген и регуляторную область £0X1. В этом примере также описано приготовление клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки человека, трансфецированных этим вектором, а также клеток, в геном которых встроена такая репортерная кассета.

Линии £0X1 -экспрессирующих линий клеток дефинитивной энтодермы, несущих генетическую метку в виде репортерного гена, конструировали, помещая репортерный ген СЕ£ под контроль регуляторной области (промотора) гена £0X1. Сначала получали плазмидный конструкт, в котором экспрессию ЕСЕ£ регулирует промотор гена £0X1 человека, соединяя промотор СΜV вектора ρЕСΕР-N1 (С1оп1се11) с регуляторной областью £0X1 человека (№ Генбанка АЕ192496), которая состоит из последовательности нуклеотидов, располагающейся в области от приблизительно 4,4 тыс. пар оснований (кб) в направлении 3'-5 до приблизительно 85 пар основание в направлении 5'-3' от сайта начала транскрипции £0X1. Эта область содержит описанный регуляторный элемент гена £0X1 и способна обеспечивать нормальный профиль экспрессии £0X1 у трансгенных мышей. В полученном в результате векторе экспрессию ЕЕС£ направляет промотор £0X1. В некоторых экспериментах вектор можно ввести путем трансфекции в ЭСКч.

Кассету, содержащую промотор £0X1 и ЕСЕ£, вырезали из описанного выше вектора, а затем субклонировали в вектор селекции, содержащий ген неомицин фосфотрансферазы, под контролем промотора фософоглицерат киназы-1. Эту кассету селекции фланкировали сайтами распознавания для рекомби

- 44 011953 назы йр, что позволяет удалять эту кассету. Этот вектор селекции линеаризовали, а затем вводили в ЭСКч, при помощи стандартных способов липофекции. После 10-14 дней селекции в среде С418, выделяли и размножали недифференицрованные трансгенные клоны ЭСКч.

Пример 23. Выделение Ρ^X1-положительной энтодермы передней кишки.

Следующий пример демонстрирует, что ЭСКч, содержащие промотор Ρ^X1/ΕСΕΡ кассеты, можно подвергнуть дифференцировке в Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки, а затем выделить способом активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (ЕАС8).

Содержащие промотор Ρ^X1/ΕСΕΡ трансгенные ЭСКч подвергали дифференцировке в содержащей активин А среде в течение 5 дней, а затем в среде, содержащей активин А и ретиноевую кислоту. Дифференцированные клетки собирали посредством обработки трипсином и сортировали на аппарате для ЕАС8 (Вес1оп ΩίοΚιηδοη ЕАС8 Ωίνα) непосредственно в лизирующий буфер для выделения ДНК или в фосфатный буфер (ΡΒ8). Брали образец отдельных живых клеток без сортировки по сигналу ΕСΕΡ (Ы\^ге) и отдельные живые клетки сортировали на ΕСΕΡ-положительную популяцию (СΕΡ) и СΕΡотрицательную популяцию (№§). В одном эксперименте ΕСΕΡ-положительную фракцию разделяли на две популяции одинакового размера в зависимости от интенсивности флуоресценции (высокая и низкая).

После сортировки популяции клеток анализировали посредством количественной ПЦР и иммуноцитохимическим способом. Для анализа способом количественной ПЦР РНК готовили на колонках О|;щеп КХеаку, а затем переводили в ДНК. Количественную ПЦР проводили, как описано ранее. Для иммуноцитохимического анализа клетки сортировали в ФБР, фиксировали в течение 10 мин в 4% параформальдегиде и адгезировали на стеклах при помощи центрифуги СуФкрт. Первичные антитела к цитокератину 19 (ККТ19) получали из СНепнсоп: к ядерному фактору гепатоцитов 3-бета (Η№3β) из 8аШа

С.'гих: к транспортеру глюкозы 2 (СЬИТ2) от Κ&Ό кукФшк. Для регистрации связывания первичных антител применяли соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с Е1ТС (зеленый) или родамином (красный).

Типичный результат сортировки дифференцированных клеток способом ЕАС8 показан на фиг. 45. Процент выделенных Ρ^X1-положительных клеток составил в этом примере приблизительно 7% и варьировался в зависимости от эффективности дифференцировки приблизительно от 1 до 20%.

Клетки после сортировки анализировали способом количественной ПЦР. Дифференцированные клетки продемонстрировали корреляцию флуоресценции ΕСΕΡ с эндогенной экспрессией гена ΡΌΧ1. ΕСΕΡ-положительные клетки продемонстрировали 20-кратное увеличение уровней экспрессии ΡΌΧ1 по сравнению с нефлуоресцирующими клетками (фиг. 46). Разделение клеток с высокой и низкой интенсивностью флуоресценции ΕСΕΡ указывает на корреляцию уровня экспрессии ΕСΕΡ с уровнем экспрессии ΡΌΧ1 (фиг. 47). В дополнение к анализу маркера ΡΌΧ1, отсортированные клетки анализировали способом количественной ПЦР в отношении нескольких генов, которые экспрессируют клетки энтодермы поджелудочной железы. Содержание продукта каждого из этих маркерных генов (ΝΚΧ2.2, СЬИТ2, КВТ19, Η№4α и Η№3β) в ΕСΕΡ-положительной части клеток было повышено (фиг. 48А-Е). Напротив, содержание маркеров нервных клеток ΖΙΟ и СΕΑΡ в ΕСΕΡ-положительной части клеток повышено не было (фиг. 49А и В).

