JP2015006194A - Ｐｄｘ１発現性内胚葉 - Google Patents

Ｐｄｘ１発現性内胚葉 Download PDF

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Abstract

【課題】効率の良い、一定方向へのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の分化を達成する方法の提供。【解決手段】ヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞及びヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物であって、ヒト胚体内胚葉細胞の９５個ごとに、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも５個存在する、細胞培養物。該細胞培養物は、多能性幹細胞、レチノイド、TGFβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの増殖因子等をさらに含む。【選択図】図１

Description

本願は、次の３つの仮特許出願、すなわち、２００４年４月２７日に出願された、名称「ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（ＰＤＸ１発現性内胚葉）」の米国仮特許出願第６０／５６６，２９３号、２００４年７月１４日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカイン
細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号、および、２００４年７月９日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰ
ＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８６，５６６号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張する、２００４年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）
」の米国特許出願第１１／０２１，６１８号の一部継続出願である。
本発明は、医学および細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳類ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む組成物と、そのような細胞の作製、分離および使用方法に関する。
胚性幹（ＥＳ）細胞や胚性生殖（ＥＧ）細胞などのヒト多能性幹細胞は、まず１９９４年に、線維芽細胞フィーダーを使用しない培養（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、そして線維芽細胞フィーダーを使用した培養（Ｈｏｇａｎ、１９９７）において分離された。その後、Ｔｈｏｍｓｏｎ、ＲｅｕｂｉｎｏｆｆおよびＳｈａｍｂｌｏｔｔが、有糸分裂的に不活性化したマウスの支持細胞層を用いてヒトＥＳおよびＥＧ細胞の連続培養を確立した（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。
ヒトＥＳおよびＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発生の初期段階の研究、並びに糖尿病やパーキンソン病などのいくつかの病状における治療のために極めて貴重な機会を提供する。例えば、ｈＥＳＣに由来するインシュリン産生β細胞の使用により、糖尿病治療のためドナー膵臓からの細胞を利用する現在の細胞療法に多大な進歩をもたらすだろう。しかしながら、現在、ｈＥＳＣからインシュリン産生β細胞を生成する方法は知られていない。そのため、ドナー膵臓の膵島細胞を利用する糖尿病の細胞治療法は、移植に必要な良質の膵島細胞の不足により制限されている。一人のＩ型糖尿病患者に対する細胞療法では、約８×１０８個の膵島細胞の移植を必要とする（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。よって、移植を成功させるのに十分な膵島細胞を得るためには、少なくとも２つの健康なドナー臓器が必要である。ｈＥＳＣは、ヒト細胞療法用に相当な量の良質の分化細胞を発生させるための出発物質の源を提供する。
ｈＥＳＣが細胞療法の用途に非常に適している所以たる二つの特性は、多能性と、遺伝子変化が蓄積することなく、これらの細胞を培養物中において長期間維持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）全ての派生細胞（これらは、胚体外組織（例えば、胎盤）および生殖細胞に加え、成熟した生体の全てのタイプの体細胞を形成する）に分化する、ｈＥＳＣの能力により定義される。多能性は、ｈＥＳＣに並はずれた有用性を付与するが、この特性はまた、これらの細胞とその誘導体を研究および取り扱う上で、独自の難題をもたらす。多種多様な細胞型が、分化ｈＥＳＣ培養物中に発生し得ることから、非常に多くの細胞型が、非常に低い効率で作製される。さらに、特定の細胞型の作製を評価する上での成功は、適切なマーカーを定めることに大きく依存してい
る。効率の良い、特定の分化を達成することは、ｈＥＳＣの治療への応用にとって非常に重要なことである。
細胞療法の用途において有用な細胞を生成する出発物質としてｈＥＳＣを使用するためには、上述の問題を克服することが有益である。例えば、膵島細胞移植治療に必要なレベルの細胞材料となるためには、分化のかなり初期段階で、膵島／β細胞系列の方向にｈＥＳＣを効率的に誘導することが有益である。
また、分化プロセスの効率的な誘導に加えて、膵島／β細胞系列への分化経路にそって中間細胞型を単離し特徴付けることや、そのような細胞を分化の更なる段階のために適した系列前駆細胞として使用することも有益である。
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＤＸ１発現（ＰＤＸ１陽性）内胚葉細胞を含む組成物、およびその作製方法に関連するものである。他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団と、その細胞集団の作製方法に関連するものである。また、他の実施形態は、内胚葉細胞でＰＤＸ１の発現を高める方法と、ＰＤＸ１陰性および／又はＰＤＸ１陽性の内胚葉の更なる分化に有用な因子を同定する方法に関連するものである。本明細書記載の前記組成物、およびその作製方法に関して、いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞である。好適な実施形態においては、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞であり、他の好適な実施形態においては、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸後方部の内胚葉細胞である。
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物であって、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物に関する。いくつかの実施形態において、当該細胞培養物はヒト細胞を含む。このようなヒト細胞培養物において、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、培養物中のヒト細胞の少なくとも約２％、約５％、約１０％または約２５％を含む組成とすることができる。いくつかの実施形態において、この少なくとも約２％、約５％、約１０％または約２５％とは、培養物中に存在する支持細胞（フィーダー細胞）を除いて算出された割合である。本明細書の細胞培養物のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）遺伝子、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）遺伝子およびＳＯＸ１７からなる群から選択されるマーカーを発現する。他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および／又は神経系細胞を実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、前記細胞培養物はさらに、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイド化合物、ＦＧＦ−１０またはＢ２７の１又は２以上を含む。
本発明の他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含み、または当該細胞が単離もしくは実質的に精製された細胞集団に関するものであって、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞などの多分化能細胞由来である。本発明の他の実施形態は、構成細胞の少なくとも約９０％がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞であって、当該ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞集団に関する。好適な実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、細胞集団中の細胞の少なくとも約９５％であり、さらに好適な実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、細胞集団中の細胞の少なくとも約９８％である。
本発明の他の実施形態は、ＰＤＸ１を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞）を含む細胞培養物又は細胞集団に、レチノイドなどの前腸分化促進因
子を供給することによって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作製する方法に関する。たとえばＲＡであるレチノイドは、約０．０１μＭから約５０μＭまでの範囲の濃度で供給される。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化は、細胞培養物又は細胞集団に、ＦＧＦ−１０および／又はＢ２７を供給することによって高められる。ＦＧＦ−１０は、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給することができる。いくつかの実施形態において、Ｂ２７は、培地全体の約０．１％から約２０％までの範囲の濃度で、細胞培養物又は細胞集団に供給することができる。ＦＧＦ−１０および／又はＢ２７は、前記レチノイドとほぼ同時に、あるいはそれぞれの因子の添加について、各添加ごとに数時間の間をおいて、細胞培養物又は細胞集団に添加することができる。ある実施形態によると、レチノイドは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉培養開始後約４日で添加され、他の実施形態では、レチノイドは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉培養開始後約５日で添加される。
さらに他の実施形態は、ＲＡなどのレチノイドを加えた細胞培養物又は細胞集団でのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の生産をさらに向上するため、前腸分化促進因子を使用する方法に関する。そのような実施形態において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への分化は、アクチビンＡおよび／又はアクチビンＢを細胞培養物又は細胞集団に供給することによって向上される。アクチビンＡおよび／又はアクチビンＢは、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給することができる。他の実施形態は、レチノイドを含む培地でＰＤＸ１陰性細胞を分化させることによって、細胞培養物又は細胞集団でのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の生産を向上する方法に関するものであって、前記培地は、ある細胞タイプの成長又は維持によって条件付けられている。そのような細胞タイプは、特に限定されるものではないが、胚性幹細胞や、血清またはアクチビンＡ、アクチビンＢ、ノーダルおよび／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの増殖因子ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含む培地で分化させたその他の多分化能細胞を含んでいる。いくつかの実施形態では、条件培地が、成長培地全体の約１％から約１００％までの範囲の濃度で、細胞培養物又は細胞集団に供給される。ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子および／又は条件培地は、前記レチノイドとほぼ同時に、あるいはそれぞれの因子の添加について、各添加ごとに数時間の間をおいて、細胞培養物又は細胞集団に添加することができる。
本発明の実施形態はまた、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団を生産する方法に関する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、多分化能細胞の集団（当該多分化能細胞集団の少なくとも１つの細胞が、ＰＤＸ１プロモーターの制御下にある少なくとも１コピーの核酸を含む）を得る工程を含むものであり、前記核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列またはその生物活性をもつ断片を含む。 他の実
施形態では、前記多分化能細胞を分化させて、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作製する付加的工程と、当該ＰＤＸ１陽性細胞をＰＤＸ１陰性細胞から分離する工程とを含んでいる。また、いくつかの実施形態において、前記分化工程は、前記多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を、前記多分化能細胞集団に供給する工程と、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量の前腸分化促進因子を、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給する工程とをさらに含んでいる。
本発明のいくつかの実施形態は、ＳＯＸ１７発現（ＳＯＸ１７陽性）胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高める方法に関するものであって、当該胚体内胚葉細胞に、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる工程を含んでいる。ある実施形態によると、前記分化促進因子は、ＲＡ、ＦＧＦ−１０およびＢ２７から選択される。
本発明の他の実施形態は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、候補分化促進因子をＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に接触させ、前記候補分化促進因子と
の接触後に、細胞集団でのＰＤＸ１発現が、当該接触前の細胞集団でのＰＤＸ１発現よりも増加したかどうかを決定する。細胞集団でのＰＤＸ１発現の増加から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつと判断される。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１発現は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により決定される。ある実施形態によると、前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのＨＯＸＡ１３および／又はＨＯＸＣ６遺伝子の発現を決定する工程をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、前記候補分化促進因子は、低分子、たとえばＲＡなどのレチノイドであり、他の実施形態において、前記候補分化促進因子は、ポリペプチド、たとえばＦＧＦ−１０などの増殖因子である。
本発明のさらに他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、候補分化促進因子をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に接触させ、前記候補分化促進因子との接触後に、細胞集団でのマーカーの発現が、当該接触前の細胞集団での前記マーカーの発現よりも増加したか減少したかを決定する。前記マーカーの発現の増加または減少から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつと判断される。ある実施形態によると、前記マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される。いくつかの実施形態において、前記候補分化促進因子は、低分子、たとえばＲＡなどのレチノイドであり、他の実施形態において、前記候補分化促進因子は、ポリペプチド、たとえばＦＧＦ−１０などの増殖因子である。
なお、本明細書において使用される「含む」という語は、いわゆる「開かれた」用語として使われており、他の付加的な要素を含んでいてもよい趣旨である。この点に留意しつつ、本発明の具体的態様について、以下番号を付した項目を参照して説明する。
１．ヒト細胞を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約２％がＰＤＸ１（pancreatic-duodenal homoebox factor-1）陽性前腸内胚葉細胞であり、前記ＰＤＸ１陽
性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物。
２．前記ヒト細胞の少なくとも約５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
３．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
４．前記ヒト細胞の少なくとも約２５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
５．ヒト支持細胞（フィーダー細胞）が培養物中に存在し、当該ヒト支持細胞以外のヒト細胞の少なくとも約２％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
６．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）遺伝子を発現する項目１に記載の細胞培養物。
７．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）遺伝子を発現する項目１に記載の細胞培養物。
８．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７を発現する項目１に記載の細胞培養物。
９．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目１に記載の細胞培養物。
１０．臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および神経系細胞からなる群から選択される細胞を実質的に含んでいない項目１に記載の細胞培養物。
１１．当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約１０個ごとに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する項目１に記載の細胞培養物。
１２．当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約５個ごとに、ＰＤＸ１
陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する項目１に記載の細胞培養物。
１３．当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約４個ごとに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する項目１に記載の細胞培養物。
１４．胚性幹細胞をさらに含む項目１に記載の細胞培養物。
１５．前記胚性幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）および胚の生殖隆起からなる群から選択される組織に由来する項目１４に記載の細胞培養物。
１６．レチノイドをさらに含む項目１に記載の細胞培養物。
１７．前記レチノイドは、レチノイン酸（ＲＡ）である項目１６に記載の細胞培養物。
１８．ＦＧＦ−１０をさらに含む項目１に記載の細胞培養物。
１９．Ｂ２７をさらに含む項目１に記載の細胞培養物。
２０．ＲＡおよびＦＧＦ−１０の双方を含む項目１に記載の細胞培養物。
２１．Ｂ２７をさらに含む項目２０に記載の細胞培養物。
２２．細胞を含む細胞集団であって、前記細胞の少なくとも約９０％が、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞であり、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞集団。
２３．前記細胞の少なくとも約９５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目２２に記載の細胞集団。
２４．前記細胞の少なくとも約９８％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目２２に記載の細胞集団。
２５．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＨＯＸＡ１３遺伝子を発現する項目２２に記載の細胞集団。
２６．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＨＯＸＣ６遺伝子を発現する項目２２に記載の細胞集団。
２７．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７を発現する項目２２に記載の細胞集団。
２８．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目２２に記載の細胞集団。
２９．ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の作製方法であって、前記方法は、
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程と、
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを前記細胞集団に供給する工程とを含み、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の作製方法。
３０．ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を与える工程を含み、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を、前記細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより決定する項目２９に記載の方法。３１．前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約２％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目２９に記載の方法。
３２．前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目２９に記載の方法。
３３．前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約１０％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目２９に記載の方法。
３４．前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約２５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目２９に記載の方法。
３５．前記細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の存在の検出が、ＰＤＸ１の発現を検出することを含む項目２９に記載の方法。
３６．前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目３５に記載の方法。
３７．前記ＰＤＸ１の発現が、定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により決定される項目３５に記載の方法。
３８．前記ＰＤＸ１の発現が、免疫細胞化学により決定される項目３５に記載の方法。
３９．前記レチノイドはＲＡである項目２９に記載の方法。
４０．ＲＡは、約０．０１μＭから約５０μＭまでの範囲の濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４１．ＲＡは、約０．０４μＭから約２０μＭまでの範囲の濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４２．ＲＡは、約０．１μＭから約１０μＭまでの範囲の濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４３．ＲＡは、約０．２μＭから約２．５μＭまでの範囲の濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４４．ＲＡは、約０．５μＭから約１．５μＭまでの範囲の濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４５．ＲＡは、約１μＭの濃度で供給される項目３９に記載の方法。
４６．ＲＡは、培養開始後約４日で供給される項目３９に記載の方法。
４７．ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｂ２７、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される因子を、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生を促進するのに十分な量で前記培養に供給することを含む項目２９に記載の方法。
４８．前記因子は、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡおよびアクチビンＢからなる群から選択される項目４７に記載の方法。
４９．前記因子は、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される項目４８に記載の方法。
５０．前記因子は、約２０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される項目４８に記載の方法。
５１．前記因子は、約２５ｎｇ／ｍｌから約７５ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される項目４８に記載の方法。
５２．前記因子は、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される項目４８に記載の方法。
５３．前記因子は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目４８に記載の方法。
５４．前記因子はＢ２７である項目４７に記載の方法。
５５．Ｂ２７は、培地全体の約０．１％から約２０％までの範囲の濃度で供給される項目５４に記載の方法。
５６．Ｂ２７は、培地全体の約０．２％から約５％までの範囲の濃度で供給される項目５４に記載の方法。
５７．Ｂ２７は、培地全体の約０．５％から約２％までの範囲の濃度で供給される項目５４に記載の方法。
５８．Ｂ２７は、培地全体の約１％の濃度で供給される項目５４に記載の方法。
５９．Ｂ２７は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目５４に記載の方法。
６０．前記因子は条件培地である項目４７に記載の方法。
６１．条件培地は、培地全体の約１０％から約１００％までの範囲の濃度で供給される項目６０に記載の方法。
６２．条件培地は、培地全体の約２０％から約８０％までの範囲の濃度で供給される項目６０に記載の方法。
６３．条件培地は、培地全体の約４０％から約６０％までの範囲の濃度で供給される項目６０に記載の方法。
６４．条件培地は、培地全体の約５０％の濃度で供給される項目６０に記載の方法。
６５．条件培地は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目６０に記載の方法。
６６．条件培地は、分化したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を約２４時間細胞培養培地に接触させることによって調製される項目６０に記載の方法。
６７．ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させる項目６６に記載の方法。
６８．項目２９に記載の方法によって作製されたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞。
６９．ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団を作製する方法であって、
多分化能細胞の集団を得る工程（当該多分化能細胞集団の少なくとも１つの細胞が、ＰＤＸ１プロモーターの制御下にある少なくと１コピーの核酸を含み、当該核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列またはその生物活性をもつ断片を有する）と、
前記多分化能細胞を分化させて、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作製する工程と、
