CN106554938A - 一种体外完成细胞减数分裂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外完成细胞减数分裂的方法，包括以下步骤：1)将原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)与睾丸细胞以1：1的比例混合后在含有减数分裂启动因子的细胞培养基中共培养至形成细胞集落并检测到减数分裂启动基因表达，得到启动减数分裂的细胞；2)将步骤1)得到的启动减数分裂的细胞转移至含减数分裂维持因子的细胞培养基培养，至检测到单倍体精子细胞特异基因表达，经分选获得单倍体。给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种在体外完成减数分裂获得功能配子的方法。
背景技术
不孕不育困扰着越来越多的家庭，而男性因素导致的不育约占到不孕不育总数的一半。而对于那些无精子症导致的男性不育患者，由于没有成熟的雄性配子而不能接受辅助生殖治疗，因此不能够得到真正意义上的子代。对于这些患者，科学家们始终在尝试利用干细胞分化技术，帮助他们重新分化出多能性干细胞来源的功能性雄性配子。
现有技术中已经可以做到将小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)在体外分化成原始生殖细胞样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)，再将PGCLC移植回到不育症模型小鼠的睾丸曲细精管内完成生殖细胞的减数分裂过程，从而得到有功能的精子细胞。人类生殖细胞分化研究已经可以做到将ESC分化到PGCLC，但对于分化得到的PGCLC是否具有功能并没有进一步评估。原因在于，目前除了移植回睾丸的曲细精管以外，没有可以使生殖细胞完成减数分裂的方式。而对于人类而言，将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内仍存在着包括致瘤性在内的很多风险。如果要将雄性配子分化技术运用上临床，还是需要寻求一种可以将ESC直接在体外分化成精子细胞的方法。
发明内容
本发明首先利用生殖细胞体外分化技术，模拟体内胚胎发育过程，将ESC先分化成外胚层类似细胞(Epiblast like cells,EpiLCs)，再使EpiLC在骨形态发生蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)等因子的诱导下，转变为原始生殖细胞样细胞(PGCLC)。之后，利用唯支持细胞综合征的新生小鼠的睾丸细胞与分化得到的PGCLC混合培养，同时给予减 数分裂信号-视黄酸(Retinoic acid,RA)、睾酮(T)、促性腺激素(FSH)及垂体提取物的刺激，完成减数分裂，并产生单倍体。最后，利用流式细胞分选技术分选出单倍体的精子细胞可用于进行圆形精子细胞卵浆注射(round spermatid injection,ROSI)，得到健康出生的子代小鼠。
本发明提供了一种体外完成细胞减数分裂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLC)与睾丸细胞以1：1的数量比例混合后在含有减数分裂启动因子的细胞培养基中共培养至形成细胞集落并且检测到减数分裂启动基因表达，得到启动减数分裂的细胞；
2)将步骤1)所述的启动减数分裂的细胞转移至含有减数分裂维持因子的细胞培养基，以维持细胞的减数分裂，至检测到单倍体精子细胞的特异基因表达，经分选获得单倍体；优选地，所述分选是通过流式细胞仪实现的；
其中，所述减数分裂启动因子包括视黄酸(Retinoic acid,RA)、骨形态发生蛋白2(BMP 2),骨形态发生蛋白4(BMP 4),骨形态发生蛋白7(BMP 7)和转化生长因子β家族激活素A(Activin A)；优选地，所述减数分裂启动因子的剂量分别为视黄酸10-6M，骨形态发生蛋白2(BMP 2)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白4(BMP 4)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白7(BMP 7)的浓度为20ng/ml；转化生长因子β家族激活素A(Activin A)的浓度为100ng/ml。
所述减数分裂维持因子包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(Testosterone,T)及牛垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE)；优选地，所述减数分裂维持因子的剂量为包括促卵泡激素200ng/ml，睾酮1μM，牛垂体提取物50μg/ml。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的减数分裂启动基因为基因Stra8和/或Dmc1，优选为基因Stra8。
