KR101851956B1 - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 분화 Download PDF

Info

Publication number
KR101851956B1
KR101851956B1 KR1020137007513A KR20137007513A KR101851956B1 KR 101851956 B1 KR101851956 B1 KR 101851956B1 KR 1020137007513 A KR1020137007513 A KR 1020137007513A KR 20137007513 A KR20137007513 A KR 20137007513A KR 101851956 B1 KR101851956 B1 KR 101851956B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
stem cells
pluripotent stem
population
medium
Prior art date
Application number
KR1020137007513A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130138761A (ko
Inventor
벤자민 프라이어
Original Assignee
얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 얀센 바이오테크 인코포레이티드 filed Critical 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Publication of KR20130138761A publication Critical patent/KR20130138761A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101851956B1 publication Critical patent/KR101851956B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0613Cells from endocrine organs
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0676Pancreatic cells
    • C12N5/0678Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018Culture media for cell or tissue culture
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/34Sugars
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10Growth factors
    • C12N2501/115Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10Growth factors
    • C12N2501/19Growth and differentiation factors [GDF]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70Enzymes
    • C12N2501/72Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727Kinases (EC 2.7.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50Proteins
    • C12N2533/54Collagen; Gelatin

Abstract

본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2010년 8월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/378,448호의 이익을 주장한다.
본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린 생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하고 있다. 소리아(Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고하고 있다.
하나의 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시하였다.
다른 예에서, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생성 세포를 생성하는 것을 보고하고 있다.
미칼레프(Micallef) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무(commitment)를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하고 있다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고하고 있다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, p48, Pax6, 및 Hnf6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다(문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGF-β 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 사용하여 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만; 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든(Gordon) 등은 Wnt 시그널링 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은"Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식 세포(human embryonic germ; hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르(D'Amour) 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 부티르산나트륨 및 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 TGF-β 길항제, 예컨대 노긴(Noggin)과 함께 배양하여, PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
따라서 β 세포와 더욱 밀접하게 닮은 기능성 인슐린 발현 세포를 생성하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명은 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성함으로써 인간 배아 줄기 세포를 인슐린 발현 세포를 향해 분화시키는 효율을 향상시키는 대안적인 접근법을 취한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계와,
b. 글루코스 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함하는, 집단 내의 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
<도 1>
도 1은 실시예 1에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 단백질들의 발현의 FACS 분석을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 CXCR4 발현 수준에 대한 배지중 글루코스 농도의 영향 (패널 B) 및 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에 있어서의 세포의 수 및 생존성 (패널 B)을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 CXCR4 발현 수준 및 배양물 외관에 대한 배지중 글루코스 농도의 영향 (패널 A), 및 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에 있어서의 SOX17 발현을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 실시예 2에 개시된 제1 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
<도 5>
도 5는 실시예 2에 개시된 제2 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 실시예 2에 개시된 방법의 1일 내지 4일에 세포에의 24시간 노출 후 다양한 배지의 pH 수준을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 실시예 3에 개시된 제2 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현에 대한 배지 pH 수준의 영향을 나타낸다.
<도 8>
도 8은 실시예 4에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
개시 내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 선구 세포, 비재생 선구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 전구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "1기 세포" 또는 "1기"는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장(posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81 발현(존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 애선스 소재의 브레사겐(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조된다 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]).