当該ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を、ＰＤＸ１陰性細胞から分離する工程とを含む方法。７０．前記細胞集団は、少なくとも約９５％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む項目６９に記載の方法。
７１．前記細胞集団は、少なくとも約９８％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む項目６９に記載の方法。
７２．前記分化工程は、前記多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を、前記多分化能細胞集団に供給する工程と、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給する工程とをさらに含む項目６９に記載の方法。
７３．前記レチノイドは、ＲＡである項目７２に記載の方法。
７４．項目６９に記載の方法によって作製されたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団。
７５．ＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高める方法であって、当該胚体内胚葉細胞に、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる工程を含む方法。
７６．前記分化促進因子は、レチノイドである項目７５に記載の方法。
７７．前記分化促進因子は、ＲＡである項目７６に記載の方法。
７８．前記分化促進因子は、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｂ２７、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される項目７５に記載の方法。
７９．ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、
候補分化促進因子を、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、前記候補分化促進因子との接触後に、前記細胞集団でのＰＤＸ１発現が、当該接触前の細胞集団でのＰＤＸ１発現よりも増加したかどうかを決定する工程とを含み、
前記細胞集団でのＰＤＸ１発現の増加から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞から（腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である）ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつと判断する方法。
８０．ＰＤＸ１発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される項目７９に記載の方法。
８１．前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのＨＯＸＡ１３遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む項目７９に記載の方法。
８２．前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのＨＯＸＣ６遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む項目７９に記載の方法。
８３．前記候補分化促進因子は、低分子である項目７９に記載の方法。
８４．前記低分子は、レチノイドである項目８３に記載の方法。
８５．前記レチノイドは、ＲＡである項目８４に記載の方法。
８６．前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである項目７９に記載の方法。
８７．前記候補分化促進因子は、増殖因子である項目７９に記載の方法。
８８．前記候補分化促進因子は、ＦＧＦ−１０である項目７９に記載の方法。
８９．ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む集団を得る工程と、
候補分化促進因子を、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、前記候補分化促進因子との接触後に、前記集団でのマーカーの発現が、当該接触前の細胞集団での前記マーカーの発現よりも増加したか減少したかを決定する工程とを含み、
前記集団での前記マーカーの発現の増加または減少から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつと判断する方法。
９０．前記マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される項目８９に記載の方法。
９１．前記候補分化促進因子は、低分子である項目８９に記載の方法。
９２．前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである項目８９に記載の方法。
９３．前記候補分化促進因子は、増殖因子である項目８９に記載の方法。
９４．ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含むベクター。
９５．前記レポーター遺伝子は、ＥＧＦＰである項目９４に記載のベクター。
９６．項目９４に記載のベクターを含む細胞。
９７．ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含む細胞。
９８．前記ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合した前記レポーター遺伝子は、染色体に組み込まれている項目９７に記載の細胞。
９９．前記レポーター遺伝子は、ＥＧＦＰである項目９７に記載の細胞。
１００．前記細胞は、多分化能である項目９７に記載の細胞。
１０１．前記細胞は、ｈＥＳＣである項目１００に記載の細胞。
１０２．前記細胞は、胚体内胚葉細胞である項目９７に記載の細胞。
１０３．前記細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である項目９７に記載の細胞。
１０４．分化したｈＥＳＣ（当該ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させたもの）の集団を約２４時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したｈＥＳＣの集団を培地から除去する工程とによって調製された条件培地。
１０５．前記新鮮細胞培養培地は、ＲＰＭＩである項目１０４に記載の条件培地。
１０６．前記ＲＰＭＩは、低血清ＲＰＭＩである項目１０５に記載の条件培地。
１０７．分化したｈＥＳＣ（当該ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させたもの）の集団を約２４時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したｈＥＳＣの集団を培地から除去する工程とによって培地を条件付ける方法。
１０８．前記新鮮細胞培養培地は、ＲＰＭＩである項目１０７に記載の方法。
１０９．前記ＲＰＭＩは、低血清ＲＰＭＩである項目１０８に記載の方法。
当然のことながら、上記方法および組成物は、生体外で培養される細胞に関する。しかしながら、上記の生体外で分化させた細胞組成物は、生体内用に使用してもよい。
本発明の更なる実施形態は、２００３年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」の米国仮特許出願第６０／５３２，００
４号、２００４年４月２７日に出願された、名称「ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（ＰＤＸ１発現性内胚葉）」の米国仮特許出願第６０／５６６，２９３号、２００４年７月９日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ
ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ Ｅ
ＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８６，５６６号、２００４年７月１４日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ
ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体
）」の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号、および、２００４年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」の米国特許
出願第１１／０２１，６１８号にも記載されている場合があり、それらの全内容を引用することにより本明細書の一部とする。
図１は、ｈＥＳＣからベータ細胞を作製するために提案された分化経路を示す模式図である。前記経路における第一段階は、ＥＳ細胞を胚体内胚葉系統へ変換移行させる。この段階はまた、膵臓内胚葉、内分泌内胚葉または島／β細胞への更なる分化過程に向けての第一段階といえる。前記経路における第二段階は、ＳＯＸ１７陽性／ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への変換移行を示す。これらの変換移行の媒介に有用ないくつかの因子は、イタリック体で示される。また、各標的細胞を決定するための関連するマーカーには、下線が付されている。 図２は、保存モチーフの位置を示し、ＧＥＮＯＶＡＣ社による免疫化処理に使用された領域にスポットを当てた、ヒトＳＯＸ１７ｃＤＮＡを示す図である。 図３は、ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に最も密接に関係し、ＳＯＸ１８に対しては幾分関係性が低いことを示す関係系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同一種内のＳＯＸ群Ｆサブファミリーの他のメンバーよりも、種ホモログの間でより密接に関係している。 図４は、ラット抗ＳＯＸ１７抗体を用いて調べたウェスタンブロットを示す。このブロットは、繊維芽細胞で過剰発現したヒトＳＯＸ１７タンパク質に対するこの抗体の特異性（レーン１）や、ＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）、また最も密接に関係したＳＯＸファミリーメンバーであるＳＯＸ７との免疫反応性の欠如（レーン３）を示す。 図５Ａ〜Ｂは、相当数のＡＦＰ＋同時標識細胞を示すＳＯＸ１７＋細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ＋細胞がほとんどまたは全く見られない他のＳＯＸ１７＋クラスター（Ｂ）とは著しい対照を成している。 図６Ａ〜Ｃは、壁側内胚葉およびＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞のランダムに分化した培養物中における、壁側内胚葉細胞の細胞表面に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に対する免疫細胞化学の結果を示している。パネルＢは、ＴＭおよびＳＯＸ１７に対し二重標識した、Ａに示したものと同一の領域である。パネルＣは、ＤＡＰＩで核が標識された同一領域の位相差画像である。ＤＡＰＩで標識された核とＳＯＸ１７標識の完全な相関性に注目されたい。 図７Ａ〜Ｂは、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現と、ＳＯＸ１７特異抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞とを示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）と比較して、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強力に抑制する一方で、アクチビンＡはＳＯＸ１７遺伝子発現を増加させることを示している。パネルＢは、同一のパターンを示し、これら同程度の変化は、ＳＯＸ１７＋細胞数に反映されており、これは、ＳＯＸ１７遺伝子発現の定量ＰＣＲ測定が、単一細胞レベルでの変化に高度に反映されていることを示している。 図８Ａは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、ランダムに分化させた細胞がＡＦＰの大幅な発現増加を示す一方で、アクチビンＡの存在下における分化ｈＥＳＣの培養物のＡＦＰ遺伝子発現が低レベルにとどまることを示す棒グラフである。発現量には約７倍の差がある。図８Ｂ〜Ｃは、１０％ＦＢＳのみの場合（上）に対して、アクチビンＡ処理状態（下）において見られる非常に少ない小さなＡＦＰ＋細胞クラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制も、単一細胞レベルにおいて明白であることを示す２枚の顕微鏡写真の画像である。 図９Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーを用いたＡＦＰ＋細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在下（右のパネル）および不在下（左のパネル）におけるＡＦＰ遺伝子発現（図８Ａ）における変化の大きさが、ＡＦＰ＋細胞数に厳密に対応することを示しており、これは、単一細胞レベルで生じる変化を示すための定量ＰＣＲ分析の有用性をさらに裏付けている。 図１０Ａ〜Ｆは、ノーダル、アクチビンＡおよびアクチビンＢ（ＮＡＡ）にｈＥＳＣを暴露することにより、５日間（Ａ〜Ｃ）でＳＯＸ１７＋細胞の数が著しく増加することを示す顕微鏡写真である。各領域に存在する総細胞数に対するＳＯＸ１７＋細胞の相対存在量を比較することにより、ＤＡＰＩで染色された核（Ｄ〜Ｆ）により示されているように、ＮＡＡによる５日間の処理後、全細胞の約３０〜５０％が、ＳＯＸ１７に対し免疫反応性を有することが分かる。 図１１は、分化ｈＥＳＣにおいて、アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍＬ）が、ＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増加させることを示す棒グラフである。発現は、接着培養での３日間の処理後、すでに激しく増加しており、その後の１、３および５日間の浮遊培養中も引き続き同様に増加している。 図１２Ａ〜Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）およびＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増加は、胚体内胚葉の他の３つのマーカーである、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂに関しても見られる。アクチビンの投与量に応じて増加する発現の程度は、ＳＯＸ１７に関して観察されたものと非常に類似しており、これは、アクチビンＡが、４つ全ての遺伝子（ＳＯＸ１７＋、ＭＩＸＬ１＋、ＧＡＴＡ４＋およびＨＮＦ３ｂ＋）を共発現する細胞集団を特定していることを強く示している。 図１３Ａ〜Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）およびＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。臓側内胚葉のマーカーＡＦＰの発現は、アクチビンＡの用量に依存して減少している。いくつかの時点において、原始内胚葉（ＳＯＸ７）および壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、変化していないか、または抑制されており、これは、アクチビンＡが、これらの胚外内胚葉細胞型を特定する働きをしないことを示唆している。これは、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂの発現の増加が、アクチビンＡに応じた胚体内胚葉細胞数の増加によるものであることをさらに裏付けている。 図１４Ａ〜Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（パネルＢ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一定した発現は、神経分化へのアクチビンＡ用量依存的効果がないことを示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現の減少によって示されているように、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ処理を介して中胚葉の分化は著しく抑制されている。これは、おそらく、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の特異化が進んだ結果であろう。未処理の対照培養物と比較して、分化後期では、少量のアクチビンＡを用いた処理（１０および３０ｎｇ／ｍＬ）により、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現が維持されている。 図１５Ａ〜Ｂは、アクチビンを用いた処理により壁側内胚葉の分化が低減したことを示す顕微鏡写真である。血清のみで分化させた場合、ＴＭｈｉの壁側内胚葉の領域が、培養物（Ａ）全体に渡って見られた。一方、アクチビンが含まれている場合（Ｂ）、ＴＭ＋細胞への分化は殆ど見られず、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。 図１６Ａ〜Ｄは、アクチビンＡおよびアクチビンＢを用いた処理によるマーカーの発現を示す顕微鏡写真である。アクチビンＡおよびアクチビンＢを用いて４日間連続でｈＥＳＣを処理し、ＳＯＸ１７、ＡＦＰおよびＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡは、ＳＯＸ１７；パネルＢはＡＦＰ；パネルＣはＴＭ：そしてパネルＤが位相（Ｐｈａｓｅ）／ＤＡＰＩである。ＡＦＰ（Ｂ）およびＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な欠如に関連した多数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。 図１７は、ｈＥＳＣからの、生体外での胚体内胚葉および臓側内胚葉の発生を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域は、ＡＦＰｈｉ／ＳＯＸ１７ｌｏ／−により同定されるが、胚体内胚葉は、全く反対の特性、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／−を示す。これら二つの領域が互いに近接しているため、この領域を選択した。しかしながら、ＡＦＰｈｉ細胞のいずれの領域からも完全に孤立して、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／−の領域が見られることが頻繁にある。これは、胚体内胚葉細胞が、臓側内胚葉細胞とは別個に発生することを示唆している。 図１８は、ＴＧＦβファミリーのリガンドと受容体を表す図である。ＡＲ ＳｍａｄｓとＢＲ Ｓｍａｄｓを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉を作製する上で有用である。（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８７：２６５−７６参照）。 図１９は、ＴＧＦβ因子を単独および組合せて用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。 図２０は、ＴＧＦβ因子の組合せを用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増加を示す棒グラフである。 図２１は、ＴＧＦβ因子の組合せを用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。 図２２は、アクチビンＡが、ＳＯＸ１７＋細胞数の用量依存的な増加を引き起こすことを示す棒グラフである。 図２３は、アクチビンＡおよびアクチビンＢで処理された培養物へのＷｎｔ３ａの添加により、アクチビンＡおよびアクチビンＢのみにより引き起こされたレベル以上にＳＯＸ１７の発現が増加することを示す棒グラフである。 図２４Ａ〜Ｃは、胚体内胚葉への分化が、ＦＢＳの少ない条件下で増強されることを示す棒グラフである。２％のＦＢＳ（２ＡＡ）を含む培地におけるアクチビンＡおよびＢを用いたｈＥＳＣの処理は、１０％のＦＢＳを含む培地（１０ＡＡ）における同様の処理と比べて、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現を引き起こす（パネルＡ）。また、胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１（パネルＢ）の誘導も同様に影響され、ＡＦＰ（臓側内胚葉）（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ条件下より２％ＦＢＳ条件下で、より大きく抑制されている。 図２５Ａ〜Ｄは、培養物中、ＳＯＸ１７＋細胞が分離していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応細胞は、ｈＥＳＣコロニー（Ｃ、Ｄ）の分化領域縁部に存在し、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（パネルＢ）で標識されるが、ＯＣＴ４（パネルＣ）での同時標識はされない。さらに、ＯＣＴ４＋未分化ｈＥＳＣ（矢じり形で示す）およびＳＯＸ１７＋細胞（矢印）のいずれにおいても、核のＤＡＰＩ標識により、明瞭な有糸分裂像が見られる（Ｄ）。 図２６は、様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対的発現量を示す棒グラフである。 図２７Ａ〜Ｄは、図２６に示した同様の分化処理全体に渡って、胚体内胚葉マーカーに関するパネルが、いかにＣＸＣＲ４と非常によく似た発現パターンを共有しているかを示す棒グラフである。 図２８Ａ〜Ｅは、図２６に示した同様の処理全体に渡って、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）および臓側内胚葉（ＳＯＸ７）のマーカーが、いかにＣＸＣＲ４の発現に対し逆相関性を呈するかを示す棒グラフである。 図２９Ａ〜Ｆは、図２６〜２８に示した培地条件の内の３つに関して、ＳＯＸ１７免疫反応細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。 図３０Ａ〜Ｃは、分化培地に添加したアクチビンＡの濃度が高くなるにつれ、ＣＸＣＲ４＋の細胞数が増加することを示すフローサイトメトリーによるドットプロットである。 図３１Ａ〜Ｄは、高用量のアクチビンＡによる処理（Ａ１００−ＣＸ＋）により分離されたＣＸＣＲ４＋細胞が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーについてさらに豊富であることを示す棒グラフである。 図３２は、母集団における遺伝子発現、並びに、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて分離されたＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−細胞からの遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４＋細胞が、各母集団に存在するＣＸＣＲ４の遺伝子発現を本質的にすべて含み、ＣＸＣＲ４−集団は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんどまたは全く含まないことを示している。 図３３Ａ〜Ｄは、これら非胚体内胚葉マーカーの発現においては既に抑制されている、高用量アクチビンＡ処理により分離されたＣＸＣＲ４＋細胞における中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）および臓側内胚葉（ＳＯＸ７）の遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。 図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。 図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。 図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。 図３５は、アクチビン有りおよび無しでｈＥＳＣを培養し、４日目に添加したレチノイン酸（ＲＡ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１０）の存在下、培養４日後および６日後でのＰＤＸ１遺伝子の相対的発現を示す図である。 図３６Ａ〜Ｆは、アクチビン有りおよび無しでｈＥＳＣを培養し、４日目に添加したレチノイン酸（ＲＡ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１０）の存在下、培養４日後および６日後でのマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＳＯＸ１７、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＳＯＸ１、（Ｅ）ＺＩＣ１および （Ｆ）ＮＦＭ。 図３７Ａ〜Ｃは、アクチビン有りおよび無しでｈＥＳＣを培養し、４日目に添加したレチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１０）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−４）の１又は２以上の存在下または非存在下、培養４日後および８日後でのマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７および （Ｃ）ＮＦＭ。 図３８Ａ〜Ｇは、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０と共に、１μＭ、０．２μＭまたは０．０４μＭのいずれかでレチノイン酸（ＲＡ）を４日目に添加して胚体内胚葉細胞を培養し、培養中のマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＨＯＸＡ３、（Ｃ）ＨＯＸＣ６、（Ｄ）ＨＯＸＡ１３、（Ｅ）ＣＤＸ１（Ｆ）ＳＯＸ１および （Ｇ）ＮＦＭ。 図３９Ａ〜Ｅは、アクチビン有りおよび無しでｈＥＳＣを培養し、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１０）、および、血清リプレースメント（ＳＲ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＢ２７のいずれか１つを組み合わせたものの存在下、培養４日後および８日後でのマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＺＩＣ１および （Ｅ）ＮＦＭ。 図４０Ａ〜Ｂは、ｈＥＳＣを培養し、培養６日後（ＲＡ添加直前）および９日後（ＲＡ添加後３日）でのマーカー遺伝子（膵臓（ＰＤＸ１、ＨＮＦ６）および肝臓（ＰＤＸ１、ＨＮＦ６）に対するもの）の相対的発現を示す図である。２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）または５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のアクチビンＡの存在下、１０ｎｇ／ｍｌ（ａ１０）、２５ｎｇ／ｍｌ（ａ２５）または５０ｎｇ／ｍｌ（ａ５０）の用量といった異なる条件でアクチビンＢを添加して、比較した。アクチビンＡやアクチビンＢ無しの条件（ＮＦ）は、胚体内胚葉およびＰＤＸ１陽性内胚葉産生のためのネガティブコントロールとした。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１および（Ｂ）ＨＮＦ６。 図４１Ａ〜Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌ（Ａ１００）、５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のアクチビンＡの存在下またはアクチビンＡなし（ＮＦ）で、ｈＥＳＣを培養し、培養５日（レチノイン酸添加直前）およびＲＡ添加後２、４、６日（それぞれ培養７、９、１１日）でのマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。各バーの下のパーセンテージは、分化３−５日におけるＦＢＳの用量を示す。７日目から、ＲＡ（Ｒ）で処理した細胞は、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で成長をはじめた。ＲＡの濃度は、７日目２μＭ、９日目１μＭ、１１日目０．２μＭ、であった。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＺＩＣ１および（Ｃ）ＳＯＸ７。 図４２Ａ〜Ｂは、胚体内胚葉を誘導するため、まず低ＦＢＳにおいてアクチビンＡ処理したｈＥＳＣを培養し（５日）、次いでＰＤＸ１発現内胚葉を誘導するため、２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよびＲＡを含む新鮮培地（Ａ２５Ｒ）、または種々の条件培地（ＭＥＦＣＭ、ＣＭ＃２、ＣＭ＃３、ＣＭ＃４）およびＲＡで培養し、各培養物におけるマーカー遺伝子の相対的発現を示す図である。マーカーの発現は、５，６，７，８，９日目に決定された。各パネルはそれぞれ以下のマーカー遺伝子の相対的発現を示す。（Ａ）ＰＤＸ１および（Ｂ）ＣＤＸ１。 図４３は、胚体内胚葉を誘導するため、まず低ＦＢＳにおいてアクチビンＡ処理したｈＥＳＣを培養し、次いでアクチビンＡおよびＲＡを含む新鮮培地（Ａ２５Ｒ）、または新鮮培地に希釈された条件培地にＲＡを種々の量加えたもので培養し、各培養物におけるＰＤＸ１の相対的発現を示す図である。すべての場合において培地の全容量は５ｍｌである。 図４４は、ＲＡおよび５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ添加後３日（ｄ８）および４日（ｄ９）におけるＲＡ処理した胚体内胚葉細胞から免疫沈降したＰＤＸ１を示すウェスタンブロットである。 図４５は、ＰＤＸ１プロモーターの制御下にあるＥＧＦＰレポーターで遺伝子工学的にタグされたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の蛍光活性細胞分類（ＦＡＣｓ）の結果を示すまとめの図である。 図４６は、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）およびＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の各分類集団について、ハウスキーピング遺伝子で標準化したＰＤＸ１の相対的発現レベルを示す図である。 図４７は、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）、ＥＧＦＰ陽性細胞集団のうち低いＥＧＦＰシグナル強度をもつ半分（Ｌｏ）、およびＥＧＦＰ陽性細胞集団のうち高いＥＧＦＰシグナル強度をもつ半分（Ｈｉ）の各分類集団について、ハウスキーピング遺伝子で標準化したＰＤＸ１の相対的発現レベルを示す図である。 図４８Ａ〜Ｅは、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）およびＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の各分類集団において、ハウスキーピング遺伝子で標準化した５つの膵臓内胚葉マーカーの相対的発現レベルを示す図である。パネルＡはＮＫＸ２．２、ＢはＧＬＵＴ２、ＣはＨＮＦ３β、ＤはＫＲＴ１９、ＥはＨＮＦ４αである。 図４９は、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）およびＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の各分類集団において、ハウスキーピング遺伝子で標準化した２つの非膵臓内胚葉マーカーの相対的発現レベルを示す図である。パネルＡはＺＩＣ１、ＢはＧＦＡＰである。