При помощи иммуноцитохимического анализа было показано, что практически все выделенные Ρ^X1-положительные клетки экспрессировали ККТ19 и СЬИТ2. Для клеток линии дифференцировки энтодермы поджелудочной железы такой результат ожидаем. Окрашивание при использовании антител показало, что многие из этих клеток являются Н№3в-положительными.

Способы, композиции и оборудование, описанные в настоящей заявке, представляют собой предпочтительные способы реализации и приведены в качестве примеров, не ограничивающих объем настоящего изобретения. Возможные модификации и другие способы применения, очевидные для специалиста в данной области, входят в сущность и объем настоящего изобретения и определяются объемом описания. Соответственно, для специалиста в данной области очевидно, что в описанном здесь изобретении можно сделать разнообразные замены и модификации, не нарушая объема и сущности изобретения.

Фраза «состоящий главным образом», употребляемая ниже в формуле изобретения и во всем описании, обозначает включающий любые элементы, перечисленные после нее, и ограниченный другими элементами, которые не мешают активности или действию, указанным в описании перечисленных элементов, и не вносят в них своего вклада. Т.е. фраза «состоящий главным образом из» указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но что другие факультативные элементы могут присутствовать или отсутствовать, в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов.

Ссылки

В настоящей заявке на патент приведены ссылки на многочисленные литературные источники и патенты.

В случае некоторых источников ссылка полностью приведена в тексте. Для других источников в тексте упоминается только автор и год публикации, а полная ссылка выглядит следующим образом:

А1ехапбег, I., ВоШепЬегд, Μ., Непгу, С.Ь., апб 8Ф1шег, Ό.Υ. (1999). Сакапо\'а р1аук ап еаг1у апб еккеп

- 45 011953

Ιίαΐ го1е ίη спбобсгш ΓοπηαΙίοη ίη хсЬгаГЕН (Ген Сакапоуа играет важную роль на ранних этапах формирования энтодермы у данио-рерио). Осу Βίο1 215, 343-357.

Α1сxзη6с^, 1., зп6 8131шсг, Ό.Υ. (1999). Α пюЮсгНаг раШххау 1сз6тд 1ο αιάοώ;πη Γοηη;·ιΙίοη ίη /сЬгаГЕН (Молекулярный путь, приводящий к формированию энтодермы у данио-рерио). Сигг Βίο1 9, 1147-1157.

ΔοΚί, Т.О., Μ-ΠιΕνι, 1., 8а1п1-Е11сппс, Ь., КсЬзд11311, Μ.Κ., Ρсу^^с^ак. Ν., ап6 Кикз, Ρ.Μ. (2002). Ксди1зΙίοπ οΓ гю6а1 ЦдпаШпд ап6 ιικκαιάοώ;™! Γοηιια1ίοιι Ьу ΤΑΚΑΜ-Α, а ТСЕЬс1а-гс1а1с6 1урс I гсссрЮг (Регуляция передачи сигналов с участием белка гю6а1 и образование энтодермы через родственный ТСЕ-бета рецептор типа I ΤΑΚΑΜ-Α). Осу Βίο1 241, 273-288.

Всск, 8., Ьс ^ο6, Ι.Α., Си/шап, Μ., Бсп На1т, Ν., Ицу, Κ., Βсс^тзηи, Е., зп6 Сοηк1зт, Ό.Β. (2002). Ех^а-стЬ^ыс ргоЯакск гсди1з1с Νο6α1 к1дпа11тд 6иппд дзк1ги1з1юп (Внезародышевые протеазы регулируют передачу сигнала с участием белка Νο6α1 в ходе гаструляции). №11 Сс11 Βίο1 4, 981-985.

Βс66^ηд1οη, К.8., КзкЬЬзкк, Ρ., ап6 V^1кοη, V. (1992). ΒπκΙινιΐΓν - а дспс аГГссйпд тοи8с дзк1ги1з1юп ап6 саг1у ο^даηοдсηск^к (Кг-скушу - ген, влияющий на гаструляцию и ранний органогенез у мышей). Осу 8ирр1, 157-165.

Βο^κο, Α., Εοπβ, ΟΥ., Ν§, 8.С, ап6 Кз1пат, 8. (1994). Iкο1з1^οη ап6 си11игс οΓ шпсг сс11 такк сс11к Ггот Иитап ЫакЮсуЧк (Выделение и культивирование внутренней клеточной масс из бластоцист человека). Нит Ксрго6 9, 2110-2117.

