CN110004112B - 一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂ii期的卵母细胞的方法 - Google Patents

一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂ii期的卵母细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，该方法分为三步，首先将细胞密度为80％的多能干细胞更换PGC‑m培养基，于35～40℃、3％～6％CO2下培养10天，得原始生殖细胞样细胞；然后将形成的原始生殖细胞样细胞转移至PF‑m培养基中，于35～40℃、8％～12％CO2下培养5天，得卵泡样结构；最后将形成的卵泡样结构转移至OLC‑m培养基中孵育10～15天，得到停止在减数分裂II期的卵母细胞样细胞。采用本发明中的方法，效率高、时间短，而且诱导出的卵母细胞样细胞可排除第一极体，形成次级卵母细胞。该方法为研究人类雌性生殖细胞的形成和卵子发生提供了新的手段。

Description

一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵 母细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法。
背景技术
在没有与原肠胚形成相关的形态发生事件存在的情况下，通过体外培养产生生殖细胞，是理解体外配子发生整个过程的有效途径之一。许多研究表明，人和小鼠多能干细胞通过重建体外配子发生过程，可以产生功能性雄性配子和卵母细胞样细胞(OLCs)。通常，通过悬浮培养将多能干细胞分化形成类胚体(EB)，其产生的类固醇激素可以促进原始生殖细胞样细胞(PGCLC)的形成，然后将PGCLC在含有细胞因子(例如BMP4，SCF，EGF和LIF)的培养基中继续培养，发育形成聚集体或卵泡样结构，在添加猪卵泡液和类固醇激素的条件下，单层培养人羊水干细胞(hAFSCs)也可以分化为OLCs。首次证实小鼠胚胎干细胞在悬浮培养的条件下，可在30天左右自发分化形成OLCs，然而，OLC的染色体松散分布异常，难以观察到清晰的细胞核。有研究证实通过体外构建重组卵巢，即来自小鼠胚胎干细胞的PGCLC和来自E12.5雌性性腺的体细胞，通过体外培养即可获得成熟卵母细胞。尽管这种方法产生了完全成熟的卵母细胞，而且可以在体外进行受精，但它不能用于人类，因为胎儿性腺体细胞有悖伦理。最近，有研究证实，用人类多能干细胞诱导的卵原细胞样细胞与小鼠胚胎卵巢体细胞重建并形成异种卵巢，其内携带具有表观遗传重编程的生殖细胞并进入减数分裂前期。值得一提的是，从小鼠多能干细胞中提取生殖细胞和雄性配子的方法，为成熟卵母细胞的体外形成奠定了基础，但哺乳动物物种间生殖细胞发育的差异也是需要考虑的问题。最近，另一份研究证实，过表达DAZL和BOULE基因，可使人胚胎干细胞在体外培养添加GDF9和BMP15形成由卵母细胞和颗粒细胞混合的卵泡样结构(FLs)，类似于初级卵泡，且卵母细胞能够进入减数分裂。
将几种生殖细胞特异性标记物Oct4，Stella，Gdf9和Daz1与GFP融合，以构建报告系统用于监测体外卵子发生的进程。研究显示，构建人BMP15-EGFP报告基因并用于体外监测人OLC的形成，发现骨形态发生蛋白15(BMP15)是生殖细胞和卵母细胞功能发育的关键因子，只有当人羊水干细胞分化为卵母细胞样细胞时才会被激活。Oct4表达在卵泡样结构中显示上调。结合Oct4和c-Kit(也称为CD117)或EpCAM(上皮细胞粘附分子)纯化能够富集具有减数分裂能力的卵母细胞。此外，在PGCLC形成期间发现了涉及生殖细胞命运调节的几个关键因子。SOX17是来自内胚层谱系的标记基因，在多能干细胞向hPGCLC命运形成时其关键作用。由BMP4激活的BLIMP1直接结合抑制细胞增殖基因的表达并诱导AP2γ，其与PRDM14一起启动PGCLC特异性命运。为证实原始卵泡的形成，生殖细胞需要表达FIGLA和联会复合蛋白3(SCP3)，然后激活透明带(ZP)糖蛋白2合成。透明带由三种硫酸化糖蛋白ZP1，ZP2和ZP3组成，是卵母细胞的关键部分，在卵子发生，受精和植入过程中起着重要作用。此外，DAZL和BOULE是两种生殖细胞特异性RNA结合蛋白，能调节OCT4，BMP15，STELLA，VASA和PRDM1的表达，以促进PGC形成并进入减数分裂并调节配子的发育。卵母细胞与周围颗粒细胞之间的细胞间通讯对卵泡的正常功能和发育至关重要。这种相互作用由间隙连接蛋白CX37和CX43相关。颗粒细胞特异性标志物FOXL2在卵母细胞生长中也具有非常重要的作用。这些重要基因的调节功能有助于我们从审视来源于人多能干细胞的PGCLC和OLC的形成。