原腸形成と呼ばれるヒト発生初期における極めて重要な段階は、受精後２〜３週間で生じる。原腸形成が極めて重要である理由は、三つの一次胚葉が初めて特定化され組織化されるのがこの時だからである（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｏｅｎｗｏｌｆ ａ
ｎｄ Ｓｍｉｔｈ，２０００）。外胚葉は、体の外皮および全神経系の最終形成をつかさ
どる一方で、心臓、血液、骨、骨格筋、および他の結合組織は、中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃、小腸および大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、および膵臓などの腸管に由来する器官の形成をつかさどる胚葉と定義される（Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，２０００；Ｋｉｍｅｌｍａｎ
ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，２０００；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｅｌ
ｌｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，１９９９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，２０００）。胚体内胚葉と、原始内胚葉と呼ばれる、完全に別個の系列の細胞とを区別することは非常に重要である。原始内胚葉は、主として、胚体外組織、主に、ライヘルト膜の細胞外マトリックス物質と胎盤の卵黄嚢の壁側および臓側内胚葉部分の形成をつかさどる。
原腸形成の間、胚体内胚葉形成の過程は、中内胚葉細胞（中胚葉または内胚葉を形成することのできる細胞）が原始線条と呼ばれる構造を通って移動する、細胞移動現象から始まる。胚体内胚葉は、線条前部を通り、そして結節（線条最前部における特殊構造）を通って移動する細胞に由来する。移動が生じるにつれ、胚体内胚葉は、まず、腸管最前部に位置し、腸管後端の形成で終了する。
発生中のＰＤＸ１遺伝子発現
ＰＤＸ１（ＳＴＦ−１、ＩＤＸ−１およびＩＰＦ−１とも呼ばれる）は、膵臓および吻側十二指腸の発生に必要な転写因子である。ＰＤＸ１は最初に、前腸内胚葉の後方から生じ、外分泌および内分泌細胞を作る膵臓内胚葉にて発現し、それはマウスではＥ８．５期に始まる。その後、ＰＤＸ１はベータ細胞やデルタ細胞の一部に限局するようになり、この発現パターンは成体で維持される。ＰＤＸ１は発生初期において形成中の膵臓に隣接する十二指腸内胚葉、次いで、十二指腸エンテロサイトと腸内分泌細胞、胃腔部、総胆管、胆嚢管および胆管でも発現する。この発現領域は、膵臓での発現が制限される時点で、吻側十二指腸に優勢的に限定されるようになる。
ＰＤＸ１陽性細胞とこれに関連するプロセス
本発明の実施形態は、新規で明確なＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の生産方法に関するものであって、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸／中腸部由来の細胞、組織または器官に
分化し得る多分化能細胞である（ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉）。ここで、「多分化性」や「多分化能細胞」の語は、他の特定の細胞型（細胞タイプ）を限定数発生させる細胞型の意味で用いている。また、「前腸／中腸」の語は、前腸／中腸接合部の細胞を含む、腸管前方部および中央部の細胞の意味で用いている。
本発明の好適な実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の生産方法に関するものである。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）。
他の好適な実施形態は、前腸後方部のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の生産方法に関するものである。いくつかの実施形態において、これらのＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腸管前腸領域後方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である。
本明細書記載の方法にしたがって生産されるようなＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、十分に分化したインシュリン産生ベータ細胞の生産に利用可能である。本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、実質的にＰＤＸ１を発現しない胚体内胚葉細胞（本明細書において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞または胚体内胚葉という。）を分化させ、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成することによって生産される。ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、本明細書に記載されるようにヒト胚性幹細胞などの多分化能細胞を分化させることによって、あるいは他の公知の方法によって調製可能である。多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を生産するための簡便で効率性の高い方法が、２００４年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（
胚体内胚葉）」の米国特許出願第１１／０２１，６１８号に開示されている。
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の生産方法は、多分化能細胞から腺房細胞、導管細胞および膵島細胞などの膵臓組織を効率よく生産するための基礎を提供するものである。ある好適な実施形態において、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ヒトＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に由来し、この胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。そして、このヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、機能的なインスリン産生β細胞の生産に利用できる。有用な量のインスリン産生β細胞を得るため、膵島／β細胞への分化到達前に生じる各分化段階において、効率よく分化させることが望ましい。ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化は、機能的な膵島／β細胞の作製に向かう初期の段階に相当するため（図１に示すように）、この段階で効率よく分化させることは特に望ましい。
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を効率よく行うことは特に望ましいため、本発明のいくつかの態様は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約２−２５％をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へ転換させるインビトロ（生体外）の方法に関する。この典型的な方法として、時間的に特定された所定のやり方における培養物や増殖因子に関する条件の適用が含まれる。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に特異的に結合する試薬を使用することで、細胞集団内の他の細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分離および／または精製することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞集団をさらに豊富化することができる。選択的なものとして、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１発現を検出できるように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子で標識することができる。そのような蛍光標識細胞は、蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）によって精製することができる。本発明の他の態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物、その豊富な細胞集団、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉からまたは同内胚葉への分化に有用な因子を同定する方法に関する。
細胞培養物または細胞集団内のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の量を決定するためには、培養物または集団において、他の細胞からこの細胞型を識別する方法が望ましい。従って、本発明のある実施形態は、その存在、不在および／または相対的発現量がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に特異的である細胞マーカーと、そのようなマーカーの発現を検出および測定する方法とに関する。本明細書において使用する、「発現」とは、材料または物質の生成、並びに材料または物質の生成レベルまたは量のことを言う。よって、特異的なマーカーの発現を測定するということは、マーカーの存在または不在を簡易に検出すること、あるいは発現するマーカーの相対量または絶対量のいずれかを検出することを言う。本明
細書に使用する、「マーカー」は、観察または検出できるあらゆる分子のことを指す。例えば、マーカーは、特異的遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物のポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質，リポタンパクまたは小分子（例えば、10,000 amu未満の分子量をもつ分子）を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のいくつかの実施形態において、マーカーの発現の有無および／または量は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。例えば、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）などの一定の遺伝子マーカーや、本明細書に記載している他のマーカーにより産生される転写物の量は、定量Ｑ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態においては、上記遺伝子により発現したタンパク質の検出に免疫組織化学法が使用される。さらに別の実施形態において、そのようなマーカーの量または相対的比率の確認および測定には、Ｑ−ＰＣＲおよび免疫組織化学法の両方を利用する。
上記のような分化と検出方法を利用することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を同定するだけでなく、細胞培養物あるいは細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の比率を求めることも可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞またはその細胞集団より約２桁多い量のＰＤＸ１遺伝子を発現する。他の実施形態において、作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞またはその細胞集団より３桁以上多い量のＰＤＸ１遺伝子を発現する。さらに別の実施形態において、作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞またはその細胞集団より約２桁または３桁以上多い量の、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される一以上のマーカーを発現する。
本明細書に記載している組成物および方法には、いくつかの有用な特性がある。例えば、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含む細胞培養物および細胞集団、並びにそのような細胞培養物および細胞集団を作製する方法は、ヒト発生の初期段階をモデル化する上で有用である。さらに、本明細書に記載の組成物と方法は、糖尿病などの病状における治療行為にも役立つ。例えば、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は、限られた数の組織のみの源となるため、純粋な組織または細胞型の発生に使用することができる。
多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）の作製
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／又は細胞集団は、多分化能細胞から、まずＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（「胚体内胚葉」ともいう。）を作製することによって、作製することができる。多分化能細胞を分化させ、胚体内胚葉を豊富に含む細胞培養物および／又は細胞集団を作製する方法については、２００４年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」の米国特許出願第
１１／０２１，６１８号に詳細に開示されているが、以下簡単に説明する。これらの方法のいくつかでは、出発材料として用いられる多分化能細胞は、幹細胞である。いくつかの方法において、胚体内胚葉細胞培養物および胚体内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、胚性幹細胞から作製される。
本明細書で使用している、「胚性、胚の（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体に始まり、成長した配偶子細胞以外に多能性または全能性細胞をもはや含まない多細胞性構造体に終わる、生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により誘導された胚に加え、用語「胚性、胚の（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」は、体細胞核移植により誘導された胚も指す。胚体内胚葉細胞を誘導する好ましい方法では、胚体内胚葉作製のための出発物質として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を利用する。この方法で使用される多分化能細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起から得られたものに由来する細胞であってもよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分野において周知の方法を用いて、実質的に分化することなく多能性の状態で培養物中に維持できる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，
４５３，３５７号明細書、第５，６７０，３７２号明細書、第５，６９０，９２６号明細書、第５，８４３，７８０号明細書、第６，２００，８０６号明細書および第６，２５１，６７１号明細書に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本明細書に記載されている胚体内胚葉作製方法のいくつかの実施形態において、ｈＥＳＣは、支持細胞層で維持される。そのような方法においては、ｈＥＳＣを多能性の状態で維持できるいかなる支持細胞層も使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養に一般に使用される一支持細胞層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに最近では、ヒト線維芽細胞の支持細胞層が、ｈＥＳＣの培養に使用するために開発されている（米国特許出願第２００２／００７２１１７号明細書参照。この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる）。胚体内胚葉作製方法の別の実施形態は、支持細胞層を使用することなく、多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。そのような支持細胞層を使用しない条件下で多能性ｈＥＳＣを維持する方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号明細書に記載されており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
ここで使用されるヒト胚性幹細胞は、血清の有無にかかわらず培養物中に維持することができる。いくつかの方法においては、血清代替物（血清リプレースメント）が使用される。別の方法においては、米国特許出願第２００３／０１９０７４８号明細書に記載されているような、無血清培養技術が使用される。この特許出願の全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
幹細胞は、胚体内胚葉への分化が望まれるまで、定期的な継代培養によって、培養物中、多能性の状態で維持される。いくつかの方法においては、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物に提供することにより、胚体内胚葉に分化させる。胚体内胚葉の作製に有用なＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル／アクチビンまたはＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好適な分化方法において、増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＢＭＰ４からなる群から選択される。さらに、増殖因子Ｗｎｔ３ａおよび他のＷｎｔファミリーメンバーは、胚体内胚葉細胞の作製に有用である。このような分化方法において、上記増殖因子はいかなる組み合わせでも使用できる。
多分化能幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化方法のいくつかに関して、上記増殖因子は、幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な濃度で培養物中に存在するよう、細胞に提供される。いくつかの方法において、上記増殖因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌまたは約５０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で細胞培養物中に存在する。
多分化能幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化方法のいくつかにおいて、上記増殖因子は、添加後、細胞培養物から除去する。例えば、増殖因子は、添加後、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内又は１０日以内に除去してもよい。好適な方法において、増殖因子は、添加の約４日後に除去する。
胚体内胚葉細胞の培養物は、少量の血清を含むか、あるいは、血清を含まない培地で増殖させることができる。ある培養条件において、血清濃度は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であればよい。例えば、ある分化方法において、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）
未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満または約２０％（ｖ／ｖ）未満であってもよい。いくつかの方法において、胚体内胚葉細胞は、血清なしで、あるいは、血清代替物を用いて増殖させる。さらに別の方法において、胚体内胚葉細胞は、Ｂ２７の存在下で増殖させる。そのような方法において、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であればよい。
多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）への分化のモニタリング
ｈＥＳＣ培養物の胚体内胚葉への進行は、胚体内胚葉に特有のマーカーの発現を測定することによりモニターすることができる。いくつかの方法において、あるマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することにより測定される。また、あるマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞内におけるマーカーの存在量を測ることにより測定される。そのような方法において、マーカーの発現測定は、定性的測定であっても定量的測定であってもよい。マーカー遺伝子により作られる発現マーカーを定量化する一方法は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を利用したものである。Ｑ−ＰＣＲを行う方法は、当技術分野においては周知である。また、当技術分野において周知となっている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量化に使用できる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異な抗体を使用することにより検出することができる。いくつかの方法において、胚体内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現のほかに、ｈＥＳＣや他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の著しい発現の欠如も測定される。
以下の実施例においてさらに説明するように、胚体内胚葉の信頼できるマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。そのため、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現することにより、ＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１である。いくつかの方法において、ＳＯＸ１７およびＳＯＸ７の発現がモニターされ、胚体内胚葉細胞は、原始および臓側内胚葉に特有のＳＯＸ７マーカー遺伝子（表１参照）より高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する。さらに、いくつかの方法においては、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子と、ｈＥＳＣに特有のＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現がモニターされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するので、これらの遺伝子の発現をモニターしてもよい。
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、リガンドが化学誘引物質ＳＤＦ−１である細胞表面ケモカイン受容体をコードする。成体における、ＣＸＣＲ４受容体を有する細胞の主な役割は、造血細胞の骨髄への移動、リンパ球輸送および様々なＢ細胞とマクロファージ血液細胞系列の分化であると考えられている［Ｋｉｍ，Ｃ．およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６５、
６−１５（１９９９）］。また、ＣＸＣＲ４受容体は、ＨＩＶ−１のＴ細胞侵入のための共同受容体としても機能する［Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２、８
７２−８７７（１９９６）］。［ＭｃＧｒａｔｈ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ２１３、４４２−４５６（１９９９）］により行われた広範囲に及ぶ一連の研
究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とその特異なリガンド、ＳＤＦ−１［Ｋｉｍ，Ｃ．，およびＢｒｏｘｍｙｅｒ，Ｈ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６５、６−１５
（１９９９）］の発現は、マウスの初期発生および成体期において認められた。いずれかの遺伝子が、トランスジェニックマウス内で壊されたときに、後期胚の致死を引き起こすことが実証されたので［Ｎａｇａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３８２、６３５−６３８（１９９６）］、Ｍａ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１０、４６３−４７１（１９９９）］、発生過程におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１の相互作用が明らかになった。ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮａｓｅ保護とin situハイブリダイゼーション法
を組合せて使用し、ＣＸＣＲ４が、初期原腸陥入胚（Ｅ７．５）のときに検出される最も大量のケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸陥入胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原条胚葉細胞の移動を誘導することに主に関与しているようであり、このとき存在する胚体内胚葉、中胚葉および胚外中胚葉で見られる。Ｅ７．２〜７．８のマウス胚において、ＣＸＣＲ４とアルファフェトプロテインは互いに排他的であり、臓側内胚葉において発現しないことを示している［ＭｃＧｒａｔｈ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１３、４４２−４５６（１９９９）］。
多分化能細胞を分化させることにより作られるいくつかの胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現し、胚体内胚葉細胞の作製を調べるため、ＣＸＣＲ４の発現がモニターされる。さらに、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。他のマーカーとしては、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子より高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現し、ＣＸＣＲ４およびＳＯＸ７の発現がモニターされる。他の方法においては、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子と、ＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現がモニターされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するので、これらの遺伝子の発現をモニターしてもよい。
当然のことながら、内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現が、ＳＯＸ１７の発現を妨げることはない。このように、本明細書記載の方法によって作られる胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４を実質的に発現し、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣまたはＰＤＸ１を実質的に発現しない。
胚体内胚葉の豊富化、分離および／または精製