Скапд, Η., Βγο^, С.^., зп6 Μ-1ζυ^ Μ.Μ. (2002). СспсЕс апа1ук1к οΓ Ис таттакап ύπ^Γοι™!^ дго\\111 к^Юг-ЬсЕ! кирс^Γат^1у (Генетический анализ надсемейства трансформирующих факторов роста млекопитающих). Еп^сг Ксу 23, 787-823.

^η1οη, Е.Ь., ^уοηк, Κ.Μ., Такаски, Ν., Βατώ, Κ.8., 1<1крсг1, Α., Щитаи^ В., ап6 КοЬс^1кοη, Е.1. (1994). Α рптагу гсс.|шгстсп1 Γογ ηο6з1 т 11с Γοπι-ι-Ροπ ап6 тайИспапсс οΓ 11с рпниктс к1гсак ш Ис птоикс (Основное требование к белку Νο6α1 в образовании и сохранении первичной полоски у мышей). Осус1οριικιιΐ 120, 1919-1928.

^οидаи, 8.Т., ν-гдз, Κ.Μ., Καικ, Ό.Α., 8сЫсг, Α.Ρ., ап6 Τ3Ηο1, ν.8. (2003). Т1с го1с οΓ Ис ζ^Γ-ΗΜι ^баГгсЩсй дспск ксцшИ ап6 сусИрк ίη рзбсгшпд οΓ тсксη6ο6с^т (Роль генов, родственных ΝοώιΓ у данио-рерио с косоглазием и циклопов в формировании мезэнтодермы). ПсусИртсп! 130,1837-1851.

Ес16тзп, В., Сз1ск, Μ.Α., Едап, Е.8., ^οидаη, 8.Т., КсппсЬсск, С., 81го1кт, Η.Ι., 8сЫсг, Α.Ρ., ап6 ΤαΐЬοΐ, ν.8. (1998). Ζ^γ-ΓΕΙι οι^απίζ^ бсусИртсп! зп6 дсгт-1аусг ΓοΓΐιΐ31ίοιι гсс.|шгс ηο6з1-^с1з1с6 к1дпа1к (Для развития организатора и формирования зародышевых листков у данио-рерио необходимы сигналы, связанные с белком гю6а1). №11игс 395, 181-185.

Еспд, Υ., Βγο^γ, С.С, ^п^бу, ΡΚ., зп6 Β^^, Е.Л. (1996). Ηΐν-1 сп1гу ^Γ-Ηογ: Γι.ιιι^ίοιιαΐ с^NΑ сИшпд οΓ а С р^ο1с^η-сοир1с6 гсссрЮг (Кофактор, помогающий ВИЧ-1 проникать в клетки: клонирование функциональной кДНК пересекающего мембрану 7 раз, связанного с С-белками рецептора). 8сюпсс 272, 872-877.

Еи1ак1, 8., ΗауакЬ^, Υ., ХашакИНа, Μ., Υ-βΓ Κ., Βοπο, Η., ΗауакЬ^ζак^, Υ., ΟΚ-ζαΠ, Υ., зп6 8ск1дисЫ, Κ. (2003). ΜοΕαιΙαΓ ЬакЕ οΓ сοηк1^1и1^νс рго6ис1юп οΓ Ьакстсп1 тстЬгапс сοтрοηсη1к: Сспс схргсккюп ргоП1ск οΓ спдс1Ьгс111-1ю1т-к\уагт итюг зп6 Е9 стЬ^уοηз1 сагсиюта сс11к (Молекулярная основа постоянной продукции основных компонентов мембраны: профили экспрессии генов опухоли энгельберт-холмсворм и клеток эмбриональной карциномы Е9). 1 Βίο1 СИст.

С^зр^η-Βο11οη, Α., ап6 Μ^ΐο^ Ό.Α. (2000). Еп^^тт бсусИртсп!: Γιόιιι рзбсгшпд 1ο ο^дзηοдсηск^к (Развитие энтодермы: от формирования рельефа до органогенеза). Τι^Η Сспс1 16, 124-130.

Шпак, Т.М., зп6 СЫ16к, С. (2002). СИЬа1 дспс схргсккюп ра11сгпк биппд οΓ Е9 стЬг^юпа1 сагскюта сс11к ίιι1ο ралс1з1 α'ΐάοά^Ηΐ (Общие профили экспрессии в процессе дифференцировки эмбриональных клеток карциномы Е9 в париетальную энтодерму). Еипс1 1п1сдг Ссгютюк 2, 105-119.

^дая ΒΕ. (1996). Βοικ тο^рЬοдсηс1^с рго1стк ш бсусИртсШ (Белки морфогенеза костей в процессе развития). Сшт Οр^η Сспс1 Осу 6, 432-438.

^дая В.Ь. (1997). Ρ1и^^рο1сη1 стЬ^Ыс сс11к ап6 тс11ю6к οΓ такшд катс (Плюрипотентные эмбриональные клетки и способы их получения) (υ8Α, ναιι6^όί11 Ишусгкбу).

