KR20220058531A

KR20220058531A - 미성숙 난모세포의 유도 방법 및 성숙 난모세포의 제작 방법

Info

Publication number: KR20220058531A
Application number: KR1020227004668A
Authority: KR
Inventors: 노부히코 하마자키; 가쓰히코 하야시
Original assignee: 가부시키가이샤 디오시브
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-05-09
Also published as: AU2020345441A1; US20220333068A1; JP2023107982A; IL291249A; EP4029933A4; WO2021049613A1; JP7302865B2; EP4029933A1; CN114514313A; CA3154194A1; JP2021040578A

Abstract

미성숙 난모세포의 유도 방법은, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것을 포함한다. 성숙 난모세포의 제작 방법은, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것과, 도입 후의 상기 세포 및 난소 체세포를 공배양하는 것을 포함한다.

Description

미성숙 난모세포의 유도 방법 및 성숙 난모세포의 제작 방법

본 발명은, 미성숙 난모세포의 유도 방법 및 성숙 난모세포의 제작 방법에 관한 것이다.

본원은, 2019년 9월 12일에 일본에 출원된 특허출원 2019-166578호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.

포유동물에 있어서, 한 세포로부터의 개체 발생능으로서 정의되는 전능성은 단세포에 구비되는 특별한 성질이다. 그러나, 이러한 전능성을 형성하는 메커니즘은, 불임 치료 등의 사회적 요망이 강한 분야에도 불구하고, 난항을 겪고 있다. 그 원인은, 태아 난소에서 진행되는 난(卵) 형성 과정을 체외에서 재현할 수 없는 데 있다.

발명자들은 지금까지 마우스 다능성 줄기세포로부터 난모세포를 재구축하는 인비트로 배양계를 개발하고 있다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포 또는 iPS 세포를 BMP4 등의 액성 인자를 포함하는 배지를 이용하여 시원 생식 세포양(樣) 세포(PGCLCs)로 분화 유도하고, 얻어진 PGCLCs를 난소 체세포와 혼합시켜 재구축 난소를 제작한다. 이어서, 해당 재구축 난소에 있어서 PGCLCs로부터 제 2 감수분열 중기 난의 형성까지의 기간을 「in vitro 분화 기간」, 「in vitro 성장 기간」 및 「in vitro 성숙 기간」의 3개의 기간으로 분할하고, 각각의 배양 기간에 있어서, 2차 난포, 난핵포기(卵核胞期) 난, 제 2 감수분열 중기 난을 얻기 위해서 최적의 배양 조건을 확립하고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 등 참조).

그러나, 비특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 마우스 다능성 줄기세포로부터 원시 난포의 난모세포를 얻기 위해서, 3주간 이상 4주간 이하 정도의 기간이 필요하고, 또한 영장류나 그 외 대형 포유동물에 있어서 다능성 줄기세포로부터 난모세포를 인비트로 배양계에서 제작하기 위해서는 1년 이상의 배양이 필요하게 될 것으로 전망되고 있다.

Hikabe O et al., "Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line.", Nature, Vol. 539, p299-303, 2016.

본 발명은, 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 미성숙 난모세포를 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 성숙 난모세포를 제작하는 방법을 제공한다.

발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 난모세포의 형성에 관여하는 특정 유전자를 다능성 줄기세포에 도입하여 5일간 이상 10일간 이하 정도의 단기간 배양함으로써 미성숙 난모세포로 분화 유도할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하의 태양을 포함한다.

본 발명의 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법은, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것을 포함한다.

상기 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법은, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자를 상기 세포에 도입하는 것을 포함해도 된다.

상기 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법은, STAT3의 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함해도 된다.

상기 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법은, SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함해도 된다.

상기 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법은, SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 3종류의 유전자를 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함해도 된다.

상기 세포가 다능성 줄기세포여도 된다.

상기 제 1 태양에 따른 미성숙 난모세포의 유도 방법에 있어서, 상기 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은

상기 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있고,

상기 도입 후에, 상기 세포를 증식시키는 것과,

상기 증식 후에, 상기 발현 유도 물질을 배지에 첨가하여, 상기 유전자의 발현을 유도하는 것, 또는 상기 증식 후에, 상기 발현 안정화 물질을 배지에 첨가하여, 상기 유전자의 발현을 안정화하는 것

을 추가로 포함해도 된다.

본 발명의 제 2 태양에 따른 성숙 난모세포의 제작 방법은,

FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것과,

도입 후의 상기 세포 및 난소 체세포를 공(共)배양하는 것

을 포함한다.

상기 제 2 태양에 따른 성숙 난모세포의 제작 방법은, STAT3의 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함해도 된다.

상기 태양의 미성숙 난모세포의 유도 방법에 의하면, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 미성숙 난모세포를 유도할 수 있다. 상기 태양의 성숙 난모세포의 제작 방법에 의하면, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 성숙 난모세포를 대량으로 제작할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 있어서의 마우스 ES 세포로부터 유도된 미성숙 난모세포의 명시야상 및 형광상(배율: 200배)이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 각 배양 일수에서의 난모세포 형성 유전자가 도입된 다능성 줄기세포와 난소 체세포로 이루어지는 응집괴의 형광상(배율: 8배)이다. 상단에서는, 생식 세포 및 난모세포 마커인 Stella의 발현 제어하에 발현시키고 있는 개량된 시안 형광 단백질(Enhanced cyan fluorescent protein; ECFP)의 형광에 의해, 난모세포를 가시화하였다. 하단에서는, 활성화(성숙) 난모세포 마커인 Nucleoplasmin 2(Npm2)의 발현 제어하에 발현시키고 있는 적색 형광 단백질 mCherry의 형광에 의해, 난모세포를 가시화하였다.
도 3은 실시예 2에 있어서의 마우스 iPS 세포로부터 유도된 미성숙 난모세포의 명시야상 및 형광상(배율: 8배)이다.
도 4는 실시예 3에 있어서의 난모세포 형성 유전자 중의 중요 인자를 동정한 결과를 나타내는 도면이다. 왼쪽의 도면에 있어서, 세로축은 샘플명, 가로축은 난모세포 형성 유전자의 종류를 나타내고 있다. 백색의 난은 당해 유전자가 도입되어 있지 않는 것을 나타내고 있다. 중앙의 도면은, 각 세포주로부터 형성된 난모세포의 수를 나타내고 있다. 오른쪽의 도면은, 각 샘플에서의 Stella 유전자의 하류에 발현시키고 있는 청색 형광 단백질 CFP의 형광 면적으로부터 산출된, 난모세포의 면적을 나타내고 있다.

<미성숙 난모세포의 유도 방법>

일 실시형태에 있어서, 본 발명은, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포(이하, 이들 세포를 통틀어 「난모세포로의 분화능을 갖는 세포」라고 칭하는 경우가 있다)에 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법을 제공한다.

종래의 방법에서는, 마우스의 경우에, in vitro로 다능성 줄기세포로부터 미성숙 난모세포까지 분화 유도하기 위해서, 1개월간 정도의 시간을 요하고, 또한 in vitro로 시원 생식 세포로부터 미성숙 난모세포까지 분화 유도하기 위해서, 약 11일간 정도 요하고 있었다. 이에 반해서, 본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서는, 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포에 상기 4종류의 유전자를 도입하여, 5일간 이상 10일간 이하 정도의 단기간 배양함으로써, 미성숙 난모세포로 분화 유도할 수 있다. 또 인간의 경우는, 생체에서는 시원 생식 세포로부터 미성숙 난모세포까지 분화 유도하기 위해서, 9개월 이상의 기간을 갖지만, 본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법을 이용함으로써, 당해 기간을 극적으로 단축할 수 있다.

또한, 종래의 방법에서는, 다능성 줄기세포로부터 PGCLCs로 분화 유도하고, 해당 PGCLCs를 다시 미성숙 난모세포로 분화 유도하기 위해서, 배양 조건이 상이한 적어도 2단계의 공정을 거칠 필요가 있었다. 이에 반해서, 본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서는, 다능성 줄기세포를 미성숙 난모세포로 직접 분화 유도할 수 있다.

한편, 본 명세서에 있어서, 「미성숙 난모세포」란, 난포 성장을 거치고 있지 않는 1차 난모세포(primary oocyte)를 말한다. 미성숙 난모세포는, 반드시 난포 구조를 취할 필요는 없다. 또한, 미성숙 난모세포에서는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 난모세포 마커인 Stella 유전자나 Padi6 유전자 등의 일부의 모성 효과 유전자를 발현하고 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「난포」란, 난모세포와 그것을 둘러싸는 체세포(과립막 세포 및 협막 세포)로 이루어지는 것이다.

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에 대하여, 이하에 상세를 설명한다.

[난모세포 형성 유전자]

다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로의 도입에 이용되는 난모세포 형성 유전자는, 발명자들이 지금까지 난모세포 계열에 있어서의 유전자의 발현 동태를 RNA 시퀀싱(RNA-Seq) 해석을 행함으로써 동정한 것이다. 난모세포 형성 유전자로서 구체적으로는, 예를 들면, FIGLA, NOBOX, SOHLH1, LHX8, SUB1, STAT3, TBPL2, DYNLL1 등을 들 수 있다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자가 다능성 줄기세포로부터 미성숙 난모세포로의 유도에 특히 중요하다. 따라서, 전술한 난모세포 형성 유전자 중에서도, 적어도 FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질(바람직하게는, 적어도 상기 4종류의 유전자)을 세포에 도입함으로써, 난모세포로의 분화능을 갖는 세포를 미성숙 난모세포로 유도할 수 있다.