通常，在EB形成后开始诱导iPGC，当细胞因子和外源蛋白调节多能性降低时，胚胎干细胞进入由EB产生的类固醇激素刺激的自发分化，并进一步形成iPF和OLC。然而，EB的过程效率低且耗时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，该方法采用三步法将多能干细胞通过无饲养层单层培养得到卵母细胞样细胞，效率高、时间短，而且诱导出的卵母细胞样细胞可排除第一极体，形成次级卵母细胞。该方法为研究人类雌性生殖细胞的形成和卵子发生提供了新的手段。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，该方法会用到三种培养基，分别为：用于将多能干细胞分化为原始生殖细胞样细胞的PGC-m培养基、用于将原始生殖细胞分化为卵泡样结构的PF-m培养基以及用于卵母细胞的体外成熟的OLC-m培养基。上述三种培养基的组成如下：
PGC-m培养基：以α-MEM培养基为基本培养基，以α-MEM培养基的质量计补充有3～6％的血清替代物(KSR；Gibco)和3～6％的牛卵泡液(bFF)，并添加有0.5～2％的L-谷氨酰胺(Invitrogen)、0.5～2％的非必需氨基酸(NEAA；Gibco)和0.5～2％的抗生素(青霉素或链霉素)，同时还添加有0.05～0.15mM的b-巯基乙醇(b-ME，Gibco)；另外，还添加在培养基中的浓度为40～60ng/mL的骨形态发生蛋白(BMP4，PeproTech)、150～250ng/mL的白细胞抑制因子(LIF，Sino Biological)、80～120ng/mL的干细胞因子(SCF，PeproTech)、40～60ng/mL的表皮细胞生长因子(EGF，stemRD)和5～15μmol/L的ROCK抑制剂。
PF-m培养基：以α-MEM培养基为基础培养基，以α-MEM培养基的质量计添加有5％的KSR、5％的bFF、1％的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸和1％的抗生素，还添加有0.1mM的b-巯基乙醇。
OLC-m培养基：以TCM 199培养基为基础培养基，添加有在培养基中浓度为3mg/mL的牛血清蛋白(BSA，Sigma)、5U/mL的卵泡刺激素(FSH，Sigma)、10U/mL的人绒毛膜促性腺激素(hCG，Sigma)、10IU/mL的孕马血清促性腺激素(PMSG，Sigma)、0.23μmol/L的丙酮酸钠和10ng/mL的表皮生长因子(EGF，Sigma)，还添加有占TCM 199培养基质量1％的胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS，Gibco)。
本发明中的牛卵泡液(bFF)，从西安的三桥屠宰场许可的当地屠宰场收集成熟奶牛的牛卵巢，用37℃的无菌盐水保护，并在4～6小时内运送到实验室。使用具有18号针头的10mL注射器从卵泡中吸出bFF，并且通过在4℃下以3000g离心20分钟从bFF移除卵丘卵母细胞复合物(COCs)和颗粒细胞，bFF通过0.22μm无菌过滤器，然后等分至5mL/管中以备将来使用。将等分样品储存在-80℃，积累到一定数量后，干冰运输回宁夏医科大学实验室，并于-80℃保存。
本发明中使用的多能干细胞(hPSC)包括两种细胞系：hiPSC系，购自斯丹赛生物科技有限公司，hESC H9系来自ATCC。hiPSC在mTeSR-1(Stem Cell Technology)中在Matrigel(Becton Dickinson)上生长直至80％汇合。进行三步诱导程序以产生OLCs。具体方法如下：
(1)从多能干细胞(hiPSC或hESC)诱导形成原始生殖细胞(iPGC)：将预先铺有Matrigel的每35mm平板3×105个细胞的PSC接种于PGC-m培养基中，并在35～40℃、3％～6％(v/v)CO2条件下培养10天，培养过程中每天更换培养基。在诱导后的第二天，PSC变成扁平的上皮样形态，细胞集落之间分界明显；在分化期间，逐渐形成SOX17阳性细胞簇(直径25至50μm)；诱导后8～10天，形成突出于单层细胞的细胞集落聚集体。