Ηο\\Ό, С.С, Ον^οίΐ, С.С, 8а\\аскг 1., 8ο14γ, Ό., 81с1п, Ρ., ап6 81пск1ап6, 8. (1988). Ехргсккюп οΓ 8ΡЛКС/οк1сοηсс1^η 1гапкспр1 т типпс стЬг^юк ап6 дοηа6к (Экспрессия транскрипта 8ΡЛКС/остеонектин в мышиных эмбрионах и гонадах ). 01^1^1131^ 37, 20-25.

Ηи6кοη, С, С1стсп1к, Ό., Еп6зу, Κ.ν., 81ο11, Ό., зп6 Vοο61аи6, Η.Κ. (1997). Χ^χίν-φίνι ап6 -Ьс1а тс6131с α·ι6ο6^ιι·ι Γοηιΐ31ίοιι т Xсηοрик ^^хП-альфа и -бета-опосредованное формирование энтодермы у Xсηοрик). Сс11 91, 397-405.

1тз6з, Μ., 1тз6з, 8., 1\\'акакг Η., Κηπι^ Α., ΥашздисЬ^, Η., зп6 ΜοοίΌ, Е.Е. (1987). Ес1οтο6и1^η: тагксг кийасс рго1сш οΓ 4131 6сνс1οртсη1 ^Ыск 1к ™ο6η13^4 Ьу сусНс ΑΜΡ (Фетомодулин: маркерный поверхностный белок развития плода, модулируемый циклической АМФ). Όσν Βίο1 122, 483-491.

Κзηа^-Αζитз, Μ., 1<апаг Υ., Сз6, Ι.Μ., Τι.)!™-, Υ., Τ-уз, С, Κητο!™-!·-, Μ., 8апз1, Υ., Υοηска\νа. Η., ΥαζαΕί, Κ., Ταπί Ρ.Ρ., ап6 Шу-кЫ, Υ. (2002). Пср1с1юп οΓ 6^141^ ди1 α·ι6ο6^ιι·ι т 8οx17-ηи11 ти1ап1 тюс (Элиминация дефинитивной пищеварительной энтодермы у мышей - 8οx17-нулевых мутантов). Ос\'с1οртсη1 129, 2367-2379.

- 46 011953

Ка!ой, Μ. (2002). Ехргеккюп о£ йитап δΟΧ7 ίη погта1 Рззиез апй 1итог8 (Экспрессия δΟΧ7 человека в нормальных тканях и опухолях). Ш! ί Μо1 Μей 9, 363-368.

К1кисЫ, Υ., Αдаίйоη, Α., Α1еxаηйе^, 1., ТЫззе, С, ^а1йгоп, δ., Υе1оη, Ό., ТЫззе, В., апй 8!ашкг, Ό.Υ. (2001). Сазапоуа епсойез а поуе1 8ох-ге1а1ей рго!еш песеззагу апй зиГПс1еп1 Гог еаг1у спйойсгш ГогтаРоп ш хейгаПзй (Ген Сазапоуа кодирует новые белок семейства δΟΧ, необходимый и достаточный для раннего формирования энтодермы у данио-рерио). Сепез Иеу 75, 1493-1505.

К1т, С.Н., апй Вгохтеуег, Η.Ε. (1999). Сйетоктез: з1дпа1 1атрз Гог [гаГГкктд оГ Т апй В се11з Гог йеуе1ортеп1 апй еГГес1ог ГипсРоп (Хемокины: сигнальные огни для направления развития и эффекторных функций Т и В клеток). 1 Ьеикос Вк1 65,6-15.

К1те1тап, Ό., апй Сг1ГГ1п, К.1. (2000). \сг1еЬга1е тезепйойегт шйисйоп апй райегшпд (Индукция и формообразование мезэнтодермы позвоночных). Сигг Ορίπ Сепе! Иеу 10, 350-356.

КиЬо Α., 8Ыпо/ак1 К., 8йаппоп Ι.Μ., КоизкоГГ V., Кеппейу Μ., \Уоо δ., Ееййпд Η.Ι, Ке11ег С. (2004) Иеуе1ортеп! оГ йейпЫуе епйойегт Ггот етЬгуошс з!ет се11з ш си1!иге (Развитие дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток в культуре). Иеуе1ортеп!. 737,1651-62.

Китаг, Α., №уозе1оу, V., Се1ез!е, Α.Ι, ^о1Гтап, Ν.Μ, !еп ЮДке, Ρ., апй Киейп, Μ.Κ. (2001). №йа1 з1дпа11пд изез асйуш апй !гапз£огтшд дгоМй ГасЮг-Ье1а гесер!ог-геди1а!ей δтайз (Передача сигнала белком №йа1 использует активин и белки δтайз, регулируемые рецептором трансформирующего фактора роста-бета). 1 Вю1 Сйет 276, 656-661.

ЬаЬозку, Ρ.Α., Ваг1оте, Ό.Ρ., апй Йодат В.Ь. (1994а). ΕтЬ^уоη^с дегт се11 1шез апй !йе1г йепуаРоп Ггот тоизе рптогй1а1 дегт се11з (Линии эмбриональных зародышевых клеток и их развитие из первичных зародышевых клеток мыши). С1Ьа Еоипй δутр 182, 157-168; Ызсиззкп 168-178.