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 피더 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Reubinoff et al, Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Richards et al, Stem Cells 21: 546-556, 2003]에 개시된 영양 세포층들 중 임의의 하나 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Wang et al, Stem Cells 23: 1221-1227, 2005]에 개시된 방법에 따라 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Stojkovic et al, Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Miyamoto et al, Stem Cells 22: 433-440, 2004]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Amit et al, Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Inzunza et al, Stem Cells 23: 544-549, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20020072117호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6642048호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005014799호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Xu et al, Stem Cells 22: 972-980, 2004]에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20070010011호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050233446호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6800480호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005065354호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005065354호에 개시된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005086845호에 개시된 배양 배지에서 배양할 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Cheon et al, BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Levenstein et al, Stem Cells 24: 568-574, 2006]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050148070호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050244962호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005086845호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 실시 형태에서, 적합한 배양 기질은 매트리겔(MATRIGEL)(등록상표) (벡튼 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리겔(등록상표)은 실온에서 겔화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), 깁코(Gibco) 번호 11965-092; 넉아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 번호 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마(Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 깁코 번호 13256-029로부터 제조할 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
본 발명은 만능 줄기 세포의 집단으로부터 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 이는 단계적 분화 프로토콜을 이용하여 성취되며, 여기서 만능 줄기 세포의 집단은 먼저 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 그 후 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 그 후 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다.
본 발명은 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 상기 세포의 집단은 추가로 처리되어 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성할 수 있다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 추가로 처리되어 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성할 수 있다.
분화 효율은 원하는 세포 유형의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어 ABCG2, 크립토(cripto), FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
만능 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
본 발명의 일 태양에서, 만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화될 수 있다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향한 만능 줄기 세포의 집단의 분화는 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 만능 줄기 세포를 처리함으로써 성취된다.
대안적인 실시 형태에서, 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향해 분화시키는 것은 만능 줄기 세포를 GDF-8로 처리함으로써 성취되며, 적어도 하나의 다른 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아닐린-피리디노트라이아진, 사이클릭 아닐린-피리디노트라이아진, N-{[1-(페닐메틸)아제판-4-일]메틸}-2-피리딘-3-일아세트아미드, 4-{[4-(4-{[2-(피리딘-2-일아미노)에틸]아미노}-1,3,5-트라이아진-2-일)피리딘-2-일]옥시}부탄-1-올, 3-({3-[4-({2-[메틸(피리딘-2-일)아미노]에틸}아미노)-1,3,5-트라이아진-2-일]피리딘-2-일}아미노)프로판-1-올, N~4~-[2-(3-플루오로페닐)에틸]-N~2~-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로필]피리도[2,3-d]피리미딘-2,4-다이아민, 1-메틸-N-[(4-피리딘-3-일-2-{[3-(트라이플루오로메틸)페닐]아미노}-1,3-티아졸-5-일)메틸]피페리딘-4-카르복스아미드, 1,1-다이메틸에틸 {2-[4-({5-[3-(3-하이드록시프로필)페닐]-4H-1,2,4-트라이아졸-3-일}아미노)페닐]에틸}카르바메이트, 1,1-다이메틸에틸 {[3-({5-[5-(3-하이드록시프로필)-2-(메틸옥시)페닐]-1,3-옥사졸-2-일}아미노)페닐]메틸}카르바메이트, 1-({5-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-올, 1-({4-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-카르복스아미드 및 2-{[4-(1-메틸에틸)페닐]아미노}-N-(2-티오펜-2-일에틸)-7,8-다이하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-카르복스아미드. 사용에 적합한 인자의 예는 미국 특허 출원 제12/494,789호에서 찾아볼 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 다른 인자는 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이다.
만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 약 1일 내지 약 7일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 약 1일 내지 약 6일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 약 1일 내지 약 5일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 약 1일 내지 약 4일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 글루코스의 농도가 10.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 약 4일 동안 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 25 ng/mL의 농도로 사용된다.
액티빈 A는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, Wnt 리간드는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드의 농도는 약 20 ng/mL이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 배지의 역할 및 접종 프로토콜
계대 41(p41)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 TrypLE (카탈로그 번호: 12604-013, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐(Invitrogen))에 의해 들어올리고, 단일 세포로서 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(MATRIGEL)(등록상표) 코팅된 디쉬 (1:30의 희석)에 20 ng의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크(PeproTech)) 및 10 μM의 Y-27632(Rho 키나아제 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다.
이와 동시에, 계대 41의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포는 세포를 디스파아제(카탈로그 번호: 17105-041, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)로 들어올리고 세포를 20 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 MEF-CM 중에 도말함으로써 1:3의 계대비로 매트리겔(등록상표) 코팅 디쉬 (1:30의 희석)에 세포 콜로니로서 접종하였다. 단일 세포 포맷(format) 배양 및 콜로니 포맷 배양 둘 모두에 있어서, 배지는 접종한지 24시간 및 48시간 후 20 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 신선 MEF-CM으로 교환하였다.
접종 후 72시간에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마)을 함유하는 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트(Proliant)), 1X 글루타맥스(GlutaMax)™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 보충한 것, 그 후 3일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨, 2% BSA, 글루타맥스, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A를 포함하는 MCDB-131 (조건 1); 또는