또한, 상기 4종류의 유전자 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질에 더하여, STAT3 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 추가로 도입하는 것이 바람직하고, STAT3 유전자를 추가로 도입하는 것이 보다 바람직하다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2에 더하여, STAT3을 세포에 도입함으로써, 난모세포의 형성률을 보다 향상시킬 수 있다.

또한, FIGLA, NOBOX, LHX8, TBPL2 및 STAT3의 5종류의 유전자 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질에 더하여, 추가로, SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 추가로 도입하는 것이 바람직하고, SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 3종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 추가로 도입하는 것이 보다 바람직하며, SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 3종류의 유전자를 추가로 도입하는 것이 더 바람직하다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 상기 전체 8종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질(바람직하게는, 상기 전체 8종류의 유전자)을 세포에 도입함으로써, 난모세포로의 분화능을 갖는 세포를 미성숙 난모세포로 보다 효율 좋게 유도할 수 있다.

한편, FIGLA 유전자는, 복수의 난모세포 특이적 유전자(난포 형성에 관여하는 유전자 및 투명대(ZP1, ZP2 및 ZP3)를 코딩하는 유전자를 포함한다)를 조절하는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH) 전사 인자를 코딩하고 있다. 전사 인자 FIGLA는, ZP(ZP1, ZP2 및 ZP3) 프로모터의 E-box(5'-CANNTG-3')에 결합한다. FIGLA에 관련된 질환으로서는, 예를 들면, 조발 난소 부전(6형), 가성 반음양 등을 들 수 있다. FIGLA의 유전자 온톨로지(GO) 애노테이션에는, 서열 특이적 DNA 결합성 및 단백질 이량체화 활성이 포함된다. FIGLA의 중요한 파랄로그는 SCX이다. FIGLA는, Folliculogenesis Specific BHLH Transcription Factor, Factor In The Germline Alpha, Folliculogenesis-Specific Basic Helix-Loop-Helix Protein, Transcription Factor FIGa, BHLHC8(BHLHc8), Folliculogenesis Specific Basic Helix-Loop-Helix, FIGALPHA(FIGalpha), POF6이라고도 불린다.

FIGLA 유전자 등의 난모세포 형성 유전자의 염기 서열, 해당 유전자의 mRNA의 염기 서열, 및 해당 유전자가 코딩하고 있는 단백질의 아미노산 서열의 정보는, Genbank 등의 데이터베이스로부터 입수할 수 있다.

인간 FIGLA 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 344018」로서 개시되어 있다. 인간 FIGLA 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001004311로서 개시되어 있다. 인간 FIGLA의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001004311로서 개시되어 있다.

마우스 FIGLA 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 26910」으로서 개시되어 있다. 마우스 FIGLA 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_012013으로서 개시되어 있다. 마우스 FIGLA의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_036143으로서 개시되어 있다.

NOBOX 유전자는, 난 형성에 관여하는 전사 인자를 코딩하고 있다. NOBOX에 관련된 질환으로서는, 예를 들면, 조발 난소 부전(5형) 등을 들 수 있다. NOBOX의 GO 애노테이션에는, DNA 결합성 전사 인자 활성 및 RNA 폴리머라아제 II 근방 프로모터 서열 특이적인 DNA 결합성이 포함된다. 구체적으로는, 「5'-TAATTG-3'」, 「5'-TAGTTG-3'」 및 「5'-TAATTA-3'」 등의 염기 서열에 바람직하게 결합한다. NOBOX의 중요한 파랄로그는 UNCX이다. NOBOX는, NOBOX Oogenesis Homeobox, Homeobox Protein NOBOX, Newborn Ovary Homeobox-Encoding Gene, Newborn Ovary Homeobox-Encoding, TCAG_12042, OG-2(OG2), OG2X, POF5라고도 불린다.

인간 NOBOX 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 135935」로서 개시되어 있다. 인간 NOBOX 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001080413, XM_001134420으로서 개시되어 있다. 인간 NOBOX의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001073882, XP_001134420으로서 개시되어 있다.

마우스 NOBOX 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 18291」로서 개시되어 있다. 마우스 NOBOX 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_130869로서 개시되어 있다. 마우스 NOBOX의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_570939로서 개시되어 있다.

SOHLH1 유전자는, 정자 형성, 난 형성 및 난포 형성에 필수인 생식소 특이적인 전사 인자의 하나이며, 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH) 전사 인자를 코딩하고 있다. SOHLH1은 제 1 감수분열에 영향을 주지 않고 난모세포의 분화를 조정하는 역할을 갖는다. SOHLH1에 관련된 질환으로서는, 예를 들면, 비폐색성 무정자증, 난소 형성 부전 등을 들 수 있다. SOHLH1의 GO 애노테이션에는, DNA 결합성 전사 인자 활성 및 단백질 이량체화 활성이 포함된다. SOHLH1 유전자의 중요한 파랄로그는 SOHLH2이다. SOHLH1은, Spermatogenesis And Oogenesis Specific Basic Helix-Loop-Helix 1, Spermatogenesis-And Oogenesis-Specific Basic Helix-Loop-Helix-Containing Protein 1, Spermatogenesis Associated 27, C9orf157, NOHLH, TEB2, Chromosome 9 Open Reading Frame 157, Newborn Ovary Helix Loop Helix, BA100C15.3, SPATA27, BHLHe80, SPGF32, ODG5라고도 불린다.

인간 SOHLH1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 402381」로서 개시되어 있다. 인간 SOHLH1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001012415, XM_497082로서 개시되어 있다. 인간 SOHLH1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001012415, XP_497082로서 개시되어 있다.

마우스 SOHLH1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 227631」로서 개시되어 있고, 마우스 SOHLH1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001001714, XM_130180으로서 개시되어 있고, 마우스 SOHLH1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001001714, XP_130180으로서 개시되어 있다.

LHX8은, LIM 호메오박스 패밀리의 단백질의 멤버이며, 다양한 조직의 패턴 형성 및 분화에 관여하고 있다. LIM 호메오박스 패밀리의 단백질은, DNA 결합 호메오도메인에 더하여, LIM 도메인으로서 알려져 있는, 2개의 탠덤으로 반복된 시스테인이 풍부한 더블 징크 핑거 모티프를 포함한다. LIM 호메오박스 패밀리의 단백질은, 치(齒)의 형태 형성, 난 형성 및 뉴런 분화에 관여하는 전사 인자이다. LHX8 유전자에 관련된 질환으로서는, 예를 들면, 구개열, 치아종 등을 들 수 있다. LHX8은, LIM Homeobox 8, LIM/Homeobox Protein Lhx8, LIM-Homeodomain Protein Lhx8, LIM Homeobox Protein 8, LHX7이라고도 불린다.

인간 LHX8 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 431707」로서 개시되어 있다. 인간 LHX8 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001001933, XM_086344, NM_001256114, XM_017001316, XM_017001317로서 개시되어 있다. 인간 LHX8의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001001933, XP_086344, NP_001243043, XP_016856805, XP_016856806으로서 개시되어 있다.

마우스 LHX8 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 16875」로서 개시되어 있다. 마우스 LHX8 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_010713, XM_006501072, XM_017319470으로서 개시되어 있다. 마우스 LHX8의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_034843, XP_006501135, XP_017174959로서 개시되어 있다.

SUB1 유전자는, 전사 조절 인자를 코딩하는 유전자이다. SUB1은, TAF와 협조하여 기능하고, 상류의 액티베이터 및 일반적인 전사 기능 간의 기능적 상호작용을 중개하는 코액티베이터로서 작용한다. SUB1에 관련되는 질환으로서는, 예를 들면, 손발톱 백선 등을 들 수 있다. SUB1의 GO 애노테이션에는, 1본쇄 DNA 결합성이 포함된다. SUB1은, SUB1 Homolog, Transcriptional Regulator, Positive Cofactor 4, Activated RNA Polymerase II Transcriptional Coactivator P15, PC4, P14, Activated RNA Polymerase II Transcription Cofactor 4, RPO2TC1, P15라고도 불린다.

인간 SUB1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 10923」으로서 개시되어 있다. 인간 SUB1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_006713, XM_017008986, XM_017008987, XM_011513944로서 개시되어 있다. 인간 SUB1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_006704, XP_016864475, XP_016864476, XP_011512246으로서 개시되어 있다.

마우스 SUB1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 20024」로서 개시되어 있다. 마우스 SUB1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_011294, XM_006520042로서 개시되어 있다. 마우스 SUB1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_035424, XP_006520105로서 개시되어 있다.

STAT3은, STAT 단백질 패밀리 멤버이다. STAT 단백질 패밀리는, 인터페론(IFN), 상피 성장 인자(EGF), 인터류킨 5(IL5), 인터류킨 6(IL6), 간세포 증식 인자(HGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 골 형성 단백질 2(BMP2) 등의 사이토카인 및 성장 인자에 응답하여, 수용체 관련 키나아제로 인산화되며, 이어서 호모 또는 헤테로다이머를 형성하고, 그들이 전사 활성 인자로서 작용하는 세포핵으로 이행하여, 세포 증식이나 아폽토시스 등의 많은 세포 프로세스에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. STAT3에 관련되는 질환으로서는, 예를 들면, 유아기(幼兒期) 발증 다장기성 자기면역 질환, 상염색체 우성의 고IgE 증후군 등을 들 수 있다. STAT3의 GO 애노테이션에는, DNA 결합성 전사 인자 활성 및 서열 특이적 DNA 결합성이 포함된다. STAT3 유전자의 중요한 파랄로그는 STAT1이다. STAT3은, Signal Transducer And Activator Of Transcription 3, Acute-Phase Response Factor, APRF, Signal Transducer And Activator Of Transcription 3, DNA-Binding Protein APRF, ADMIO1, ADMIO, HIES라고도 불린다.

