KR20070030164A - Ｅｓ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한배지 - Google Patents

Ｅｓ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한배지 Download PDF

Info

Publication number
KR20070030164A
KR20070030164A KR1020067007271A KR20067007271A KR20070030164A KR 20070030164 A KR20070030164 A KR 20070030164A KR 1020067007271 A KR1020067007271 A KR 1020067007271A KR 20067007271 A KR20067007271 A KR 20067007271A KR 20070030164 A KR20070030164 A KR 20070030164A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
gene
protein
culturing
Prior art date
Application number
KR1020067007271A
Other languages
English (en)
Inventor
오스틴 제라드 스미쓰
퀴-롱 잉
제니퍼 니콜스
Original Assignee
더 유니버시티 코트, 더 유니버시티 오브 에딘버러
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0324270A external-priority patent/GB0324270D0/en
Priority claimed from GB0324378A external-priority patent/GB0324378D0/en
Priority claimed from GB0325007A external-priority patent/GB0325007D0/en
Application filed by 더 유니버시티 코트, 더 유니버시티 오브 에딘버러 filed Critical 더 유니버시티 코트, 더 유니버시티 오브 에딘버러
Publication of KR20070030164A publication Critical patent/KR20070030164A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

배양에서 다능성 세포의 자가 재생은 Id 유전자 산물 및 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 조합을 이용하여 촉진된다.

Description

ＥＳ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한 배지{Control of ES cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor}
본 발명은 줄기 세포 자가 재생을 촉진하고, 줄기 세포의 분화를 예방 또는 조절하기 위해, 다능성(pluripotent) 줄기 세포를 배양하는 배지, 배양 조건 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다능성 줄기 세포의 균질 제제를 유도, 분리 및 유지하는 방법을 제공한다. 제공된 방법 및 조성물은 다능성 줄기 세포, 예를 들면, 배아 줄기(ES) 세포, 특히 인간을 포함하는 포유류 줄기 세포를 배양 및 분리하는데 적합하다.
혈청 및 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는 배지의 존재하에 시험관 내 다능성 줄기 세포 배양의 확립 및 유지는 주지되어 있다 (Smith et al. (1988) Nature 336: 688-90). 상기 방법은 많은 계대에 걸쳐 증식허용 마우스의 균주로부터 다능성 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하기 위해 이용되었다. 다능성 줄기 세포 배양의 유지 및 자가 재생은 또한 줄기 세포가 공급자(feeder) 세포 또는 이의 추출액, 통상 마우스 섬유모세포 세포의 존재하에 배양될 때, 지지된다. 상기 조건하에, 배양에서 많은 계대에 걸쳐 다능성 상태로 인간 ES 세포를 유지하는 것이 가능하다.
이 분야에서 계속되는 문제는 집중적인 노력에도 불구하고, ES 세포의 다능 성 배양은 몇 가지 종 및 심지어 모든 배아 유래가 아닌 종에서조차 연장된 기간 동안 유도 및 유지될 수 있는 경우가 남아 있다는 것이다. 일부 경우에, 다능성 세포는 세포의 연구 또는 이의 유전적 조작을 가능하게 하는 충분한 시간 동안 배양에서 확인될 수 있으나, 유지될 수는 없다. 이는 특히 설치류 (마우스의 일부 세포주 이외의) 세포에 대해 사실이다.
최근까지 추가의 문제는 많은 계대에 걸쳐 배양에서 다능성 상태로 유지될 수 있는 ES 세포는 혈청 또는 혈청 추출액을 포함하는 배지를 이용하여 유지될 수 있었으므로, 기타 세포, 예를 들면, 인간 ES 세포를 유지하기 위해 이용된 섬유모세포 공급자 세포의 존재를 요한 세포 배양 조건이 비한정 또는 이용되었다는 것이다. 그러나, ES 세포가 원하는 세포 유형으로 조절된 분화를 하도록 의도되는 경우에, 비한정 배양 배지를 이용하거나 또는 존재하는 이종 세포를 갖는 것은 바람직하지 않다.