在根据本发明的一个实施方案中，所述单倍体精子细胞的特异基因选自基因Tp1，Prm1，Acrosin和Haprin中的一种或多种，优选为Prm1基因。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的原始生殖细胞样细胞是由胚胎干细胞在体外诱导分化得到的。
所述原始生殖细胞样细胞是通过包括下述步骤的方法得到的：采用N2B27作为PGCLC诱导的基础培养基，将胚胎干细胞(ESC)在含有20ng/ml Activin A、12ng/ml bFGF和1％血清替代物的N2B27培养基的作用下诱导为外胚层类似细胞(Epiblast Like Cells，EpiLCs)；再将EpiLCs以2x103/孔的数量接种于超低粘附96孔板中，利用无血清培养体系诱导获得原始生殖细胞样细胞；
其中，所述无血清培养体系为含有15％血清替代物(Knock out Serum，KSR)、500ng/ml骨形态发生蛋白4(BMP4)、500ng/ml骨形态发生蛋白8a(BMP8a)、1000μ/ml白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)，100ng/ml干细胞因子(Stem cell factor，SCF)和50ng/ml表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)的N2B27培养基。所述15％血清替代物(KSR)是指每100ml培养基中含有15ml血清替代物。
在根据本发明的另一个实施方案中，步骤1)所述含有减数分裂因子的细胞培养基中视黄酸(RA)浓度为10-6M，骨形态发生蛋白2，4，7(BMP2,4,7)浓度分别为20ng/ml，转化生长因子β家族激活素A(Activin A)的浓度为100ng/ml。
在根据本发明的另一个实施方案中，步骤2)所述含有减数分裂维持因子的细胞培养基中，睾酮的浓度为1μM、促卵泡激素(FSH)的浓度为200ng/ml，牛垂体提取物的浓度为50μg ml。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述含有减数分裂因子的细胞培养基和步骤2)所述含有减数分裂维持因子的细胞培养基的基础细胞培养基为含有体积分数为10％的血清替代物(KSR)的αMEM培养基。也就是说，在含有10％血清替代物的αMEM培养基中加入相应的减数分裂因子或减数分裂维持因子即可以获得相应的含有减数分裂因子的细胞培养基或含有减数分裂维持因子的细胞培养基。
在根据本发明的一个实施方案中，所述原始生殖细胞、原始生殖细胞样细胞和睾丸细胞均源自于小鼠。
在根据本发明的一个实施方案中，所述睾丸细胞为Kitw/Kitwv小鼠睾丸细胞。
本发明第一次真正意义上实现了在体外诱导多能性干细胞分化为单倍体有功能的雄性配子的全过程，在体外直接获得精子细胞，解决了体外生殖细胞减数分裂的问题.与现有技术体外获得雄性配子的技术不同，本发 明所提供的是一种高效地、安全地获得具有功能的雄性配子体外分化方法。本发明的方法有效规避了因将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内导致的包括致瘤性在内的风险，安全性更高，给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。本发明作为新一代的辅助生殖技术，将造福更多的不育症患者。
附图说明
图1：使用N2B27作为基础培养基和使用GK15作为基础培养基对PGCLC诱导的比较。
图2：细胞因子RA，BMP 2,4,7，Activin A全部添加或减少其中任意一种，在SGPD细胞系PGCLC体外减数分裂第三天及第六天时细胞状态及Stra8-EGFP表达情况，标尺：100μm。
图3：Realtime-PCR检测细胞因子RA，BMP 2,4,7，Activin A全部添加和减少其中一种时相关基因的表达水平。内参基因选用Rps2，并将添加RA，BMP 2,4,7，Activin A培养组个基因表达量设为1。
图4：各培养条件下细胞增殖曲线。
图5：BVSC细胞系在全加因子的培养基中培养前三天荧光消失情况，标尺：100μm。
图6：激素FSH、T、BPE全部添加或减少其中任意一种，在SGPD细胞系PGCLC体外减数分裂第10天及第14天时细胞状态及Prm1-DsRed表达情况，标尺：100μm。
图7：Realtime-PCR检测激素FSH、T、BPE全部添加和分别减少其中一种在培养第6天到第14天相关基因的表达水平的变化。内参基因选用Rps2。
图8：流式细胞分析培养第14天时各培养组单倍体生成情况。
图9：BVSC PGCLC用添加FSH、T、BPE的培养基体外培养第六天到第8天细胞集落免疫荧光染色，DNA由Hoechst33342染色，标尺：100μm。
图10：SGPD PGCLC体外培养第8到12天细胞染色体铺片免疫荧光染色，检测SCP1，SCP3及γH2AX的表达情况。
图11：BVSC细胞系PGCLC体外培养第8到12天细胞染色体铺片免疫荧光染色，检测SCP1、SCP3及γH2AX的表达情况。
图12：Realtime-PCR检测体外培养0-14天过程中，减数分裂相关基 因的表达水平变化，内参基因为Rps2。