인간 STAT3 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 6774」로서 개시되어 있다. 인간 STAT3 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001369512, NM_001369513, NM_001369514, NM_001369516, NM_001369517, NM_001369518, NM_001369519, NM_001369520, NM_003150, NM_139276, NM_213662, XM_017024973, XM_011525146, XM_011525145, XM_017024972, XM_005257617, XM_005257616, XM_017024975, XM_024450896, XM_017024974, XM_017024976으로서 개시되어 있다. 인간 STAT3의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001356441, NP_001356442, NP_001356443, NP_001356445, NP_001356446, NP_001356447, NP_001356448, NP_001356449, NP_003141, NP_644805, NP_998827, XP_016880462, XP_011523448, XP_011523447, XP_016880461, XP_005257674, XP_005257673, XP_016880464, XP_024306664, XP_016880463, XP_016880465로서 개시되어 있다.

마우스 STAT3 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 20848」로서 개시되어 있다. 마우스 STAT3 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_011486, NM_213659, NM_213660, XM_011248846, XM_017314401로서 개시되어 있다. 마우스 STAT3의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_035616, NP_998824, NP_998825, XP_011247148, XP_017169890으로서 개시되어 있다.

TBPL2 유전자는, TATA 박스 결합 단백질양 2를 코딩하는 유전자이다. TBPL2는, 근아세포의 근세포로의 분화를 유도하기 위해서, TAF3과 복합체를 형성하는 전사 인자이며, 해당 복합체는, 분화의 초기 단계에서 특정 프로모터에 있어서 TFIID를 치환한다. TBPL2에 관련되는 질환으로서는, 예를 들면, 망막 색소 변성 등을 들 수 있다. TBPL2의 GO 애노테이션에는, DNA 결합성 전사 인자 활성이 포함된다. TBPL2 유전자의 중요한 파랄로그는 TBP이다. TBPL2는, TATA-Box Binding Protein Like 2, TATA Box-Binding Protein-Related Factor 3, TATA Box-Binding Protein-Like Protein 2, TBP-Related Factor 3, TBP-Like Protein 2, TBP2, TRF3이라고도 불린다.

인간 TBPL2 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 387332」로서 개시되어 있다. 인간 TBPL2 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_199047로서 개시되어 있다. 인간 TBPL2의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_950248로서 개시되어 있다.

마우스 TBPL2 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 227606」으로서 개시되어 있다. 마우스 TBPL2 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001289689, NM_199059로서 개시되어 있다. 마우스 TBPL2의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001276618, NP_951014로서 개시되어 있다.

DYNLL1 유전자는, 분자량 약 1200kDa의 효소 복합체인 세포질 다이닌을 구성하는 단백질 중, 경쇄로 분류되는 단백질을 코딩하는 유전자이다. DYNLL1에 관련되는 질환으로서는, 예를 들면, 만성 장관 정맥 부전 등을 들 수 있다. DYNLL1의 GO 애노테이션에는, 단백질 호모이량체화 활성 및 단백질 도메인 특이적 결합성이 포함된다. DYNLL1 유전자의 중요한 파랄로그는 DYNLL2이다. DYNLL1은, Dynein Light Chain LC8-Type 1, Protein Inhibitor Of Neuronal Nitric Oxide Synthase, Dynein, Cytoplasmic, Light Polypeptide 1, Dynein Light Chain 1, Cytoplasmic, 8 KDa Dynein Light Chain, DNCLC1, DNCL1, DLC1, DLC8, PIN, Cytoplasmic Dynein Light Polypeptide, Hdlc1(HDLC1), LC8a, LC8이라고도 불린다.

인간 DYNLL1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 8655」로서 개시되어 있다. 인간 DYNLL1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_001037494, NM_001037495, NM_003746으로서 개시되어 있다. 인간 DYNLL1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_001032583, NP_001032584, NP_003737로서 개시되어 있다.

마우스 DYNLL1 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 「Gene ID: 56455」로서 개시되어 있다. 마우스 DYNLL1 유전자의 mRNA의 염기 서열은, 예를 들면, Genbank의 액세션 번호 NM_019682로서 개시되어 있다. 마우스 DYNLL1의 아미노산 서열은 Genbank의 액세션 번호 NP_062656으로서 개시되어 있다.

[난모세포로의 분화능을 갖는 세포]

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서 이용되는 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로서는, 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포(EpiLCs) 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포인 것이 바람직하다.

(다능성 줄기세포)

본 명세서에 있어서, 「다능성 줄기세포」란, 미분화 상태를 유지한 채로 증식할 수 있는 「자기 재생능」과 삼배엽 계열 모두로 분화할 수 있는 「분화 다능성」을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 다능성 줄기세포로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포), 배성 줄기세포(ES 세포), 시원 생식 세포에서 유래하는 배성 생식 세포(EG 세포), 정소 조직으로부터의 GS(Germline Stem) 세포의 수립 배양 과정에서 단리되는 multipotent GS 세포(mGS 세포), 골수간엽계 세포로부터 단리되는 Muse 세포 등을 들 수 있다. 한편, ES 세포는 체세포로부터 핵 초기화되어 생긴 ES 세포여도 된다. 상기에 열거한 다능성 줄기세포는, 각각 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「iPS 세포」란, 분화한 체세포에 몇 가지 유전자를 도입하는 것에 의해 다양한 조직이나 기관의 세포로의 리프로그래밍이 가능해진 세포를 의미한다. 본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서 이용되는 iPS 세포는, 적당한 도너로부터 채취한 체세포의 초대 배양 세포 유래여도 되고, 수립 세포주 유래여도 된다. iPS 세포는, 어떠한 배엽계 세포로도 분화 유도가 가능한 점에서, iPS 세포의 조제에 이용하는 체세포는, 원칙적으로는 외배엽계 및 내배엽계의 어느 배엽계 세포 유래의 것이어도 된다. 침습성이 낮고 채취가 용이한 피부, 머리카락, 잇몸, 혈액 등의 세포는, iPS 세포의 조제에 이용하는 체세포로서 적합하다. iPS 세포의 조제 방법에 대해서는, 당해 분야에서 공지된 방법에 따르면 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 「Okita K. et al., "Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.", Nature, Vol. 448, p313-317, 2007.」(참고문헌 1), 「Hamanaka S. et al., "Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells.", PLoS One, Vol. 6, Issue 7, e22008, 2011.」(참고문헌 2) 등의 공지된 문헌에 기재되어 있는 조제 방법을 이용할 수 있다.

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서 이용되는 ES 세포는, 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 대상 동물의 수정란의 배반포로부터 내부 세포괴를 채취하고, 당해 내부 세포괴를 섬유 아세포에서 유래하는 피더 세포 상에서 배양하는 것에 의해 수립할 수 있다. 그 외에, 체세포의 핵을 핵 이식하는 것에 의해 제작된 초기 배를 배양하는 것에 의해 수립한 ES 세포도 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, ES 세포는, 피더 세포를 이용하지 않고, 2i(2 inhibitor; PD0325901 및 CHIR99021), 및 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)를 첨가한 무혈청 배지에서 유지 배양할 수 있다(참고문헌 3: 「Ying QL et al., "The ground state of embryonic stem cell self-renewal.", Nature, Vol. 453, No. 7194, p519-523, 2008.」).

(에피블라스트양 세포)

한편, 본 명세서에 있어서, 「에피블라스트양 세포(EpiLCs)」는, 다능성 줄기세포(예를 들면, iPS 세포, ES 세포 등)로부터 특정 배양 조건에서 분화시킨 세포이며, 에피블라스트(생체 내에서 시원 생식 세포로 분화하는 조직)와 매우 유사한 특징을 갖는다.

다능성 줄기세포(iPS 세포 또는 ES 세포)로부터 EpiLCs를 분화 유도하는 방법은, 공지된 방법, 예를 들면, 일본 특허공표 2013-538038호 공보(참고문헌 4)나, 「Hayashi K. et al., "Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.", Cell, Vol. 146, No. 4, p519-532, 2011.」(참고문헌 5) 등을 참고로 하여 행할 수 있다.

(시원 생식 세포)

또한, 본 명세서에 있어서, 「시원 생식 세포」란, 생식 세포로 분화할 예정인 세포이며, 감수분열을 거쳐 최종적으로 난자나 정자로 분화하는 세포를 의미한다. 시원 생식 세포는, 생체 유래의 것이어도 되고, 다능성 줄기세포로부터 분화 유도한 시원 생식 세포양 세포(PGCLCs)여도 된다. 생체로부터 시원 생식 세포를 회수하는 경우에는, 예를 들면, 암컷 마우스의 태자(11.5일령부터 12.5일령까지)로부터 생식소와 함께 회수할 수 있다. 한편, 생체로부터 생식소를 회수할 때에는, 중신(中腎)을 수반하는 형태로 회수해도 되고, 중신을 분리해도 회수해도 된다.

또한, 전술한 바와 같이, 「시원 생식 세포」에는 다능성 줄기세포로부터 분화한 시원 생식 세포양 세포가 포함된다. 다능성 줄기세포(iPS 세포 또는 ES 세포)로부터 PGCLCs를 분화 유도하는 방법은, 공지된 방법, 예를 들면, 상기 참고문헌 5 등을 참고로 하여 행할 수 있다.