다능성 줄기 세포를 배양하는데 전형적으로 이용되는 혈청은 소태아(소) 혈청이며, 이는 시토카인 및 기타 신호전달 분자의 복잡한 혼합물을 포함하는 것으로 알려져 있다. 분화 경로를 조절하기 위해, 배양 배지에 미지의 시토카인을 도입하는 것은 바람직하지 않은데, 이는 분화의 최종적인 결과에 대한 이의 영향이 정량적이지 않으며, 잠재적으로 해로울 수 있기 때문이다. 또한, 각각의 혈청 배취는 독특하고, 배양 절차에 변이를 도입한다.
그 결과, 상기 복합 배지에서 배양에 의해 수득된 ES 세포, 및 이의 임의의 분화된 자손은 ES 세포를 유지하기 위해 필요한 공급자 세포와 같은 세포 및/또는 배지 성분에 의해 오염될 위험이 있다. 상기 인자는 ES 세포 및 이의 자손의 치료학적 및 기타 적용을 위한 좋은 제조 실시의 개발에 대해 완화된다.
ES 세포 배양으로부터 분화된 세포 집단을 유도할 때, 고비율의 ES 세포를 동일한 유형의 자손으로 전환할 수 있는 것, 즉, 가능한 한 세포의 균일한 집단을 유지하는 것이 바람직하다. 그러나, 실제로 분화에 이어, 세포의 이종 혼합물을 포함하는 세포 집단이 관찰된다. 그리하여, 자손의 더 순수한 집단을 수득하기 위해 상기 방식으로 또는 상기 인자를 이용하여 ES 세포 집단의 분화를 수행할 수 있는 것이 바람직하다.
본 출원인에 의한 선행 출원(WO-A-03/095628)에서, gp130 (예를 들면, LIF) 및 TGF-β 슈퍼패밀리 (예를 들면, BMP4) 신호전달 경로의 작용제를 포함하는 무혈청 배지에서 ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포를 배양하는 것이 복수의 계대를 위해 줄기 세포의 자가 재생을 촉진하기 위해 이용된다. gp130 신호전달의 존재하에, TGF-β 슈퍼패밀리 신호전달 경로의 작용제는 놀랍게도 분화 전 신호보다 자가 재생 자극을 제공하였다.
본 발명의 목적은 많은 계대 동안 미분화된 상태로 다능성 줄기 세포의 자가 재생을 지지할 수 있는 다능성 줄기 세포의 대안적인, 바람직하게는 개선된 배양 방법 및 상기 다능성 줄기 세포에 적합한 배양 배지를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 세포의 분화가 조절된 방식으로 유도될 때까지 시험관 내에서 다능성 줄기 세포 배양의 유지를 허용하는 대안적인 배양 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명의 여전히 추가의 목적은 다능성 줄기 세포의 유도 및 분리를 증진하며, ES 세포 분리에 무반응인(refractory) 생물체 또는 다능성 줄기 세포가 아직 분리되지 않은 것으로부터 이의 유도 및 분리를 촉진하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, gp130 신호전달의 존재하에 다능성 세포에 Id 단백질의 공급은 분화를 억제하고, 자가 재생을 촉진한다.
본 발명에서, ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포는 예를 들면, (i) Id 유전자를 발현하기 위한 Smad 경로의 직접적인 활성화, 또는 Id 유전자의 발현, 또는 (ii) Id 유전자 산물 또는 동등한 신호의 세포에서 존재를 통해, Id 유전자 발현과 부합하는 gp130 (예를 들면, LIF) 신호전달 경로의 작용제를 포함하는 무혈청 배지에서 배양된다. 복수의 계대를 위한 줄기 세포의 자가 재생이 따라서 촉진된다. 그리하여, gp130 신호전달의 존재하에 다능성 세포에서 Id 유전자 활성은 자가 재생 자극을 제공한다.