图13：体外培养第12天减数分裂核型。
图14：流式细胞分析技术检测体外培养第8、10、12天单倍体生成情况。
图15：A为流式选Prm1-DsRed阳性的单倍体细胞。B为分选的单倍体细胞进行DDX4免疫荧光染色及PNA染料染色。DNA由Hoechst33342染色，标尺：5μm。
图16：A为ROSI健康出生的子代小鼠及其胎盘。B为A中小鼠基因型鉴定。C为A中小鼠核型鉴定。D为A中小鼠印记基因Snrpn及H19启动子区甲基化检测。
图17：BVSC细胞系单倍体功能检测。A为流式选单倍体细胞。B为BVSC单倍体细胞ROSI在4-细胞期观察到Stella-ECFP表达，标尺：100μm。C为ROSI健康出生的子代小鼠。D为C中胚胎的基因型检测。E为C中小鼠核型鉴定。F为C中小鼠0-4周生长曲线。
具体实施方式
在整个体外分化的培养过程当中，可以直接利用原始生殖细胞开始诱导减数分裂，也可以首先利用PGCLC诱导分化体系获得原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)再诱导减数分裂。利用PGCLC诱导分化体系获得原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)的步骤为：先将ESC在体外分化成为EpiLC，再添加BMP4信号，使EpiLC进一步进入生殖细胞命运，从而分化为PGCLC。发明人在进一步地研究中发现可以利用特定的细胞因子和小分子对分化得到的PGCLC进行全体外减数分裂的诱导。
在本发明的实施例中为了研究的便利，使用下述两种携带生殖细胞不同时期报告基因的小鼠胚胎干细胞。一种是带有PGC的两个特异的标志因子Blimp1-mVenus&Stella-ECFP(BVSC)报告系统的细胞系，可以用于监测PGCLC的产生和分选分化得到的PGCLC。另一种是携带有减数分裂启动特异的标志基因Stra8-EGFP和精子细胞特异标志基因protamine1-DsRed(Prm1-DsRed)(SGPD)报告系统的细胞系，可以用于观察减数分裂启动及单倍体形成。
应当理解，本发明并非仅限于上述多能干细胞，对于减数分裂启动特异基因、精子细胞特异标志基因并不限于下述实施例的范围，例如，也可 以使用Dmc1基因等指示减数分裂启动，或者使用Tp1，Acrosin和/或Haprin等基因指示单倍体的形成。
在下述实施例中，细胞培养所使用的培养基为含有10％血清替代物(KSR)的αMEM作为基础培养基，即每100ml培养基中含有10ml血清替代物。
在下述实施例中，Activin A购自R&D Systems，bFGF购自R&D Systems，血清替代物(Knock out Serum，KSR)购自Gibco，BMP4&BMP8a购自R&D Systems，白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor；LIF)购自Invitrogen，干细胞因子(Stem cell factor；SCF)购自R&D Systems，表皮生长因子(Epidermal growth factor；EGF)购自R&D Systems，BMP2,4,7购自R&D Systems，视黄酸(Retinoic acid,RA)购自Sigma，睾酮(Testosterone)购自Acros Organics。
在下述实施例中带有PGC的两个特异的标志因子Blimp1-mVenus&Stella-ECFP(BVSC)报告系统的细胞系和携带有减数分裂启动特异的标志基因Stra8-EGFP和精子细胞特异标志基因protamine 1-DsRed(Prm1-DsRed)(SGPD)报告系统的细胞系的构建方法为：
BVSC转基因小鼠由日本Mitinori Saitou教授赠送，C57BL6背景，具体信息参考文献(Yasuhide Ohinata,Mitsue Sano,Mayo Shigeta1,Kaori Yamanaka1and Mitinori Saitou,A comprehensive,non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.Reproduction(2008)136,503-514)。将其公鼠与野生型129背景母鼠交配后，取3.5天囊胚进行ESC建系，具体建系方法参考文献(Wei Li,Ling Shuai,Haifeng Wan,Mingzhu Dong,Meng Wang,Lisi Sang,Chunjing Feng,Guan-Zheng Luo,Tianda Li,Xin Li,Libin Wang,Qin-Yuan Zheng,Chao Sheng,Hua-Jun Wu,Zhonghua Liu,Lei Liu,Liu Wang,Xiu-Jie Wang,Xiao-Yang Zhao&Qi Zhou.Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.NATURE(2012)407)。