b. 1일 동안 RPMI-1640 (카탈로그 번호: 22400-105, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 보충한 것, 그 후 추가로 3일 동안 매일 2% BSA, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 RPMI-1640 배지 (조건 2).
4일에, 샘플들을 FACS 분석용으로 수집하였다. 도 1에서, CXCR4 및 CD9 발현에 대한 유세포분석 결과는 X축 상에 도시된 CD9 발현에 대한 Y축 상에 도시된 CXCR4 발현을 이용하여 산점도 포맷으로 나타낸다. CXCR4, CD9, 및 CD99 (분화의 추가의 마커)를 발현하는 세포의 백분율이 표 1에 요약되어 있다. 세포 표면 마커 CXCR4 및 CD99의 증가된 발현에 의해 측정되는 분화는 MCDB-131 배지의 사용에 의해 향상되었으며, CXCR4 및 CD99의 발현은 콜로니 스타일 배양으로부터 단일 세포 배양으로 변화시킴으로써 추가로 증가되었다. 더욱이, 이들 데이터는 미분화 세포에 있어서의 세포 마커인 CD9의 감소된 발현과 상관되었으며, 이는 유세포분석법에 의해 측정되는 바와 같았다.
흥미롭게도, 도 1에서, 클러스터(cluster) 또는 콜로니 스타일 포맷 중 어느 하나에서 MCDB-131을 사용하면 더욱 적은 공동 음성(CXCR4-/CD9-) 세포가 있거나 - 이는 더욱 적은 비특이적 분화를 나타냄 - , 또는 MCDB-131 배지로 처리한 배양물에서 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하지 않는 더욱 적은 세포가 있다. 전체적으로, 이들 데이터는 H1 인간 배아 줄기 세포가 RPMI-1640 배지보다 MCDB-131 배지의 존재 하에서 더욱 효율적으로 분화하며, MCDB-131에서의 분화는 콜로니 스타일 접종 및 배양에 대하여 단일 세포로서 세포를 접종 및 배양함으로써 추가로 향상될 수 있음을 나타낸다.
[표 1]
Figure 112013025602227-pct00001
실시예 2
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 글루코스의 역할
글루코스는 에임스 배지(Ames' Medium); 기본 이글 배지(Basal Medium Eagle; BME); BGJb 배지의 피톤-잭슨 변형물(Fitton-Jackson Modification); 클릭 배지(Click's Medium); CMRL-1066 배지; 둘베코 변형 이글 배지(DMEM); DMEM/햄 영양소 혼합물(Ham's Nutrient Mixture) F-12 (50:50); F-12 쿤 변형물(Coon's Modification); 피셔 배지(Fischer's Medium); H-Y 배지(하이브리-맥스(Hybri-Max)(등록상표)); 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM); 맥코이 5A 변형 배지(McCoy's 5A Modified Medium); MCDB 배지; 배지 199; 최소 필수 이글 배지(Minimum Essential Medium Eagle; EMEM); NCTC 배지; 영양소 혼합물, 햄 F-10; 영양소 혼합물, 햄 F-12; 영양소 혼합물 햄 F-12 카인 변형물(Kaighn's Modification; F12K); RPMI-1640; 무혈청/무단백질 하이브리도마 배지; 웨이마우쓰 배지(Waymouth Medium) MB; 윌리엄스 배지(Williams Medium) E 및 다양한 독점적(proprietary) 배지를 포함하는 거의 모든 세포 배양 배지에 첨가되는 용해성 헥소스 당이다. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html을 참조하라.
세포 배양 제형 중 글루코스의 양은 다양하다. MCDB 배지 시리즈는 3.9 내지 10 mM의 범위의 글루코스를 함유하는 반면, 대부분의 배지는 1 g/L(5.5 mM)로부터 10 g/L(55 mM)만큼 높은 글루코스를 함유하며, 이때 RPMI-1640에서는 11 mM의 글루코스로 맞추어진다. 10 mM 초과의 글루코스 농도는 세포 배양 시스템 내에서 당뇨 조건과 유사하다. 이는 생체 내에서 세포 및 분자에 영향을 줄 수 있는 동일한 과정이 시험관 내에서 일어날 수 있기 때문에 중요하다. 본질적으로 당뇨성인 조건 하에서의 세포 성장의 결과는 세포 및 세포 생성물이 당화 및 당산화(glyoxidation) 과정에 의해 변경되며, 글루코스 매개된 산화적인 그리고 카르보닐의 스트레스에 의해 손상될 수 있다는 것이다. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html을 참조하라.
완성 내배엽 생성에 현재 사용되는 한 가지 배지로는 25 mM의 글루코스를 함유하는 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) (문헌[Kubo et al; April 1, 2004, Development 131, 1651-1662]), 11 mM의 글루코스를 포함하는 RPMI (문헌[D'Amour et al Nat Biotechnol. 2005 Dec; 23(12):1534-41]), 또는 17.5 mM의 글루코스를 포함하는 DMEM-F12가 있다. 이들 배지 각각은 글루코스 농도가 당뇨 조건과 유사한 10 mM 초과이다. 그 결과, 배양 배지 중 고 글루코스에 의해 유도될 수 있는, 세포에 대한 스트레스를 감소시키기 위하여, 인간 배아 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서 10 mM보다 더 낮은 글루코스 농도를 찾으려고 시도되었다. 글루코스 농도가 10 mM 미만인 한 가지 그러한 배지로는 5.5 mM의 베이스 글루코스 농도를 함유하는 MCDB-131이 있다.
계대 41(p41)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 TrypLE (카탈로그 번호: 12604-013, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐))에 의해 들어올리고, 단일 세포로서 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔®(등록상표) 코팅된 디쉬 (1:30의 희석)에 20 ng의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y-27632(Rho 키나아제 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 배지는 접종한지 24시간 및 48시간 후 20 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 신선 MEF-CM으로 교환하였다. 배양물들을 하기와 같이 72시간 후에 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 및 0, 5, 10, 15, 20 또는 25 mM의 글루코스 (카탈로그 번호: G8769, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지, 그 후
b. 추가로 3일 동안 2% BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스, 100 ng/㎖의 액티빈 A, 및 0, 5, 10, 15, 20, 또는 25 mM의 글루코스가 보충된 MCDB-131 배지.
4일에 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR을 사용한 유전자 발현 분석용으로 수집하고, 바이아카운트(ViaCount)(등록상표) (구아바(Guava)(등록상표), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재의 밀리포어(Millipore))로 카운팅하였다. 실시예 1로부터의 결과와 일치하여, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화는 완성 내배엽 계통과 결부된 마커들의 강한 발현으로 이어졌다 (도 2a). 배지 중 글루코스 농도가 0, 5, 10, 15, 20, 또는 25 mM의 글루코스로 보충될 때 (최종 농도: 각각 5.5, 10.5, 15.5, 20.5, 25.5, 또는 30.5 mM의 글루코스), 세포수의 보통의 증가가 추가의 10 mM 글루코스(15.5 mM의 최종 글루코스 농도)로 처리한 샘플에서 관찰되었으며, 이는 도 2b에 나타낸 바와 같았다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 추가의 5 mM 글루코스(10.5 mM의 최종 글루코스 농도)가 보충된 세포에 있어서의 CXCR4 발현의 보통의 증가가 또한 관찰되었다. 그러나, CXCR4 및 세포수의 이들 증가는 전체 세포 생존성의 감소에 의해 상쇄되었다 (도 2b).
기저 수준의 글루코스(5.5 mM)에서, 배양물 중 거의 모든 세포는 SOX17 양성이며, 세포는 균일한 패턴으로 배양 디쉬 내에서 분산되었다 (도 3a 및 도 3b). 글루코스 농도를 증가시켰을 때, 세포는 SOX17의 높은 발현을 유지하였지만, 세포는 클러스터링되는 것으로 관찰되었다. 후속적으로, 이러한 클러스터링된 세포는 기저 수준의 글루코스에서 배양된 세포의 집단보다 배양 표면 상에서 덜 고르게 분산되었다. 이러한 효과는 클러스터링된 세포에 있어서 호메오박스 HB9(HLXB9)로도 공지된 췌장의 췌장 호메오박스 1(MNX1)의 유전자 발현의 감소와, 미분화 세포에 대한 세포 마커인 CD9 및 OCT4와, 배자외 외배엽에 대한 세포 마커인 SOX7의 발현의 약간의 증가와 상관시켰다 (도 4).
분화에 대한 유사한 글루코스 관련 영향은 5.5 mM(저) 또는 25 mM(고) 글루코스 농도를 함유하는 DMEM (카탈로그 번호: 10567-014 및 21063-029, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)으로 분화시킨 배양물에서 또한 관찰되었다. 상기에 설명한 바와 같이, 대조군에 있어서, 세포를 단일 세포로서 접종하고, MEF 조절 배지에서 3일 동안 배양하고, 5.5 mM 또는 25 mM 글루코스 보충된 배지를 포함하는 MCDB-131에서, 또는 2% 무지방산 BSA, 100 ng/㎖의 액티빈 A, 및 20 ng/㎖의 WNT-3a가 보충된 DMEM 고 또는 저 글루코스 배지 - 제1일에 - 와, 2% 무지방산 BSA 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 DMEM 고 또는 저 글루코스 배지 - 다음 3일 동안 - 에서 매일 배지를 교환하여 분화시켰다.
상승된 글루코스가 저 글루코스 배지 처리 세포와 비교하여 완성 내배엽 형성을 억제하는, MCDB-131 배지를 이용한 결과와 유사하게, DMEM 중 고 글루코스 농도가 hES 세포 분화를 감소시키는 것이 관찰되었다. 유세포분석에 의하면, 완성 내배엽으로의 분화 후, 25 mM의 글루코스를 함유하는 배지에서의 80% CXCR4 양성 세포에 대하여 5.5 mM의 글루코스를 함유하는 배지에서 세포 중 88.6%가 CXCR4 양성이었다. 부가적으로, qRT-PCR에 의해 측정되는 완성 내배엽으로의 분화의 마커(SOX17)는 감소한 반면, 미분화 세포의 마커(OCT4) 또는 대안적인 분화 운명의 마커(CDX2)는 저 글루코스 배지를 공급한 것에 대하여 고 글루코스를 함유하는 배지를 공급한 세포에서 증가하였다 (도 5). 이러한 효과는 적어도 부분적으로는 배지의 pH로 인한 것이며, 그 이유는 4일간의 분화에 걸쳐 배지 pH가 분화일 48시간 후에 강하되기 때문이다. 더욱이, 완성 내배엽 형성 동안 배양 배지의 출발 pH 및 최종 pH가 더욱 높을수록 (8.1>pH>7.6) (도 6) 완성 내배엽으로의 전환이 더욱 완벽해진다.