한편, 다능성 줄기세포 유래의 PGCLCs를 시원 생식 세포로서 이용하는 경우에는, 분화 유도시킨 다능성 줄기세포 집단으로부터 미분화한 상태의 세포를 미리 제거하는 것이 바람직하다. 이와 같은 방법은 공지되어 있고, 예를 들면, 다능성 줄기세포에, 시원 생식 세포의 마커 유전자인 Blimp1과 리포터 단백이 결합한 융합 단백을 코딩하는 핵산을 도입해 둠으로써, 다능성 줄기세포로부터 분화 유도된 PGCLCs와 미분화한 세포를 Fluorescence-activated cell sorting(FACS)법 등에 의해 용이하게 분리할 수 있다.

또한, 「시원 생식 세포」에는 생체 유래의 시원 생식 세포나 다능성 줄기세포 유래의 시원 생식 세포양 세포의 유전자를 유전자 공학의 수법을 이용하여 개변한 세포도 포함된다. 생체 유래의 시원 생식 세포 및 다능성 줄기세포 유래의 시원 생식 세포양 세포의 유전자를 개변하는 방법으로서는, CRISPR 시스템, Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALEN)를 이용한 방법, 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 방법, 상동 재조합법 등의 공지된 게놈 편집법을 이용하여, 목적으로 하는 핵산이나 벡터 등의 도입을 행할 수 있다. 핵산이나 벡터 등의 도입법으로서는, 예를 들면, 현미 주입법(마이크로인젝션), 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 바이러스 벡터를 이용한 핵산 도입법 등을 들 수 있다. 또한, 외래 유전자나 외래의 핵산 프래그먼트의 도입법은, 유전자 개변된 시원 생식 세포가 본 실시형태의 방법에 의해 기능적인 난모세포로 분화할 수 있는 한에 있어서, 상기에 열거한 방법에 한정되지 않는다. 한편, 시원 생식 세포에 대한 유전자 개변은, 시원 생식 세포의 배양 기간 중의 적절한 타이밍에 행할 수 있다. 예를 들면, 마우스에 있어서는, 11.5일령부터 12.5일령까지의 기간에 행할 수 있다. 또한, 다능성 줄기세포 유래의 시원 생식 세포양 세포를 이용하는 경우에는, 시원 생식 세포양 세포로의 분화 유도 전의 다능성 줄기세포를 공지된 방법에 의해 유전자 개변할 수도 있다.

그 중에서도, 본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서 이용되는 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로서는, 다능성 줄기세포가 바람직하다. 특히, ES 세포를 이용한 경우에는, 그 증식능의 높이로부터, 대량의 미성숙 난모세포를 얻을 수 있다.

또한, 난모세포로의 분화능을 갖는 세포는, 포유동물에서 유래하는 것을 이용할 수 있다. 포유동물로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간, 침팬지 및 그 외의 영장류; 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 돼지, 래트(누드 래트도 포함한다), 마우스(누드 마우스 및 스키드 마우스도 포함한다), 햄스터, 모르모트 등의 가축 동물, 애완 동물 및 실험용 동물 등을 들 수 있고, 이들에 한정되지 않는다.

[도입 공정]

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에 있어서, 상기 난모세포 형성 유전자는, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입된다.

또한, 난모세포 형성 유전자 대신에, 그의 전사물인 mRNA 또는 그의 발현 단백질을 도입해도 된다. 난모세포 형성 유전자의 mRNA 및 그의 발현 단백질로서는, 상기 Genbank의 액세션 번호로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 mRNA 및 아미노산 서열로 이루어지는 발현 단백질을 이용할 수 있다.

그 중에서도, 상기 난모세포 형성 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.

도입 방법으로서는, 특별히 한정되지 않고, 대상 세포, 도입 재료의 종류(핵산인지, 혹은 단백질인지 등)에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

난모세포 형성 유전자를 세포에 도입하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, DEAE 덱스트란법, 유전자총법, 일렉트로포레이션법, 인산 칼슘법 등을 들 수 있다.

난모세포 형성 유전자의 mRNA를 세포에 도입하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, Lipofectamine(등록상표) MessengerMAX(Life Technologies사제) 등의, 시판되는 RNA 트랜스펙션 시약 등을 이용하는 방법을 들 수 있다.

난모세포 형성 유전자의 발현 단백질을 세포에 도입하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 단백질 도입 시약을 이용하는 방법, 단백질 도입 도메인(PTD) 융합 단백질을 이용하는 방법, 마이크로인젝션법 등을 들 수 있다.

난모세포 형성 유전자는, 발현 벡터의 형태로, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하여, 일과적으로 발현시켜도 되고, 난모세포 형성 유전자를 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포의 염색체에 편입해도 된다. 그 중에서도, 유전자를 안정되게 발현시킬 수 있는 점에서, 난모세포 형성 유전자를 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포의 염색체에 편입하는 것이 바람직하다.

난모세포 형성 유전자를 발현 벡터의 형태로 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 경우에는, 난모세포 형성 유전자의 염기 서열과, 해당 난모세포 형성 유전자의 염기 서열의 발현을 제어하는 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 이용할 수 있다. 해당 발현 벡터에 있어서, 난모세포 형성 유전자의 염기 서열은, 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. 또한, 상기 8종의 난모세포 형성 유전자 중, 사용하는 유전자 모두를 하나의 발현 벡터에 편입해도 되고, 그들을 1종류씩 상이한 벡터에 편입해도 되지만, 그 중에서도, 도입 효율의 관점에서, 사용하는 유전자 모두를 하나의 발현 벡터에 편입하는 것이 바람직하다.

프로모터로서는, 특별한 한정은 없고, 대상 세포에 있어서 활성을 갖는 것이어도 되고, 약제 등에 의해 활성을 유도 가능한 발현 유도형 프로모터여도 된다.

대상 세포에 있어서 활성을 갖는 프로모터로서는, 예를 들면, 거의 모든 세포에 있어서 강한 프로모터 활성을 갖는, 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV 프로모터), CMV early enhancer/chicken beta actin(CAG 프로모터) 등을 들 수 있다.

발현 유도형 프로모터로서는, 인위적으로 프로모터 활성을 제어할 수 있는, 독시사이클린 유도형 프로모터(TetO 프로모터) 등을 들 수 있다.

발현 벡터는, 난모세포 형성 유전자의 염기 서열 및 프로모터 외에, 희망에 따라 인핸서, 폴리 A 부가 시그널, 마커 유전자, 복제 개시점, 복제 개시점에 결합하여 복제를 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자 등을 포함하고 있어도 된다. 「마커 유전자」란, 해당 마커 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해, 세포의 선별이나 선택을 가능하게 하는 유전자를 가리킨다. 마커 유전자의 구체예로서는, 예를 들면, 약제 내성 유전자, 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 발색 효소 유전자 등을 들 수 있다. 이들은, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다. 상기 약제 내성 유전자의 구체예로서는, 예를 들면, 퓨로마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등을 들 수 있다. 상기 형광 단백질 유전자의 구체예로서는, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 황색 형광 단백질(YFP) 유전자, 적색 형광 단백질(RFP) 유전자 등을 들 수 있다. 상기 발광 효소 유전자의 구체예로서는, 예를 들면, 루시페라아제 유전자 등을 들 수 있다. 상기 발색 효소 유전자의 구체예로서는, 예를 들면, β 갈락토시타아제 유전자, β 글루쿠로니다아제 유전자, 알칼리 포스파타아제 유전자 등을 들 수 있다.

난모세포 형성 유전자를 편입하는 발현 벡터로서는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 발현 벡터를 이용할 수 있다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

플라스미드 벡터는, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포 내에서 발현 가능한 플라스미드 벡터이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 포유동물 세포 발현용 플라스미드 벡터로서, 일반적으로 이용되고 있는 것을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 발현용 플라스미드 벡터로서는, 예를 들면, pX459, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

바이러스 벡터로서는, 예를 들면, 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함한다) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 폴리오바이러스 벡터, 실비스 바이러스 벡터, 랍도바이러스 벡터, 파라믹소바이러스 벡터, 오쏘믹소바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

그 중에서도, 발현 벡터로서는, 플라스미드 벡터가 바람직하다.

난모세포 형성 유전자를 염색체에 편입하는 경우에는, 공지된 녹인 시스템을 이용하여 행할 수 있다. 공지된 녹인 시스템으로서는, 예를 들면, CRISPR/Cas 시스템, Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제 등의 공지된 게놈 편집법으로 염색체를 절단하고, 상동 재조합용의 도너 벡터를 이용하여 상동 재조합을 행하는 방법이나, 트랜스포존 벡터 시스템을 이용한 방법 등을 들 수 있다.

도너 벡터는, 호몰로지 암으로서 표적 영역에 인접하는 염기 서열을 포함한다. 도너 벡터는, 5' 암과 3' 암 사이에 난모세포 형성 유전자의 염기 서열(이하, 「녹인 서열」이라고 하는 경우가 있다)을 포함할 수 있다. 또한, 난모세포 형성 유전자를 안정되게 발현시키기 위해서, 세이프 하버 영역 내에 표적 영역을 설정하는 것이 바람직하다.

도너 벡터는, 환상 DNA 벡터(예를 들면 플라스미드 벡터)여도 되고, 선상 DNA 벡터여도 된다. 도너 벡터는, 호몰로지 암 및 녹인 서열에 더하여, 다른 서열을 포함하고 있어도 된다. 다른 서열로서는, 예를 들면, 마커 유전자, 복제 개시점, 복제 개시점에 결합하여 복제를 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다. 마커 유전자로서는, 상기와 마찬가지의 것을 들 수 있다.