(2)原始生殖细胞(iPGC)诱导形成原始卵泡(iPF)：在诱导后第11天，将细胞集落转移至PF-m培养基中并培养5天，培养过程中每天更换一半量的培养基。约第15天，在显微镜下明显可见原始卵泡样的结构(直径50至200μm)。
(3)原始卵泡(iPF)的卵母细胞样细胞(OLC)的体外成熟：将iPF以50μL/液滴培养基体积培养，用矿物油覆盖，并在OLC-m中孵育10-15天，每2天更换一半培养基。然后可以观察到直径从50到150μm变化的OLC。
本发明中处理人卵巢和卵母细胞的方案经宁夏医科大学伦理审查委员会和宁夏医科大学总院伦理审查委员会批准。
本发明的有益效果是：本发明采用三步方法，卵母细胞样细胞(OLCs)能够从多能干细胞(hPSC)通过单层培养中获得，且效率高、时间短，所诱导而来的卵母细胞样细胞可排除第一极体，形成次级卵母细胞，为研究人类雌性生殖细胞的形成和卵子发生提供了新的手段。
附图说明
图1为多能干细胞在诱导后不同天数(D0-D10)下细胞形态的变化；
图2为诱导后第5天(D5)和第10天(D10)的hiPSC(Ctrl)和iPGC中的多能基因OCT4、SOX2和PRDM14的mRNA表达；
图3为通过qRT-PCR评估iPGC中激素产生相关基因P450，CYP17和FSHR的mRNA表达；
图4为诱导10天后，hiPSC和iPGC中c-KIT表达的FACS图；
图5为通过qRT-PCR检测在iPGC细胞中PGC标记基因BLIMP1、TFAP2C、SOX17和TmRNA的表达检测；
图6为诱导7天左右形成的生殖细胞集落；
图7为对分化后形成的生殖细胞集落进行免疫荧光染色，生殖细胞标记蛋白FRAGILIS、DDX4和NOBOX的表达；
图8为诱导后12～20天，细胞集落逐渐形成不同发育阶段的卵泡样结构；
图9为将构建的BMP15-EGFP载体，对诱导15天的卵泡样结构(iPFs)进行转染，显示EGFP蛋白仅在OLC里表达；
图10为采用蛋白免疫印迹技术，对分化后细胞中卵母细胞特异性蛋白BMP15和OCT4表达的检测；
图11为在诱导分化过程中，用荧光定量PCR技术检测卵泡发生相关基因DAZL、FIGLA和IFITM3的表达；
图12为用RT-PCR技术检测诱导不同天数下，颗粒细胞标记基因FOXL2的表达情况；
图13为诱导15天后，将pBMP15-EGFP载体转染卵泡样结构，同时用细胞免疫荧光染色技术检测卵泡细胞特异性蛋白FOLX2和生殖细胞特异性蛋白DDX4的表达；
图14为来源于卵泡样结构的卵丘卵母细胞复合体(COCs)和卵母细胞样细胞OLC的形态，细胞核被DAPI染色；
图15为诱导25天后，采用免疫印迹技术检测卵母细胞特异性蛋白ZP2和ZP3的表达；
图16为通过pBMP15-EGFP载体瞬时转染诱导后25天的卵泡样结构，同时检测卵母细胞特异性蛋白SCP3和ZP2的表达；
图17为用免疫荧光技术检测OLC中缝隙连接蛋白CX37的表达；人卵母细胞(hOocyte)用作阳性对照；
图18为经体外成熟后OLC的形态，箭头所示为GV期的OLC；
图19为用细胞核染料DAPI对OLC进行染色；
图20为经体外成熟培养后，M II期的OLC，箭头所示为排出到卵周隙的第一极体，细胞核用DAPI复染；
图21为用PCR技术检测，诱导不同天数后减数分裂相关基因SCP3和DMC1的表达情况以及采用免疫印迹技术，检测诱导20天后减数分裂蛋白SCP3的表达(左)和灰度值分析(右)；
图22和图23为孤雌激活后，形成的1-，2-细胞和早期桑椹胚阶段的胚胎样结构，细胞核用DAPI复染；
图24为用免疫荧光技术检测孤雌胚胎中生殖细胞DDX4和c-KIT的表达，细胞核用DAPI复染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，包括以下步骤：
(1)诱导人多能干细胞形成原始生殖细胞样细胞：将多能干细胞接种至PGC-m培养基中，于37℃、5％CO2条件下培养10天，得原始生殖细胞样细胞(iPGC)，培养过程中每天对培养基进行更换；PGC-m培养基为补充有5％的KSR和5％的bFF的α-MEM培养基，并且，PGC-m培养基中还添加有如下组分：
1％的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的b-巯基乙醇、1％的青霉素、50ng/mL骨形态发生蛋白、200ng/mL的白细胞抑制因子、100ng/mL的干细胞因子、50ng/mL的表皮细胞生长因子和10μmol/LROCK抑制剂；