前述のいずれかの方法により作られた胚体内胚葉細胞は、そのような細胞に特異な親和性標識を使用することにより、濃縮（豊富化）、分離および／または精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異な親和性標識の例としては、胚体内胚葉細胞の細胞表面には存在するが、本明細書に記載されている方法により作製される細胞培養物において見られる他の細胞型には実質的に存在しないポリペプチドなどのマーカー分子に特異的な抗体、リガンドまたは他の結合剤が挙げられる。いくつかの方法においては、ＣＸＣＲ４に結合する抗体が、胚体内胚葉細胞の濃縮、分離または精製のための親和性標識として使用される。また、他の方法においては、ケモカインＳＤＦ−１または他のＳＤＦ−１系分子も、親和性標識として使用することができる。そのような分子としては、ＳＤＦ−１断片、ＳＤＦ−１融合物、またはＳＤＦ−１模倣物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
抗体を作製する方法、およびそれらを細胞分離に使用する方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法は、本明細書に記載されている胚体内胚葉細胞や抗体を用いて実施することができる。ある方法において、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、磁気ビーズに付着させた後、細胞間および基質接着性を低下させるよう酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に結合させる。そして、細胞／抗体／ビーズ複合体を、ビーズ結合胚体内胚葉細胞を非結合細胞から分離するために使用する変動磁界に曝す。一旦、胚体内胚葉細胞を培養物中の他の細胞から物理的に分離すると、抗体結合を解き、その細胞を適切な組織培養培地に再度蒔き培養する。
濃縮、分離または精製された胚体内胚葉細胞培養物または集団を得るため、他の方法を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４抗体は、細胞間および基質接着性を低下させるよう処理された胚体内胚葉含有細胞培養物と共にインキュベートされる。その後、細胞を洗浄し、遠心分離し、再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、一次抗体に結合し得るＦＩＴＣ標識抗体などの二次抗体と共にインキュベートする。その後、その細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液中に再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、
蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて分析選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞とは別に回収することにより、そのような細胞型を分離することができる。必要に応じて、分離された細胞組成物は、親和性を利用した別の方法を利用するか、あるいは胚体内胚葉に特異的な、同じまたは別のマーカーを用いてさらに一連の選別を行なうことにより、さらに精製することができる。
さらに他の方法において、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンドまたは他の分子を用いて、濃縮、分離および／または精製される。いくつかの方法において、その分子は、ＳＤＦ−１、或いはその断片、融合物または模倣物である。
好適な方法において、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が、胚体内胚葉系列に沿って分化するよう誘導された後、濃縮され、他の非胚体内胚葉細胞から分離および／または精製される。当然のことながら、上記濃縮、分離および精製方法は、分化のどの段階においても、上記のような培養物で採用することができる。
また、上述の方法に加え、胚体内胚葉細胞は、細胞を分離する他の技術により分離してもよい。さらに、胚体内胚葉細胞は、前記胚体内胚葉細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する増殖条件で、連続継代培養法により濃縮または分離してもよい。
本明細書に記載されている方法を用いて、濃縮、分離および／または精製された胚体内胚葉細胞の集団および／または組織は、少なくともいくらか分化した、幹細胞培養物または集団などの多能性細胞培養物またはその細胞集団から生体外で作製することができる。いくつかの方法において、細胞は、ランダムに分化する。しかしながら、好適な方法において、細胞は、主として胚体内胚葉に分化するように誘導される。いくつかの好適な濃縮、分離および／または精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の生体外での作製に関する。本明細書に記載されている方法を用いて、細胞集団または細胞培養物の胚体内胚葉含有量を、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍から約１０００倍に濃縮することができる。
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）を含む組成物
本明細書記載の方法によって作製される細胞組成物は、胚体内胚葉を含む細胞培養物と、胚体内胚葉を豊富に含む細胞集団とを包含する。例えば、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が、その培養物中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞であるものを作製可能である。分化方法の効率は、一定のパラメーターを変更することにより調整できるため、本明細書に記載した分化方法では、多能性細胞の胚体内胚葉への転換は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％以上でありうる。前記一定のパラメーターとしては、細胞増殖条件、増殖因子濃度および培養段階のタイミングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。胚体内胚葉細胞の単離方法では、例えば、ＣＸＣＲ４受容体に結合する親和剤を使用して、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団を得ることができる。
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の作製
本明細書記載のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞集団は、前述のように多分化能細胞から得られるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉から作られる。好適な方法は、出発材料としてヒト胚性幹細胞を使用する。ある実施形態によると、ｈＥＳＣをまずＰＤＸ１陰性胚体内胚葉に変換し、次にＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に変換する。しかし、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉作製のための出発材料は、多分化能細胞分化法により作られた胚体内胚葉細胞に限定されるものではない。ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、その起源にかかわらず、本明細書記載の方法で得られるものを使用できる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団は、さらにＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞培養物および／又は細胞集団に分化させるために用いることができる。例えば、ヒトＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を用いることができる。いくつ
かの実施形態において、細胞培養物または細胞集団は、先の分化工程（すなわち、多分化能細胞から胚体内胚葉細胞への分化工程）において使用したアクチビン、ノーダルおよび／又はＢＭＰなどの分化促進因子を含むものであってもよい。他の実施形態において、先の分化工程において使用した因子は、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化のために使用される因子の添加前に細胞培養物または細胞集団から除去される。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞作製のための材料として使用される。
ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する分化促進因子（前腸分化促進因子）を加えることによって、培養物中のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へと分化させる。本発明のいくつかの実施形態において、前腸分化促進因子は、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドである。いくつかの実施形態において、レチノイドは、ＦＧＦ−４やＦＧＦ−１０などの線維芽細胞増殖因子と組み合わせて使用される。他の実施形態において、レチノイドは、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子メンバーおよび／又は条件培地と組み合わせて使用される。
「条件培地」とは、基礎培地と比較して変更された培地を意味する。例えば、培地の条件付けは、栄養因子および／又は増殖因子などの分子を加えたり、基礎培地の元のレベルから低下させることによってもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ある期間ある条件の下で培地のある細胞型を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。例えば、所定時間、所定温度にて所定組成の培地中でｈＥＳＣを増殖、分化または維持させることによって、培地は条件付けされる。当業者にとって理解できるように、細胞、培地のタイプ、時間および環境条件の様々な組み合わせが、殆ど無限の種類の条件培地作製に使用することができる。本発明のいくつかの実施形態において、血清濃度が約１％から約２０％の培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。他の実施形態において、約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。さらに他の実施形態において、約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。好適な実施形態において、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと約２μＭのＲＡを含むＲＰＭＩなどの培地で２４時間、分化したｈＥＳＣを成長または維持させることによって、条件培地は調製される。
本発明のいくつかの実施形態において、培地の条件付けに使用され、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への分化を高めるために使用される細胞は、ｈＥＳＣなどの多分化能細胞から、約０−約２０％の血清および／又はＴＧＦβスーパーファミリーの増殖／分化促進因子を１以上含むＲＰＭＩなどの培地で約５日間にわたって分化される細胞である。アクチビンＡおよびＢＭＰ４などの分化促進因子は、約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される。本発明のある実施形態において、培地の条件付けに使用される細胞は、ｈＥＳＣから、低血清ＲＰＭＩで約５日間にわたって分化される細胞である。いくつかの実施形態によると、低血清ＲＰＭＩとは、血清濃度が所定期間にわたって徐々に増加する低血清培地のことである。例えば、ある実施形態によると、低血清ＲＰＭＩは、細胞増殖の初日は約０．２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞増殖の２日目は約０．５％のＦＢＳ、細胞増殖の３−５日目は約２％のＦＢＳを含んでいる。他の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、初日は約０％、２日目は約０．２％、３−６日目は約２％のＦＢＳを含んでいる。ある好適な実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、アクチビンＡおよびＢＭＰ４などの分化促進因子を１以上含んでいる。培地の条件付けに使用される細胞の調製での使用に加えて、低血清ＲＰＭＩは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化のための培地として使用することができる。
条件培地は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の成長または維持を妨げるものでない限り、ＲＰＭＩ以外の培地から調製できること、また、培地の条件付けに使用できる細胞には種
々のタイプのものを使用できることが、当業者に理解されるだろう。新たに分化させた細胞を培地の条件付けに使用する場合、そのような細胞の分化は、当該細胞の成長または維持を妨げるものでない限り、ＲＰＭＩ以外の培地で行うことができる。さらに、条件付けの期間、条件付けのための細胞の調製期間は、それぞれ２４時間、５日間である必要はなく、他の期間であっても同様の効果を得ることが可能であることが、当業者に理解されるだろう。
概して、線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子メンバー、条件培地、またはこれら前腸分化促進因子の組み合わせのいずれかと、レチノイドとを組み合わせて使用すると、レチノイド単独に比べて、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を高める。好適な実施形態では、ＲＡおよびＦＧＦ−１０の双方が、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物に供給される。他の好適な実施形態では、条件培地、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＲＡを含む培養物においてＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を分化させる。
本明細書記載の分化方法の実施形態において、前記前腸分化促進因子は、これらの因子がＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の細胞培養物または細胞集団の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように、細胞に供給される。「一部」という用語は、細胞培養物または／又は細胞集団と組み合わせて使用される場合、細胞培養物又は細胞集団の単一細胞から全体までにわたる、量的にゼロでない細胞培養物又は細胞集団を意味する。
本発明のいくつかの実施形態において、レチノイドは、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、または少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。ここで「レチノイド」とは、レチノール、レチナール、レチノイン酸およびこれら化合物の誘導体を意味する。好適な実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
本発明の他の実施形態においては、線維芽細胞増殖因子ファミリーの分化促進因子が、１又は２以上細胞培養物に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に存在させることができる。本発明のさらに他の実施形態においては、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に存在させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４またはＦＧＦ−１０のいずれかが、ＲＡと一緒に細胞培養物に供給される。好適な実施形態では、ＲＡの細胞培養物での濃度は１μＭであり、ＦＧＦ−１０の濃度は５０ｎｇ／ｍｌである。
本発明のいくつかの実施形態においては、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子、お
よび／又は条件培地が、細胞培養物に存在する。これらの分化促進因子は、ＲＡおよび／又は他の中腸―前腸分化促進因子（ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１０を含むが、これに限定されない）と組み合わせて使用できる。例えば、いくつかの実施形態においては、アクチビンＡおよび／又はアクチビンＢが、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に存在する。本発明のさらに他の実施形態においては、条件培地が、培地全体の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の濃度で細胞培養物に存在する。いくつかの実施形態においては、アクチビンＡ、アクチビンＢおよび条件培地が、ＲＡと一緒に細胞培養物に供給される。好適な実施形態では、約１μＭのＲＡ、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、および分化したｈＥＳＣ（約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む低血清ＲＰＭＩで約５日間分化させたもの）によって約２４時間条件付けられた低血清ＲＰＭＩ培地を含む細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化させる。他の好適な実施形態では、アクチビンＢおよび／又はＦＧＦ−１０もまた、それぞれ２５ｎｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養物に存在する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記前腸分化促進因子は、添加後、細胞培養物から除去される。例えば、前腸分化促進因子は、添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日以内に除去することができる。
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞クラスターは、低血清培地にて増殖可能である。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲にすることができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物で増殖される。例えば、いくつかの実施形態において、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、または約２０％（ｖ／ｖ）未満とすることができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清なしで増殖される。他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物で増殖される。
さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、Ｂ２７存在下で増殖される。そのような実施形態において、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲あるいは約２０％（ｖ／ｖ）以上の濃度で、細胞培養物に供給することができる。いくつかの実施形態において、培地のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、または約２０％（ｖ／ｖ）とすることができる。 選択的に、添加したＢ２７サプリメントの濃度は、商業的に入手
可能なＢ２７ストック溶液の強度によって測定できる。例えば、Ｂ２７は、Invitrogen社（Carlsbad, CA）の５０Ｘストック溶液を利用できる。十分な容量の増殖培地に、このストック溶液を十分量加えると、所望の量のＢ２７が供給された培地とすることができる。例えば、９０ｍｌの増殖培地に、５０Ｘ Ｂ２７ストック溶液を１０ｍｌ加えると、５０
Ｘ Ｂ２７が供給された増殖培地とすることができる。培地へのＢ２７供給濃度は、約０
．１Ｘ、約０．２Ｘ、約０．３Ｘ、約０．４Ｘ、約０．５Ｘ、約０．６Ｘ、約０．７Ｘ、約０．８Ｘ、約０．９Ｘ、約１Ｘ、約１．１Ｘ、約１．２Ｘ、約１．３Ｘ、約１．４Ｘ、約１．５Ｘ、約１．６Ｘ、約１．７Ｘ、約１．８Ｘ、約１．９Ｘ、約２Ｘ、約２．５Ｘ、約３Ｘ、約３．５Ｘ、約４Ｘ、約４．５Ｘ、約５Ｘ、約６Ｘ、約７Ｘ、約８Ｘ、約９Ｘ、約１０Ｘ、約１１Ｘ、約１２Ｘ、約１３Ｘ、約１４Ｘ、約１５Ｘ、約１６Ｘ、約１７Ｘ、約１８Ｘ、約１９Ｘ、約２０Ｘ、または約２０Ｘ以上とすることができる。
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性内胚葉への分化のモニタリング
多分化能細胞から胚体内胚葉への分化と同様に、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への分化の進行は、これらの細胞型に特有のマーカーの発現を測定することによりモニターすることができる。そのようなモニタリングによって、例えば、１又は２以上の分化促進因子の濃度や環境条件など、種々の条件下での所望量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の生産に十分な時間を決定することができる。好適な実施形態では、所望量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の生産に十分な時間は、ＰＤＸ１発現を検出することによって決定される。本発明のいくつかの実施形態において、あるマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することにより測定される。また、あるマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞内におけるマーカーの存在量を測ることにより測定される。そのような実施形態において、マーカーの発現測定は、定性的測定であっても定量的測定であってもよい。前述のように、マーカー遺伝子により作られる発現マーカーを定量化する好適な方法は、Ｑ−ＰＣＲを利用したものである。ある実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現、および他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の発現欠如を定量化することによって、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉培養物の細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への進行をモニターするため、Ｑ−ＰＣＲを使用する。また、当技術分野において公知となっている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量化に使用できる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異な抗体を使用することにより検出することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現のほかに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉、ｈＥＳＣおよび他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の著しい発現の欠如も測定される。
以下の実施例においてさらに説明するように、ＰＤＸ１は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に関係するマーカー遺伝子である。そのため、本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１の発現が測定される。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉にて発現する他のマーカー遺伝子（ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３および／又はＨＯＸＣ６を含むが、これに限定されない）の発現が測定される。ＰＤＸ１はまた、他の所定の細胞型（臓側内胚葉および所定の神経系外胚葉）で発現する場合があるので、本発明のいくつかの実施形態は、臓側内胚葉および／又は神経系外胚葉と関係するマーカー遺伝子の発現欠如または実質的な発現欠如を確かめている。例えば、いくつかの実施形態では、臓側内胚葉および／又は神経系細胞で発現するマーカー遺伝子（ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭを含むが、これに限定されない）の発現が測定される。
いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法によって作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。ある実施形態では、本明細書記載の方法によって作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉および／又は神経系細胞を実質的に含まない。
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の豊富化、分離および／または精製
本発明の更なる態様として、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、濃縮（豊富化）、分離および／または精製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、当該細胞を培養物から分離することによって
作製される。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、蛍光標識され、その後、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて非標識細胞から分離される。そのような実施形態において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸または発現性蛍光マーカー遺伝子をコードする他の核酸が、ＰＤＸ１陽性細胞を標識するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１プロモーターの下流に、ＧＦＰまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする少なくとも１コピーの核酸が、多分化能細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞に導入され、ＰＤＸ１プロモーターの制御下に、ＧＦＰ遺伝子産物またはその生物活性をもつフラグメントを発現させるようにする。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１をコードする核酸の全コード領域が、ＧＦＰまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする核酸に置換される。他の実施形態では、ＧＦＰまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする核酸は、ＰＤＸ１をコードする核酸の少なくとも一部と融合され、融合タンパク質を生じさせる。そのような実施形態では、融合タンパク質は、ＧＦＰと同様の蛍光活性を保持する。
上記多分化能細胞のように蛍光標識された細胞は、前述したように、胚体内胚葉、さらにＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へと分化される。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は蛍光マーカーを発現する一方、ＰＤＸ１陰性細胞は発現しないので、これら２つの細胞型を分離することができる。いくつかの実施形態では、蛍光標識されたＰＤＸ１陽性細胞と非標識のＰＤＸ１陰性細胞との混合物を含む細胞懸濁液から、ＦＡＣＳを用いて選別する。ＰＤＸ１陽性細胞は、ＰＤＸ１陰性細胞と分離して回収され、その細胞型が分離される。必要に応じて、分離された細胞組成物は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特異的な、同じまたは別のマーカーを用いてさらに一連の選別を行なうことにより、さらに精製することができる。
また、上述の方法に加え、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、細胞を分離する他の技術により分離してもよい。さらに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する増殖条件で、連続継代培養法により濃縮または分離してもよい。
当然のことながら、上記濃縮、分離および精製方法は、分化のどの段階においても、上記のような培養物で採用することができる。
本明細書に記載されている方法を用いて、濃縮、分離および／または精製されたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の集団および／または組織は、少なくともいくらか分化した、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞培養物またはその細胞集団から生体外で作製することができる。いくつかの方法において、細胞は、ランダムに分化する。しかしながら、好適な方法において、細胞は、主としてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化するように誘導される。いくつかの好適な濃縮、分離および／または精製方法は、ヒト胚性幹細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の生体外での作製に関する。