본 발명은 그리하여 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진하는데 Id 유전자 산물의 용도를 제공한다. 본 발명에 따라, Id 유전자 산물은 세포에 의도적으로 제공되고/되거나 Id 유전자 또는 동등물이 의도적으로 활성화된다. gp130 신호전달과 부합하여, 특히 LIF와 같은 시토카인을 이용하여, 다능성 세포의 자가 재생이 수득되었다.
LIF를 이용하여 자가 재생 및 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체의 하류의 신호전달의 활성화를 촉진하는 것이 본 발명가에 의한 이전의 출원으로부터 알려져 있다. 본 발명에서, LIF와 조합된 Id 유전자 활성은 ES 세포의 자가 재생을 초래한다. 그리하여, 본 발명은 하기의 조합을 통해, 자가 재생 신호를 제공하는 부가적인 수단을 제공한다:
(i) Id 단백질 활성을 증가시키는 Id 단백질 또는 물질로서, 상기 물질은 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체의 하류의 신호전달 경로의 활성화제 이외의 것이며;
(ii) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
Id 단백질에 대한 참고는 Id 단백질과 기타 단백질, 예를 들면, 수송 도메인의 융합, 및 하기 기재된 Id 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. (i)의 물질은 적당하게 TGF-베타 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하지 않고, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성을 유도하는 외래 인자이다. 예는 피브로넥틴, 피브로넥틴 수용체의 작용제, 인테그린 신호전달의 활성화제, 나노그(nanog), 및 Id 유전자 발현 또는 Id 단백질 활성을 유도하는 전술한 모든 유사체를 포함한다. 본 발명의 방법은 다능성 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포의 배양에 적합하다.
하기 실시예에서, 우리는 자가 재생을 촉진하기 위해 Id 유전자의 발현을 유도하였다. 또한 하기 기재된 본 발명의 또 다른 구현예에서, 우리는 다능성 세포를 유전자 조작하여, 예를 들면, 다능성 세포 내로 Id 유전자를 포함하는 벡터를 도입함으로써, Id 유전자를 발현하였다. 정확한 조절은 벡터 내의 유도성 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다. 상기 유형의 유전적 변형은 세포가 약물 탐색에 이용되는 경우에 허용가능하나, 세포 또는 자손이 치료적으로 이용되고자 하는 경우에 허용가능하지 않을 수 있으며, 이 경우에 자가 재생을 촉진하기 위한 외래 인자의 이용이 바람직하다.
하기에 더욱 상세히 기재된 구체적인 방법에서, 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진하는 방법은 (i) Id 유전자를 발현 또는 Id 유전자의 발현을 유도하고, (ii) gp130 하류 신호전달을 활성화하는 것을 포함한다. Id 유전자는 편리하게 에피좀으로 발현될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 하기의 조합의 용도를 제공한다:
(a) Id 유전자의 발현을 초래하는 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 활성화제; 및
(b) 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때, gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
본 발명의 대안적인 양태는 하기 조합의 용도를 제공한다:
(a) Id 유전자 산물; 및
(b) 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때, gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
하기에 더욱 상세히 기재된 본 발명의 특정 구현예에서, LIF는 Id1을 구성적으로(constitutively) 발현하는 ES 세포가 배양되는 배지에 포함된다. 자가 재생은 증진되었는데, 이는 LIF 및 발현된 Id 유전자의 상승효과를 증명한다.
본 발명의 이점은 자가 재생을 촉진시, Id 유전자 산물의 세포에서 직접적인 공급이다. 자가 재생의 직접적인 유도와 함께, 예를 들면, 자가 재생 기작의 물질로부터 몇 단계 떨어진 경로의 활성화에 기인할 수 있는 부작용이 적으면서, 자가 재생의 더 큰 조절이 된다.