SG&PD报告基因载体由德国Wolfgang Engel教授赠送，具体质粒信息参见文献：(Karim Nayernia,Jessica Nolte,Hans W.Michelmann,Jae Ho Lee,Kristina Rathsack,1Nadja Drusenheimer,Arvind Dev,Gerald Wulf,Ingrid E.Ehrmann,David J.Elliott,Vera Okpanyi,Ulrich Zechner,Thomas
Haaf,5Andreas Meinhardt,and Wolfgang Engel.In Vitro-Differentiated Embryonic Stem Cells Give Rise to Male Gametes that Can Generate Offspring Mice.Developmental Cell(2006)11,125132)，通过原核注射的方法得到转基因动物。再通过SG雄鼠与PD雌鼠交配得到同时携带SGPD报告系统的胚胎，进行ESCs细胞系构建，具体建系方法参见文献：(Wei Li,Ling Shuai,Haifeng Wan,Mingzhu Dong,Meng Wang,Lisi Sang,Chunjing Feng,Guan-Zheng Luo,Tianda Li,Xin Li,Libin Wang,Qin-Yuan Zheng,Chao Sheng,Hua-Jun Wu,Zhonghua Liu,Lei Liu,Liu Wang,Xiu-Jie Wang,Xiao-Yang Zhao&Qi Zhou.Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.NATURE(2012)407)。
实施例 1诱导产生原始生殖样细胞(PGCLC)
将胚胎干细胞(ESC)在含有20ng/ml Activin A、12ng/ml bFGF和1％血清替代物(Knock out Serum，KSR)的N2B27培养基中诱导为外胚层类似细胞(Epiblast Like Cells，EpiLCs)。再将EpiLC以2x103/孔的数量接种于超低粘附96孔板(Cornning)中，利用含有15％KSR、500ng/ml BMP4&BMP8a、1000μ/ml白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor；LIF)，100ng/ml干细胞因子(Stem cell factor；SCF)和50ng/ml表皮生长因子(Epidermal growth factor；EGF)的N2B27培养基作为无血清培养体系，获得原始生殖细胞样细胞(PGCLC)。
发明人发现，虽然相比使用GK15作为基础培养基进行PGC分化过程中，使用N2B27作为基础培养基出现Prdm1-mVenus和Dppa3-ECFP阳性的时间较晚，但是，对于Prdm1-mVenus和Dppa3-ECFP双阳性的PGCLC的增殖和维持却有更好的效果，如图1所示。
实施例 2诱导原始生殖细胞样细胞(PGCLC)减数分裂
将实施例1分化得到的SGPD细胞系的PGCLC与Kitw/Kitwv小鼠睾丸细胞按1:1混合进行培养，利用培养基：αMEM包含10％KSR、BMP2,4,7(20ng/ml)、RA(10-6M)以及Activin A(100ng/ml)，检测不同细胞因子对PGCLC进入减数分裂的影响，将在培养基中添加因子BMP2,4,7，RA，Activin A的培养组，与只在培养基中添加其中两个因子(BMP2,4,7和RA；RA和Activin A；BMP2,4,7和Activin A)的培养组进行对比，分别观察细 胞增殖及减数分裂启动情况。在培养第三天时，添加了视黄酸(Retinoic acid,RA)(10-6M,Sigma)，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2,4,7；BMP 2,4,7)(20ng/ml,R&D),转化生长因子β家族激活素A(Activin A)(100ng/ml,R&D)培养的细胞开始表达绿色荧光，细胞可以形成集落，而绿色荧光集中在集落中表达，其他组分均未见荧光和细胞集落(图1)。
结果如图2所示，Realtime-PCR结果显示在添加了上述细胞因子的培养条件下培养0-6天的细胞精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells，SSCs)特异表达的基因(Nanos3,Oct4)，生殖细胞特异表达的基因(Ddx4)，减数分裂启动的基因(Stra8,Dmc1)的表达水平，不添加RA的培养组，其Nanos3、Oct4和Ddx4的表达水平较第0天有升高，且与全加因子组相当，而减数分裂启动的特异基因Stra8与Dmc1的表达量在培养过程中没有升高，说明RA是影响到减数分裂的启动。而BMP 2、4、7或未添加Activin A的培养组，不仅Stra8和Dmc1的表达量没有随着培养时间的延长而升高，Nanos 3、Oct 4以及Ddx 4的表达量也较第0天有所下降，在未添加BMP 2,4,7或未添加Activin A的培养组，生殖细胞的数量有所下降。