本明細書に記載されている方法を用いて、細胞集団または細胞培養物のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞含有量を、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍から約１０００倍に濃縮することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍から約５００倍に濃縮することができる。他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍から約２００倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍から約１００倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍から約８０倍まで濃縮することができる。ある実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍から約２０倍まで濃縮することができる。
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含む組成物
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものであって、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）である。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好適な実施形態において、胚体内胚葉はヒト細胞である。
本発明の他の実施形態は、ｈＥＳＣ、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞および中胚葉細胞からなる群から選ばれる１又は２以上の細胞型の細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。いくつかの実施形態において、ｈＥＳＣは、培養物の全細胞の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。他の実施形態において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、培養物の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書記載の方法によって作られ、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を主要な細胞型として含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法は、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、または少なくとも約５１％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／又は細胞集団を作製する。好適な実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含んでいる。他の実施形態では、本明細書記載の方法は、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、または少なくとも約１％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／又は細胞集団を作製する。好適な実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含んでいる。いくつかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の割合は、培養物に残存する支持細胞を除いて計算される。
本発明のさらに他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞とＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞との混合物を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。例えば、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約９５個につき、少なくとも約５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。他の実施形態においては、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約５個につき、少なくとも約９５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。また、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対し、他の割合のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。例えば、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１００００００個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１０００００
個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１００００個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１０００個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約５００個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１００個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１０個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約５個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約４個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約２個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約２個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約４個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１０個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約２０個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約５０個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１０００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、少なくとも約１０００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞約１個につき、および少なくとも約１００００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物を作製できる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作るためのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞などのヒト多分化能細胞由来である。ある実施形態では、ヒト多分化能細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起に由来する。他の実施形態では、ヒト多分化能細胞は、胎生期を過ぎ発達した多細胞構造の生殖組織に由来する。
本発明のさらに他の実施形態は、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含むヒト細胞を有する細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものであって、前記ヒト細胞の少なくとも約２％において、ＰＤＸ１マーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％、ヒト細胞の少なくとも約１０％、ヒト細胞の少なくとも約１５％、ヒト細胞の少なくとも約２０％、ヒト細胞の少なくとも約２５％、ヒト細胞の少なくとも約３０％、ヒト細胞の少なくとも約３５％、ヒト細胞の少なくとも約４０％、ヒト細胞の少なくとも約４５％、ヒト細胞の少なくとも約５０％、ヒト細胞の少なくとも約５５％、ヒト細胞の少なくとも約６０％、ヒト細胞の少なくとも約６５％、ヒト細胞の少なくとも約７０％、ヒト細胞の少なくとも約７５％、ヒト細胞の少なくとも約８０％、ヒト細胞の少なくとも約８５％、ヒト細胞の少なくとも約９０％、ヒト細胞の少なくとも約９５％、またはヒト細胞の少なくとも約９８％において、ＰＤＸ１マーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、細胞培養物または細胞集団において、ＰＤＸ１の発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高いヒト細胞の割合は、支持細胞を除いて計算される。
本発明のいくつかの実施形態は、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、当該ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％以上において、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される１又は２以上のマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、ヒト細胞の
少なくとも約５％、ヒト細胞の少なくとも約１０％、ヒト細胞の少なくとも約１５％、ヒト細胞の少なくとも約２０％、ヒト細胞の少なくとも約２５％、ヒト細胞の少なくとも約３０％、ヒト細胞の少なくとも約３５％、ヒト細胞の少なくとも約４０％、ヒト細胞の少なくとも約４５％、ヒト細胞の少なくとも約５０％、ヒト細胞の少なくとも約５５％、ヒト細胞の少なくとも約６０％、ヒト細胞の少なくとも約６５％、ヒト細胞の少なくとも約７０％、ヒト細胞の少なくとも約７５％、ヒト細胞の少なくとも約８０％、ヒト細胞の少なくとも約８５％、ヒト細胞の少なくとも約９０％、ヒト細胞の少なくとも約９５％、またはヒト細胞の少なくとも約９８％において、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される１又は２以上のマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、細胞培養物または細胞集団において、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される１又は２以上のマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高いヒト細胞の割合は、支持細胞を除いて計算される。
本発明の他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、前記内胚葉細胞の少なくとも約２％において、ＰＤＸ１マーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。他の実施形態では、内胚葉細胞の少なくとも約５％、内胚葉細胞の少なくとも約１０％、内胚葉細胞の少なくとも約１５％、内胚葉細胞の少なくとも約２０％、内胚葉細胞の少なくとも約２５％、内胚葉細胞の少なくとも約３０％、内胚葉細胞の少なくとも約３５％、内胚葉細胞の少なくとも約４０％、内胚葉細胞の少なくとも約４５％、内胚葉細胞の少なくとも約５０％、内胚葉細胞の少なくとも約５５％、内胚葉細胞の少なくとも約６０％、内胚葉細胞の少なくとも約６５％、内胚葉細胞の少なくとも約７０％、内胚葉細胞の少なくとも約７５％、内胚葉細胞の少なくとも約８０％、内胚葉細胞の少なくとも約８５％、内胚葉細胞の少なくとも約９０％、内胚葉細胞の少なくとも約９５％、または内胚葉細胞の少なくとも約９８％において、ＰＤＸ１マーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。
本発明のさらに他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、前記内胚葉細胞の少なくとも約２％において、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される１又は２以上のマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。他の実施形態では、内胚葉細胞の少なくとも約５％、内胚葉細胞の少なくとも約１０％、内胚葉細胞の少なくとも約１５％、内胚葉細胞の少なくとも約２０％、内胚葉細胞の少なくとも約２５％、内胚葉細胞の少なくとも約３０％、内胚葉細胞の少なくとも約３５％、内胚葉細胞の少なくとも約４０％、内胚葉細胞の少なくとも約４５％、内胚葉細胞の少なくとも約５０％、内胚葉細胞の少なくとも約５５％、内胚葉細胞の少なくとも約６０％、内胚葉細胞の少なくとも約６５％、内胚葉細胞の少なくとも約７０％、内胚葉細胞の少なくとも約７５％、内胚葉細胞の少なくとも約８０％、内胚葉細胞の少なくとも約８５％、内胚葉細胞の少なくとも約９０％、内胚葉細胞の少なくとも約９５％、または内胚葉細胞の少なくとも約９８％において、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６からなる群から選択される１又は２以上のマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカーの発現より高い。
本明細書に記載されている方法を用いて、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含み、実質的に他の細胞型を含まない組成物を作製することができる。細胞培養物または細胞集団内の細胞に関して、「実質的に含まない」という表現は、細胞培養物または細胞集団が含まない特定の細胞型が、細胞培養物または細胞集団に存在する細胞総数の約５％未満の量で存在することを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／又はＮＦＭマーカー遺伝子を著しく発現する細胞
を実質的に含まない。
本発明の一実施形態において、マーカー遺伝子の発現に基づいてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を表した場合、ＰＤＸ１高、ＡＦＰ低、ＳＯＸ７低、ＳＯＸ１低、ＺＩＣ１低、ＮＦＭ低となる。
ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を高める方法
本発明のいくつかの態様は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団においてＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高める方法に関する。そのような実施形態において、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる。分化促進因子と接触させると、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性またはＰＤＸ１陽性となる。いくつかの実施形態において、分化促進因子はレチノイドであり、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に、約０．０１μＭから約５０μＭの濃度範囲のレチノイドを接触させる。好適な実施形態では、レチノイドはＲＡである。
本発明の他の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団において、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞に線維芽細胞増殖因子ファミリーの分化促進因子を接触させることによって高められる。そのような分化促進因子は単独で用いてもよいし、ＲＡと組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に、約１０ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の線維芽細胞増殖因子を接触させる。好適な実施形態では、線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ−１０である。
本発明のいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団において、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞にＢ２７を接触させることによって高められる。この分化促進因子は単独で用いてもよいし、分化促進因子であるレチノイン酸および線維芽細胞増殖因子ファミリーの一方または両方と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に、約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の濃度範囲のＢ２７を接触させる。好適な実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に、ＲＡ、ＦＧＦ−１０およびＢ２７を接触させる。
ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団においてＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高める方法は、低血清または無血清の増殖培地にて行うことができる。いくつかの実施形態において、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり、他の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性細胞は、血清代替物で増殖される。
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法
本発明の他の態様は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る１又は２以上の分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を得た後、細胞培養物または細胞集団でのＰＤＸ１の発現が決定される。ＰＤＸ１の発現を決定した後、細胞培養物または細胞集団の細胞に、候補分化促進因子を接触させる。いくつかの実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後のＰＤＸ１の発現が決定される。ＰＤＸ１発現はまた、細胞と候補分化促進因子との接触後に、１回または２回以上決定される。候補分化促進因子との接触後に、ＰＤＸ１発現が、当該接触前のＰＤＸ１発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。
いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る因子を同定する前記方法は、細胞培養物または細胞集団でのＨＯＸＡ１３遺伝子および／又はＨＯＸＣ６遺伝子の発現をさらに決定する方法を含む。そのような実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触前後における、ＨＯＸＡ
１３および／又はＨＯＸＣ６の発現を決定する。候補分化促進因子との接触後のＰＤＸ１およびＨＯＸＡ１３の発現が、当該接触前のＰＤＸ１およびＨＯＸＡ１３の発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。同様に、候補分化促進因子との接触後のＰＤＸ１およびＨＯＸＣ６の発現が、当該接触前のＰＤＸ１およびＨＯＸＣ６の発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。好適な実施形態では、細胞培養物または細胞集団の細胞と候補分化促進因子との接触前後のＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６の発現を決定することによって、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつ分化促進因子を同定する。好適な実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３および／又はＨＯＸＣ６の発現は、Ｑ−ＰＣＲによって決定される。
いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６の１又は２以上の発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞と候補分化促進因子との接触前ではなく、当該接触時または接触直後において決定してもよい。そのような実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後におけるＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６の１又は２以上の発現は、当該接触後の１回または２回以上のＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＣ６の１又は２以上の発現と比較される。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞と候補分化促進因子との接触後にＰＤＸ１発現が決定される１回または２回以上は、約１時間から約１０日の範囲である。例えば、ＰＤＸ１発現は、細胞と候補分化促進因子との接触後約１時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約４時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約６時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約８時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１０時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１２時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１６時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２４時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２日、細胞と候補分化促進因子との接触後約３日、細胞と候補分化促進因子との接触後約４日、細胞と候補分化促進因子との接触後約５日、細胞と候補分化促進因子との接触後約６日、細胞と候補分化促進因子との接触後約７日、細胞と候補分化促進因子との接触後約８日、細胞と候補分化促進因子との接触後約９日、細胞と候補分化促進因子との接触後約１０日、または細胞と候補分化促進因子との接触後約１０日以上で決定することができる。
本明細書記載の方法に使用できる候補分化促進因子は、ポリペプチドおよび低分子などの化合物から選択することができる。例えば、候補ポリペプチドは、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスタンパク質および合成ペプチドを含むことができるが、これに限定されるものではない。好適な実施形態では、増殖因子は、ＦＧＦファミリー、例えばＦＧＦ−１０である。候補低分子は、コンビナトリアルケミストリー合成から生ずる化合物、および、ステロイド、イソプレノイド、テルペノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイドおよびフラビノイドなどの天然産物を含むが、これに限定されるものではない。当業者にとっては、何千分類にもわたる天然および合成低分子が入手でき、本明細書記載の方法に使用可能であって、上記例示のものに限定されないことがわかるであろう。典型的には、低分子は、分子量１００００ａｍｕ未満のものである。好適な実施形態では、低分子は、ＲＡなどのレチノイドである。
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る因子を同定する方法
本発明の他の態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る１又は２以上の分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を得た後、細胞培養物または細胞集団でのマーカーの発現が決定される。前記マーカーの発現を決定した後、細胞培養物または細胞集団の細胞に、候補分化促進因子を接触させる。いくつかの実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後のマーカーの発現が決定される。同マーカーの発現は
また、細胞と候補分化促進因子との接触後に、１回または２回以上決定される。候補分化促進因子との接触後に、マーカーの発現が、当該接触前のマーカーの発現より増加または減少した場合には、当該候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつものと同定される。好適な実施形態では、前記マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される。
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞と候補分化促進因子との接触後に前記マーカーの発現が決定される１回または２回以上は、約１時間から約１０日の範囲である。例えば、マーカーの発現は、細胞と候補分化促進因子との接触後約１時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約４時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約６時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約８時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１０時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１２時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約１６時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２４時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約２日、細胞と候補分化促進因子との接触後約３日、細胞と候補分化促進因子との接触後約４日、細胞と候補分化促進因子との接触後約５日、細胞と候補分化促進因子との接触後約６日、細胞と候補分化促進因子との接触後約７日、細胞と候補分化促進因子との接触後約８日、細胞と候補分化促進因子との接触後約９日、細胞と候補分化促進因子との接触後約１０日、または細胞と候補分化促進因子との接触後約１０日以上で決定することができる。
前述のように、本明細書記載の方法に使用できる候補分化促進因子は、ポリペプチドおよび低分子などの化合物から選択することができる。
以上説明した各方法は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞についてのものであったが、いくつかの実施形態では、前述のＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞および／又は前述の前腸後方部のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む組成物の生産において、当該方法を使用できることがわかるであろう。
さらに、本明細書記載のいずれのＰＤＸ１陽性内胚葉細胞タイプも、前述のスクリーニング方法に使用することができる。
本発明について、一般的に説明してきたが、ある特定の実施例を参照することにより一層理解を深めることができる。それら実施例は、あくまでも説明のみを目的としてここに挙げられており、何ら限定することを意図するものではない。
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用について説明している。多能性ヒト細胞の作製方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第５，４５３，３５７号明細書、第５，６７０，３７２号明細書、第５，６９０，９２６号明細書、第６，０９０，６２２号明細書、第６，２００，８０６号明細書および第６，２５１，６７１号明細書、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号明細書を含む多数の科学出版物に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
実施例１
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発生に関して研究するため、正常な核型を維持しながら、培養物中、一見無制限に分裂可能な、多能性のヒト胚性幹細胞を用いた。ＥＳ細胞は、分離に際し免疫学的または機械的方法のいずれかを使用し、５日目の胚の内部細胞塊から得た。具体的には、患者によるインフォームド・コンセントを得た後、体外受精サイクルの余剰の凍結受精卵から、ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を得た。解凍すると同時に、孵化した胚盤胞は、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ＩＴＳサプリメント）において、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に蒔き培養した。胚は培養皿に付着し、約２週間後、未分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦを入れた新しい皿に移植した。移植は、機械的に切離し、ディスパーゼを用いて短時間分解し、引き続き細胞クラスターを機械的に除去し、洗浄し、そして再度蒔くことにより行った。誘導以後、ｈＥＳＣ
ｙｔ−２５は、１００回に渡り連続継代した。胚体内胚葉を作製するための出発物質としてｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