도너 벡터의 도입 방법은, 특별히 한정되지 않고, 대상 세포에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 도너 벡터의 세포로의 도입 방법으로서는, 예를 들면, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, DEAE 덱스트란법, 유전자총법, 일렉트로포레이션법, 인산 칼슘법 등을 들 수 있다.

트랜스포존 벡터 시스템에서는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 난모세포 형성 유전자의 염기 서열이 편입된 트랜스포존 벡터를 세포에 도입하고, 트랜스포자아제를 작용시키는 것에 의해, 용이하게 세포의 염색체 중에 편입할 수 있다. 또한, 재차 트랜스포자아제를 작용시키는 것에 의해, 염색체 중에 편입된 상기 난모세포 형성 유전자의 염기 서열을, 염색체로부터 잘라내어, 흔적을 남기지 않고 제거할 수도 있다. 트랜스포존으로서는, 예를 들면, piggyBac(등록상표), Hyperactive version of piggyBac(등록상표) transposase(hyPBase), Sleeping Beauty, Tol II, mariner 등을 들 수 있다.

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법은, 상기 도입 공정에 더하여, 임의의 공정을 포함해도 된다. 임의의 공정으로서는, 예를 들면, 세포를 증식시키는 공정(증식 공정)이나, 도입된 난모세포 형성 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 그의 발현 단백질이 도입된 세포를 선택하는 공정(선택 공정), 도입 공정 후의 세포를 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있거나 또는 난모세포 형성 유전자의 발현 단백질이 존재하고 있는 상태에서 배양하는 공정(배양 공정) 등을 들 수 있다. 또한, 도입 공정에 있어서, 난모세포 형성 유전자를 도입하는 경우에는, 도입된 난모세포 형성 유전자의 발현을 유도하는 공정(발현 유도 공정), 혹은 도입된 난모세포 형성 유전자의 발현을 안정화하는 공정(발현 안정화 공정)을 포함할 수 있다.

[증식 공정]

증식 공정에서는, 보다 대량의 미성숙 난모세포를 얻기 위해서, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포를 증식시킨다.

증식 공정에서는, 예를 들면, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포를 증식용 배지에서 배양함으로써 증식시킬 수 있다. 증식용 배지로서는, ES 세포, iPS 세포, EpiLCs, 시원 생식 세포 등을 배양하기 위한 공지된 배지를 이용할 수 있지만, 이에 한정되지 않고, ES 세포, iPS 세포, EpiLCs, 시원 생식 세포의 배양에 적절한 배지이면 어떠한 것이어도 된다. 증식용 배지로서 구체적으로는, 예를 들면, 후술하는 실시예에 있어서 나타내는 바와 같이, 2i(2 inhibitor; PD0325901 및 CHIR99021), 및 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)를 첨가한 무혈청 배지 등을 들 수 있다.

증식 공정에 있어서의 배양 조건으로서는, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포를 배양하는 공지된 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 배양 온도는 30℃ 이상 37℃ 이하 정도로 할 수 있다. 배양 기간은, 마우스의 경우에는, 특별한 한정은 없지만, 예를 들면, 1일간 이상 10일간 이하 정도로 할 수 있고, 3일간 이상 7일간 이하 정도로 할 수 있으며, 5일간 정도로 할 수 있다. 또한, 당업자이면, 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 배양 기간을 설정할 수 있다.

증식 공정은, 상기 도입 공정의 전이어도 되고, 후여도 된다. 한편, 도입 공정의 후인 경우에는, 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있거나 또는 난모세포 형성 유전자의 발현 단백질이 존재하고 있으면, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포로부터 미성숙 난모세포로의 분화 유도가 개시되기 때문에, 증식이 정지한다. 그 때문에, 후술하는 발현 유도 공정/발현 안정화 공정에 나타내는 바와 같이, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있는 경우에는, 도입 공정의 후에, 발현 유도 물질 및 발현 안정화 물질의 비존재하에서 증식 공정을 행할 수 있다.

또한, 일과성의 발현 벡터의 형태로 난모세포 형성 유전자를 도입하는 경우, 또는 난모세포 형성 유전자의 전사물 또는 발현 단백질을 도입하는 경우에는, 상기 도입 공정의 전에 증식 공정을 행하는 것이 바람직하다.

[선택 공정]

선택 공정에서는, 난모세포 형성 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 그의 발현 단백질이 도입된 세포를 선택한다.

선택 공정에서는, 예를 들면, 리포터 유전자를 이용함으로써, 난모세포 형성 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 그의 발현 단백질이 도입된 세포를 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 난모세포 형성 유전자를 발현 벡터의 형태로 세포에 도입하는 경우에는, 해당 발현 벡터에 리포터 유전자를 포함함으로써, 세포 내에서, 난모세포 형성 유전자의 발현과 함께, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현과는 독립적으로 리포터 유전자를 발현시켜, 세포를 선택할 수 있다. 난모세포 형성 유전자를 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포의 염색체에 편입하는 경우에는, 난모세포 형성 유전자의 상류 또는 하류에 리포터 유전자를 기능적으로 연결시킨 컨스트럭트를 편입함으로써, 난모세포 형성 유전자의 발현과 함께, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현과는 독립적으로 리포터 유전자를 발현시켜, 세포를 선택할 수 있다. 난모세포 형성 유전자의 전사물을 도입하는 경우에는, 난모세포 형성 유전자의 전사물의 상류 또는 하류에 리포터 유전자의 전사물을 기능적으로 연결시킨 컨스트럭트를 세포에 도입함으로써, 난모세포 형성 유전자의 발현과 함께, 리포터 유전자를 발현시켜, 세포를 선택할 수 있다. 난모세포 형성 유전자의 발현 단백질을 세포에 도입하는 경우에는, 난모세포 형성 유전자의 발현 단백질과 리포터 유전자의 발현 단백질의 융합 단백질을 세포에 도입함으로써, 세포를 선택할 수 있다. 리포터 유전자로서는, 상기 「도입 공정」의 설명에 있어서 마커 유전자로서 예시된 것을 이용할 수 있다.

[발현 유도 공정/발현 안정화 공정]

상기 도입 공정에 있어서, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있는 경우에, 발현 유도 물질을 배지에 첨가함으로써, 난모세포 형성 유전자의 발현이 유도된다. 혹은, 상기 도입 공정에 있어서, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있는 경우에, 발현 안정화 물질을 배지에 첨가함으로써, 난모세포 형성 유전자의 발현이 안정화된다. 한편, 발현 안정화 물질 비존재하에서는, 발현된 난모세포 형성 유전자에서 유래하는 발현 단백질은 프로테아솜에 의해 분해된다. 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포로부터 미성숙 난모세포로 분화 유도되면, 세포의 증식이 정지한다. 그 때문에, 보다 대량의 미성숙 난모세포를 얻기 위해서, 발현 유도 공정 또는 발현 안정화 공정을 행하기 전에, 증식 공정을 행하는 것이 바람직하다. 즉, 난모세포 형성 유전자를 발현 벡터의 형태로 세포에 도입하는 경우에는, 증식 공정, 도입 공정, 및 발현 유도 공정 또는 발현 안정화 공정을 이 순서로 행하는 것이 바람직하다. 한편, 난모세포 형성 유전자를 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포의 염색체에 편입하는 경우에는, 도입 공정, 증식 공정, 및 발현 유도 공정 또는 발현 안정화 공정을 이 순서로 행하는 것이 바람직하다.

난모세포 형성 유전자의 발현 유도는, 예를 들면, 난모세포 형성 유전자를 발현 유도형 프로모터(예를 들면, 독시사이클린 유도형 프로모터(TetO 프로모터))에 기능적으로 연결시킨 형태로 세포에 도입하고, 발현 유도 물질(예를 들면, 독시사이클린)을 배지에 첨가함으로써 난모세포 형성 유전자를 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.

혹은, 난모세포 형성 유전자의 발현 안정화는, 예를 들면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, ProteoTuner(등록상표) 시스템(클론테크사제)을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 난모세포 형성 유전자의 상류 또는 하류에 불안정화 도메인(Destabilizing Domain; DD, 12kDa)을 코딩하는 서열을 기능적으로 연결시킨 컨스트럭트를 세포에 도입함으로써, 해당 컨스트럭트가 발현한 융합 단백질은, 발현 안정화 물질의 비존재하에서는, 프로테아솜에 의해 신속히 분해된다. 한편, 발현 안정화 물질로서 프로테아솜에 의한 분해로부터 보호하는 저분자 화합물 Shield1(막투과성의 저분자 화합물, 750Da)을 배지에 첨가함으로써, 난모세포 형성 유전자를 안정적으로 발현시켜, 세포 내에 축적시킬 수 있다.

발현 유도 물질 또는 발현 안정화 물질의 첨가량으로서는, 난모세포 형성 유전자의 발현량이 원하는 양이 되는 농도이면 되고, 특별한 한정은 없다. 예를 들면, 발현 유도 물질이 독시사이클린인 경우에는, 배지 중의 농도는 예를 들면 1nM(1nmol/L) 이상 10μM(10μmol/L) 이하 정도로 할 수 있다. 예를 들면, 발현 안정화 물질이 Shield1인 경우에는, 배지 중의 농도는 예를 들면 10nM(10nmol/L) 이상 10μM(10μmol/L) 이하 정도로 할 수 있고, 100nM(100nmol/L) 이상 5μM(5μmol/L) 이하 정도로 할 수 있고, 300nM(300nmol/L) 이상 3μM(3μmol/L) 이하 정도로 할 수 있고, 400nM(400nmol/L) 이상 1μM(1μmol/L) 이하 정도로 할 수 있으며, 500nM(500nmol/L) 정도로 할 수 있다.