Id 유전자에 대한 참고는 문헌에 정의된 유전자, 예를 들면, Id1, Id2, Id3, 및 Id4를 포함할 의도이며, 또한 Id 유전자 산물의 성질, 즉, myoD 및 mash1와 같은 bHLH 인자의 전사 활성을 저해하는 성질을 나타내는 기능성 단편 및 유도체를 포함하는 이의 모방물(mimics)을 포함할 의도이다. 구체적인 마우스, 래트, 개 및 인간 Id 단백질 서열이 서열번호 1-4에 기재된다. 기타 구체적인 Id 단백질 서열은 공개적으로 유용한 서열 데이타베이스를 통해 수득가능하다. Id 유전자 활성은 적당하게 bHLH 유전자의 발현 또는 활성을 막거나 감소시킴으로써, 또는 E 단백질의 발현 또는 활성을 막거나 감소시킴으로써, 모방될 수 있다. 이는 유전자 녹아웃 또는 저해성 RNA 전략을 이용하거나 또는 외래 유도 인자를 제거함으로써 달성될 수 있다. 안티센스 RNA가 RNA 표적화 방법에 이용될 수 있거나, 또는 siRNA 기재 접근이 이용될 수 있다.
증가된 Id 단백질 활성과 동등한 신호가 (i) bHLH 유전자 저해제, (ii) myoD 저해제, (iii) mash1 저해제, (iv) 증가된 hes 유전자 활성, (v) 증가된 hes 단백질 활성, 및 (vi) 하나 이상의 상기 모두의 조합에 의해 제공될 수 있다.
선행 기술에서, BMP와 같은 인자가 TGF-β 슈퍼패밀리 수용체의 하류의 하나 이상의 신호전달 경로를 활성화시키기 위해 이용된다. 본 발명은 예를 들면, Id 유전자를 발현하는 벡터를 통해 세포에서 Id 유전자 활성의 직접적인 공급에 의존하거나, 또는 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통하지 않고, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 활성화에 의존하거나, 또는 상기 활성화의 효과를 직접 모방하는 점에서 선행 기술과 상이하다. 본 발명은 선행 기술보다 더욱 표적화될 수 있으며, 지금까지의 것보다 자가 재생 표현형을 유지할 때 더 큰 정확성을 가능하게 한다.
하나 이상의 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화는 gp130을 통해 작용하는 시토카인, 예를 들면, LIF 수용체의 시토카인 또는 기타 작용제의 이용에 의해 달성될 수 있다.
gp130을 통해 작용할 수 있으므로, gp130 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 시토카인에는 LIF, CNTF, 카디오트로핀, 온코스타틴 M, IL-6 + sIL-6 수용체 및 하이퍼(hyper) II-6 가 포함된다. 적당한 시토카인에는 gp130을 통해 신호전달을 활성화시키고/시키거나 결합할 수 있는 모방물, 융합 단백질 또는 키메라가 포함된다. 혈청의 존재하에 gp130을 통해 작용하는 시토카인의 역할은 잘 확립되어 있으나, 혈청의 부재하에 미분화된 세포를 유지하는 시토카인의 능력은 제한된다.
그러므로, 본 발명은 하나의 구현예에서, 혈청, 혈청 추출액, 공급자 세포 및 공급자 세포 추출액이 없는 배지에서 ES 세포의 대안적인 및/또는 개선된 배양을 제공한다. LIF 및 본 발명의 특정 구현예의 Id 단백질 활성-활성화 배지 및/또는 직접적인 Id 유전자 발현을 이용할 때, ES 세포의 연장된 계대가 가능하다.
본 발명의 배양 시스템의 또 다른 이점은 ES 세포의 분화가 혈청의 존재하의 배양과 비교하여 감소된다는 것이다. 이는 종종 가장 다능성 ES 세포가 혈청에서 상당히 분화하는 경향이 있어, 이의 조작 및 팽창을 어렵게 하기 때문이다. 상기 결과는 본 발명의 배양 조건이 ES 세포를 혈청의 부재하에 자가 재생하게 한다는 것을 보여준다.
배아 줄기 세포는 마우스 (Bradley et al (1984) Nature 309: 255-56), 아메리카 밍크 (Mol Reprod Dev (1992) Dec; 33(4): 418-31), 돼지 및 양 (J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60), 햄스터 (Dev Biol (1988) May; 127 (1): 224-7) 및 암소 (Roux Arch Dev Biol (1992); 201: 134-141)를 포함하는 수많은 포유류 공급원으로부터 보고되었다. 본 발명의 방법 및 조성물은 영장류, 특히 인간, 설치류, 특히 마우스 및 래트, 및 조류 ES 세포를 포함하는 기타 포유류 다능성 세포 배양물을 배양하는데 적응하기에 적합하다는 것을 인식할 것이다.