当技術分野における当業者にとっては当然のことであるが、幹細胞または他の多能性細胞も、本明細書に記載されている分化方法のための出発物質として使用することができる。例えば、当技術分野において周知の方法により分離することのできる、胚の生殖隆起から得られる細胞を、多能性細胞出発物質として使用することができる。
実施例２
ｈＥＳＣｙｔ−２５特性
ヒト胚性幹細胞株のｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養物中において、１８カ月に渡り正常な形態、核型、増殖、および自己複製特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０抗原に対し強い免疫反応を示し、それら全抗原は、未分化ｈＥＳＣに特有なものであり、また、他の樹立したｈＥＳＣ株と同一の形態およびアルカリホスファターゼ活性を示す。さらに、ヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５はまた、懸濁培養をした場合、容易に胚様体（ＥＢ）を形成する。多能性を実証するがごとく、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要な胚葉に対応する様々な細胞型に分化する。外胚葉の産生は、ＺＩＣ１に関してはＱ−ＰＣＲにより、またネスチンおよびさらに成熟したニューロンマーカーに関しては免疫細胞化学（ＩＣＣ）により立証した。β−ＩＩＩチューブリンの免疫細胞化学的染色が、初期ニューロンの特徴である細長い細胞のクラスターにおいて観察された。先に、レチノイン酸を用いてＥＢを懸濁処理し、多能性幹細胞の、胚外系列の臓側内胚葉（ＶＥ）への分化を誘導した。処理した細胞は、５４時間の処理によりＶＥの二つのマーカーである、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）およびＳＯＸ７を高いレベルで発現した。単層で分化した細胞は、免疫細胞化学的染色により示されるように、弧発的な斑状にＡＦＰを発現した。また、下記に説明するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰが発現することなく、ＳＯＸ１７に対するリアルタイムの定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）と免疫細胞化学により確認されるように、胚体内胚葉を形成することもできた。中胚葉への分化を立証するために、いくつかの時点で、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の発現に関し、分化ＥＢを分析した。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、実験の間、漸次増加した。上記の点から、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は、三つの胚葉に対応する細胞を形成する能力により示されるように、多能性を有する。
実施例３
ＳＯＸ１７抗体の作製
ｈＥＳＣ培養物において胚体内胚葉を同定する上での主要な障害は、適切な手段がないことである。そこで、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して産生される抗体の作製を行なった。
マーカーＳＯＸ１７は、原腸形成の間に形成されるにつれ、胚体内胚葉全体において発現し、その発現は、器官形成が開始される頃まで、（発現量は、Ａ−Ｐ軸に沿って異なるが）腸管内で維持される。また、ＳＯＸ１７は、胚外内胚葉細胞のサブセットにおいても発現する。中胚葉または外胚葉では、このタンパク質の発現は観察されていない。現在、ＳＯＸ１７は、胚外系列を除外するためのマーカーと併用した場合、胚体内胚葉系列に対する適切なマーカーであることが分かっている。
ここに詳細に説明するように、ＳＯＸ１７抗体は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の作製を目的とした、各種処理と分化方法の効果を具体的に調べるのに利用した。また、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣおよびトロンボモジュリンに反応する他の抗体も、臓側および壁側内胚葉（胚外内胚葉）の産生を除外するために使用した。
ＳＯＸ１７に対する抗体を作製するため、ＳＯＸ１７タンパク質（図２）のＣ末端のアミノ酸１７２−４１４（配列番号：２）に対応するヒトのＳＯＸ１７ｃＤＮＡ（配列番号：１）の一部を、抗体製造会社、ＧＥＮＯＶＡＣ社（フライベルク、ドイツ）において、そこで開発された方法により、ラットでの遺伝子による免疫化に用いた。遺伝子による免
疫化方法は、米国特許第５，８３０，８７６号明細書、第５，８１７，６３７号明細書、第６，１６５，９９３号明細書および第６，２６１，２８１号明細書、並びに国際公開第ＷＯ００／２９４４２号および第ＷＯ９９／１３９１５号に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
また、遺伝子による免疫化のための他の適切な方法は、非特許文献にも記載されている。例えば、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６：６１６−６２０、１９９４に、遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の作製（ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）について記載しており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。特定のタンパク質に対して抗体を産生する遺伝子免疫法の具体的な例は、例えば、Ｃｏｓｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉ
ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ ａｎｄ ａｌｌｏｗｓ ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１４５８
−１４６５；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｒａｐｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｌｔ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １７：５６９−５
７６；Ｓｃｈｍｏｌｋｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕ
ｍ ｂｙ Ｅ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４５４
１−４５４５；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９９）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｉｔｈ ａｎ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ
ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：１１
９−１２９；およびＵｌｉｖｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｂｙ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５１：１９１−１９４に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
ＳＯＸ７およびＳＯＸ１８は、図３に示す関係系統樹に描かれているように、ＳＯＸ１７に対し最も近いＳｏｘファミリーである。ＳＯＸ１７抗体が、ＳＯＸ１７に特異的であり、尚且つ、その最も近いファミリーメンバーと反応しないことを立証するために、陰性対照として、ヒトのＳＯＸ７ポリペプチドを使用した。具体的には、遺伝子免疫化により作製された抗体が、ＳＯＸ１７に特異的であることを立証するために、ＳＯＸ７および他のタンパク質を、ヒト線維芽細胞において発現させた後、ウェスタンブロットおよびＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応を分析した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７およびＥＧＦＰ発現ベクターの作製、それらのヒト線維芽細胞への形質移入、およびウェスタンブロットによる分析には、例えば、以下の方法を用いた。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７およびＥＧＦＰの作製に使われた発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ロックヴィル、メリーランド州）、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州）であった。タンパク質の製造には、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過性に形質移入した。形質移入後３６時間で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナポリス、インデ
ィアナ州）を含む、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸塩を用いて、全細胞溶解物を回収した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％の勾配ポリアクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、エレクトロブロッティングによりＰＤＶＦ膜（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社、カリフォルニア州）に移した細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析では、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）において、１／１０００に希釈したラットのＳＯＸ１７抗血清、引き続き、アルカリホスファターゼ標識抗ラットＩｇＧ（Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ）（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウエスト・グローブ、ペンシルバニア州）で検出し、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｌａｃｋ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）により明
らかにした。使用したタンパク質サイズ基準は、広範囲のカラーマーカー（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）であった。
図４において、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７またはＥＧＦＰ ｃＤＮＡが一過性に形質移入さ
れたヒト線維芽細胞から作製した抽出タンパク質を、ＳＯＸ１７抗体を用いてウェスタンブロット上で検出した。ｈＳＯＸ１７形質移入細胞からの抽出タンパク質のみが、ヒトのＳＯＸ１７タンパク質の予測分子量４６Ｋｄａに近い５１Ｋｄａまでのバンドを生じさせた。ヒトのＳＯＸ７またはＥＧＦＰ形質移入細胞のいずれかから作られた抽出物に対するＳＯＸ１７抗体の反応は全くなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現コンストラクトを形質移入されたヒト線維芽細胞の核を明確に標識したが、ＥＧＦＰのみを形質移入された細胞は標識しなかった。このように、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣにより特異性を示した。
実施例４
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の検証
ＳＯＸ１７抗体が、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して特異的であり、さらには、胚体内胚葉を標識する証拠として、部分的に分化したｈＥＳＣを、ＳＯＸ１７とＡＦＰ抗体で同時標識した。ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦ（図３）の近縁関係にあるメンバーであるＳＯＸ７やＳＯＸ１７およびＡＦＰは、それぞれ臓側内胚葉で発現することが実証されている。しかしながら、ＡＦＰおよびＳＯＸ７は、胚体内胚葉細胞において、ＩＣＣにより検出できるレベルでは発現しないため、本物の胚体内胚葉細胞に対する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、離散的にグループ化した細胞として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混ざり合う細胞集団を標識することが明らかにされた。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞が、ＡＦＰで同時標識されたことを示している。しかしながら、ＳＯＸ１７＋細胞の場にＡＦＰ＋細胞が、殆どまたは全くない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉も、ＳＯＸ１７を発現すると報告されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣおよび／またはトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７を同時標識する抗体は、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７＋細胞を同定するのに使用することができる。図６Ａ〜Ｃに示すように、トロンボモジュリンとＳＯＸ１７とで同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞のランダムな分化により産生された。
上記の細胞標識実験から見て、胚体内胚葉細胞は、マーカープロファイルＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／［ＴＭｌｏまたはＳＰＡＲＣｌｏ］により同定することができる。すなわち、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉に特有のＡＦＰマーカーおよび壁側内胚葉に特有のＴＭまたはＳＰＡＲＣマーカーの発現より多い。従って、ＳＯＸ１７に対しては陽性であるが、ＡＦＰおよびＴＭまたはＳＰＡＲＣに対しては陰性である細胞が、胚体内胚葉である。
胚体内胚葉を予測するＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／ＴＭｌｏ／ＳＰＡＲＣｌｏマーカ
ープロファイルの特異性の更なる証拠を得るべく、ＳＯＸ１７およびＡＦＰ遺伝子発現を、量的に抗体標識細胞の相対数で比較した。図７Ａに示されているように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）またはアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣでは、ＳＯＸ１７ｍＲＮＡの発現量に、１０倍の差が生じた。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差を反映していた（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されているように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理により、ＡＦＰ遺伝子発現は、処理しなかった場合に比べ６．８倍抑制された。これは、図８Ｂ〜Ｃに示されているように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の著しい減少により、視覚的に示された。さらにこれを定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこの約７倍の減少が、フローサイトメトリーにより測定したＡＦＰ抗体標識細胞数が同様に７倍減少した結果であることが立証された（図９Ａ〜Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより確認される、遺伝子発現における量的変化が、抗体染色により観察される、細胞型の特異性における変化を反映することを示す点において極めて重要である。
ノーダルファミリーメンバー（ノーダル、アクチビンＡおよびアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下におけるｈＥＳＣの培養により、ＳＯＸ１７抗体標識細胞は、時間と共に著しく増加した。５日間継続したアクチビン処理により、５０％を超える細胞が、ＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜Ｆ）。５日間のアクチビン処理後、ＡＦＰで標識された細胞は、ほとんどまたは全くなかった。
つまり、ヒトのＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端２４２アミノ酸に対して産生された抗体は、ウェスタンブロットでヒトのＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も近いＳＯＸファミリー類縁体である、ＳＯＸ７は認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７＋／ＡＦＰｌｏ／−（標識細胞の９５％を超える）である分化ｈＥＳＣ培養物中の細胞の一部、並びにＳＯＸ１７およびＡＦＰ（臓側内胚葉）で同時標識されるわずかなパーセンテージ（＜５％）の細胞も認識した。ｈＥＳＣ培養物のアクチビン処理により、ＳＯＸ１７遺伝子発現およびＳＯＸ１７標識細胞が著しく増加し、ＡＦＰｍＲＮＡの発現やＡＦＰ抗体で標識された細胞の数は著しく抑制された。
実施例５
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現測定
以下の実験では、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の効果を調べる主な測定法として、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を採用した。具体的には、遺伝子発現のリアルタイム測定結果を、Ｑ−ＰＣＲにより複数の時点で、複数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態に関する理解を深めるために、望ましいおよび望ましくない細胞型に特有のマーカー遺伝子を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所としては、その感度が極めて高いことや、ゲノム配列が容易に入手可能であるため、必要なマーカーの開発が比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感度により、非常に大きな集団内の比較的少数の細胞から遺伝子発現を検出することが可能となる。また、極めて低レベルの遺伝子発現を検出する性能により、その集団内での「分化傾向」が示される。これらの細胞表現型の明らかな分化に先立って、免疫細胞化学技法を用いては、特定の分化経路に沿った傾向を認識することはできない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成果を調べる免疫細胞化学技法を少なくとも補完するものであり、尚且つ、その技法より潜在的にはるかに優れた分析方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、分析の準ハイスループットスケールでの定量フォーマットにおける分化プロトコルの成果を評価するメカニズムを提供する。
ここで取ったアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ３０００装置（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎケミストリを用い、且つ、ツーステップＲＴ−Ｐ
ＣＲフォーマットを使用して、相対的な定量化を行うことであった。このようなアプローチにより、将来、更なるマーカー遺伝子を分析するためのｃＤＮＡサンプルを保存することが可能となり、よって、サンプル間の逆転写効率におけるばらつきを避けることができる。
プライマーは、極力、エキソン同士の境界上に位置するか、或いは少なくとも８００ｂｐでイントロンにまたがるように設計した。これは、汚染ゲノムＤＮＡからの増幅を排除するように実験的に決定されたものである。イントロンを含まないマーカー遺伝子を採用した場合、またはマーカー遺伝子が偽遺伝子を有する場合、ＲＮＡサンプルのデオキシリボヌクレアーゼＩ処理を行なった。
我々は、細胞サンプルにおける遺伝子発現に関する幅広いプロファイルの説明を提供するために、標的または非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現の測定には、通常Ｑ−ＰＣＲを利用した。ｈＥＳＣ分化（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉、および胚外内胚葉）の初期段階に関するマーカーで、そのための有効なプライマーセットが入手可能なものを下記表１に挙げている。また、これらのプライマーセットのヒト特異性も立証された。これは、ｈＥＳＣが多くの場合マウス支持細胞層で増殖することから、重要な事である。最も一般的には、それぞれの条件において三組のサンプルを採取し、個別に、各定量に関連した生物学的変動を評価するためにそれぞれのサンプルを二つずつ分析した。
ＰＣＲテンプレートを作成するために、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて分離し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて
定量した。総ＲＮＡ３５０〜５００ｎｇからの逆転写は、ｏｌｉｇｏ−ｄＴおよびランダムプライマーの混合物を含むｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して行なった。各２０μＬの反応物は、その後、総量１００μＬまで希釈し、３μＬを、４００ｎＭの順方向および逆方向プライマーと５μＬの２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ社）とを含む、各１０μＬのＱ−ＰＣＲ反応物に使用した。２段階のサイクリングパラメータを使用し、８５〜９４°Ｃ（各プライマーセットの単位複製配列の融解温度によって具体的に選択された）で５秒間の変性と、引き続き、６０°Ｃで４５秒間のアニール／伸長を採用した。蛍光データは、各伸長段階の最後の１５秒間に収集した。３ポイント１０倍希釈シリーズ（ｔｈｒｅｅ ｐｏｉｎｔ、１０−ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を、各回ごとに検量線を作成するために使用し、この検
量線に基づいて、サイクル閾値（Ｃｔ）を定量値に変換した。各サンプルの定量化された値を、ハウスキーピング遺伝子能力に対して規準化した後、三組のサンプルに関して平均および標準偏差を計算した。ＰＣＲサイクルの終わりに際し、融解曲線分析を行い、反応物の特異性を確認した。単一の特定産物が、そのＰＣＲ単位複製配列に適したＴｍで単一のピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで行われた反応は、陰性対照としての役目を果たし、増幅しない。
Ｑ−ＰＣＲ法を確立する上での第一段階は、実験系に適したハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）を検証することであった。ＲＮＡインプット、ＲＮＡの完全性および逆転写効率に関する全サンプルの規準化にＨＧが使用されるため、規準化が有意であるためには、ＨＧが、全種類のサンプルにおいて、長期に渡り一定レベルで発現することが重要であった。我々は、分化ｈＥＳＣにおいて、サイクロフィリンＧ、ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、ベータ−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビアン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｉａｎｅ）シンターゼ（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、およびグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）ベータ（ＧＵＳ）の発現量を測定した。我々の得た結果は、ベータ−２−ミクログロブリンの発現量が、分化するにしたがって上昇することを示した。従って、規準化のためのこの遺伝子の使用は除外した。他の遺伝子は、長時間に渡り、且つ全処理を通して一定の発現量を示した。我々は、通常、サイクロフィリンＧおよびＧＵＳの双方を使用し、全サンプルに関する規準化因子を計算した。多数のＨＧを使用することにより、規準化プロセスに伴う変動性を低減すると同時に、相対的な遺伝子発現値の信頼性を高める。
規準化に使用する遺伝子を得た後、Ｑ−ＰＣＲを使用し、様々な実験処理を施す全サンプルにおいて、多くのマーカー遺伝子の相対的な遺伝子発現量を求めた。使用したマーカー遺伝子を選択したのは、それらが、初期胚葉の典型的な特定集団において豊富にみられるからであり、特に、胚体内胚葉および胚外内胚葉において、特異的に発現する遺伝子グループに集中したためである。これらの遺伝子およびそれらの相対的な発現分析結果を、
表１に示す。
多くの遺伝子が、一以上の胚葉で発現するため、同一実験において、多くの遺伝子の発現量を定量的に比較することが有益である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉において発現し、臓側および壁側内胚葉では少しばかり発現する。ＳＯＸ７およびＡＦＰは、この初期発生の時点において臓側内胚葉で発現する。ＳＰＡＲＣおよびＴＭは、壁側内胚葉で発現し、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは初期中胚葉で発現する。
胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７ｍＲＮＡを高度に発現し、ＡＦＰおよびＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）の発現レベルは低いものと予想された。さらに、ＺＩＣ１をここで使用し、初期外胚葉の誘導をさらに排除した。また、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂが、胚体および胚外内胚葉の両方において発現した。従って、それらは、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７の発現と相関する（表１）。典型的な実験を、図１１〜１４に示している。図１１〜１４は、表１に記載されているマーカー遺伝子が、各種サンプル間でいかに互いに相関しているかを示しており、それにより、胚体内胚葉および胚外内胚葉、並びに中胚葉および神経細胞型に特異的な分化パターンを明示している。
上記のデータから、アクチビン投与量の増加が、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増加をもたらしたことは明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、主に、胚外内胚葉ではなく胚体内胚葉を示した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７およびＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関にあるという観察結果に基づいている。
実施例６
ヒトＥＳ細胞の胚体内胚葉への誘導分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化の状態が能動的に維持されない条件下で培養された場合、ランダムに分化する。この不均一な分化により、壁側および臓側内胚葉（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７発現）の双方からなる胚外内胚葉細胞、並びにＺＩＣ１、ネスチン（外胚葉）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）の発現によって示される、初期の外胚葉および中胚葉誘導体が産生される。胚体内胚葉細胞の出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的な抗体マーカーの欠如により、従来検証または特定されていない。そのため、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉の産生は、あまりよく研究されていない。胚体内胚葉細胞に対するよい抗体試薬の入手が不可能なため、性質決定のほとんどは、外胚葉および胚外内胚葉に集中している。概して、ランダムに分化したＥＳ細胞培養物には、ＳＯＸ１７ｈｉ胚体内胚葉細胞と比較すると、非常に多くの胚外および神経外胚葉細胞型が
ある。
未分化ｈＥＳＣコロニーは、繊維芽細胞フィーダーの上で増殖するため、コロニーの縁部は、コロニーの内側に存在するそれらの細胞とは異なる別の形態を呈する。これらの外縁細胞の多くは、それほど均一ではなくより大きな細胞体の形態や、ＯＣＴ４の高発現量により識別できる。ＥＳ細胞は、分化し始めると、未分化ＥＳ細胞と比較してＯＣＴ４発現量が増加または減少するとされている。未分化閾（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ
ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に対するＯＣＴ４発現量の上下変化は、多能性の状態から脱した
分化の初期段階を意味する可能性がある。
未分化のコロニーを、ＳＯＸ１７免疫細胞化学により調べた際、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞集団が、その周辺のランダムな場所、および未分化のＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述のように、これらのコロニー外縁に散在したポケットは、コロニーがサイズ的に大きくなり、より多くなるにつれ、古典的ＥＳＣ形態とは異なった分化をする最初の細胞の数個となるようであった。若くて小さな完全に未分化のコロニー（＜１ｍｍ；４〜５日目）には、コロニー内または縁部においてＳＯＸ１７陽性細胞は全く見られなかった。一方、古くて大きいコロニー（直径１〜２ｍｍ、＞５日目）には、いくつかのコロニーの周辺、または先に説明した古典的ｈＥＳＣ形態とは異なって分化した縁部の内側の領域において、散在し孤立した斑状のＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞があった。これが有効なＳＯＸ１７抗体の最初の発生であったとすれば、そのような初期の「未分化」ＥＳＣ培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまで立証されたことはない。
Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７およびＳＰＡＲＣ遺伝子発現量の逆相関に基づくと、大部分のＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞は、抗体同時標識により壁側マーカーに対し陰性を示すであろう。これは、図１５Ａ〜Ｂで示されているように、ＴＭを発現している壁側内胚葉細胞に関して明確に立証された。ノーダル因子アクチビンＡおよびＢへの暴露により、ＴＭ発現強度およびＴＭ陽性細胞数は著しく減少した。アクチビン処理培養物におけるＳＯＸ１７、ＡＦＰおよびＴＭ抗体を用いた三重標識により、ＡＦＰおよびＴＭに対しても陰性であったＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜Ｄ）。これらは、分化ＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の最初の細胞を示すものである（図１６Ａ〜Ｄおよび図１７）。
上述のＳＯＸ１７抗体およびＱ−ＰＣＲのツールを使用し、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／ＳＰＡＲＣ／ＴＭｌｏ胚体内胚葉細胞になるようにＥＳＣを効果的にプログラムミングすることのできる数々の手法を調べた。我々は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関するＱ−ＰＣＲによる集団レベルと、ＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識による個々の細胞レベルとで測定した、これら細胞の数および増殖能力を増強することを目的とした様々な分化手順を適用した。
生体外の細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を作製する際に使用する、ノーダル／アクチビン／ＢＭＰなどのＴＧＦβファミリー増殖因子の効果を分析し、説明したのは、我々が初めてであった。典型的な実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰまたはそれら増殖因子の組み合わせを、未分化ヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物に添加し、分化プロセスを開始させた。
図１９に示されているように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したところ、分化開始後４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対し、１９倍のＳＯＸ１７遺伝子発現の誘導が起きた。アクチビンファミリーの第二のメンバーであるアクチビンＢをアクチビンＡと共に添加したところ、混合アクチビン処理後４日目までに未分化ｈＥＳＣに対し、３７倍の誘導が起きた。最後に、ノダール／アクチビンおよびＢＭＰサブグループＢＭＰ４からＴＧＦβファミリー第三のメンバーを、アクチビンＡおよびアクチビンＢと共に添加したところ、発光量比は未分化ｈＥＳＣの５７倍まで増加した（図１９）。アクチビンおよびＢＭＰを用いたＳＯＸ１７の誘導を、因子無添加培地である対照と比較した場合、４日目の時点で、５倍、１０倍および１５倍の誘導が起きていた。アクチビンＡ、ＢおよびＢＭＰを用いた三重処理後５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣに比べ７０倍を超えて誘導さ
れた。これらのデータは、ノーダル／アクチビンＴＧＦβファミリーメンバーの高投与量および長時間処理により、ＳＯＸ１７発現が増加することを示している。
ノーダルおよび関連分子アクチビンＡ、ＢおよびＢＭＰは、生体内または生体外における胚体内胚葉形成およびＳＯＸ１７の発現を促進する。さらに、ＢＭＰを添加することにより、ＳＯＸ１７の誘導が高まるが、これはおそらく、ノーダルコレセプターであるクリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）の更なる誘導によるものであろう。
我々は、ＢＭＰ４とアクチビンＡおよびＢの組み合わせにより、ＳＯＸ１７の誘導、引いては、胚体内胚葉形成が、相加的に増強されることを立証した。アクチビンＡおよびＢとの組み合わせで、長時間（＞４日）ＢＭＰ４を添加していると、壁側および臓側内胚葉、並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７が誘導されることもある。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、添加４日以内に、前記処理においてＢＭＰ４を除くことが大切である。
個々の細胞レベルでＴＧＦβ因子を用いた処理の効果を求めるため、ＳＯＸ１７抗体標識を使用し、ＴＧＦβ因子添加の経時変化を調べた。先に図１０Ａ〜Ｆで示したように、ＳＯＸ１７標識細胞の相対数は、時間と共に著しく増加した。相対的に定量化（図２０）した場合、ＳＯＸ１７標識細胞は、２０倍を超える増加を示している。この結果は、細胞数およびＳＯＸ１７遺伝子発現量のいずれも、ＴＧＦβ因子への暴露時間とともに増加していることを示している。図２１に示されているように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＢＭＰ４への暴露４日後、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣの１６８倍に到達した。また、図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、投与量に依存していたことを示している。アクチビンＡの投与量が１００ｎｇ／ｍＬ以上である場合、ＳＯＸ１７遺伝子発現および細胞数を強力に誘導することができた。
ＴＧＦβファミリーメンバーに加えて、Ｗｎｔ分子ファミリーが、胚体内胚葉の特異化および／または維持に役立つ場合もある。アクチビンのみで処理したサンプルに対し、アクチビンとＷｎｔ３ａとを用いて処理したサンプルにおいて、ＳＯＸ１７遺伝子発現が増加したことにより示されているように、Ｗｎｔ分子の使用も、ｈＥＳＣを胚体内胚葉に分化させるのに有益であった（図２３）。
上記実験の全ては、添加因子と共に１０％の血清を含む組織培養培地を使用して行なった。驚くべきことに、図２４Ａ〜Ｃに示されているように、血清濃度が、添加アクチビンの存在下におけるＳＯＸ１７発現量に影響を及ぼすことを発見した。血清レベルを１０％から２％に低下させた場合、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡおよびＢの存在下、３倍になった。
最後に、図２５Ａ〜Ｄに示したように、アクチビンにより誘導されたＳＯＸ１７＋細胞が、培養物中において分裂することを立証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された有糸分裂プレートパターン（ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｌａｔｅ ｐａｔｔｅｒｎ）および位相差有糸分裂プロファイル（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌ
ｅ）からも明らかなように有糸分裂中のＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。
実施例７
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、中胚葉、外胚葉または臓側内胚葉用のマーカーではなく、胚体内胚葉用マーカーと相関する
上述のごとく、ＴＧＦβファミリー、より具体的には、アクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、ＥＳＣは胚体内胚葉細胞層に分化すべく誘導される。さらに、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の割合が、ＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響することを明らかにした。この影響とは、培地においてアクチビンＡが所定の濃度である場合、ＦＢＳレベルが高くなると、胚体内胚葉への最大分化が阻害されるというものである。外因性アクチビンＡの不在下では、胚体内胚葉系列へのＥＳＣの分化は非常に非効率的であり、ＦＢＳ濃度がＥＳＣの分化プロセスに及ぼす影響は、かなり緩やかである。
これらの実験では、ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含むまたは含まない、０．５％、２．０％または１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州；カタログ番号６１８７０−０３６）で６日間増殖させることにより分化させた。さらに、分化の最初３日間は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬと併せて、０．５％から２．０％の範囲のＦＢＳ勾配も採用した。６日後、各培養条件の複製サンプルを収集し、リアルタイム定量ＰＣＲにより相対的遺伝子発現を分析した。残りの細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に準備した。
ＣＸＣＲ４の発現量は、使用した７つの培養条件により、著しく変化した（図２６）。一般に、ＣＸＣＲ４発現量は、アクチビンＡで処理した培養物で多く（Ａ１００）、外因性アクチビンＡを入れなかった培養物では少なかった（ＮＦ）。さらに、Ａ１００で処理した培養物において、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低い時、最も高かった。相対的発現がアクチビンＡを加えなかった状態（ＮＦ）にむしろ近いほど、１０％ＦＢＳの条件下でＣＸＣＲ４レベルは著しく低下した。
上述のごとく、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１およびＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特性と一致する。７つの分化条件の全てにおいて、これら４つの遺伝子の相対的発現は、ＣＸＣＲ４のそれと酷似している（図２７Ａ〜Ｄ）。これは、ＣＸＣＲ４も、胚体内胚葉のマーカーであることを示している。
外胚葉および中胚葉系列は、それらの各種マーカーの発現により胚体内胚葉と識別される。初期中胚葉は、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＭＯＸ１遺伝子を発現し、一方、新生神経外胚葉はＳＯＸ１およびＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜Ｄは、外因性アクチビンＡを添加しなかった培養物が、中胚葉および外胚葉遺伝子の発現で選択的に濃縮され、アクチビンＡで処理した培養物の中では、１０％のＦＢＳ条件においても、中胚葉および外胚葉マーカー発現のレベルが増加したことを示している。これらの発現パターンは、ＣＸＣＲ４とは逆であり、ＣＸＣＲ４が、この発生時期においてＥＳＣ由来の中胚葉または外胚葉ではあまり発現しないことを明らかにした。
哺乳類発生の初期、胚外系列への分化も起こる。ここで特に関連性があるのは、ＳＯＸ１７を含む、胚体内胚葉と共通の多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化である。胚体内胚葉を胚外臓側内胚葉と識別するためには、これら二つの間で異なったマーカーを調べなくてはならない。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現するが、胚体内胚葉系列では発現しないマーカーの代表である。よって、ＳＯＸ７発現の不在下で、強度のＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養状態は、臓側内胚葉ではなく、胚体内胚葉を含む傾向にある。ＳＯＸ７はアクチビンＡを加えなかった培養物で高度に発現しており、また、ＳＯＸ７はＦＢＳが１０％含まれたときアクチビンＡの存在下でも発現の増加を示したことが、図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４の発現パターンとは逆であることから、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉では高度に発現されないことを示唆している。
上記各分化条件下で存在するＳＯＸ１７免疫反応（ＳＯＸ１７＋）細胞の相対数も求めた。ｈＥＳＣを、高用量アクチビンＡの存在下、低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）で分化させた場合、ＳＯＸ１７＋細胞は、培養物全体に渡り偏在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用するが、含まれるＦＢＳが１０％（ｖ／ｖ）である場合、ＳＯＸ１７＋細胞の出現頻度はかなり低く、培養物全体に渡り均等に分布するのではなく、常に孤立したクラスターとして出現した（図２９ＡおよびＣ並びにＢおよびＥ）。外因性アクチビンＡを使用しなかった場合、ＳＯＸ１７＋細胞の更なる減少が見られた。これらの条件下でも、ＳＯＸ１７＋細胞は、クラスターとして出現した。これらクラスターは、高用量アクチビンＡ、低濃度ＦＢＳで処理した場合に見られるものより小さく、はるかにまれであった（図２９ＣおよびＦ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４の発現パターンが、胚体内胚葉遺伝子発現と一致しているだけでなく、各条件下における胚体内胚葉細胞の数とも一致していることを立証している。
実施例８
胚体内胚葉を増加する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増加させる
アクチビンＡの投与量も、胚体内胚葉がＥＳＣから誘導される効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンＡの投与量増加により、培養物中のＣＸＣＲ４＋細胞の比率が高くなることを実証している。
ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日間で０．５％から１．０％へ、そして２．０％へと増加した）および０、１０または１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で分化させた。７日間分化させた後、細胞を、室温で５分間、２％
ＦＢＳおよび２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含みＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳにおいて
分離させた。細胞は、３５ｕｍのナイロンフィルターを通して濾過し、数を数え、ペレット状にした。ペレットは、少量の５０％のヒト血清／５０％の正常なロバ血清で再懸濁させ、非特異的抗体結合部位を遮断するために氷上で２分間培養した。これに、５０μＬ（約１０５個の細胞を含む）につき、１μＬのマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ）社、カタログ番号ａｂ１０４０３−１００）を添加し、４５分間氷上で標識化を行なった。細胞を、２％のヒト血清（緩衝液）を含むＰＢＳ５ｍＬを添加することにより洗浄し、ペレット状にした。緩衝液５ｍＬで２回目の洗浄を完了し、その後、細胞は、１０５個の細胞ごとに緩衝液５０μＬに再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ標識ロバ抗マウス；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０９６−１５
１）を、最終濃度５μｇ／ｍＬで加え、３０分間標識化し、その後、上述のように緩衝液で二度洗浄した。細胞は緩衝液中、５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、フローサイトメトリー・コアファシリティー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌ
ｉｔｙ）（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において、
スタッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社）を使用して分析および選別した。細胞は、リアタイム定量ＰＣＲにより、遺伝子発現解析のために総ＲＮＡを引き続き分離するため、ＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）の中に直接回収した。
分化培養培地において、アクチビンＡの投与量が増加するにつれ、フローサイトメトリーにより求めたＣＸＣＲ４＋細胞の数の著しい増加が観察された（図３０Ａ〜Ｃ）。ＣＸＣＲ４＋細胞は、Ｒ４ゲート内にあったものであり、このゲートは、イベントの０．２％がＲ４ゲート内に位置する二次抗体のみの対照を使用して設定した。ＣＸＣＲ４＋細胞数の著しい増加は、アクチビンＡの投与量が増加するにつれて生じた胚体内胚葉遺伝子発現の力強い増加と相関する（図３１Ａ〜Ｄ）。
実施例９
ＣＸＣＲ４陽性細胞の分離により胚体内胚葉遺伝子発現を増加し、中胚葉、外胚葉および臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を減少させる
上記実施例８において同定したＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を分析し、母集団の遺伝子発現を同時に測定した。
ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対量は、アクチビンＡの投与量の増加と共に著しく増加した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４＋細胞のアクチビンＡ用量依存的な増加と非常によく相関した（図３０Ａ〜Ｃ）。各集団から分離したＣＸＣＲ４＋細胞が、その集団におけるＣＸＣＲ４遺伝子発現ほぼ全ての原因であったことも明白である。これは、これらの細胞を回収するＦＡＣＳ法の効率の良さを立証している。
遺伝子発現解析は、ＣＸＣＲ４＋細胞に、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分のみでなく、胚体内胚葉のマーカーに関する他の遺伝子発現も含まれることを明らかにした。図３１Ａ〜Ｄに示されているように、ＣＸＣＲ４＋細胞は、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３ＢおよびＭＩＸＬ１に関して、親Ａ１００集団よりもさらに豊富であった。さらに、ＣＸＣＲ４−画分には、これらの胚体内胚葉マーカーに関する遺伝子発現は殆どなかった。また、ＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−集団は、中胚葉、外胚葉および胚外内胚葉のマーカーに関し逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜Ｄは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１およびＳＯＸ７の遺伝子発現に関して、Ａ１００母集団と比較し、ＣＸＣＲ４＋細胞では激減したことを示している。このＡ１００母集団においては、アクチビンＡの投
与量が少ないかまたは全くない条件に比べ、これらのマーカーの発現はもともと低かった。これらの結果は、高用量アクチビンＡの存在下で分化させたｈＥＳＣからＣＸＣＲ４＋細胞を分離することにより、胚体内胚葉で高度に濃縮され、且つ、実質的に純胚体内胚葉である集団が得られることを明らかにしている。
実施例１０
ＣＸＣＲ４を用いた、細胞集団内の胚体内胚葉細胞の定量化
細胞培養物または細胞集団に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量化を確認するために、ＣＸＣＲ４および胚体内胚葉の他のマーカーを発現している細胞をＦＡＣＳにより分析した。前記比率の定量化は、本明細書において先に求めたもの、並びに、２００３年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）
」の米国仮特許出願第６０／５３２，００４号明細書において求められたものであり、この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
上記実施例で説明したような方法を用いて、ｈＥＳＣを分化させ胚体内胚葉を作製した。具体的には、分化細胞培養物において示される収率および純度を増加させるため、培地の血清濃度を以下のように制御した：１日目は０．２％ＦＢＳ、２日目は１．０％ＦＢＳ、そして３〜６日目は２．０％ＦＢＳとした。分化した培養物は、三つの細胞表面エピトープ、Ｅ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４、およびトロンボモジュリンを用いて、ＦＡＣＳで分取した。そして、分取した細胞集団は、Ｑ−ＰＣＲにより分析し、胚体および胚外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対的発現量を求めた。最適に分化した培養物から採取したＣＸＣＲ４分取細胞は、純度９８％を超える胚体内胚葉細胞を分離する結果となった。
表２は、ここで説明した方法を用いてｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果示す。
具体的には、表２は、ＣＸＣＲ４およびＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が、細胞培養物中の細胞の７０％〜８０％を占めることを示している。これらのＳＯＸ１７を発現している細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から、ＴＭ陽性およびＡＦＰ陽性細胞（壁側および臓側内胚葉の合計：３％）の比率を差し引くと、細胞培養物の約６７％から約７７％が胚体内胚葉であったことが分かる。細胞の約１０％は、ｈＥＳＣのマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に陽性であり、細胞の約１０〜２０％は他の細胞型であった。
ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物中の胚体内胚葉の純度は、ＦＢＳ濃度を５〜６日間の分化過程を通して０．５％以下に維持することにより、上記の低血清処理と比較して改善できることが分かった。しかしながら、５〜６日間の分化過程を通して０．５％以下に細胞培養物を維持することは、作製される胚体内胚葉細胞総数を減少させることに
もなる。
ここに記載した方法により作製された胚体内胚葉細胞は、それほど分化を伴わず、５０日間を超えてアクチビンの存在下、培養物中に維持し増殖させた。そのような場合、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３βの発現は、培養期間中維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１およびＢＲＡＣＨは、これらの培養物において検出されなかった。そのような細胞は、それほど分化を伴わず、実質的に５０日を越えて培養物中で維持し、増殖させることができるようである。
実施例１１
胚体内胚葉細胞の更なるマーカー
以下の実験では、ＲＮＡを、精製した胚体内胚葉およびヒト胚性幹細胞集団から分離した。その後、精製した各集団から得たＲＮＡの遺伝子チップ分析により遺伝子発現を分析した。また、Ｑ−ＰＣＲも行い、胚体内胚葉のマーカーとして、胚体内胚葉では発現するが、胚性幹細胞では発現しない遺伝子の可能性をさらに調査した。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、２０％のノックアウト血清リプレースメント、４ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で維持した。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で５日間培養することにより、胚体内胚葉に分化させた。ＦＢＳの濃度は、以下のように日毎に変化させた：０．１％（一日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
遺伝子発現解析用にｈＥＳＣおよび胚体内胚葉の精製集団を得るため、蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）により細胞を分離した。ｈＥＳＣは、ＳＳＥＡ４抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ社、カタログ番号ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、胚体内胚葉は、ＣＸＣＲ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して、免疫精製を行な
った。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号２５３００−０５４）を用いて分離し、２％のヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、非特異的結合を遮断するために１０分間氷上で１００％のヒト血清中に再懸濁させた。８００μＬのヒト血清中、５×１０６個の細胞に対し、フィコエリトリン標識抗体２００μＬを添加することにより、氷上で３０分間染色を行なった。細胞は、ＰＢＳ緩衝液８ｍＬで二度洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａ
ｇｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのコアファシリティにより、ＦＡＣＳ分離が行われた。細胞は
、ＲＬＴ溶解緩衝液中に直接回収し、ＲＮＡは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ社）の使用説明に従いＲＮｅａｓｙにより分離した。
アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製プラットフォームおよびＵ１３３ Ｐ
ｌｕｓ ２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用し、発現プロファイルデータを作
製するため、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ社（ダラム、ノースカロライナ）
に、精製したＲＮＡを２コピー提出した。提示されたデータは、ｈＥＳＣおよび胚体内胚葉の２つの集団の間で、特異的に発現した遺伝子を同定する群比較である。ｈＥＳＣにおいて見られた発現量を超えて、力強い上昇変化を示した遺伝子を、胚体内胚葉に極めて特有である新しいマーカー候補として選択した。選択した遺伝子は、上述のように、Ｑ−ＰＣＲにより分析し、遺伝子チップ上で見られる遺伝子発現変化を検証し、またｈＥＳＣが分化する間のこれら遺伝子の発現パターンも調べた。
図３４Ａ〜Ｍは、一定のマーカーに関する遺伝子発現結果を示している。結果は、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの添加後１日目、３日目および５日目に分析した細胞培養物、５日間の分化過程の終わりに精製したＣＸＣＲ４発現胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）、および精製ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）について示している。図３４Ｃおよび図３４Ｇ〜Ｍ
を比較することにより、六つのマーカー遺伝子ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が、互いにほぼ等しく、またＣＸＣＲ４およびＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の発現パターンとも等しい発現パターンを示すことが立証されている。先に説明したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉およびＳＯＸ７発現胚外内胚葉の両方において発現する。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現しないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比率により、全体として集団内で見られるＳＯＸ１７発現に対する胚体内胚葉の寄与について信頼性のある推定が得られる。パネルＧ〜ＬおよびＭのパネルＣに対する類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性が高く、胚外内胚葉細胞においては著しく発現することはないことを示している。
当然のことながら、ここに記載したＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができる。
実施例１２
レチノイン酸およびＦＧＦ−１０は、胚体内胚葉培養物において特異的にＰＤＸ１を誘導する