발현 유도 공정 또는 발현 안정화 공정에서 이용되는 배지로서는, 상기 증식 공정에서 증식용 배지로서 예시된 것을 사용할 수 있다.

[배양 공정]

배양 공정에서는, 상기 도입 공정 후의 세포를, 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있거나 또는 난모세포 형성 유전자의 발현 단백질이 존재하고 있는 상태에서 배양한다.

배양 조건으로서는, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포를 배양하는 공지된 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 배양 온도는 30℃ 이상 37℃ 이하 정도로 할 수 있다. 배양 기간은, 마우스의 경우에는, 1일간 이상 10일간 이하 정도로 할 수 있고, 3일간 이상 7일간 이하 정도로 할 수 있다.

배양 공정에서 이용되는 배지로서는, 상기 증식 공정에서 증식용 배지로서 예시된 것을 사용할 수 있다. 한편, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있는 경우에는, 배지에 상기 발현 유도 물질을 첨가하여, 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양한다. 혹은, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있는 경우에는, 배지에 상기 발현 안정화 물질을 첨가하여, 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양한다.

바람직한 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법으로서는, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있고, 이하의 1)∼5)를 포함한다.

1) FIGLA, NOBOX, LHX8, 및 TBPL2의 4종류의 난모세포 형성 유전자(바람직하게는, FIGLA, NOBOX, LHX8, TBPL2, 및 STAT3의 5종류의 난모세포 형성 유전자; 보다 바람직하게는, FIGLA, NOBOX, LHX8, TBPL2, STAT3, SOHLH1, SUB1, 및 DYNLL1의 8종류의 난모세포 형성 유전자)를 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포(특히 바람직하게는, 다능성 줄기세포)의 염색체에 도입하는 것;

2) 도입 후의 세포를 증식시키는 것;

3) 증식 후의 세포 중, 난모세포 형성 유전자가 염색체에 도입된 세포를 선택하는 것;

4) 선택 후의 세포에 있어서, 발현 유도 물질을 배지에 첨가하여, 난모세포 형성 유전자의 발현을 유도하는 것, 또는 선택 후의 세포에 있어서, 발현 안정화 물질을 배지에 첨가하여, 난모세포 형성 유전자의 발현을 안정화하는 것;

5) 발현 유도 후 또는 발현 안정화 후의 세포를 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양하는 것

보다 바람직한 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법으로서는, 난모세포 형성 유전자의 발현이 ProteoTuner(등록상표) 시스템에 의해 제어되어 있고, 이하의 1)∼5)를 포함한다.

1) FIGLA, NOBOX, LHX8, 및 TBPL2의 4종류의 난모세포 형성 유전자(바람직하게는, FIGLA, NOBOX, LHX8, TBPL2, 및 STAT3의 5종류의 난모세포 형성 유전자; 보다 바람직하게는, FIGLA, NOBOX, LHX8, TBPL2, STAT3, SOHLH1, SUB1, 및 DYNLL1의 8종류의 난모세포 형성 유전자)의 상류 또는 하류에 불안정화 도메인(Destabilizing Domain; DD, 12kDa)을 코딩하는 서열이 기능적으로 연결되어 있는 컨스트럭트를 다능성 줄기세포의 염색체에 도입하는 것;

2) 도입 후의 세포를 증식시키는 것;

4) 선택 후의 세포에 있어서, Shield1을 배지에 첨가하여, 난모세포 형성 유전자의 발현을 안정화하는 것;

5) 발현 안정화 후의 세포를 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양하는 것

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에서는, 전술한 바와 같이, 난모세포 형성 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 그의 발현 단백질의 도입으로부터 5일간 이상 10일간 이하 정도의 짧은 배양 기간으로, 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포를 미성숙 난모세포로 분화 유도할 수 있다.

다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포가 미성숙 난모세포로 분화 유도된 것은, 공지된 난모세포의 마커 유전자(예를 들면, Stella 등)의 발현으로부터 확인할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 난모세포의 마커 유전자인 Stella와 리포터 단백질(예를 들면, 개량된 시안 형광 단백질(Enhanced cyan fluorescent protein; ECFP))이 결합한 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 미리 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포의 염색체에 도입해 둠으로써, Stella-ECFP의 발현에 의해 검출되는 형광으로부터 미성숙 난모세포로 분화 유도된 것을 확인할 수 있다. 나아가, Stella-ECFP의 발현으로부터, Fluorescence-activated cell sorting(FACS)법 등에 의해, 분화 유도시킨 세포 집단으로부터 미분화한 상태의 세포를 제거하여, 미성숙 난모세포를 용이하게 분리할 수 있다.

<성숙 난모세포의 제작 방법>

일 실시형태에 있어서, 본 발명은,

FIGLA, NOBOX, LHX8, 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것과,

도입 후의 상기 세포 및 난소 체세포를 공배양하는 것

을 포함하는, 성숙 난모세포의 제작 방법을 제공한다.

본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법에 있어서, 난모세포 형성 유전자의 도입(도입 공정)은, 상기 「미성숙 난모세포의 유도 방법」에 기재된 도입 공정과 동일하기 때문에, 설명을 할애한다.

한편, 본 명세서에 있어서, 「성숙 난모세포」란, 제 2 감수분열 중기의 난을 의미하고, 2차 난모세포(secondary oocyte)라고도 불린다. 또한, 성숙 난모세포에서는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 활성화 난모세포 마커인 Npm2 유전자를 발현하고 있다.

[응집괴 형성 공정]

본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법은, 상기 「난모세포의 유도 방법」에 기재된 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포, 및 난소 체세포를 공배양하여, 응집괴를 형성시키는 공정(응집괴 형성 공정)을 포함한다.

응집괴 형성 공정에 이용되는 난소 체세포는, 생체의 난소로부터 채취된 체세포이며, 상기 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포와 공배양함으로써, 난포를 구성하는 과립막 세포나 협막 세포로 분화하는 세포이다.

한편, 생체의 난소로부터 체세포를 채취하는 방법은, 상기 참고문헌 5에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, 난소로부터 체세포를 채취하는 방법은, 생체로부터 외과적으로 난소를 채취하여, 트립신 처리 등에 의해 난소를 구성하는 체세포를 해리시킬 수 있다. 한편, 이때, 생체 유래의 난소에 내재하는 생식 세포를 제거하는 것이 바람직하다. 난소에 내재하는 생식 세포를 제거하는 방법은, 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 항SSEA1 항체나 항CD31 항체를 이용한 Magnetic activated cell sorting법에 의해 내재하는 생식 세포를 제거할 수 있다. 여기에서, 난소 체세포를 채취하기 위해 난소는 태자 유래의 것이 바람직하다. 마우스의 경우이면, 예를 들면, 태령(「배령」이라고도 한다) 12.5일의 마우스 태자 유래의 생식소(난소)를 사용할 수 있다. 또한, 당업자이면, 본 개시 및 당해 기술 분야에 있어서의 기술 상식으로부터, 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 시기의 생식소(난소)를 선택할 수 있다.

응집괴 형성 공정에 있어서, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포, 및 난소 체세포를 공배양함으로써, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포, 및 난소 체세포로 이루어지는 응집괴를 형성시키는 것이 바람직하다.

도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포, 및 난소 체세포로 이루어지는 응집괴를 제작하는 방법은, 예를 들면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 10% 소 태아 혈청(FCS), 150μM의 아스코르브산, 1×Glutamax, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 55μM의 머캅토에탄올을 첨가한 S10 배지(StemPro(등록상표)-34 SFM, 라이프 테크놀로지스사제) 중에서, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포와 난소 체세포를 혼합 및 응집시켜 배양함으로써 실시할 수 있다. 한편, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있는 경우에는, 배지에 상기 발현 유도 물질 또는 상기 발현 안정화 물질을 첨가하여, 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양한다. 배양에는 저흡착의 배양 접시(예를 들면, 세포 저접착 U 바닥 96웰 플레이트 등)를 이용하는 것이 바람직하다.

마우스의 경우이면, 예를 들면, 응집괴를 제작하기 위한 배양 기간을 2일간 이상 3일간 이하 정도로 할 수 있고, 2일간이 바람직하다. 또한, 당업자이면, 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 배양 기간을 설정할 수 있다.

또한, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포와 난소 체세포의 혼합 시의 비율은, 제작된 응집괴가 성숙 난포를 형성하는 한에 있어서 한정되지 않지만, 예를 들면 마우스의 경우에 있어서는, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포와 난소 체세포의 세포수의 비를, 약 2:1로 하는 것이 바람직하다.

또한, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포나 난소 체세포, 또는 난소 체세포를 포함하는 난소는, 동결 보존한 것을 이용할 수도 있다. 동결 보존 방법은, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 도입 공정 후의 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포나 난소 체세포의 동결 보존은 10% DMSO 용액이나 시판되는 동결제(셀뱅커(등록상표) 등)를 이용한 완만 동결법 등에 의해 행할 수 있다.

한편, 본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법에서 사용되는 난소 체세포는, 응집괴를 구성하는 다능성 줄기세포, EpiLCs 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포와 동일 종의 포유동물에서 유래하는 것이어도, 상이한 종의 포유동물에서 유래하는 것이어도 되지만, 동일 종의 포유동물에서 유래하는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 포유동물로서는, 상기 난모세포로의 분화능을 갖는 세포의 설명에 있어서 예시된 것과 마찬가지의 것을 들 수 있다.

본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법은, 상기 도입 공정의 후이며 상기 응집괴 형성 공정의 전에, 임의의 공정을 포함해도 된다. 임의의 공정으로서는, 상기 「미성숙 난모세포의 유도 방법」에 기재된 증식 공정, 선택 공정 등을 들 수 있다.