특히, 인간 ES 세포에 대해, 인간 ES 세포는 LIF에 반응하므로, 자가 재생 자극이 LIF 및 Id 단백질의 조합에 반응하여 수득되는 본 발명의 배지 및 방법이 인간 ES 세포에 적용할 수 있다는 것이 알려져 있다.
본 발명의 방법에 적당한 세포 밀도는 이용된 다능성 줄기 세포 및 임의의 원하는 자손의 특성에 따라 변할 것이다. 양호한 결과가 단층 배양에서 배아 줄기 세포를 배양하고, 배아 줄기 세포를 해리하고, 이어서 배양물 표면 상에 단층 배양으로 0.2-2.5 x 104 세포/cm2 의 밀도로, 더욱 특히 0.5-1.5 x 104 세포/cm2 의 밀도로 배아 줄기 세포를 배양함으로써 수득되었다. 상기 세포는 부착성 단층으로서 증식하며, LIF와 함께 혈청 함유 배지에서 키운 ES 세포와 필적할만한 배가 시간(doubling time)을 갖는 것으로 관찰된다.
본 발명에 따른 ES 세포 및 이의 자손의 배양물에 대한 전형적인 표면은 세포 배양에 유용한 당 분야에서 인식된 배양물 표면이며, 상기는 통상 널리 시판되는 플라스틱 조직 배양 플레이트와 같은 표면이 이용되지만, 플라스틱, 금속, 복합체의 표면을 포함한다. 상기 플레이트는 종종 직경이 수 센티미터이다. 스케일 업을 위해, 상기 유형의 플레이트는 더 큰 직경이 이용될 수 있으며, 많은 반복 플레이트 단위가 이용된다.
배양 표면이 통상 표면 상에 코팅된 세포 부착 단백질을 포함하는 것이 통상적이다. 세포 상의 수용체 또는 기타 분자는 단백질 또는 기타 세포 배양 기질에 결합하며, 이는 표면에 대한 부착을 촉진하며, 성장을 촉진하는 것으로 제안된다. 젤라틴 코팅된 플레이트는 통상 유용하며, 본 발명에 적합하며, 기타 단백질이 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 배양 기간의 적어도 일부 동안 배양 배지에 분화를 억제하는 물질, 예를 들면, FGF 수용체 또는 MEK/Erk 신호전달 저해제를 포함하는 것은 ES 세포가 분화하는 경향을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 하나의 구현예에서, ES 세포는 FGF 수용체 저해제가 제거되기 전에 지정된 기간 동안 LIF 및 FGF 수용체 저해제를 포함하는 지정된 무혈청 배지에서 배양되며, Smad 신호전달의 직접적인 활성화제에 의해 대체된다. FGF 수용체 저해제는 인간 세포 이외의 세포에 특히 이용되며, 예는 화합물 SU5402 및 PD173074를 포함한다. 대안적으로, FGF 수용체의 경쟁적 저해제가 수용체의 적당하게 가용성 형태로 이용될 수 있다. 적당한 MEK/Erk 저해제는 PD98059, U0126 및 PD184352를 포함한다.