요약하면, 본 출원인의 결과는 분화 배지 중 글루코스의 기저 수준(5.5 mM)은 세포 중 80% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하기에 충분함을 나타낸다. 분화 배지 중 글루코스 농도를 10.5 mM로 증가시키는 것은 유사한 집단의 생성에 충분하지만, 글루코스 농도를 10.5 mM 초과로 증가시키는 것은 만능성/감소된 분화의 마커, 예를 들어 CD9 또는 OCT4의 발현을 증가시키거나, 또는 대안적인 운명의 분화/배자외 외배엽과 결부된 마커, 예를 들어 SOX7 또는 CDX2의 발현을 증가시킬 수 있다.
실시예 3
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 pH 제어의 역할
계대 46(p46)의 인간 배아 줄기(hES) 세포주 H1의 세포는 세포를 디스파아제(카탈로그 번호: 17105-041, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)로 들어올리고 세포를 20 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 MEF-CM 중에 도말함으로써 1:3의 계대비로 매트리겔 (1:30의 희석) 코팅 디쉬에 세포 콜로니로서 접종하였다. 하기와 같이, 완성 내배엽(DE)으로의 분화가 개시될 때까지 20 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 신선 MEF-CM으로 배지를 매일 교환하였다:
a. 1일 동안 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)가 보충된 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지, 이어서 추가로 3일 동안 매일 2% BSA, 글루타맥스, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 MCDB-131로 처리; 또는
b. 1일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마)을 함유하는 MCDB-131에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 보충한 것, 이어서 추가로 3일 동안 매일 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨을 포함하고 2% BSA, 글루타맥스, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 MCDB-131로 처리.
4일에 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR을 사용한 유전자 발현 분석용으로 수집하고, 바이아카운트(등록상표) (구아바(등록상표), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재의 밀리포어)로 카운팅하였다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 분화 배지의 상대적으로 더욱 산성인 pH(<7.6의 pH)가 덜 인도된 분화 및 증가된 대안적인 분화로 인하여 CXCR4 발현을 감소시킬 수 있다.
이러한 효과가 pH로 인한 것인지를 시험하기 위하여, 1 g/리터의 공개된 농도의 중탄산나트륨을 함유하는 기본 MCDB-131에서 세포를 분화시키고, 3.7 g/리터인 중탄산염 농도의 DMEM이 되도록 보충한 배지에서 세포를 분화시켰다. 세포 표면 마커 CXCR4의 증가된 발현 및 CD9의 감소된 발현에 의해 측정되는 바와 같이 분화가 완충제의 사용에 의해 향상되었음을 관찰하였다. 완충제를 위한 3.7 g/l의 중탄산나트륨을 포함하는 MCDB-131 배지는 단지 기저 수준의 중탄산염 (1 g/l)을 함유하는 MCDB-131에서 분화시킨 세포에 대하여 유의하게 더 높은 CXCR4 발현 및 더 낮은 CD9 발현 수준을 가졌다 (도 7a 및 도 7b). 이는 부분적으로는 MCDB-131 배지의 pH 수준이 7.5이고 2.7 g/l의 중탄산나트륨의 첨가가 상기 pH를 7.6으로 상승시킨다는 사실로 인한 것이다.
더욱이, 분화의 마지막에, 미분화 배지에서 성장시킨 배양물로부터의 배지 (pH 컬러 센서 페놀 레드를 함유함)는 적색으로 남아있는 보충적 중탄산나트륨 완충 배지에 의한 배양물보다 유의하게 더욱 황색이고 산성이었다. 이들 결과는 배지 pH를 7.6 이상으로 증가시키는 것이 만능 줄기 세포로부터의 더욱 효율적인 완성 내배엽 분화를 촉진하고, 배지 pH의 상승 및 안정화는 인큐베이터 CO2 수준 및 다른 용해성 완충 시스템, 예를 들어 HEPES, 또는 인산염의 증가를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 중탄산염 완충에 대한 대안에 의해 성취될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 RPMI-1640 또는 MCDB-131 배지 및 TGF-베타 수퍼패밀리 구성원인 액티빈 A 및 GDF-8의 역할
계대 47(p47)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 TrypLE (카탈로그 번호: 12604-013, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 의해 들어올리고, 단일 세포로서 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표) 코팅된 디쉬 (1:30의 희석)에 20 ng의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 3 μM의 H-1152, 글리실 (Rho 키나아제 억제제, 카탈로그 번호: 555554, 미국 뉴저지주 깁스타운 소재의 이엠디 케미칼즈(EMD chemicals)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다.
접종 후 72시간에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마)을 함유하는 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 보충하고, 그 후 MCDB-131에 3일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨, 2% BSA, 글루타맥스, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A를 보충하거나, 또는
b. 1일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마)을 함유하는 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 GDF-8 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 2.5 μM의 GSK3B 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온을 보충하고, 그 후 MCDB-131에 추가로 3일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨, 2% BSA, 글루타맥스, 및 100 ng/㎖의 GDF-8을 보충하거나, 또는
c. 4일 동안 추가의 0.0025 g/㎖의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마)을 함유하는 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/㎖의 GDF-8 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)을 보충하거나, 또는
d. 1일 동안 RPMI-1640 (카탈로그 번호: 22400-105, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 및 100 ng/㎖의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/㎖의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 보충하고, 그 후 RPMI-1640 배지에 추가로 3일 동안 매일 2% BSA, 및 100 ng/㎖의 액티빈 A를 보충하였다.
e. 1일 동안 RPMI-1640 (카탈로그 번호: 22400-105, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트) 및 100 ng/㎖의 GDF-8 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 2.5 μM의 GSK3B 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온을 보충하고, 그 후 추가로 3일 동안 매일 RPMI-1640 배지에 2% BSA, 및 100 ng/㎖의 GDF-8을 보충하였다.
4일에, 샘플들을 FACS 분석 및 qRT-PCR용으로 수집하였다. 표 2에서, CXCR4, CD9, 및 CD99 (분화의 추가의 마커)를 발현하는 세포의 백분율이 표 2에 요약되어 있다. 세포 표면 마커 CXCR4의 증가된 발현에 의해 측정되는 바와 같이, 분화는 RPMI-1640과 비교하여 MCDB-131 배지의 사용에 의해 향상되었으며, CXCR4의 발현은 액티빈 A 및 Wnt3a로 처리한 세포와 비교하여 GDF-8을 GSK3B 억제제와 조합하여 사용함으로써 추가로 증가되었다. RPMI-1640과 비교하여 MCDB-131 배지의 사용에 의해, 그리고 액티빈 A 및 Wnt3a로 처리한 세포와 비교하여 GDF-8을 GSK3B 억제제("MCX")와 조합하여 사용함에 의해 향상된 분화를 나타내는 유사한 결과가 유전자 MNX-1에 대한 qRT-PCR에 의해 관찰되었다 (도 8). 더욱이, 이들 데이터는 유세포분석 (표 2)에 의해 측정되는 바와 같이 미분화 세포에 대한 세포 마커인 CD9의 감소된 발현 또는 qRT-PCR (도 8)에 의해 측정되는 바와 같이 OCT4 및 CD9의 감소된 발현과 상관되었다. 이들 데이터는 H1 인간 배아 줄기 세포가 RPMI-1640 배지보다 MCDB-131 배지의 존재 하에서 더욱 효율적으로 분화되며, MCBD-131에서의 분화는 액티빈 A 및 Wnt3a를 이용한 분화에 대하여 GDF-8 및 GSK3B 억제제의 존재 하에서의 세포의 분화에 의해 더욱 향상될 수 있음을 나타낸다.
[표 2]
Figure 112013025602227-pct00002
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원칙 하에 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정되는 것으로 인식될 것이다.