实施例 3细胞因子对细胞增殖的影响
以1x105/孔的细胞量将PGCLCs和Kitw/Kitwv小鼠睾丸体细胞混合接种于12孔板中，每天计数一个孔的细胞量并记录。
实验中进一步检测了这些培养条件下细胞增殖的情况，发现在未添加BMP 2,4,7或在未添加Activin A的培养条件下，细胞增殖非常缓慢，在培养的0-6天时间内，细胞只增殖了1倍(图3)。
以上结果显示，在减数分裂启动阶段，细胞因子RA，BMP 2、4、7及Activin A都是必须添加的，缺乏其中任何一个因子，减数分裂启动将不能正常进行。
实施例 4诱导产生功能性配子
在开始共培养时开始计算时间，在培养第7天时更换为含有10％KSR、1μM Testosterone(购自Acros Organics)、200ng/ml FSH(购自Sigma)以及50μg/mlBPE(购自Corning)的αMEM培养基。
对BVSC细胞系分化出的PGCLC用添加RA，BMP 2,4,7和Activin A的培养基诱导细胞减数分裂，结果发现在培养前3天时，PGCLC表达的 Blimp1-mVenus及Stella-ECFP逐渐消失(图4)。
在开始共培养时开始计算时间，培养六天后细胞自发形成集落，且在集落中有减数分裂启动，随后更换培养基，撤掉启动减数分裂的细胞因子，改用维持减数分裂继续进行及促进单倍体形成的各种激素，包括FSH、T以及BPE。之后检测了各种激素对SGPD细胞系单倍体形成(即Rrm1-DsRed荧光表达情况)的影响。结果显示，同时添加了200ng/ml促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH，购自Sigma)、1μM睾酮(Testosterone,T，购自Acros Organics)以及50μg/ml牛垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE，购自Corning)的培养组，在培养第10天时开始出现红色荧光，且红色荧光集中在集落中表达，到培养第14天时，可以看到集落明显增大，并且表达Prm1-DsRed。而未添加其中一种激素的各组，虽然有集落形成，但未见Prm1-DsRed表达(图5)，说明没有单倍体形成。
Realime-PCR检测了不同激素添加组四倍体精母细胞特异基因Scp3和单倍体精子细胞特异基因Tp1、Prm1、Acrosin和Haprin在培养第6天到第14天的表达量变化，结果显示，少添加FSH,T,或BPE的其中一种，都会大大降低单倍体特异基因的表达量(图6)。
不同培养组在培养第14天通过流式细胞分选技术进行倍体分析，结果表明，缺少FSH,T或BPE的其中一种激素，则几乎没有单倍体生成，而同时添加了FSH,T和BPE的培养组则可以形成大约14％的单倍体(图7)。
以上结果显示，在减数分裂维持及单倍体形成阶段，T和BPE的添加是必须的，若不添加其中一种激素，则完全不能产生单倍体。而FSH的添加会大大促进单倍体的比例。
用该培养条件同时对BVSC细胞系的PGCLC进行实验，并用免疫荧光技术在培养第8天的时候对细胞集落进行生殖细胞特异表达蛋白DDX4，sertoli细胞特异蛋白GATA4，四倍体精母细胞特异蛋白SCP3及γH2AX进行免疫荧光染色，均可以检测到这些蛋白的表达(图8)。
在上述实验中诱导原始生殖细胞减数分裂的过程中，转换细胞的培养条件的时间点是通过检测SGPD细胞系的绿色荧光开始表达，也就是检测到精子细胞特异标志基因protamine 1-DsRed(Prm1-DsRed)表达，且细胞聚集成较大的集落确定。确定培养6天可以达到这个标准，对于其他的细胞系(例如BVSC细胞系)则是在共培养6天这个时间点更换培养条件的。
对培养了8天，10天，12天的SGPD及BVSC细胞系的细胞集落进行联会复合物SCP1，SCP3及DSB修复特异蛋白γH2AX进行了免疫荧光染色(图9)。PGCLC保持同步进入并维持减数分裂的状态，并有正常的联会及DSB修复的发生。两个细胞系未见明显差异(图10)。
随后对SGPD细胞系不同时间点减数分裂相关基因的表达量进行了Realtime-PCR的检测，减数分裂各基因的表达严格的按照体内一次减数分裂的先后顺序出现(图11)。
在培养的第12天时进行核型的检测，结果可以看到典型的减数分裂中期的核型存在(图12)。在培养的第8天，第10天和第12天，分别对细胞的DNA含量进行了流式检测，结果发现单倍体的比例逐渐升高(图13)。
对培养第14天的SGPD细胞系进行流式分选Prm1-DsRed阳性的单倍体细胞(图15A)。将分选的细胞进行生殖细胞特异表达蛋白DDX4免疫荧光染色及精子顶体染料PNA的染色。结果发现，单倍体细胞表达Prm1-DsRed，同时有DDX4的表达(图15B)。
利用分选的单倍体进行圆形精子胞浆注射(ROSI)，共得到一个健康的雄性子代动物(图16A)，基因型检测为携带有单Prm1-DsRed转基因标记(图16B)。对出生动物进行了核型及印记基因甲基化水平的检测，显示其有正常的40挑染色体的核型(图16C)。印记基因Snrpn及H19启动子区亚硫酸氢盐测序结果显示其印记基因甲基化水平正常(图16D)。