[배양 공정]

또한, 본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법은, 상기 응집괴 형성 공정의 후에, 배양 공정을 포함할 수 있다.

배양 공정에서는, 상기 응집괴 형성 공정 후의 응집괴를 콜라겐막 상에 옮기고, 배양하는 것이 바람직하다.

배양 조건으로서는, 응집괴를 배양하는 공지된 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 배양 온도는 30℃ 이상 37℃ 이하 정도로 할 수 있다. 배양 기간은, 마우스의 경우에는, 7일간 이상 35일간 이하 정도로 할 수 있고, 8일간 이상 30일간 이하 정도로 할 수 있다. 또한, 당업자이면, 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 배양 기간을 설정할 수 있다.

배양 공정에서 이용되는 배지로서는, 상기 증식 공정에서 증식용 배지로서 예시된 것을 사용할 수 있다. 한편, 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은 난모세포 형성 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있는 경우에는, 배지에 상기 발현 유도 물질 또는 상기 발현 안정화 물질을 첨가하여, 세포 내에서 난모세포 형성 유전자가 발현하고 있는 상태에서 배양한다.

배양 공정 후의 응집괴는, 2차 난포 구조를 가져, 난모세포를 다층화된 과립막 세포가 둘러싸고 있고, 추가로, 다층화된 과립막 세포를 둘러싸는 난포막(theca folic)이 형성되며, 난포막의 내측(theca interna)을 구성하고 있는 협막 세포(theca cell)가 황체화 호르몬 수용체(luterinzing hormone receptor)를, 과립막 세포는 난포 자극 호르몬 수용체(follicle stimulating hormone receptor)를 발현하고 있다.

이어서, 배양 공정에서 얻어진 난포를 비특허문헌 1에 기재된 방법을 이용하여 배양함으로써, 성숙 난모세포를 제작할 수 있다. 구체적으로는, 성숙 난모세포를 얻을 때까지의 공정을 성장 공정과 성숙 공정으로 나눌 수 있다.

[성장 공정]

성장 공정에서는, 배양 공정에서 얻어진 난포를 개개의 난포로 단리하고, 성장용 배지를 이용하여 배양한다.

배양 조건으로서는, 비특허문헌 1에 기재된 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 배양 온도는 30℃ 이상 37℃ 이하 정도로 할 수 있다. 배양 기간은, 마우스의 경우에는, 7일간 이상 15일간 이하 정도로 할 수 있고, 8일간 이상 13일간 이하 정도로 할 수 있다. 또한, 당업자이면, 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 배양 기간을 설정할 수 있다.

성장용 배지로서는, 비특허문헌 1에 기재된 조성의 배지를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 마우스의 경우에는, 배양 개시로부터 2일간은, 5% 소 태아 혈청(FCS), 2% 폴리바이닐피롤리돈(여기까지 Sigma사제), 150μM의 아스코르브산, 1×GlutaMAX, 1×페니실린/스트렙토마이신, 100μM의 2-머캅토에탄올, 55μg/mL의 피루브산 나트륨(여기까지 나칼라이 테스크사제), 0.1IU/mL의 난포 자극 호르몬(폴리스팀(등록상표), MSD사제), 15ng/mL의 BMP15(Bone morphogenetic protein 15), 및 15ng/mL의 GDF9(Growth differentiation factor 9)(여기까지 R&D Systems사제)를 함유하는 α-MEM을 이용하여 난포를 배양한다. 이어서, 배양 개시로부터 2일째에 상기 조성 중 BMP15 및 GDF9를 제외한 α-MEM으로 교환하고, 0.1%의 Type IV 콜라게나아제(MP Biomedicals사제) 중에서 난포를 배양한다. 이어서, 5% FCS 함유 α-MEM으로 수회 세정한 후, 난포를 상기 조성 중 BMP15 및 GDF9를 제외한 α-MEM을 이용하여 배양 개시로부터 11일째까지 배양한다.

성장 공정 후의 난포는, 포상(胞狀) 난포 구조를 갖고, 난핵포기의 난을 갖는 난구(卵丘) 난모세포 복합체를 형성하고 있다.

[성숙 공정]

성숙 공정에서는, 성장 공정에서 얻어진 난포를, 성숙용 배지를 이용하여 배양한다.

성숙용 배지로서는, 비특허문헌 1에 기재된 조성의 배지를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 마우스의 경우에는, 5% FCS, 25μg/mL의 피루브산 나트륨, 1×페니실린/스트렙토마이신, 0.1IU/mL의 난포 자극 호르몬, 4ng의 EGF(Epidermal Growth Factor), 및 1.2IU/mL의 hCG(Human chorionic gonadotropin, 약칭: 고나도트로핀, ASKA사제)를 함유하는 α-MEM을 들 수 있다.

성숙 공정 후의 난포는, 제 2 감수분열 중기의 난(2차 난모세포)까지 성숙하고 있다.

제 2 감수분열 중기의 난(2차 난모세포)인 것은, 예를 들면, 현미경 등을 이용한 육안에 의해 제 1 극체의 방출을 지표로 평가할 수 있다.

얻어진 성숙 난모세포(2차 난모세포)는, 불임 치료에 적합하게 이용된다. 즉, 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 상기 방법으로 얻어진 성숙 난모세포를 이용하는, 불임 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법을 이용하여 얻어진 성숙 난모세포는, 산업 동물의 효율적인 육종, 희소 동물의 번식을 위해서 적합하게 이용된다. 즉, 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 상기 방법으로 얻어진 성숙 난모세포를 이용하는, 산업 동물의 육종 방법 또는 희소 동물의 번식 방법을 제공한다.

한편, 상기 적용 대상이 되는 동물로서는, 포유동물이 바람직하다. 포유동물로서는, 상기에 예시된 것과 마찬가지의 것을 들 수 있다.

또한, 본 실시형태의 성숙 난모세포의 제작 방법을 이용하여 얻어진 성숙 난모세포는, 불임 원인의 구명, 폐경 질환의 메커니즘 해명에 도움이 될 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

(벡터의 구축)

CAG 프로모터 및 불안정화 도메인(DD)을 CAG-DD-hTFAP2C 플라스미드(참고문헌 6: 「Kobayashi T et al., "Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.", Nature, Vol. 546, No. 7658, p416-420, 2017.」)로부터 클로닝하고, 종래부터 사용하고 있는 PiggyBAC 벡터(참고문헌 7: 「Shimamoto S et al., "Hypoxia induces the dormant state in oocytes through expression of Foxo3", PNAS, https://doi.org/10.1073/pnas.1817223116, 2019.」)에 삽입하여, PB-CAG-DD 벡터를 제작하였다. 이어서, FIGLA, NOBOX, SOHLH1, LHX8, SUB1, STAT3, TBPL2 및 DYNLL1의 8개의 유전자의 cDNA를 수정 후 13.5일령의 암컷 마우스 난소의 cDNA로부터 증폭하고, 인퓨전 HD 클로닝 키트(타카라 바이오사제)를 이용하여, PB-CAG-DD 벡터에 클로닝하였다. 각 cDNA의 증폭은, 메이커의 프로토콜에 따라, KOD Fx Neo 또는 KOD Plus Neo DNA 폴리머라아제(TOYOBO사제)를 이용하여, PCR에 의해 행하였다.

(벡터의 트랜스펙션)

ES 세포는, 미리, 피더 세포를 이용하지 않고, 2i 및 LIF를 첨가한 무혈청 배지에서 유지 배양해 두었다(상기 참고문헌 3 참조). 또한, 미성숙 난모세포 및 성숙 난모세포로의 분화를 모니터할 수 있도록, 생식 세포 계열의 중요한 결정 인자인 Blimp1의 발현 제어하의 황색 형광 단백질(YFP)의 베리언트인 mVenus(membrane-targeted Venus)를 코딩하는 유전자, 생식 세포 및 난모세포 마커인 Stella의 발현 제어하의 개량된 시안 형광 단백질(Enhanced cyan fluorescent protein; ECFP)을 코딩하는 유전자, 및 활성화(성숙) 난모세포 마커인 Nucleoplasmin 2(Npm2)의 발현 제어하의 적색 형광 단백질 mCherry(membrane-targeted Cherry)를 코딩하는 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있는 마우스 ES 세포(Blimp1-mVenus: Stella-ECFP: Npm2-mCherry(BVSCNmC))를 이용하였다. 구축한 8개의 유전자를 포함하는 PB-CAG-DD 벡터를 Lipofectamine 2000에 의해 hyperactive PBase(hypBase) 플라스미드와 동시에 트랜스펙션하였다. 2i 및 LIF를 첨가한 무혈청 배지에서, 37℃에서 5일간 배양하여 증식시킨 후, 퓨로마이신 선택에 의해 단일 콜로니를 얻었다.

(미성숙 난모세포로의 분화 유도)

이어서, 10% 소 태아 혈청(FCS), 150μM의 아스코르브산, 1×Glutamax, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 55μM의 머캅토에탄올을 첨가한 S10 배지(StemPro(등록상표)-34 SFM, 라이프 테크놀로지스사제)에 0.5μM의 Shield1(클론테크사제)을 혼합한 배지(이하, 「난모세포 분화 유도 배지」라고 칭한다)를 분주한 세포 저접착 U 바닥 96웰 플레이트에, 퓨로마이신 선택 후의 1×10⁵개의 ES 세포를 옮기고, 37℃에서 5일간 배양하여 미성숙 난모세포로 분화 유도시켰다. 공초점 현미경(Carl Zeiss사제, 형번: Zeiss LSM 700)하에서 관찰한 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 있어서, 「난모세포 형성 유전자」란, FIGLA, NOBOX, SOHLH1, LHX8, SUB1, STAT3, TBPL2 및 DYNLL1의 8개의 유전자를 나타낸다. 「난모세포 형성 유전자 발현 OFF」는 Shield1을 포함하는 배지의 첨가 전의 세포이며, 「난모세포 형성 유전자 발현 ON」은 Shield1을 포함하는 배지를 첨가하고 5일간 배양한 후의 세포이다.