以下の実験は、レチノイン酸およびＦＧＦ−１０が、胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を誘導することを示すものである。
アクチビン存在下または非存在下に、ヒト胚性幹細胞を４日間培養した。４日目に、ＲＡを１μＭ、ＦＧＦ−１０を５０ｎｇ／ｍｌ、細胞培養物に添加した。ＲＡおよびＦＧＦ−１０を添加して４８時間後、ＰＤＸ１マーカー遺伝子および前腸内胚葉に非特異的な他のマーカー遺伝子の発現が、Ｑ−ＰＣＲによって定量化された。
胚体内胚葉細胞へのＲＡの添加は、臓側内胚葉（ＳＯＸ７、ＡＦＰ）、神経性（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）あるいはニューロン性（ＮＦＭ）の遺伝子発現マーカーの発現を増加させることなく（図３６Ａ−Ｆ）、ＰＤＸ１遺伝子発現の顕著な増加をもたらした（図３５）。ＲＡを１μＭ、ＦＧＦ−１０を５０ｎｇ／ｍｌ添加して４８時間後、ＰＤＸ１遺伝子発現は、胚体内胚葉で観察されたレベルより約５００倍高いレベルにまで誘導された。さらに、ＲＡ添加前にアクチビン処理していない培養物に対して、アクチビン処理した細胞培養物において約１６０倍高いＰＤＸ１発現が見られたように、これらの結果は、先に胚体内胚葉（ＳＯＸ１７）へ分化した細胞培養物でのみ実質的なＰＤＸ１誘導が生じたことを示している。
実施例１３
ＦＧＦ−１０は、ＲＡ単独よりもＰＤＸ１発現をより増加させる
本実施例は、ＲＡおよびＦＧＦ−１０の組み合わせが、ＲＡ単独よりも大幅にＰＤＸ１発現を増加させることを示すものである。
先の実施例と同様に、ｈＥＳＣをアクチビン存在下または非存在下に４日間培養した。４日目に、細胞を次のいずれかで処理した。すなわち、ＲＡのみ１μＭ、ＲＡを１μＭとＦＧＦ−４またはＦＧＦ−１０のいずれかとの組み合わせ、あるいは、ＲＡを１μＭとＦＧＦ−４およびＦＧＦ−１０の双方との組み合わせ、である。ＲＡまたはＲＡ／ＦＧＦを添加して９６時間後、ＰＤＸ１、ＳＯＸ７およびＮＦＭの発現が、Ｑ−ＰＣＲによって定量化された。
ｈＥＳＣ培養物をアクチビン、ついでレチノイン酸で処理すると、ＰＤＸ１遺伝子発現が約６０倍の増加に誘導された。ＲＡ処理にＦＧＦ−４を加えると、ＰＤＸ１発現はわずかではあるが（ＲＡ単独の約３倍）、さらに誘導された。一方、ＦＧＦ−１０とレチノイン酸を共に加えると、ＰＤＸ１の誘導は、ＲＡ単独の６０倍へと更に増強された（図３７Ａ）。この非常に強力なＰＤＸ１誘導は、アクチビン処理やＲＡ／ＦＧＦ処理のない場合に比べて、１４００倍以上の強さであった。興味深いことに、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−１０の同時添加は、ＦＧＦ−１０の有利な効果を減殺し、ＦＧＦ−４添加の場合のように、わずかにＰＤＸ１発現を増加させるのみであった。
ＲＡ／ＦＧＦ−４またはＲＡ／ＦＧＦ−１０を組み合わせて添加しても、添加しなかった細胞に比べて、前腸内胚葉と関係しないマーカー遺伝子の発現は増加しなかった（図３７Ｂ−Ｃ）。
実施例１４
レチノイン酸用量は、インビトロでの前方―後方（Ａ−Ｐ）位置に影響を及ぼす
ＲＡの用量が、インビトロでの細胞培養物のＡ−Ｐ位置に影響を及ぼすかどうかを決定するため、以下の実験を行った。
アクチビン存在下または非存在下に、ヒト胚性幹細胞を４日間培養した。４日目に、ＦＧＦ−１０を５０ｎｇ／ｍｌと、ＲＡを０．０４μＭ、０．２μＭまたは１．０μＭのいずれかを組み合わせて、細胞培養物に添加した。ＰＤＸ１マーカー遺伝子および前腸内胚葉に非特異的な他のマーカー遺伝子の発現が、Ｑ−ＰＣＲによって定量化された。
ＦＧＦ−１０を５０ｎｇ／ｍｌと組み合わせて、種々の用量でレチノイン酸を加えると、異なった遺伝子発現パターンを誘導した。これら遺伝子発現パターンは、特異的な前方―後方位置パターンと相関する。ＲＡの最も高い用量（１μＭ）は、前方内胚葉マーカー（ＨＯＸＡ３）の発現を誘導し、また最も強力にＰＤＸ１発現を増加させた（図３８Ａ−Ｂ）。ＲＡの中レベルの用量（０．２μＭ）は、中腸内胚葉マーカー（ＣＤＸ１、ＨＯＸＣ６）の発現を誘導した（図３８Ｃおよび図４１Ｅ）。一方、ＲＡの最も低い用量（０．０４μＭ）は、後腸内胚葉マーカー（ＨＯＸＡ１３）の発現を誘導した（図３８Ｄ）。ＲＡの用量は、神経系（ＳＯＸ１）またはニューロン性（ＮＦＭ）マーカーの相対的発現に実質的影響を及ぼさなかった（図３８Ｆ−Ｇ）。これらの結果は、ＲＡがインビトロでモルフォゲンとして使用できること、特に分化したｈＥＳＣの内胚葉誘導体のモルフォゲンとして使用できることを示している。
実施例１５
Ｂ２７の使用は、ＰＤＸ１発現を増強する
たくさんの因子および細胞増殖／分化条件を用いることによって、胚体内胚葉でのＰＤＸ１発現に影響を与えることができる。以下の実験は、Ｂ２７の使用が、胚体内胚葉細胞でのＰＤＸ１発現を増強することを示すものである。
未分化ｈＥＳ細胞を高用量のアクチビンＡ（０．５−２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１００−２００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で４日間成長させることによって、胚体内胚葉への分化を誘導した。アクチビンＡなしのコントロールは、０．５−２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に、アクチビンＡを添加しないものであった。４日目に、培養物を、２％ＦＢＳ（なし）中または２％血清リプレースメント（ＳＲ）中にアクチビンＡなし、あるいは、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２（なし、＋ＦＢＳ、＋Ｂ２７）中または２％血清リプレースメント（ＳＲ）中に、２μＭのＲＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０と共に、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかにした。Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）は、１／５０に希釈して、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋Ｂ２７）に直接添加した。各場合に細胞サンプルを複数用意し、全ＲＮＡを回収し、前述同様にＱ−ＰＣＲによって定量した。
図３９Ａ−Ｅは、無血清でＢ２７を加えたものが、ＰＤＸ１遺伝子発現の誘導をさらに有利にしたことを示している。前腸内胚葉に非特異的なマーカー遺伝子の発現については、無血清で成長した細胞でのマーカー遺伝子の発現と比べて、増加を誘導しなかった。
実施例１６
アクチビンＢの使用は、ＰＤＸ１誘導を増強する
本実施例は、アクチビンＢの使用が、インビトロでの細胞培養物における、ＰＤＸ１陰性細胞からＰＤＸ１陽性細胞への分化を増強することを示す。
未分化ｈＥＳ細胞を低血清ＲＰＭＩにおいて高用量のアクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で６日間成長させることによって、ヒト胚
性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。ＦＢＳの用量は、１日目０％、２日目０．２％、３−６日目２％であった。胚体内胚葉作製のためのネガティブコントロール（ＮＦ）は、アクチビンＡを添加しない２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩであった。ＰＤＸ１発現を誘導するために、６日目、各培養物の２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩにレチノイン酸２μＭを加えた。１−５日目にアクチビンＡ処理された培養物は、アクチビンＡ単独（５０ｎｇ／ｍｌ）のほか、異なる用量のアクチビンＡおよびアクチビンＢの組み合わせで処理された。アクチビンＡなしのコントロール培養物（ＮＦ）は、アクチビンＡやアクチビンＢで処理されなかった。ＲＡ／アクチビン処理は３日間行われ、その後各複数の細胞サンプルについてＰＤＸ１遺伝子発現がＱ−ＰＣＲによって測定された。
図４０Ａに示すように、２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）または５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のアクチビンＡ存在下に１０−５０ｎｇ／ｍｌの範囲の用量のアクチビンＢ（ａ１０、ａ２５、ａ５０）を加えると、アクチビンＡ単独（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した培養物の少なくとも２倍にＰＤＸ１発現が増加した。アクチビンＢを加えた結果、発生のこの時点での肝臓ならびに膵臓のマーカーであるＨＮＦ６の発現は増加することなく（図４０Ｂ）、ＰＤＸ１発現が増加した。この結果は、肝臓に比べて、膵臓に分化する細胞の割合が増加したことを示している。
実施例１７
ＰＤＸ１誘導を増強する用量での血清の使用
胚体内胚葉細胞でのＰＤＸ１発現は、分化プロセスにおいて、細胞培養物に存在する血清量によって影響を受ける。以下の実験は、ｈＥＳＣからＰＤＸ１陰性胚体内胚葉への分化における培養物での血清量が、ＰＤＸ１陽性内胚葉へのさらなる分化におけるＰＤＸ１発現に影響を与えることを示すものである。
未分化ｈＥＳ細胞を低血清ＲＰＭＩにおいて高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で５日間成長させることによって、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。ＦＢＳの用量は、１日目０．１％、２日目０．５％、３−５日目は０．５％、２％および１０％のいずれかであった。アクチビンＡなしのコントロール（ＮＦ）は、アクチビンＡを添加しない同用量のＦＢＳ／ＲＰＭＩであった。ＰＤＸ１発現は、６日目からＲＡを添加して誘導された。培養物は、６−７日目、０．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中にレチノイン酸２μＭとし、８日目１μＭ、９−１１日目０．２μＭとした。レチノイン酸処理中、アクチビンＡは５０ｎｇ／ｍｌと低くし、アクチビンＡなしのコントロール（ＮＦ）では、なしのままにした。
図４１Ａに示すように、胚体内胚葉誘導の３日間（３，４，５日）におけるＦＢＳの用量は、引き続きレチノイン酸処理においてＰＤＸ１遺伝子発現の誘導を変える能力を持った。またこれは、ＺＩＣ１（図４１Ｂ）またはＳＯＸ７（図４１Ｃ）遺伝子発現の発現パターンを実質的に変えなかった。
実施例１８
ＰＤＸ１誘導を増強する条件培地の使用
胚体内胚葉細胞でのＰＤＸ１発現に影響を与える他の因子および増殖条件についても検討した。以下の実験は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性内胚葉細胞への分化における条件培地の影響を示すものである。
未分化ｈＥＳ細胞を低血清ＲＰＭＩにおいて高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で５日間成長させることによって、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。ＦＢＳの用量は、１日目０．２％、２日目０．５％、３−５日目２％であった。
５日間のアクチビンＡ処理で得られた胚体内胚葉培養物は、その後４日間２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有する２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩにＲＡを添加することによって、ＰＤＸ１発現内胚葉への分化を誘導した。ＲＡの添加は、最初の２日間は２μＭとし、３日目１μＭ、４日目０．５μＭとした。ＰＤＸ１誘導のためのこの基礎培地は、新鮮なもの（
２Ａ２５Ｒ）または４つの異なる細胞集団の１つによって２４時間条件付けられた後のものであった。条件培地（ＣＭ）は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦＣＭ）または、ｉ）３％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ（ＣＭ２）、ｉｉ）アクチビンＡ（ＣＭ３）もしくはｉｉｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（ＣＭ４）の３つの条件の１つによって最初に５日間分化させたｈＥＳＣのいずれかによって作製された。アクチビンＡまたはＢＭＰ４因子は、前記同様のＦＢＳ用量（０．２％、０．５％、２％）の下で、１００ｎｇ／ｍｌ加えられた。これら３つの異なる分化条件は、３つの非常に異なるヒト細胞集団を生じさせ、それによってＰＤＸ１誘導培地を調節することができる。増殖因子を添加しない３％ＦＢＳ（ＮＦ）は、大部分が胚外内胚葉、外胚葉および中胚葉細胞からなる不均一な集団を生じさせた。アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）は胚体内胚葉の大集団を生じさせ、ＢＭＰ４処理培養物（Ｂ１００）は主要なものとして栄養外胚葉を、さらに胚外内胚葉を生じさせた。
図４２Ａに示すように、新鮮培地および条件培地において、最初の２日間のＲＡ処理で、ＰＤＸ１は同様に誘導された。しかし、３日目に、新鮮培地およびＭＥＦ条件培地において、ＰＤＸ１発現は減少しはじめた。分化ｈＥＳＣにより作製した条件培地は、ＰＤＸ１遺伝子発現を維持し、または新鮮培地より３，４倍高いレベルで発現をさらに増加させた。ｈＥＳＣ条件培地でＰＤＸ１高発現を維持した効果は、４日目にＲＡ処理することでさらに増強され、新鮮培地より６，７倍高いレベルとなった。
図４２Ｂに示すように、条件培地処理すると、ＰＤＸ１発現内胚葉の領域では発現しない遺伝子である、ＣＤＸ１遺伝子発現のレベルは非常に低くなった。このことは、分化ｈＥＳＣ培養物から作製した条件培地で胚体内胚葉を処理することによって、ＰＤＸ１発現内胚葉全体の純度が非常に高められたことを示している。
図４３に示すように、ＰＤＸ１遺伝子発現は、胚体内胚葉細胞に添加された条件培地の量に対して、用量依存的応答を示した。各プレートに添加された培地全量は５ｍｌであり、条件培地の各量（図４３）が新鮮培地（Ａ２５Ｒ）に希釈された。注目すべきことに、４ｍｌの新鮮培地に１ｍｌの条件培地を加えたものも、５ｍｌの新鮮培地のみに比べてＰＤＸ１発現の高レベルを誘導し維持することができた。このことは、ＰＤＸ１発現内胚葉を誘導するための条件培地の有利な効果が、細胞から条件培地に放出される１又は複数の物質に依存しており、この物質（群）の用量依存的にＰＤＸ１発現内胚葉の生産が高まることを示している。
実施例１９
ＰＤＸ１と結合する抗体の有効性
ＰＤＸ１と結合する抗体は、細胞集団でのＰＤＸ１の発現誘導をモニターするのに有効なツールである。そこで、本実施例は、ＰＤＸ１に対するウサギポリクローナルＩｇＹ抗体が、ＰＤＸ１タンパク質の存在を検出するのに利用できることを示す。
最初の実験では、細胞溶解物中のＰＤＸ１と結合するＩｇＹ抗ＰＤＸ１抗体（ＩｇＹ
α―ＰＤＸ１）の有効性がウェスタンブロットによって調べられた。この実験では、ＭＤＸ１２ヒト線維芽細胞または２４時間前にＰＤＸ１発現ベクターを感染させたＭＤＸ１２細胞からの細胞溶解物全５０μｇに対するＩｇＹ α―ＰＤＸ１抗体の結合性が比較され
た。細胞溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、エレクトロブロッティングによって膜に転写された後、まずＩｇＹ α―ＰＤＸ１抗血清をプローブとして反応させ、次に
アルカリホスファターゼ共役ウサギ抗ＩｇＹ（Ｒｂ α―ＩｇＹ）２次抗体と反応させた
。１次抗体および２次抗体の希釈度は、以下のように異なる組み合わせのものであった。Ａ（１次抗体500x希釈，２次抗体10,000x希釈）、Ｂ（2,000x, 10,000x）、Ｃ（500x, 40,000x）、Ｄ（2,000x, 40,000）、Ｅ（8,000x, 40,000x）
ＰＤＸ１発現ベクター感染細胞（ＰＤＸ１陽性）での結合性は、使用した抗体の組み合わせすべてで検出された。非感染（ＰＤＸ１陰性）の線維芽細胞では、高濃度の１次抗体および２次抗体を共に使用した場合（組み合わせＡ）でのみ結合性が認められた。非特異的な結合として、感染および非感染の線維芽細胞双方で、ＰＤＸ１よりわずかに高い分子量での付加的バンドが検出された。
第２の実験では、ウサギポリクローナル抗ＰＤＸ１抗体（Ｒｂ α―ＰＤＸ１）のＰＤ
Ｘ１に対する結合性が免疫細胞化学法によって調査された。ＰＤＸ１発現細胞を作製するため、ＰＤＸ１―ＥＧＦＰ発現ベクター（ClontechのpEGFP-N1を用いて作製）を、ＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４６０）に一過性に感染させた。その後、感染細胞は、Ｒｂ α―ＰＤＸ１およびα―ＥＧＦＰ抗血清で標識された。感染細胞は、ＥＧＦＰの蛍
光と、Ｃｙ５共役２次抗体を用いたα―ＥＧＦＰ免疫細胞化学法との双方によって可視化された。ＰＤＸ１の免疫蛍光は、α―Ｒｂ Ｃｙ３共役２次抗体を用いて可視化された。
その結果、Ｒｂ α―ＰＤＸ１およびα―ＥＧＦＰ抗体の結合は、ＧＦＰ発現と共局在
した。
実施例２０
ヒト膵臓組織の免疫細胞化学法
本実施例は、ＰＤＸ１に対し特異性をもつ抗体が、免疫細胞化学法によってヒトＰＤＸ１陽性細胞を同定するのに利用できることを示す。
最初の実験では、ヒト膵臓のパラフィン包埋切片に対し、１／２００倍希釈したモルモット抗インシュリン１次抗体（Ｇｐα−Ｉｎｓ）と、１／１００倍希釈したＣｙ２共役イヌ抗モルモット２次抗体（Ｄ α−Ｇｐ）とを用いて、インシュリンを染色した。第２の
実験では、同じくヒト膵臓のパラフィン包埋切片に対し、１／４０００倍希釈したＩｇＹ抗ＰＤＸ１一次抗体と、１／３００倍希釈したＡＦ５５５共役ウサギ抗ＩｇＹ２次抗体とを用いて、ＰＤＸ１を染色した。第１および第２の実験で得られた画像を重ね合わせて、両発現の関係を調べた。第３の実験では、ＩｇＹ抗ＰＤＸ１抗体で染色した細胞をさらにＤＡＰＩ染色した。
ヒト膵臓切片の解析の結果、ランゲルハンス島での強い染色の存在が認められた。最も強いＰＤＸ１シグナルは（インシュリン陽性の）膵島で認められたが、（インシュリン陰性の）腺房組織においても弱い染色が認められた。ＤＡＰＩとＰＤＸ１をともに染色した結果、ＰＤＸ１は多く、しかし全部ではないが、核に局在していた。
実施例２１
レチノイン酸処理細胞からのＰＤＸ１の免疫沈降
ＲＡ存在下に分化させた胚体内胚葉細胞でのＰＤＸ１発現と、ＲＡ存在下に分化させなかった胚体内胚葉細胞でのＰＤＸ１の不存在とをさらに確かめるため、ウサギ抗ＰＤＸ１抗体（Ｒｂ α−ＰＤＸ１）を用いて、ＲＡによる分化および未分化胚体内胚葉細胞から
ＰＤＸ１を免疫沈降した。免疫沈降したものから、ＩｇＹ抗ＰＤＸ１抗体を用いたウェスタンブロット解析により検出を行った。
免疫沈降に供する分化および未分化胚体内胚葉細胞の溶解物を得るため、ｈＥＳＣが低血清において１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで５日間処理され（胚体内胚葉細胞）、その後、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、all-trans RAを２日２μＭ、１日１μＭおよび１日０．２μＭで処理された（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）。ポジティブコントロールとして、ＰＤＸ１発現ベクターを感染させたＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−２４６０
）からの細胞溶解物も調製された。各溶解物にウサギ抗ＰＤＸ１抗体とウサギ特異的２次抗体を加えて、ＰＤＸ１を免疫沈降した。沈降物を遠心分離に供し、ＳＤＳ含有バッファーに溶解した後、ポリアクリルアミドゲルにロードした。分離後、エレクトロブロッティングによりタンパク質を膜に転写し、ＩｇＹ抗ＰＤＸ１一次抗体および標識ウサギ抗ＩｇＹ２次抗体を用いて検出した。
ＭＳ１−Ｖ陽性コントロール細胞および８日目（レーンｄ８、ＲＡ処理から３日）および９日目（レーンｄ９、ＲＡ処理から４日）の同細胞から得られた免疫沈降物は、ＰＤＸ１タンパク質陽性であった（図４４）。未分化胚体内胚葉細胞（図４４で（Ａ）と示された、アクチビンＡ処理した５日目の細胞）および未分化ｈＥＳＣ（図４４で（ＮＦ）と示された、未処理５日目の細胞）から得られた免疫沈降物は、ＰＤＸ１陰性であった。
実施例２２
ＰＤＸ１プロモーターＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ細胞の作製
細胞単離のためのＰＤＸ１マーカーを使用するため、発現性レポーター遺伝子をもつタグつきのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を遺伝子工学的に作製した。本実施例では、ＰＤＸ１調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを有するベクターを作製した。また、上記ベクターを感染させたヒト胚性幹細胞やレポーターカセットがゲノムに組み込まれた細胞などの細胞を調製した。
ＰＤＸ１遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を配置し、レポーター遺伝子を遺伝子工学的にタグ付けしたＰＤＸ１発現胚体内胚葉細胞系統を作製した。最初に、pEGFP-N1ベクター（Clontech）のＣＭＶプロモーターを、ＰＤＸ１の転写開始部位から約４．４キロ塩基対（ｂｐ）上流から約８５塩基対（ｂｐ）下流までの範囲の核酸配列を含むヒトＰＤＸ１調節領域（Genbank Accession No. AF192496）に置換することによって、ヒトＰＤＸ１遺伝子プロモーターによりＥＧＦＰ発現が制御されるプラスミドコンストラクトを作製した。この領域は、ＰＤＸ１遺伝子の特徴的な調節エレメントを含んでおり、トランスジェニックマウスに通常のＰＤＸ１発現パターンを付与するのに十分である。得られたベクターでは、ＥＧＦＰ発現がＰＤＸ１プロモーターにより調節され、実験においてこのベクターをｈＥＳＣに感染させることができる。
ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記ベクターから切り出し、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーター制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む選択ベクターにサブクローニングした。選択カセットは、カセットを除去できるようにｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接して配置した。この選択ベクターを直鎖化して、通常のリポフェクタミン法によりｈＥＳＣに導入した。Ｇ４１８により１０−１４日間選択した後、未分化トランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離し、増やした。
実施例２３
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の単離
本実施例は、ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣがＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化可能であり、これを蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）によって単離可能であることを示すものである。
ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを、５日間はアクチビンＡ含有培地、その後２日間はアクチビンＡおよびＲＡ含有培地で分化させた。分化した細胞をトリプシン消化し、Becton Dickinson FACS Diva でＲＮＡ溶解バッファーまたはＰ
ＢＳに直接分離した。ＥＧＦＰに対するゲーティングなしで単一生細胞のサンプルをとり（Live）、ＥＧＦＰ陽性（ＧＦＰ）およびＧＦＰ陰性（Ｎｅｇ）の集団へ単一生細胞をゲートさせた。１つの実験では、ＥＧＦＰ陽性フラクションを蛍光強度（ＨｉとＬｏ）に応じて２つの等しい大きさの集団に分離した。
分離後、細胞集団はＱ−ＰＣＲおよび免疫細胞化学法で分析された。Ｑ−ＰＣＲ解析では、Qiagen RNeasy columnsを用いてＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを作製した。Ｑ−ＰＣＲ
は前記同様に行った。免疫細胞化学法では、細胞をＰＢＳに分離し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、Cytospin centrifugeを用いてスライドガラスに固定した。サ
イトケラチン１９（ＫＲＴ１９）に対する１次抗体はChemiconから、Hepatocyte nuclear
factor 3 beta（ＨＮＦ３β）に対するものはSanta Cruzから、Glucose Transporter 2
（ＧＬＵＴ２）に対するものはR&D systemsからのものを使用した。FITC（緑）又はRhodamine（赤）で標識した２次抗体を、１次抗体との直接結合に使用した。
典型的な分化細胞のＦＡＣＳ分離結果を図４５に示す。本実施例で単離されたＰＤＸ１陽性細胞の割合はおよそ７％であったが、分化効率に応じて約１％から約２０％まで変化した。
分離した細胞はさらにＱ−ＰＣＲ解析に供された。分化した細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＰＤＸ１遺伝子発現との相関を示した。非蛍光細胞と比較すると、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＰＤＸ１発現レベルが２０倍以上増加していた（図４６）。ＥＧＦＰ強度の高低で分
離すると、ＥＧＦＰ発現レベルはＰＤＸ１発現レベルと相関を示した（図４７）。ＰＤＸ１マーカー解析に加えて、分離した細胞について、膵臓内胚葉にて発現するいくつかの遺伝子のＱ−ＰＣＲ解析を行った。これらのマーカー遺伝子（ＮＫＸ２．２、ＧＬＵＴ２、ＫＲＴ１９、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３β）それぞれの産物はすべて、ＥＧＦＰ陽性フラクションにおいて豊富であった（図４８Ａ−Ｅ）。対照的に、神経系マーカーＺＩＣ１およびＧＦＡＰは、分離されたＥＧＦＰ発現細胞では豊富でなかった（図４９ＡおよびＢ）。
免疫細胞化学法によって、実質的にすべての単離されたＰＤＸ１陽性細胞において、ＫＲＴ１９およびＧＬＵＴ２が発現していた。この結果から、膵臓内胚葉系統の細胞であると考えられる。これらの細胞の多くはまた、抗体染色でＨＮＦ３β陽性であった。
本明細書に記載した方法、組成物および装置は、好適な実施形態の現時点での代表的および模範的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当技術分野における当業者は、本発明の精神に包含され、開示内容の範囲により明確にされる変更および他の用途を考え付くこともあろう。よって、種々の代替および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、ここに開示した本発明に帰することは当業者にとっては明らかであろう。
請求項および本開示事項全体に渡って使用されている、「本質的に〜から成る」という表現により、その表現の中に記載されたあらゆる要素を含み、記載されている要素に関する開示において特定した働きあるいは作用を妨げたり寄与したりすることのない他の要素に限定された、あらゆる要素を含むことを意味する。よって、「本質的に〜から成る」という表現は、記載されている要素は必要、すなわち必須であるが、他の要素は任意であり、記載されている要素の働きまたは作用に影響するかどうかによって存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示している。
参考文献
本特許出願においては、多数の文献および特許参考文献が引用されている。本特許出願において引用された全ての参考文献は、その全内容を引用することにより本明細書の一部とされる。
いくつかの参考文献に関しては、本文中、完全な典拠を記載している。その他の参考文献に関しては、本文中、著者および年度により言及しており、その完全な典拠を以下に示す。
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Claims (10)

  1. ヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞およびヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物であって、ヒト胚体内胚葉細胞の９５個ごとに、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも５個存在する、細胞培養物。
  2. ヒト多能性細胞をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養物。
  3. 前記ヒト多能性細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項２に記載の細胞培養物。
  4. 前記ヒト多能性幹細胞が、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）または胚の生殖隆起に由来する、請求項３に記載の細胞培養物。
  5. 前記ヒト多能性幹細胞が、胎生期を過ぎ発達した多細胞構造の生殖組織に由来する、請求項３に記載の細胞培養物。
  6. 前記細胞培養物がレチノイドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  7. 前記細胞培養物が、TGFβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの増
    殖因子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  8. 前記細胞培養物が、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および／または神経系細胞を実質的に含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  9. 前記細胞培養物がヒト中胚葉細胞を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  10. 前記中胚葉細胞が５％未満の濃度で存在する、請求項９に記載の細胞培養物。
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