Claims (17)

  1. 만능 줄기 세포의 집단을 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 함유하고 글루코스의 농도가 5.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화하는 것을 포함하며,
    완성 내배엽 계통의 특징적인 마커가 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민, DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인,
    완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단의 생성방법.
  2. 만능 줄기 세포의 집단을 GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온을 함유하고 글루코스의 농도가 5.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화하는 것을 포함하며,
    완성 내배엽 계통의 특징적인 마커가 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민, DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인,
    완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단의 생성방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 완성 내배엽 세포인 것인 방법.
  4. (1) 액티빈 A와 Wnt 리간드, 또는 (2) GDF-8과 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충되고 글루코스 농도가 5.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포로 분화하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항, 제2항 또는 제4항에 있어서, 분화 전에 만능 줄기 세포의 배양을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항, 제2항 또는 제4항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 만능 줄기 세포인 방법.
  8. 제1항, 제2항 또는 제4항에 있어서, 배지의 pH가 7.6 이상인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 만능 줄기 세포를 액티빈 A와 Wnt 리간드가 보충되고 글루코스 농도가 5.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제1항 또는 제9항에 있어서, Wnt 리간드가 Wnt-3a인 방법.
  11. 제1항 또는 제9항에 있어서, 액티빈 A가 1 pg/ml 내지 100 μg/ml의 농도로 사용되는 방법.
  12. 제1항 또는 제9항에 있어서, Wnt 리간드가 1 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 농도로 사용되는 방법.
  13. 제4항에 있어서, 만능 줄기 세포를 GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충되고 글루코스 농도가 5.5 mM을 초과하지 않는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제2항 또는 제13항에 있어서, GDF-8이 5 ng/ml 내지 500 ng/ml의 농도로 사용되는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 만능 줄기 세포를 1 일 내지 7 일 동안 분화하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제4항에 있어서, 만능 줄기 세포를 1 일 내지 7 일 동안 배양하는 것을 포함하는 방법.
  17. 삭제
KR1020137007513A 2010-08-31 2011-08-17 인간 배아 줄기 세포의 분화 KR101851956B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37844810P 2010-08-31 2010-08-31
US61/378,448 2010-08-31
PCT/US2011/048127 WO2012030538A2 (en) 2010-08-31 2011-08-17 Differentiation of human embryonic stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130138761A KR20130138761A (ko) 2013-12-19
KR101851956B1 true KR101851956B1 (ko) 2018-04-25