(2)诱导原始生殖细胞形成卵泡样结构：将步骤(1)诱导形成的原始生殖细胞转移至PF-m培养基中，于37℃、10％CO2条件下培养5天，得原始卵泡样结构(iPF)，培养过程中每天更换一半量的培养基；PF-m培养基以α-MEM为基本培养基，添加如下组分形成：
5％的KSR、5％的bFF、1％的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的的b-巯基乙醇和1％的链霉素；
(3)卵母细胞的体外成熟：将步骤(2)诱导形成的原始卵泡样结构转移至50μL液滴培养基中，用矿物油覆盖，然后置于OLC-m培养基孵育10天，每两天更换一半培养基，得到停滞在减数分裂II期的卵母细胞样细胞；OLC-m培养基以TCM 199为基本培养基，添加如下组分形成：
3mg/mL的牛血清蛋白、5U/mL的卵泡刺激素、10U/mL的人绒毛膜促性腺激素、10IU/mL的孕马血清促性腺激素、0.23μmol/L的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子和1％的胰岛素-转铁蛋白-硒。
实施例二
一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，包括以下步骤：
(1)诱导人多能干细胞形成原始生殖细胞样细胞：将多能干细胞接种至PGC-m培养基中，于35℃、3％CO2条件下培养10天，得原始生殖细胞样细胞(iPGC)，培养过程中每天对培养基进行更换；PGC-m培养基为补充有3％的KSR和6％的bFF的α-MEM培养基，并且，PGC-m培养基中还添加有如下组分：
0.5％的L-谷氨酰胺、2％的非必需氨基酸、0.15mM的b-巯基乙醇、1.5％的青霉素、40ng/mL骨形态发生蛋白、250ng/mL的白细胞抑制因子、80ng/mL的干细胞因子、60ng/mL的表皮细胞生长因子和5μmol/LROCK抑制剂；
(2)诱导原始生殖细胞形成卵泡样结构：将步骤(1)诱导形成的原始生殖细胞转移至PF-m培养基中，于35℃、8％CO2条件下培养5天，得原始卵泡样结构(iPF)，培养过程中每天更换一半量的培养基；PF-m培养基以α-MEM为基本培养基，添加如下组分形成：
5％的KSR、5％的bFF、1％的L-谷氨酰胺、0.5％的非必需氨基酸、0.1mM的b-巯基乙醇、1％的链霉素和1％的的青霉素；
(3)卵母细胞的体外成熟：将步骤(2)诱导形成的原始卵泡样结构转移至50μL液滴培养基中，用矿物油覆盖，然后置于OLC-m培养基孵育10天，每两天更换一半培养基，得到停滞在减数分裂II期的卵母细胞样细胞；OLC-m培养基以TCM 199为基本培养基，添加如下组分形成：
3mg/mL的牛血清蛋白、5U/mL的卵泡刺激素、10U/mL的人绒毛膜促性腺激素、10IU/mL的孕马血清促性腺激素、0.23μmol/L的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子和1％的胰岛素-转铁蛋白-硒。
实施例三
一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，包括以下步骤：
(1)诱导人多能干细胞形成原始生殖细胞样细胞：将多能干细胞接种至PGC-m培养基中，于40℃、6％CO2条件下培养10天，得原始生殖细胞样细胞(iPGC)，培养过程中每天对培养基进行更换；PGC-m培养基为补充有6％的KSR和3％的bFF的α-MEM培养基，并且，PGC-m培养基中还添加有如下组分：
2％的L-谷氨酰胺、0.5％的非必需氨基酸、0.05mM的b-巯基乙醇、0.5％的青霉素、60ng/mL骨形态发生蛋白、150ng/mL的白细胞抑制因子、120ng/mL的干细胞因子、40ng/mL的表皮细胞生长因子和15μmol/LROCK抑制剂；
(2)诱导原始生殖细胞形成卵泡样结构：将步骤(1)诱导形成的原始生殖细胞转移至PF-m培养基中，于40℃、12％CO2条件下培养5天，得原始卵泡样结构(iPF)，培养过程中每天更换一半量的培养基；PF-m培养基以α-MEM为基本培养基，添加如下组分形成：
5％的KSR、5％的bFF、1％的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的的b-巯基乙醇和0.5％的链霉素；
(3)卵母细胞的体外成熟：将步骤(2)诱导形成的原始卵泡样结构转移至50μL液滴培养基中，用矿物油覆盖，然后置于OLC-m培养基孵育15天，每两天更换一半培养基，得到停滞在减数分裂II期的卵母细胞样细胞；OLC-m培养基以TCM 199为基本培养基，添加如下组分形成：