도 1로부터, 난모세포 형성 유전자의 발현이 OFF인 세포에서는, 콜로니를 형성하고 있고, Stella의 발현 제어하에서 발현되는 ECFP(Stella-ECFP)의 형광이 거의 보이지 않았다. 이에 반해서, 난모세포 형성 유전자의 발현이 ON인 세포에서는, 세포끼리가 뿔뿔이 흩어져 존재하고, Stella-ECFP의 강한 형광이 검출되어, 미성숙 난모세포로 분화 유도된 것이 시사되었다.

(성숙 난모세포의 제작)

이어서, 상기 (벡터의 트랜스펙션)에 있어서, 트랜스펙션 후, 37℃에서 5일간 배양하여 증식시킨 후, 퓨로마이신으로 선택한, 단일 콜로니의 ES 세포(1×10⁵개)를 상기 난모세포 분화 유도 배지에서, 3×10⁴개의 수정 후 12.5일령의 암컷 마우스 유래의 난소 체세포와 혼합하여 응집괴를 제작하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 난소 체세포는, 미리, 비특허문헌 1 등에 기재된 방법을 이용하여, 수정 후 12.5일령의 암컷 마우스로부터 난소를 적출하고, 당해 난소로부터 단리된 것을 사용하였다. 또한, 이어서, 해당 응집괴를 트랜스웰-COL막(Coaster사제) 상에 옮겨, 상기 난모세포 분화 유도 배지에서 28일간 배양하였다. 배양 개시로부터 2, 6, 8, 10 및 12일째의 응집괴에서의 각 마커의 발현을 공초점 현미경(Carl Zeiss사제, 형번: Zeiss LSM 700)하에서 관찰한 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 있어서, 상단에서는, 생식 세포 및 난모세포 마커인 Stella-ECFP의 형광에 의해, 난모세포를 가시화하였다. 하단에서는, 활성화(성숙) 난모세포 마커인 Nucleoplasmin 2(Npm2)의 발현 제어하에 발현시키고 있는 적색 형광 단백질 mCherry(Npm2-mCherry)의 형광에 의해, 난모세포를 가시화하였다.

도 2로부터, 배양 기간을 통하여, 세포에 있어서 Stella-ECFP의 형광은 계속해서 관찰되었다. 한편, 배양 개시로부터 8일째에는, Npm2-mCherry의 형광이 관찰되어(도 2 중의 「Day8」 하단의 화살표 참조), 난모세포의 성숙이 진행되고 있는 것이 나타났다.

또한, 배양 개시로부터 28일째에, 개개의 난포를, 첨예화 텅스텐 침을 이용하여 수동으로 단리하였다. 단리된 난포는, 2차 난포 구조를 갖고 있었다. 해당 난포를 비특허문헌 1에 기재된 「in vitro 성장 기간」 및 「in vitro 성숙 기간」에 있어서의 배양 조건하에서 배양함으로써, 포상 난포를 거쳐 제 2 감수분열 중기 난으로 성숙시켰다.

[실시예 2]

마우스 iPS 세포를 이용하여, ES 세포와 마찬가지로 난모세포로의 분화 유도에 대하여 검토하였다.

(벡터의 트랜스펙션)

iPS 세포는, 비특허문헌 1의 논문에 있어서 수립된 바이러스 버스터에 의해 제작된 마우스 BVSC iPS 세포를 이용하였다. 실시예 1에 있어서 구축한 8개의 유전자를 포함하는 PB-CAG-DD 벡터를 Lipofectamine 2000에 의해 hyperactive PBase(hypBase) 플라스미드와 동시에 마우스 BVSC iPS 세포에 트랜스펙션하였다. 2i 및 LIF를 첨가한 무혈청 배지에서, 37℃에서 5일간 배양하여 증식시킨 후, 퓨로마이신 선택에 의해, 단일 콜로니를 얻었다.

(미성숙 난모세포로의 분화 유도)

퓨로마이신 선택 후의 iPS 세포를, 실시예 1과 마찬가지의 방법을 이용하여, 37℃에서 5일간 배양하여 미성숙 난모세포로 분화 유도시켰다.

(성숙 난모세포의 제작)

이어서, 상기 (벡터의 트랜스펙션)에 있어서, 트랜스펙션 후, 37℃에서 5일간 배양하여 증식시킨 후, 퓨로마이신으로 선택한, 단일 콜로니의 iPS 세포(1×10⁵개)를 상기 난모세포 분화 유도 배지에서, 3×10⁴개의 수정 후 12.5일령의 암컷 마우스 유래의 난소 체세포와 혼합하여 응집괴를 제작하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 이어서, 해당 응집괴를 트랜스웰-COL막(Coaster사제) 상에 옮겨, 상기 난모세포 분화 유도 배지에서 21일간 배양하였다. 배양 개시로부터 21일째의 응집괴에서의 Stella-ECFP의 발현을 공초점 현미경(Carl Zeiss사제, 형번: Zeiss LSM 700)하에서 관찰한 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 있어서, 좌측의 상은 명시야상이고, 우측의 상은 생식 세포 및 난모세포 마커인 Stella-ECFP의 형광에 의해, 난모세포를 가시화한 형광상이다.

도 3으로부터, 배양 개시로부터 21일째의 세포에 있어서 Stella-ECFP의 형광이 관찰되었다. 이것으로부터, iPS 세포에 있어서도 ES 세포와 마찬가지로 난모세포로 분화 유도할 수 있었던 것이 확인되었다.

[실시예 3]

(난모세포 형성 유전자 중의 중요 인자의 동정)

난모세포 형성 유전자 중 중요 인자인 유전자를 동정하기 위해서, 도 4의 왼쪽의 도면에 기재된 유전자의 조합이 되도록, 실시예 1과 마찬가지의 방법을 이용하여, 합계 26종류의 벡터를 구축하였다. 이어서, 실시예 1과 마찬가지의 방법을 이용하여, 마우스 ES 세포(Blimp1-mVenus: Stella-ECFP: Npm2-mCherry(BVSCNmC))에 각 벡터를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후, 37℃에서 5일간 배양하여 증식시키고, 퓨로마이신으로 선택한, 단일 세포 유래의 ES 세포(1×10⁵개)를 상기 난모세포 분화 유도 배지에서, 3×10⁴개의 수정 후 12.5일령의 암컷 마우스 유래의 난소 체세포와 혼합하여 응집괴를 제작하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 이어서, 얻어진 응집괴를 실시예 1과 마찬가지의 방법을 이용하여, 21일간 배양하였다. 배양 후의 세포에 대하여, 각 세포주로부터 형성된 난모세포의 수를 계측하였다. 또, Stella 유전자의 하류에 발현시키고 있는 청색 형광 단백질 CFP의 형광 면적으로부터 산출된, 난모세포의 면적을 산출하였다. 이들 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4로부터, 난모세포 형성 유전자 중, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자가 다능성 줄기세포로부터 미성숙 난모세포로의 분화 유도 및 난모세포의 성숙에 중요한 인자인 것이 분명해졌다. 또한, FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자에 더하여, STAT3 유전자를 도입함으로써, 난모세포의 형성 효율이 보다 향상되는 것이 분명해졌다.

본 실시형태의 미성숙 난모세포의 유도 방법에 의하면, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 미성숙 난모세포를 유도할 수 있다. 상기 태양의 성숙 난모세포의 제작 방법에 의하면, 종래보다도 단기간의 배양으로 간편하게 다능성 줄기세포 등의 난모세포로의 분화능을 갖는 세포로부터 성숙 난모세포를 대량으로 제작할 수 있다.

Claims

FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 1 항에 있어서,
FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자를 상기 세포에 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
STAT3의 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 4 항에 있어서,
SOHLH1, SUB1 및 DYNLL1로 이루어지는 3종류의 유전자를 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 다능성 줄기세포인, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자의 발현이 발현 유도 물질의 존재에 의해 유도되도록 제어되어 있거나, 혹은
상기 유전자의 발현이 발현 안정화 물질의 존재에 의해 안정화되도록 제어되어 있고,
상기 도입 후에, 상기 세포를 증식시키는 것과,
상기 증식 후에, 상기 발현 유도 물질을 배지에 첨가하여, 상기 유전자의 발현을 유도하는 것, 또는 상기 증식 후에, 상기 발현 안정화 물질을 배지에 첨가하여, 상기 유전자의 발현을 안정화하는 것
을 추가로 포함하는, 미성숙 난모세포의 유도 방법.
FIGLA, NOBOX, LHX8 및 TBPL2로 이루어지는 4종류의 유전자, 또는 그들의 전사물 혹은 발현 단백질을 다능성 줄기세포, 에피블라스트양 세포 및 시원 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 세포에 도입하는 것과,
도입 후의 상기 세포 및 난소 체세포를 공배양하는 것
을 포함하는, 성숙 난모세포의 제작 방법.
제 8 항에 있어서,
STAT3의 유전자, 또는 그의 전사물 혹은 발현 단백질을 상기 세포에 추가로 도입하는 것을 포함하는, 성숙 난모세포의 제작 방법.