Family

ID=45697773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137007513A KR101851956B1 (ko) 2010-08-31 2011-08-17 인간 배아 줄기 세포의 분화

Country Status (15)

Country Link
US (3) US9506036B2 (ko)
EP (2) EP3372672A1 (ko)
JP (2) JP6168991B2 (ko)
KR (1) KR101851956B1 (ko)
CN (1) CN103221536B (ko)
AR (1) AR082819A1 (ko)
AU (1) AU2011296381B2 (ko)
BR (1) BR112013004616A2 (ko)
CA (1) CA2809300A1 (ko)
ES (1) ES2660897T3 (ko)
MX (1) MX355340B (ko)
PL (1) PL2611909T3 (ko)
RU (1) RU2620938C2 (ko)
SG (2) SG187946A1 (ko)
WO (1) WO2012030538A2 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3372672A1 (en) * 2010-08-31 2018-09-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN103890167A (zh) 2011-06-21 2014-06-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层
US20140242038A1 (en) * 2011-10-11 2014-08-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for generating beta cells
JP5979452B2 (ja) * 2012-06-11 2016-08-24 国立大学法人北海道大学 多能性幹細胞の選別方法
DK3008168T3 (da) 2013-06-11 2020-05-04 Harvard College Sc-celler og sammensætninger og fremgangsmåde til dannelse deraf
US10190096B2 (en) 2014-12-18 2019-01-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof
CN113234661A (zh) 2014-12-18 2021-08-10 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
EP4194549A1 (en) * 2017-01-27 2023-06-14 Kaneka Corporation Endodermal cell population, and method for producing cell population of any of three germ layers from pluripotent cell
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
CA3139585C (en) 2019-05-31 2024-01-23 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
WO2020243668A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
EP3976236A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates Inc. A biocompatible membrane composite
WO2022169375A2 (en) * 2021-02-08 2022-08-11 Qatar Foundation For Education, Science And Community Development Generation of induced pluripotent stem cell lines from human patients with mutations in the glucokinase gene

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007143193A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems

Family Cites Families (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
RU2139351C1 (ru) 1991-04-25 1999-10-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Н- и l-цепи моноклонального антитела рм1 (монат) к рецептору il-6r человека и их v-области, модифицированная монат, его н- и l-цепи и их v-области, cdr- последовательности, днк-последовательности
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
AU687386B2 (en) 1993-04-08 1998-02-26 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ko) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
KR100252743B1 (ko) 1994-12-29 2000-09-01 나가야마 오사무 Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
NZ500447A (en) 1997-04-24 2001-09-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles that inhibit cytokine production and are useful in the treatment of inflammatory disease
PT1028737E (pt) 1997-07-03 2007-07-11 Osiris Therapeutics Inc Células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
PT1538206E (pt) 1997-09-16 2010-04-12 Centocor Ortho Biotech Inc Método para a síntese química e construção completa de genes e genomas
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
US6372779B1 (en) 1997-12-29 2002-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-inflammatory compounds
ES2258329T3 (es) 1998-03-18 2006-08-16 Osiris Therapeutics, Inc. Celulas madre mesenquimaticas para la prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes.
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
US6458593B1 (en) 1999-01-21 2002-10-01 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
CA2385628A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 Ammon B. Peck Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US6753153B2 (en) 1999-12-13 2004-06-22 The Scripps Research Institute Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
KR100947577B1 (ko) 2000-06-26 2010-03-15 엔씨 메디컬 리서치 가부시키가이샤 신경계 세포로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 세포분획
CN100525768C (zh) 2000-10-23 2009-08-12 史密丝克莱恩比彻姆公司 新化合物
CZ20031594A3 (cs) 2000-12-08 2004-06-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Pyrrolinové sloučeniny substituované indazolylovou skupinou jako inhibitory kinázy
ATE301661T1 (de) 2000-12-08 2005-08-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
CA2435826A1 (en) 2001-01-24 2002-08-01 The Government Of The United States Of America Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
ES2359391T3 (es) 2001-01-25 2011-05-23 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Formulación de compuestos de acido boronico.
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
US20050054102A1 (en) 2001-04-19 2005-03-10 Anna Wobus Method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
DE60231035D1 (de) 2001-04-24 2009-03-19 Ajinomoto Kk Stammzellen und verfahren zu deren trennung
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
AU2002319780A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
BR0214772A (pt) 2001-12-07 2007-01-09 Macropore Biosurgery Inc sistemas e métodos para o tratamento de pacientes com células lipoaspiradas processadas
EP1463798A4 (en) 2001-12-07 2005-01-19 Geron Corp ISLAND CELLS FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1671835A (zh) 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
EP1498478A1 (en) 2002-04-17 2005-01-19 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
JP2005529918A (ja) 2002-05-08 2005-10-06 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 置換されたピロリンキナーゼ阻害剤
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
JP2005527241A (ja) 2002-05-28 2005-09-15 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー invitroにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法
JP2005531609A (ja) 2002-06-05 2005-10-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ キナーゼ阻害剤としてのシスインドリル−マレイミド誘導体
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
CA2494040A1 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
AU2003302702B2 (en) 2002-12-05 2008-08-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
CA2508880C (en) 2002-12-16 2018-02-06 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same
US7976853B2 (en) 2003-01-29 2011-07-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for producing coated preparation
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2004087885A2 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
US7413734B2 (en) 2003-06-27 2008-08-19 Ethicon, Incorporated Treatment of retinitis pigmentosa with human umbilical cord cells
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
AU2004269395A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン インコーポレイテッド Cyp26aおよびcyp26bの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN109628371B (zh) * 2003-12-23 2021-02-19 维亚希特公司 定形内胚层
DK2722387T3 (da) * 2003-12-23 2020-01-20 Viacyte Inc Definitiv endoderm
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005080551A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
AU2005221095A1 (en) 2004-03-09 2005-09-22 John J. O'neil Methods for generating insulin-producing cells
CN1950498A (zh) 2004-03-10 2007-04-18 加利福尼亚大学董事会 培养胚胎干细胞的组合物和方法
US7892835B2 (en) 2004-03-23 2011-02-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Pluripotent stem cell growing method
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
CA2555571C (en) 2004-04-01 2012-10-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
DK1740612T3 (da) 2004-04-27 2019-10-07 Viacyte Inc Pdx1 udtrykkende endoderm
WO2006016999A1 (en) 2004-07-09 2006-02-16 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
AU2005272681B2 (en) 2004-08-13 2009-11-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
JP5420837B2 (ja) 2004-09-08 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 胚幹細胞の培地及び培養
MX2007002389A (es) 2004-09-08 2009-02-12 Wisconsin Alumni Res Found Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas.
WO2006079854A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Novathera Ltd Methods for embryonic stem cell culture
EP1859026A2 (en) 2005-01-31 2007-11-28 ES Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
WO2006088867A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
AU2006218359A1 (en) 2005-03-04 2006-09-08 John O'neil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
EP1875234B1 (en) 2005-04-26 2011-06-22 Aarhus Universitet Biosurface structure array
WO2006126574A1 (ja) 2005-05-24 2006-11-30 Kumamoto University Es細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
RU2007147917A (ru) 2005-06-10 2009-07-20 Айрм Ллк (Bm) Соединения, поддерживающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
GB2441488C (en) 2005-06-22 2011-10-05 Geron Corp Suspension culture of human embryonic stem cells
ATE439349T1 (de) 2005-06-30 2009-08-15 Janssen Pharmaceutica Nv Cyclische anilinopyridinotriazine als gsk-3- inhibitoren
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
EP1962719A4 (en) 2005-08-29 2011-05-04 Technion Res And Dev Of Foundation Ltd MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS
JP2009506769A (ja) 2005-09-02 2009-02-19 エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ 間充織幹細胞誘導方法
SG151259A1 (en) 2005-09-12 2009-04-30 Es Cell Int Pte Ltd Cardiomyocyte production
CN101310012B (zh) 2005-10-14 2012-05-09 明尼苏达大学董事会 非胚胎干细胞分化成具有胰腺表型的细胞
ES2687233T3 (es) 2005-10-27 2018-10-24 Viacyte, Inc. Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX-1
CN103773804A (zh) 2005-12-13 2014-05-07 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
US8153429B2 (en) 2006-02-23 2012-04-10 Viacyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
SG170068A1 (en) 2006-03-02 2011-04-29 Cythera Inc Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
ES2725601T3 (es) 2006-04-28 2019-09-25 Lifescan Inc Diferenciación de células madre embriónicas humanas
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
CA2650561C (en) 2006-05-02 2014-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US9598673B2 (en) * 2006-05-19 2017-03-21 Creative Medical Health Treatment of disc degenerative disease
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) * 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
EP2046946B8 (en) 2006-06-26 2017-01-25 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US9040297B2 (en) 2006-08-02 2015-05-26 Technion Research & Development Foundation Limited Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
KR101331510B1 (ko) * 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
US20100323442A1 (en) 2006-10-17 2010-12-23 Emmanuel Edward Baetge Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
KR101419965B1 (ko) 2006-10-17 2014-07-16 스티펠 래버러토리즈, 인코포레이티드 탈라로졸 대사물
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
US20110151554A1 (en) 2006-11-09 2011-06-23 Akira Yuo Method for culturing and subculturing primate embryonic stem cell, as well as method for inducing differentiation thereof
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
KR20090115142A (ko) 2007-01-30 2009-11-04 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 초기 중배엽 세포,내배엽 및 중배엽 계통의 생성에 유용한 중내배엽 세포의 안정한 집단 및 다능성 유주 세포(mmc)
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
DK3293256T3 (da) 2007-06-29 2019-08-12 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Automatiseret fremgangsmåde og apparatur til dyrkning af embryonale stamceller
EP3957716A1 (en) 2007-07-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
WO2009048675A1 (en) 2007-07-31 2009-04-16 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
CA2696622C (en) 2007-08-24 2016-07-19 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Compositions for the treatment of neoplastic diseases
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
WO2009070592A2 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
BRPI0908033A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Centocor Ortho Biotech Inc Método placas de superfície modificada e composições para adesão, cultura e desprendimento de célula
WO2009110215A1 (ja) * 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
SG188918A1 (ko) 2008-03-17 2013-04-30 Agency Science Tech & Res
RU2359030C1 (ru) * 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
DK2283117T3 (da) 2008-04-21 2014-01-20 Viacyte Inc Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
DK2993226T3 (da) * 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
CN102159703B (zh) * 2008-06-30 2015-11-25 森托科尔奥索生物科技公司 多能干细胞的分化
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US9683215B2 (en) 2008-08-22 2017-06-20 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
KR101712085B1 (ko) 2008-10-31 2017-03-03 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
CN107435038B (zh) 2008-10-31 2021-07-09 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
NZ592622A (en) 2008-11-04 2012-10-26 Viacyte Inc Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP2356227B1 (en) 2008-11-14 2018-03-28 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
AU2009316580B2 (en) 2008-11-20 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
EP2356218B1 (en) 2008-12-05 2017-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
WO2011011300A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
BR112012010136A2 (pt) 2009-10-29 2015-09-15 Janssen Biotech Inc células -tronco pluripotentes
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
SG10201408552YA (en) 2009-12-23 2015-02-27 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
RU2586506C2 (ru) 2009-12-23 2016-06-10 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
SG10201501513TA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
JP5909482B2 (ja) 2010-03-31 2016-04-26 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 細胞の再プログラム
WO2011139628A1 (en) 2010-04-25 2011-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
SG185511A1 (en) 2010-05-12 2012-12-28 Centocor Ortho Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
AU2011285531B2 (en) 2010-08-05 2015-04-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
EP3372672A1 (en) * 2010-08-31 2018-09-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101836855B1 (ko) 2010-08-31 2018-04-19 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
WO2012117333A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
WO2013055397A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
JP6441080B2 (ja) 2011-12-22 2018-12-19 ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
CN108103006A (zh) 2012-06-08 2018-06-01 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
CN104903440B (zh) 2012-09-03 2018-04-06 诺和诺德股份有限公司 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
EP2970892A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
US11779311B2 (en) 2018-09-14 2023-10-10 Fujifilm Sonosite, Inc. Method and apparatus for performing spectral doppler imaging