在培养第14天时，对BVSC细胞系进行单倍体细胞的流式分选(图17A)进行ROSI，四细胞期可见Stella-ECFP荧光表达(图17B)，共出生子代小鼠三只(图17C)，对子代小鼠进行基因型鉴定，结果显示三只小鼠都携带有BVSC转基因标记(图17D)，核型鉴定及生长曲线的描绘的结果发现这三只小鼠具有正常的40条染色体的核型(图17E)，且1个月之内体重增长正常(图17F)。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种体外完成细胞减数分裂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLC)与睾丸细胞以1：1的数量比例混合后，在含有减数分裂启动因子的细胞培养基中共培养至形成细胞集落并且检测到减数分裂启动基因表达，得到启动减数分裂的细胞；
2)将步骤1)所述的启动减数分裂的细胞转移至含有减数分裂维持因子的细胞培养基，以维持细胞的减数分裂，至检测到单倍体精子细胞的特异基因表达，经分选获得单倍体；优选地，所述分选是通过流式细胞仪实现的；
其中，所述减数分裂启动因子包括视黄酸(RA)、骨形态发生蛋白2(BMP 2),骨形态发生蛋白4(BMP 4),骨形态发生蛋白7(BMP 7)和转化生长因子β家族激活素A(Activin A)；
所述减数分裂维持因子包括睾酮、促卵泡激素(FSH)和牛垂体提取物(BPE)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的减数分裂启动基因为Stra8和/或Dmc1。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单倍体精子细胞的特异基因选自基因Tp1，Prm1，Acrosin和Haprin中的一个或多个，优选为Prm1基因。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的原始生殖细胞样细胞是由胚胎干细胞在体外诱导分化得到的。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原始生殖细胞样细胞是通过包括下述步骤的方法得到的：
a)将胚胎干细胞(ESC)在含有20ng/ml转化生长因子β家族激活素A(Activin A)、12ng/ml成纤维细胞生长因子(bFGF)和1％的血清替代物(Knock out Serum，KSR)的N2B27培养基中诱导得到外胚层类似细胞(Epiblast Like Cells，EpiLCs)；
b)再将步骤a)得到的外胚层类似细胞以2x103/孔的数量接种于超低粘附96孔板(Cornning)中，利用无血清培养体系诱导获得原始生殖细胞样细胞；
其中，所述无血清培养体系为含有15％血清替代物(Knock out Serum，KSR)、500ng/ml骨形态发生蛋白4(BMP4)、500ng/ml骨形态发生蛋白8a(BMP8a)、1000μ/ml白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)，100ng/ml干细胞因子(Stem cell factor，SCF)和50ng/ml表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)的N2B27培养基。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述含有减数分裂因子的细胞培养基中视黄酸(RA)浓度为10-6M、骨形态发生蛋白2(BMP 2)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白4(BMP 4)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白7(BMP 7)的浓度为20ng/ml；转化生长因子β家族激活素A(Activin A)的浓度为100ng/ml。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述含有减数分裂维持因子的细胞培养基中，睾酮的浓度为1μM、促卵泡激素(FSH)的浓度为200ng/ml，垂体提取物的浓度为50μg/ml。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述含有减数分裂因子的细胞培养基和步骤2)所述含有减数分裂维持因子的细胞培养基的基础细胞培养基为含有10％血清替代物的αMEM培养基。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述原始生殖细胞、原始生殖细胞样细胞和睾丸细胞，例如Kitw/Kitwv小鼠睾丸细胞均源自于小鼠。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法获得的单倍体的细胞。
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