ЬаЬозку, Ρ.Α., Ваг1оте, Ό.Ρ., апй Модат В.Ь. (1994Ь). Μоизе етЬгуошс дегт (Έ6) се11 йпез: йапзийззкп !йгоидй !йе дегтйпе апй ййГсгепсез т !йе те!йу1айоп 1трпп! о£ тзийп-йке дго\\1й £ас!ог 2 гесер!ог (IдГ2^) депе сотрагей \уйй етЬгуошс з!ет (Εδ) се11 1шез (Линии эмбриональных зародышевых (ЭЗ): клеток мыши: передача по зародышевой линии и различия в метилировании гена инсулиноподобного фактора роста 2 (Пд2г) в сравнении с клеточными линиями эмбриональных стволовых (ЭС) клеток). Иеуе1ортеп! 720, 3197-3204.

Ьккей, Η., Ки!зсй, δ., Кап/кг, В., Татар Υ., Таке!о, Μ.Μ, апй Кет1ег, Κ. (2002). ЕогтаРоп о£ ти1!1р1е йеайз ш писе Го11о\утд йе1е!кп о£ Ье!а-са!ешп т !йе етЬгуошс епйойегт (Образование множественных сердец у мышей после делеции бета-катанина в эмбриональной энтодерме). Иеу Се11 3, 171-181.

Ьи, С.С, Вгеппап, 1., апй Ε.Ι. (2001). Егот ГегРйхакоп !о даз!ги1айоп: ах1з ГогтаРоп ш !йе тоизе етЬгуо (От оплодотворения к гаструляции: формирование оси в эмбрионе мыши). Сигг Οр^η Сепе! Иеу 77, 384-392.

Μа, О., 1опез, И., апй δр^^ηде^, ТА. (1999). Тйе сйешокше гесер!ог СXСΚ4 1з гес.|шгей Гог !йе ге!еп!кп о£ В йпеаде апй дгапи1осуйс ргесигзогз \УЙ1пп !йе Ьопе шагготе ткгоепуйоптеп! (Рецептор СXСΚ4 необходим для сохранения линии дифференцировки В и предшественников гранулоцитов в микроокружении костного мозга). Iтшишίу 10, 463-471.

ΜсС^а!й КЖ., Кошзк1 Α.Ό., ΙΥΠόν Ι<.Μ., ΜсСаηη 1.К., ИаНз 1. (1999) ΕшЬ^уоη^с ехргеззкп апй ГипсРоп о£ !йе сйетокте δ^Ε-1 апй йз гесер!ог, СXСΚ4 (Эмбриональная экспрессия и функция хемокина δ^Ε-1 и его рецептора, СXСΚ4.). Иеу Вю1. 213,442-56.

Μ^уаζоηо, К., Кизападг К., апй Шоие, Η. (2001). И1уегдепсе апй сопуегдепсе о£ ΤСΕ-Ьеίа/ВΜΡ з1дпа11пд (Дивергенция и конвергенция передачи сигналов белками - трансформирующий фактор ростабета/белок морфогенеза костей). 1 Се11 Ρйуз^о1 187, 265-276.

№дазатеа, Т., Шго1а, δ., ТасйЬапа, К., Такакига, Ν., ^зйПк-пуа, δ., КВатига, Υ., УозЫйа, Ν., К1ки!аш, Η., апй К1зй1шо!о, Т. (1996). ИеГес1з о£ В-се11 1утрйоро1ез1з апй Ьопе-тагго\у туе1оро1ез1з т тке 1асктд !йе СXС сйетокйче ΡВδΕ/δ^Ε-1 (Дефекты лимфопоэза В-клеток и миелопоэза у мышей, в организме которых отсутствуют СХС-хемокин ΡВδΕ/δ^Ε-1). №1Р1гс 382, 635-638.

№\уа, Η. (2001). Μо1еси1а^ тесйатзт !о татРап з!ет се11 гепе\уа1 о£ Εδ се11з (Молекулярный механизм поддержания стволовой клетки и воостановления эмбриональных стволовых клеток). Се11 δίπκΐ Еипс! 26, 137-148.

Οβί^-Γ Η., ΑΓπβΡ, 1., апй ΜίΥ^Υ К. (2001). Вейауюга1 айпогтайРез о£ Ζκ1 апй Ζχ2 ши1нп! тке: РирйсаРопз аз тойе1з Гог йитап пеиго1одка1 Фзогйегз (Поведенческие аномалии мышей-мутантов по генам Ζχ1 и Ζκ2: применение в качестве модели неврологических нарушений у человека). Вейау Сепе! 31, 317-324.

В.Е., Бега, ΜΕ., Еопд, Ο.Υ., Тгоипзоп, Α., апй Вопдзо, Α. (2000). ΕшЬ^уоη^с з!ет се11 йпез Ггот йитап Ь1аз!осуз!з: зотайс йгГГегепйайоп ш уВго (Линии эмбриональных стволовых клеток из бластоцисты человека: соматическая дифференцировка ш уВго). №11 Вк!есйпо1 18, 399-404.

йойатеау, Α., апй ГаРевк Κ. (2001). Μезеηйойе^ш: ап апскп! дегт 1ауег? (мезэнтодерма: древний зародышевый листок?). Се11 105, 169-172.

йойатеау, Α., Такейа, Η., КозЫйа, δ., ВгоайЬеп!, 1., кпсе, В., δш^!й, 1.С, каРенк Κ., апй ^^γ, Ν. (1999). Шйисйоп о£ !йе шсзспйойсгш ш !йе хейгаПзй дегт ппд Ьу уо1к се11-йепуей ТСЕ-Ье!а Гатйу з1дпа1з апй й1зсгйшпаРоп о£ шсзойсгш апй спйойсгш Ьу ЕСЕ (Стимуляция мезэнтоермы в зародышевом щитке

- 47 011953 динио-рерио сигналами полученных из клеток белков семейства трансформирующего фактора роста бета и дифференциации мезодермы и энтодермы фактором роста фибробластов). Ьеуе1ортеп! 126, 3067-3078.

Койг, К.В., 8сйи1!е-Мегкег, 8., апй ТаШх, Ό. (1999). ΖеЬ^аГ^кй хю1 ехргеккюп ш Ьгаш апй котйек 1к аГГес!ей Ьу ВМР апй йейдейод ЦдпаШпд (На экспрессию хю1 данио-рерио в мозге и сомитах влияет передача сигнала при участии белка морфогенеза костей и белков Нейдейод). Месй Эеу 85,147-159.

8сЫег, А.Е. (2003). №йа1 Цдпайпд ίπ гег!ейга!е йеге1ортеп! (Передача сигнала при участии белка №йа1 в развитии позвоночних). Аппи Кеу Се11 Эеу Вю1 19, 589-621.

8сйоеп\го1Е С.С, апй 8тйй, ЬЬ. (2000). Сак!ги1а!юп апй еаг1у текойегта1 райегшпд т уег!еЬга!ек (Гаструляция и раннее формирование мезодермы у позвоночных). Ме!йойк Мо1 Вю1 135, 113-125.

8йатЬ1о!!, М.Г, Ахе1тап, 1., Аапд, 8., Видд, Е.М., Ьй!1еДе1й, ЬА., Эопоуап, Р.1, В1итеп!йа1, Р.Э., Ниддтк, С.К., апй Сеагйаг!, ЙЬ. (1998). ЬепуаРоп оГ р1иг1ро1еп( к!ет се11к Ггот сийигей йитап рптогй1а1 дегт се11к (Образование плюрипотентных стволовых клеток из культивируемых первичных зародышевых клеток). Ргос Май Асай 8с1 И8А 95, 13726-13731.

8йар1го, А.М, Ьакеу, ЙК., Куап, Е.А., КогЬий, С.8., То!й, Е., Аагпоск, С.Ь., Кпе!етап, КМ., апй Ка_)ойе, Κ.ν. (2000). 1к1е! !гапкр1ап!аРоп т кеуеп райеп!к тейй !уре 1 й1аЬе!ек теййик иктд а д1исосогйсо1й-Ггее 1ттипокирргекк1уе гедтеп (Трансплантация островков у семи пациентов с сахарным диабетом 1 типа без использования глюкокортикоидов). N Епд1 1 Мей 343, 230-238.

8йарйо, А.М., Куап, Е.А., апй Ьакеу, ЬК. (2001а). Рапсгеайс 1к1е1 !гапкр1ап!айоп т !йе !геа!теп! оГ й1аЬе!ек теййик (Трансплантация островков поджелудочной железы в лечении сахарного диабета). Век! Ргас! Кек С1ш Епйосгшо1 Ме!аЬ 15, 241-264.

8йар1го, 1., Куап, Е., Аагпоск, С.Ь., Кпе!етап, КМ., Ьакеу, 1., КогЬий, С.8., апй Ка_)ойе, КА. (2001Ь). Сои1й Гссгег 1к1е1 се11к Ье !гапкр1ап!ей ш 1у ре 1 й1аЬе!ек? 1пкийп шйерепйепсе кйои1й Ье йоттап! Гогсе ш 1к1е1 !гапкр1ап!аРоп (Возможно ли трансплантировать меньше островковых клеток при диабете 1 типа? Независимость от инсулина должна быть движущей силой в трансплантации островков). Вт) 322, 861.

8йюхата, М., Нйаока, Υ., Кота!ки, Ν., Ода^а, М., 8ака1, Υ., апй А1ко, 8. (1996). С1ошпд апй сйагас!епха!юп оГ Хепорик 1аеу1к х8ох7 сЬМА (Клонирование и описание кДНК гена х8ох7 Хепорик 1аеу1к). ВюсЫт Вюрйук Ас!а 1309, 73-76.

8тйй, 1. (1997). Вгасйуигу апй !йе Т-Ьох депек (Ген Вгасйуигу и гены Т-бокса). Сигг Орт Сепе! Ьеу 7, 474-480.

8тйй, ЬС, Агтек, КА., Соп1оп, Е.Ь., Тайа, М., итЬйаиег, М., апй Аек!оп, К.М. (1997). Иркйеат апй йо\\пк!геат Ггот Вгасйуигу, а депе гедтгей Гог уег!ейга!е текойегт Гогтайоп (В направлениях 3'-5' и 5'-3' от Вгасйуигу, гена, необходимого для образования мезодермы). Со1й 8рппд НагЬ 8утр Опап! Вю1 62, 337346.

Такакй, А., Сашхагек, 1., Воппеаий, Ν., Рои1а!, Е., Майер М.С., 1ау, Р., апй Вейа, Р. (2001). 8ОХ7 !гапкспр!юп Гас!ог: кедиепсе, сйготокота1 1осайкайоп, ехргеккюп, !гапкасйуайоп апй т!егГегепсе тейй Ап! ЦдпаШпд (Транскрипционный фактор 8ОХ7: последовательность, хромосомная локализация, экспрессия, трансактивация и взаимодействие с передачей сигнала Ап!). Мис1е1с Ас1йк Кек 29, 4274-4283.

ТашдисЫ, К., Н1гаока, Υ., Ода^а, М., 8ака1, Υ., К1йо, 8., апй А1ко, 8. (1999). 1ко1а!юп апй сйагас!епхаРоп оГ а тоике 8КУ-ге1а!ей сЬМА, т8ох7 (Выделение и описание кДНК, связанной с нарушением детерминации пола, т8ох7 ). ВюсЫт Вюрйук Ас!а 1445, 225-231.

Тесйпаи, и. (2001). Вгасйуигу, !йе Ь1ак!ороге апй !йе еуо1ийоп оГ !йе текойегт (Вгасйуигу, бластопор и развитие мезодермы). Вюеккаук 23, 788-794.

Тйоткоп, ЬА., Йккоуйх-Ыйог Ь, 8йарйо, 8.8., Аакпйх, М.А., 8Мегд1е1, ЬЬ, Магкйа11, ν.8., апй 1опек, ЬМ. (1998). ЕтЬгуошс к!ет се11 йпек йепуей Ггот йитап Ь1ак!осук!к (Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека). 8аепсе 282, 1145-1147.

ТгетЬ1ау, К.Э., Ноой1екк, Р.А., В1ко£Г, Е.К., апй КоЬег!коп, Ей. (2000). Еогтайоп оГ !йе йейшйуе епйойегт 1п тоике 1к а 8тай2-йерепйеп! ргосекк (Образование дефинитивной энтодермы у мышей является 8тай2-зависимым процессом). Ьеуе1ортеп! 127, 3079-3090.

Vаπйекотре1е, 1., Ье Рге!ег, К., Ра!!уп, Е., Рорре, В., Vаπ Коу, Ν., Ье Раере, А., апй 8ре1етап, Е. (2002). Ассига!е погтайхаРоп оГ геа1-йте диапШаРуе КТ-РСК йа!а Ьу деотейгс ауегадтд оГ ти1йр1е т!егпа1 соп!го1 депек (Точная нормировка данных количественной ПЦР в режиме реального времени путем геометрического усреднения множественных генов внутреннего контроля). Сепоте Вю1 3, КЕ8ЕАКСН0034.

νρΓΚΡ I., СоШдпоп, Ь, апй КоЬег!коп, Ей. (1997). Мойа1 ехргеккюп ш !йе рптШуе епйойегт 1к гедтгей Гог кресШсайоп оГ !йе ап!епог ах1к йиппд тоике дак!ги1а!юп (Экспрессия пойа1 в первичной энтодерме необходима для выделения внешней оси в процессе гаструляции у мышей). Ьеуе1ортеп! 124, 1033-1044.

Апсеп!, 8.Ό., Эшт, КК., НауакЫ, 8., Мотк, О.Р., апй КоЬег!коп, Ей. (2003). Се11 Га!е йеакюпк \\йЫп !йе тоике огдашхег аге доуетей Ьу дгайей Мойа1 к1дпа1к (Определение судьбы клеток в организаторе у мышей управляется дифференцированными сигналами пойа1). Сепек Ьег 17, 1646-1662.

Аейег-Сие!!1ег, Н., А1гй, А.С, КауЬигп, Н., Никат, М., апй КокепЬегд, К.Ь. (1996). Ьеуе1ортеп!а11у геди1а!ей депе ехргеккюп оГ !йготЬотойийп т рокйтр1ап!айоп тоике етЬгуок (Эволюционно регулируе

- 48 011953 мая экспрессия гена тромбомодулина в эмбрионах мышей). Оеуе1ортепб 122, 2271-2281.

^ейег-Сией1ег, Н., Уи, К., 8оГГ, С., Сийак, Ь.Г, апб КокепЬегд, Ρ.Ό. (1992). ТНготЬотойи1т депе геди1айоп Ьу сΛΜΡ апб гебшок ас16 т Р9 етЬгуопа1 сагстота се11к (Регуляция гена тромбомодулина циклической АМФ и ретиноевой кислотой в клетках эмбриональной карциномы Р9). Ρ^осее6тдκ ОГ ТНе Νιб1опа1 Асабету ОГ 8скпсек ОГ ТНе Ишбей 8!абек ОГ Атенса 89, 2155-2159.

^е11к, 1.М., апб Ме1боп, ΌΑ. (1999). УейеЬгабе епбобегт 6еуе1ортепб (Развитие энтодермы позвоночных). Аппи Кеу Се11 Эеу Вю1 15, 393-410.

^е11к, 1.М., аиб Ме1боп, ΌΑ. (2000). Еаг1у тоике епбобегт ίκ райетей Ьу ко1иЬ1е Гасбогк Ггот а6)асепб дегт 1ауегк (Формирование ранней энтодермы у мышей определяют растворимые факторы прилежащих листков). Оеуе1ортепб 127, 1563-1572.

^1Шкоп, К. (1990). ТНе тоике ВгасНуигу депе ап6 текойегт Гогтабюп (Ген ВгасНуигу мышей и формирование мезодремы). Тгепйк Сепеб 6,104-105.

ΖΗ^, С.р. (2003). Сопкесщепсек оГ кпосктд оиб ВΜΡ К1дпа1тд т бНе тоике (Последствия «отключения» передачи сигнала белком морфогенеза костей у мышей). Сепек1к 35, 43-56.

Ζ^ικ Χ., 8акак1, Н., Ьо^е, Ь., Нодап, В.Ь., ап6 КиеНп, М.К. (1993). №6а1 ίκ а поуе1 ТСР-Ье!а-йке депе ехргеккеб ш бНе тоике побе Йигтд дакйи1абюп (№6а1 - новый ТСР-бета-подобный ген, экспрессирующийся в узелках в процессе гаструляции у мышей). №биге 361, 543-547.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Культура клеток, содержащая клетки человека, в которой по меньшей мере 2% указанных клеток человека представляют собой панкреатический и дуоденальный гомеобокссодержащий фактор-1 (ΡΌΧ1) - положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные ΡΌΧ1-положительные клетки энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.
2. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что по меньшей мере приблизительно 5% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.
3. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что по меньшей мере приблизительно 10% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.
4. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что по меньшей мере приблизительно 25% указанных клеток человека представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.
5. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что в указанной культуре присутствуют фидерные клетки человека и по меньшей мере приблизительно 2% клеток человека, не являющихся указанными фидерными клетками человека, представляют собой Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.
6. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют гомеобокссодержащий ген А13 (НОХА13).
7. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют гомеобокссодержащий ген С6 (НОХС6).
8. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют 8ОX17.
9. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанные Ρ^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ΡΌΧ1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из альфа-фетопротеина (АРΡ), 8ОX7, 8ОX1, ΖΙί,Ί и ММ.
10. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанная культура клеток практически свободна от клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток висцеральной энтодермы, клеток париетальной энтодермы и нервных клеток.
11. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы.
12. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 Ρ^X1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы.
13. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 Ρ^X1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 4 клетки Ρ^X1-отрицательной дефинитивной энтодермы.
14. Культура клеток по п.1, которая дополнительно содержит эмбриональную стволовую клетку.
15. Культура клеток по п.14, отличающаяся тем, что указанная эмбриональная стволовая клетка получена из ткани, выбранной группы, состоящей из морулы, внутренней массы клеток эмбриона и гонадных валиков эмбриона.
16. Культура клеток по п.1, которая дополнительно содержит ретиноид.
17. Культура клеток по п.16, отличающаяся тем, что ретиноид представляет собой ретиноевую ки

- 49 011953 слоту (КА).
18. Культура клеток по п.1, которая дополнительно содержит фактор роста фибробластов РОР-10.
19. Культура клеток по п.1, которая дополнительно содержит В27.
20. Культура клеток по п.1, которая дополнительно содержит и КА и РОР-10.
21. Культура клеток по п.20, которая дополнительно содержит В27.
22. Популяция клеток, содержащая клетки, причем по меньшей мере приблизительно 90% указанных клеток представляют собой 1’11X1 -положительные клетки энтодермы передней кишки человека, причем указанные 1’11X1-1 положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки.
23. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что по меньшей мере приблизительно 95% указанных клеток представляют собой ГОУ] -положительные клетки энтодермы передней кишки.
24. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что по меньшей мере приблизительно 98% указанных клеток представляют собой Р^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки.
25. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что указанные Р^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген НОХА13.
26. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что указанные Р^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген НОХС6.
27. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что указанные Р^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют 80X17.
28. Популяция клеток по п.22, отличающаяся тем, что указанные Р^X1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют 1’11X1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из АРР, 80X7, 80X1, ΖΙ^1 и ΝΓΜ.