3mg/mL的牛血清蛋白、5U/mL的卵泡刺激素、10U/mL的人绒毛膜促性腺激素、10IU/mL的孕马血清促性腺激素、0.23μmol/L的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子和1％的胰岛素-转铁蛋白-硒。
结果分析
以实施例一为例，如图1所示，在培养基PGC-m中培养10天后hiPSC的形态变为具有不同细胞边界的扁平上皮细胞类型。在从第0天到第10天的分化期间，多能基因OCT4，SOX2和PRDM14的表达显着降低，如图2所示。为了评估分化过程中雌性激素的合成，确定了与雌激素生物合成有关的基因的表达，并显示雌激素生物合成中涉及的两个关键基因的表达，P450芳香酶(P450)和细胞色素P45017α-羟化酶(CYP17)，以及卵泡刺激素受体(FSHR)的基因显著增加，如图3所示，其在hiPSC中检测不到，表明分化细胞内的颗粒样细胞产生激素以刺激iPGCs的发育。此外，c-KIT(配子发生和卵母细胞成熟的关键因子)的表达水平从hiPSC中的0.45％增加至iPGC中的50.6％，如图4所示。
在iPGCs的晚期(第10天)，原始生殖细胞相关标志物BLIMP1，TFAP2C和SOX17的表达相对于iPGC的早期阶段(第5天)显著升高，如图5所示。另外，在细胞集落中还观察到FRAGILIS，DDX4和NOBOX的表达，如图6和图7所示，这些对于卵泡发生和卵母细胞特异性基因表达的调节是必需的。这些发现表明，人类iPSCs可以通过iMeLCs阶段分化为晚期PGCs和颗粒样细胞的。
继续诱导第10天至第15天时，细胞逐渐形成来集落，其形态显示出与具有颗粒细胞和卵丘卵母细胞复合物(COC)结构的原始卵泡相似的结构，在此阶段，从细胞集落中释放出含有颗粒细胞的原始卵泡(iPFs)，并观察到不同大小的iPFs，一些附着细胞培养皿底部，一些漂浮在细胞悬液中，如图8所示。将BMP15启动子指导的EGFP转染到诱导了15天的iPFs中，显示具有绿色荧光，如图9所示，表明卵母细胞特异性BMP15，其与GDF9具有高度同源性并且在卵母细胞成熟和卵母细胞成熟中起关键作用，表明卵母细胞在iPF中被激活。蛋白免疫印迹分析进一步证明，BMP15表达在iPGC和iPF阶段中被激活，并且在同一阶段，OCT4表达显着降低，如图10所示。
为了进一步证实iPFs，进行了qRT-PCR测定以测量卵母细胞特异性标志物的表达。结果显示DAZL和FIGLA表达被显着激活，并且IFITM3也被上调，如图11所示。为了确定iPF中是否有颗粒细胞的存在，在15天内发现颗粒细胞标记物FOXL2，但在对照中不存在，如图12所示；然后使用BMP15阳性iPF与抗FOXL2和抗VASA抗体进行免疫染色，其中VASA是生殖细胞谱系中的独特蛋白质，并且显示BMP15/VASA阳性OLC被FOXL2阳性细胞包围，一些FOXL2阳性细胞集落不呈现BMP15阳性信号，表明iPF结构是由VASA和BMP15表达阳性的生殖细胞和FOXL2表达阳性的颗粒细胞共同组成。还检查了iPFs中P450，CYP17和FSHR的表达，发现与来自人卵巢组织的对照相比，iPFs具有更高水平的雌激素生物合成相关基因表达，如图13所示。这些结果表明iPFs来源于iPGCs，可以表达多种雌性生殖细胞相关的标记物。
在诱导15至20天后，可以观察到具有大核的卵母细胞。收获分离的iPF，然后在OLC-m中培养10天，从iPF分离的OLC以各种尺寸(直径50-150μm)呈现并漂浮在培养基中。偶尔，从COC分离的一些OLC具有透明带(ZP)并且被颗粒状细胞包围，如图14所示；具有ZP的OLC能够通过显微操作仪的持针器拾取，尽管薄的ZP易碎并且极难用微量注射器操作。通过免疫细胞化学和蛋白质印迹实验证实OLC中的ZP2和ZP3表达，如图15所示；同时检测到SCP3和ZP2的表达，两者的表达标志着已形成具有透明带OLC已经形成原始卵泡，并进入减数分裂时期。ZP糖蛋白2合成的标记，并证实SCP3以及ZP2在OLC中共定位，但在包围的颗粒细胞中没有，如图16所示。此外，在来自hESC的BMP15阳性iPF中也可检测到SCP3蛋白。由于CX37介导卵母细胞和卵巢体细胞间隙连接通讯的形成，主要在卵母细胞膜上表达。为进一步确定颗粒细胞与OLCs之间的联系，用抗CX37进行了免疫细胞化学分析。结果显示CX37确实在OLCs中表达，但是，在OLCs中的表达较低，而正常人卵母细胞中的CX37蛋白分布更广泛，且存在密集的点状分布现象，如图17所示。
在诱导后20～30天，将OLC从COCs中分离出来，显示OLC与处于生发泡(GV)阶段与正常人卵母细胞形态极为相似，如图18所示。DAPI染色显示OLC中具有不同大小的细胞核，并且在单独的OLC中观察到第一极体并通过DAPI染色证实，如图19和图20所示。此外，检测到减数分裂特异性标记基因SCP3和DMC1的表达，发现这些基因在OLC中高度表达如图21所示，但在iPF阶段不存在。这些结果表明OLCs进入减数分裂II期。从理论上讲，高质量的MIIOLC可以储存并用于体外受精。
在OLC-m中继续培养OLC长达35天，一些OLC开始自发发育成与植入前胚胎相似的多细胞结构。核染色显示2-细胞和多细胞结构(图22)，表明OLC是孤雌激活的。桑椹胚阶段胚胎用DAPI染色，并显示胚胎内的多个细胞核(图23)。为了阐明胚胎样结构，进行了IF分析并显示VASA和c-KIT在源自OLC的单性生殖激活胚胎中表达(图24)，表明VASA和c-KIT参与孤雌胚胎的形成。在生殖细胞的形成和分化过程中，孤雌激活的胚胎样结构同样具有一定的发育潜力。在未来的研究中，优化MII OLC的培养条件和揭示OLC的孤雌激活的原理有助于揭示体外OLCs的发育能力。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (6)

1.一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)诱导人多能干细胞形成原始生殖细胞样细胞：待无饲养层培养条件下培养的人多能干细胞密度为80～85％时，更换PGC-m培养基，于35～40℃、3％～6％CO2条件下培养10天，得原始生殖细胞样细胞，培养过程中每天对培养基进行更换；所述人多能干细胞为hiPSC或hESC；所述PGC-m培养基为补充有KSR和bFF的α-MEM培养基，并且，所述PGC-m培养基中还添加有如下组分：
L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、b-巯基乙醇、抗生素、骨形态发生蛋白、白细胞抑制因子、干细胞因子、表皮细胞生长因子和ROCK抑制剂；
其中，所补充的KSR和bFF均占α-MEM培养基质量的3～6％，所添加的L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素均占α-MEM培养基质量的0.5～2％；所添加的b-巯基乙醇为0.05～0.15mM；所添加的骨形态发生蛋白、白细胞抑制因子、干细胞因子、表皮细胞生长因子和ROCK抑制剂在培养基中的浓度分别为：40～60ng/mL、150～250ng/mL、80～120ng/mL、40～60ng/mL和5～15μmol/L；
(2)诱导原始生殖细胞形成卵泡样结构：将步骤(1)诱导形成的原始生殖细胞转移至PF-m培养基中，于35～40℃、8％～12％CO2条件下培养5天，得原始卵泡样结构，培养过程中每天更换一半量的培养基；所述PF-m培养基以α-MEM为基础培养基，添加如下组分形成：
KSR、bFF、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、b-巯基乙醇和抗生素；
PF-m培养基中所添加的KSR、bFF、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素分别占α-MEM培养基质量的5％、5％、1％、1％、1％；所添加的b-巯基乙醇为0.1mM；
(3)卵母细胞的体外成熟：将步骤(2)诱导形成的原始卵泡样结构转移至液滴培养基中，用矿物油覆盖，然后置于OLC-m培养基孵育10～15天，每两天更换一半培养基，得到停滞在减数分裂II期的卵母细胞样细胞；所述OLC-m培养基以TCM 199为基础培养基，添加如下组分形成：
牛血清蛋白、卵泡刺激素、人绒毛膜促性腺激素、孕马血清促性腺激素、丙酮酸钠、表皮生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒。
2.根据权利要求1所述的诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于：PGC-m培养基中所补充的KSR和bFF均占α-MEM培养基质量的5％；所添加的L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素均占α-MEM培养基质量的1％；所添加的b-巯基乙醇为0.1mM；所添加的骨形态发生蛋白、白细胞抑制因子、干细胞因子、表皮细胞生长因子和ROCK抑制剂在培养基中的浓度分别为：50ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL和10μmol/L。
3.根据权利要求1所述的诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中多能干细胞在37℃、5％CO2条件下进行培养。
4.根据权利要求1所述的诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中原始生殖细胞在37℃、10％CO2条件下进行培养。
5.根据权利要求1所述的诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于：OLC-m培养基中所添加的牛血清蛋白、卵泡刺激素、人绒毛膜促性腺激素、孕马血清促性腺激素、丙酮酸钠和表皮生长因子在培养基中的浓度分别为：3mg/mL、5U/mL、10U/mL、10IU/mL、0.23μmol/L、10ng/mL，所添加的胰岛素-转铁蛋白-硒占TCM 199培养基质量的1％。
6.根据权利要求1所述的诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于：所述抗生素为青霉素和/或链霉素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN115197901A (zh) * 2021-04-10 2022-10-18 南京医科大学 一种人的新型超潜能性干细胞体外分化为类卵母细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660500A (zh) * 2012-05-28 2012-09-12 安徽农业大学 牛iPS细胞诱导分化形成卵母细胞的方法
CN108368483A (zh) * 2015-09-17 2018-08-03 学校法人东京农业大学 将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660500A (zh) * 2012-05-28 2012-09-12 安徽农业大学 牛iPS细胞诱导分化形成卵母细胞的方法
CN108368483A (zh) * 2015-09-17 2018-08-03 学校法人东京农业大学 将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human Amniotic Fluid Stem Cells Possess the Potential to Differentiate into Primordial Follicle Oocytes In Vitro;Xiaoli Yu等;《Biology of Reproduction》;20140226;第90卷(第4期);73：1–11 *
Oocytes from stem cells;U.C. Sarma等;《Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology》;20181231;第55卷;第14-22页 *
人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究;俞晓丽;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》;20150215(第2015年02期);E059-24 *
人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究;王宁;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20200215(第2020年02期);E059-27 *
牛卵泡液对卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响;李向城等;《第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集》;20061031;第10卷(第1期);第446-450页 *

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