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007143193A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems

Also Published As

Publication number Publication date
US20180237752A1 (en) 2018-08-23
KR20130138761A (ko) 2013-12-19
EP2611909A2 (en) 2013-07-10
US20120052571A1 (en) 2012-03-01
PL2611909T3 (pl) 2018-05-30
CA2809300A1 (en) 2012-03-08
US20170009212A1 (en) 2017-01-12
JP6449829B2 (ja) 2019-01-09
RU2620938C2 (ru) 2017-05-30
MX2013002405A (es) 2013-04-05
US9951314B2 (en) 2018-04-24
AU2011296381A1 (en) 2013-03-14
JP2017038614A (ja) 2017-02-23
ES2660897T3 (es) 2018-03-26
JP2013536685A (ja) 2013-09-26
RU2013114373A (ru) 2014-10-10
WO2012030538A2 (en) 2012-03-08
EP2611909B1 (en) 2018-01-17
BR112013004616A2 (pt) 2016-07-05
MX355340B (es) 2018-04-16
JP6168991B2 (ja) 2017-07-26
CN103221536A (zh) 2013-07-24
SG187946A1 (en) 2013-03-28
WO2012030538A3 (en) 2012-06-07
AR082819A1 (es) 2013-01-09
US9506036B2 (en) 2016-11-29
AU2011296381B2 (en) 2016-03-31
EP2611909A4 (en) 2014-03-05
CN103221536B (zh) 2016-08-31
EP3372672A1 (en) 2018-09-12
SG10201506855RA (en) 2015-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101851956B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화
KR101836855B1 (ko) 만능 줄기 세포의 분화
KR101836850B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant