CN102533778A - 一种基于Figla基因的超表达促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Figla基因的超标达促细胞向雌性生殖细胞分化的方法，Figla基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。Figla基因被标记后转染多能性干细胞以促进多能性干细胞向雌性生殖细胞分化或转分化的应用。pDsRed1-N1-Figla转染mESCs后，RFP表达于细胞克隆边缘的分化细胞，而在克隆边缘光滑处未见表达；转染mESCs在传代后成片状生长，大部分不再形成克隆。说明Figla基因促进了mESCs的分化。

Description

一种基于Figla基因的超表达促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于Figla基因的超表达促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法。

背景技术

雌性生殖细胞的发生是指雌性配子的形成、发育和成熟，这包括原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)的迁移、卵原细胞的增殖、卵泡的发生以及卵母细胞成熟。在卵巢中，原始卵泡是生殖系统最基本的单位，也是发育成优势卵泡的基础。研究结果显示，众多对卵泡和胚胎形成起调控作用的转录因子都是从早期卵泡的生长发育开始起作用的，所以早期卵泡的调控十分重要。

生殖系a因子(Figla)是第一个生殖细胞特异表达的转录因子，对早期卵泡发育中的关键基因进行调控，能直接影响原始卵泡的形成(Choi Y，Rajkovic A.Genetics of early mammalian folliculogenesis[J].Cellular andMolecular Life Sciences，2006，63(5)：579-590；Soyal S M，Amleh A，Dean J.FIGα，a germ cell-specific transcription factor required for ovarian follicleformatiaon[J].Development，2000，127：4645-4654.)。小鼠的Figla最早可以在13.5d的雌性胚胎的生殖嵴中表达，并且在卵泡和生殖细胞簇的发育过程中持续表达，对于Zp基因的表达、透明带的形成具有调节作用(Huntriss J，Gosden R，Hinkins M et al.Isolation，characterization and expression of thehuman Factor In the Germline alpha(FIGLA)gene in ovarian follicles andoocytes[J].Molecular Human Reproduction，2002，8(12)：1087-1095.)。

对于雌性胚胎，缺乏Figla不会影响生殖细胞的迁移和增殖，生殖嵴也会正常形成出现，但是出生后卵母细胞会迅速退化消失，不能形成原始卵泡。而且敲除Figla基因会导致雌鼠不孕(Liang L，Soyal SM，Dean J.FIGα，a germcell specific transcription factor involved in the coordinate expression of the zonapellucida genes[J].Development，1997，124：4939-4949.)。

人类的Figla缺失或突变可能会引起不同程度的卵巢发育或卵母细胞成熟障碍，促使卵巢早衰(POF)、不孕的发生(Suzumori N，Pangas SA，RajkovicA et al.Candidate genes for premature ovarian failure[J].Current medicinalchemistry，2007，14(3)：353-357；Van Dooren MF，Bertoli-Avella AM，Oldenburg RA.Premature ovarian failure and gene polymorphisms[J].Currentopinion in obstetrics & gynecology，2009，21(4)：313-317.)。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。已有研究证实干细胞可以在体外分化为早期生殖细胞，甚至进一步分化为卵母细胞或精子(Hübner K，Fuhrmann G，Christenson LK et al.Derivation ofoocytes from mouse embryonic stem cells[J].Science，2003，300：1251-1256；Geijsen N，Horoschak M，Kim K et al.Derivation of embryonic germ cells andmale gametes from embryonic stem cells[J].Nature，2004，427：148-154.)。有研究发现超表达Dazl或其家族基因可促进胚胎干细胞向生殖细胞分化(YuZ，Ji P，Cao J et al.Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stemcells[J].J Mol Cell Biol，2009，1：93-103.Kee K，Angeles VT，Flores M et al.Human DAZL，DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell andhaploid gamete formation[J].Nature，2009，462：222-225.)。借助外源性转录因子和基因可以使终末分化的体细胞重编程为诱导型的多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouseembryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell，2006，126(4)：663-676.)。而且最近的报道显示，借助特异的外源性转录因子可使终末分化的体细胞转分化为肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等(Uhlenhaut N H，JakobS，Anlag K et al.Somatic sex reprogramming of adult ovaries to testes by FOXL2ablation[J].Cell，2009，139(6)：1130-1142.Sekiya S，Suzuki A.Directconversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors[J].Nature，2011，475(7356)：390-393.Pang Z P，Yang N，Vierbuchen T et al.Induction of human neuronal cells by defined transcription factors[J].Nature，2011，476(7359)：220-223.Efe J A，Hilcove S，Kim J et al.Conversion of mousefibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy[J].NatCell Biol，2011，13(3)：215-222)。

然而，已有的报道诱导多能性干细胞向生殖细胞分化尤其卵母细胞分化的数量有限，诱导效率和重复性较差，诱导过程长，效果不稳定，因此很难在体内、体外深入探讨相关细胞因子、微环境和一些关键基因在干细胞向生殖细胞发育分化过程中的作用和机理。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于Figla基因的超表达进而促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法，通过表达外源Figla基因促进干细胞或体细胞体外向雌性生殖细胞分化，可提高干细胞向雌性生殖细胞分化的效率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种Figla基因序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

基于Figla基因序列构建的表达载体，包括SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因，在Figla基因的下游连接荧光报告基因。

所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

所述的荧光标记基因为DsRed，抗生素筛选基因为neor。

所述的基于Figla基因序列构建的表达载体为pDsRed1-N1-Figla表达载体，通过Ecor I和Bgl II酶切位点将Figla基因克隆到pDsRed1-N1表达载体中。

Figla基因被标记后转染多能性干细胞以促进多能性干细胞向雌性生殖细胞分化或转分化的应用。

一种通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，包括以下步骤：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因序列，并将Figla基因序列通过Ecor I和Bgl II酶切位点克隆到pDsRed1-N1表达载体，得到pDsRed1-N1-Figla表达载体；

2)将pDsRed1-N1-Figla表达载体转染到多能干细胞中；转染后用以下诱导液进行诱导，诱导液为：H-DMEM培养基+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+15％体积浓度的FBS；

3)诱导后，通过免疫荧光染色和RT-PCR进行生殖特异性基因表达的检测；筛选已分化的雌性生殖细胞。

所述的细胞包括P19和传代培养的多能性干细胞；

多能性干细胞的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的胎牛血清。

所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明克隆了Figla基因并构建了pDsRed1-N1-Figla载体。通过提取小鼠卵巢组织总RNA，反转录试剂盒反转录得到cDNA。发现克隆的基因在558bp处发生突变，该突变未造成氨基酸的改变。通过SWISS-PROT蛋白质序列数据库分析，其二级结构未发生变化。

2.本发明用pDsRed1-N1-Figla重组载体转染细胞，在荧光显微镜下，P19和mESCs中均观察到红色荧光蛋白(RFP)的表达；转染后，随时间延长，表达RFP的细胞数增多。pDsRed1-N1-Figla转染P19后，细胞增大、变圆，脱离培养皿底部，部分出现卵母细胞生长特性，而转染pDsRed1-N1的细胞仍为多角形。

pDsRed1-N1-Figla转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)后，RFP表达于细胞克隆边缘的分化细胞，而在克隆边缘光滑处未见表达；转染mESCs在传代后成片状生长，大部分不再形成克隆。说明Figla基因促进了mESCs的分化。

3.本发明对转染pDsRed1-N1-Figla后48h的mESCs细胞进行免疫荧光染色，显示表达RFP的细胞同时表达多能性基因Oct4，生殖特异性基因Vasa，减数分裂特异性基因Scp3和Stra8，以及雌性生殖细胞特异性基因Figla和Zp3；在Stra8阳性细胞中可见到分裂相的细胞。

RT-RCR分析结果表明，转染pDsRed1-N1-Figla 2d后，mESCs内的Figla总表达量明显增加，且内源性表达量亦有所提高，即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达。

转染后，随培养时间的延长，外源性Figla基因的表达下调。转染5d后，细胞中Vasa和维甲酸受体(RAR)的表达增强，而Oct4和Stra8的表达减弱。对Figla的靶基因进行检测发现，转染pDsRed1-N1-Figla可以促进Zp1、Zp3和Gdf9的表达。QRT-PCR进一步检测发现，在转染3d的mESCs中，Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调，而Oct4和Stra8的表达量下降。表明其开始向雌性生殖细胞分化。

附图说明

图1是PCR扩增的Figla基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是Ecor I和Bgl II双酶切鉴定阳性重组质粒pDsRed1-N1-Figla；

图3是荧光显微镜观察重组质粒pDsRed1-N1-Figla在P19细胞的表达；

图4是荧光显微镜观察重组质粒pDsRed1-N1-Figla在mESCs的表达；

图5是免疫荧光染色显示转染pDsRed1-N1-Figla的mESCs体外分化后生殖细胞特异性标记基因的表达结果；

图6是转染pDsRed1-N1和pDsRed1-N1-Figla 2d和5d的mESCs体外分化后生殖细胞特异性标记基因PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

图7是定量PCR检测转染pDsRed1-N1和pDsRed1-N1-Figla 3d的mESCs体外分化后生殖细胞特异性标记基因的表达结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Figla基因的克隆及载体构建

根据GenBank数据库中小鼠Figla的基因序列(NCBI：NM_012013.1)，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计扩增Figla基因的上、下游引物并突变Figla基因的终止密码子，选择合适的限制性内切酶，具体设计以下引物：

上游引物：5′TCAGATCTTGGTCTTGACCACCATGGATA 3′

下游引物：5′CTGAATTCCATCAGACTCCTCATGAGTGAAGTA 3′

上游引物中划线部分为Bgl II酶切位点，下游引物中下划线部分为EcorI酶切位点；

Figla基因PCR扩增反应体系为15μL，其中包括：10×buffer 1.5μL，MgCl2(25mmol/L)1.6μL，dNTP(2.5mmol/L)1.2μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.3μL，cDNA模板0.5μL，ddH2O 9.5μL。

反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃补延伸10min，4℃保存。

回收并纯化PCR产物，得到Figla基因片段(电泳结果如图1所示，可以看到得到了目的片段)，然后将PCR产物、pDsRed1-N1真核表达载体分别用Ecor I和Bgl II双酶切后连接，将其克隆入pDsRed1-N1真核表达载体，构建重组质粒pDsRed1-N1-Figla。

将重组载体pDsRed1-N1-Figla进行Ecor I和Bgl II双酶切鉴定，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在609bp和4700bp处出现特异性条带。pDsRed1-N1-Figla载体的Ecor I和Bgl II双酶切鉴定结果如图2所示，可以看到克隆到的Figla基因目标片段和剩余的pDsRed1-N1载体骨架。

测序后得到Figla基因序列，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。基因在558bp处发生突变，该突变未造成氨基酸的改变。

2、重组质粒的转染及转染后细胞的观察

所转染的所述细胞包括P19和传代培养的多能性干细胞；

多能性干细胞的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的胎牛血清。

所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。

在转染前，分别将处于对数生长期的P19和mESCs用0.05％胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，并用差速贴壁法去除mESCs中的MEF饲养层细胞，分别接种到铺有明胶的24孔培养板中。培养细胞至约70％融合时，按照Fermentas公司的TurboFect^TM转染说明书分别对P19和mESCs进行pDsRed1-N1-Figla重组质粒的转染。具体为：

将2μg重组质粒加入300μl opti-MEM培养液中，再加入4μl TurboFect转染试剂，温和混匀。室温孵育20min后，将TurboFect/DNA混合物均匀加入培养皿内。转染后3～4h，更换为H-DMEM+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+15％体积浓度的胎牛血清培养进行诱导2～14d。

转染诱导后，随时间延长，表达RFP的细胞数增多。pDsRed1-N1-Figla转染P19后，P19细胞增大、变圆，脱离培养皿底部，部分出现卵母细胞生长特性，而作为对照的转染pDsRed1-N1的细胞仍为多角形(结果如图3所示)。

pDsRed1-N1-Figla转染mESCs后，RFP表达于细胞克隆边缘的分化细胞，而在克隆边缘光滑处未见表达；转染mESCs在传代后成片状生长，大部分不再形成克隆(图4)。说明Figla基因促进了mESCs的分化。

3、转染pDsRed1-N1-Figla的mESCs生殖特异性基因表达的检测

对转染pDsRed1-N1-Figla后2d的mESCs进行免疫荧光染色，显示表达RFP的细胞同时表达多能性基因Oct4，生殖特异性基因Vasa，减数分裂特异性基因Scp3和Stra8，以及雌性生殖细胞特异性基因Figla和Zp3(检测结果如图5所示)。在Stra8阳性细胞中可见到分裂相的细胞。

RT-RCR分析结果表明，转染pDsRed1-N1-Figla 2d后，mESCs内的Figla总表达量明显增加，且内源性表达量亦有所提高，即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达。转染后，随培养时间的延长，外源性Figla基因的表达下调。转染5d后，细胞中Vasa和RAR的表达增强，而Oct4和Stra8的表达减弱。对Figla的靶基因进行检测发现，转染pDsRed1-N1-Figla可以促进雌性生殖细胞标记基因如Zp1、Zp3和Gdf9的表达(图6)。

QRT-PCR进一步检测发现，在转染外源Figla后3d的mESCs中，Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组(对照组为转染空载体细胞)均有明显上调；而Oct4和Stra8表达量较对照组下调(图7)。这表明外源Figla的超标达促进雌性生殖特异基因Vasa、Scp3和Zp1的表达，而多能性基因Oct4和雄性生殖细胞减数分裂前关键基因基因Stra8的表达均下调，证明Figla的超标达促进细胞向雌性生殖细胞分化。

Claims (9)

1.一种Figla基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，包括SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因，在Figla基因的下游连接荧光报告基因。

3.如权利要求2所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

4.如权利要求3所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的荧光标记基因为DsRed，抗生素筛选基因为neor。

5.如权利要求2所述的基于Figla基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的基于Figla基因序列构建的表达载体为pDsRed1-N1-Figla表达载体，通过Ecor I和Bgl II酶切位点将Figla基因克隆到pDsRed1-N1表达载体中。

6.Figla基因被标记后转染多能性干细胞以促进多能性干细胞向雌性生殖细胞分化或转分化的应用。

7.一种通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因序列，并将Figla基因序列通过Ecor I和Bgl II酶切位点克隆到pDsRed1-N1表达载体，得到pDsRed1-N1-Figla表达载体；

2)将pDsRed1-N1-Figla表达载体转染到细胞中；转染后用以下诱导液进行诱导，诱导液为：H-DMEM培养基+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+15％体积浓度的FBS；

3)诱导后，通过免疫荧光染色和RT-PCR进行生殖特异性基因表达的检测；筛选已分化的雌性生殖细胞。

8.如权利要求7所述的通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，所述的细胞包括P19和传代培养的多能性干细胞；

多能性干细胞的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的胎牛血清。

9.如权利要求8所述的通过表达外源Figla基因促进细胞向雌性生殖细胞转化的方法，其特征在于，所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。

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