대안적인 구현예에서, FGF 수용체 또는 MEK/Erk 저해제를 제거하지 않는 것은 선택이다. 그리하여, 상기 저해제는 Id 단백질의 유도자의 존재 또는 부재하에 연장된 기간 동안 배양 배지에 존재한다. ES 세포는 그리하여 LIF 및 FGF 저해제의 존재하에 N2B27 배지에서 20 계대 이상 동안 배양물에서 키울 수 있다. 상기 저해제가 상기 배지로부터 제거되지 않는다면, 특정 저해제이며, 기타 수용체에 거의 또는 전혀 활성을 가지지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 양태는 하기를 포함하는 배지에서 ES 세포를 유지하는 것을 포함하는 ES 세포 자가 재생을 촉진하기 위한 ES 세포의 배양 방법을 제공한다:
(1) (a) Id 유전자의 발현을 초래하는, TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의 세포내 신호전달 경로의 활성화제, 또는 (b) Id 유전자 산물; 및
(2) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
본 발명의 방법은 ES 세포가 이전에 혈청 또는 혈청 추출액의 존재하에 계대된, 혈청 및 혈청 추출액이 없는 배지에서 ES 세포의 자가 재생을 촉진하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 또한 공급자 세포 및/또는 공급자 세포 추출액의 부재하에 수행된다. 예를 들면, 하기 단계를 포함하는 ES 세포의 배양이 수행될 수 있다:
- gp130 및 혈청 또는 혈청 추출액을 통해 작용하는 시토카인의 존재하에, 임의로 공급자 상에, 배양에서 다능성 상태로 ES 세포를 유지하는 단계;
- 1회 이상 ES 세포를 계대하는 단계;
- 상기 배지로부터 혈청 또는 혈청 추출액 및 (존재한다면) 공급자를 제거하여, 배지에 공급자, 혈청 및 혈청 추출액이 없는 단계; 및
- 이어서 (TGF-β 수용체를 통해 작용하는 것 이외의) Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기(effector) 및 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 존재하에 다능성 상태로 ES 세포를 유지하는 단계.
혈청 또는 혈청 추출액을 배지로부터 제거할 때쯤, 배지에 분화를 억제하는 물질, 예를 들면, FGF-수용체 저해제를 첨가하는 것은 선택이다. 분화 저해제가 Id 단백질의 존재하에 세포의 유지와 동시에 또는 이어서 제거되는 것은 선택이다. 상기 혈청 또는 추출액은 공급자 세포 또는 추출액이 제거됨과 동시에 또는 전에 또는 후에 제거될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, ES 세포의 트랜스펙션된 집단을 수득하는 방법을 제공한다:
- 선택성 마커를 코딩하는 구축물로 ES 세포를 트랜스펙션하는 단계;
- 상기 ES 세포를 도말하는 단계;
- 상기 ES 세포를 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기 및 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 존재하에 배양하는 단계; 및
- 상기 선택성 마커를 발현하는 세포를 선발하는 단계.
상기 선택성 마커는 예를 들면, EP-A-0695351에 기재된 항생제 내성, 세포 표면 마커 또는 또 다른 선택성 마커를 코딩할 수 있으며, 바람직하게는 원하는 세포에서 선택성 마커를 우선적으로 발현하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택성 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 배양 용기, 예를 들면 플레이트 상의 개개의 웰에 개개의 ES 세포를 옮기는 단계, 및 모두가 단일 ES 세포의 자손인 ES 세포의 클론 집단을 수득하기 위해, Smad 신호전달 경로의 직접적인 활성화제 또는 효과기 및 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 존재하에 상기 ES 세포를 배양하는 단계를 포함하는, ES 세포의 배양 방법을 제공한다.
일단 ES 세포의 안정한, 균일 배양물이 수득되면, 배양 조건은 세포의 분화를 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 세포 운명으로부터 선택된 하나 이상의 세포 유형으로 지시하도록 변경될 수 있다. 시토카인 및 신호전달 인자의 첨가 또는 제거는 고 효율로 특정 분화된 세포 집단의 유도를 가능하게 할 수 있다. 비-신경외배엽 운명으로의 ES 세포의 분화는 gp130을 통해 작용하는 시토카인 및 Smad 신호전달 경로의 직접적인 활성화제 또는 효과기의 존재하에 ES 세포를 유지한 후, Smad 신호전달 경로의 직접적인 활성화제 또는 효과기를 유지하면서 시토카인을 제거하고/하거나 분화를 유도할 수 있는 추가의 신호전달 분자를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 전술한 방법은 임의로 상기 방법의 산물인 분화된 세포를 수득 및/또는 분리하는 단계를 포함한다.
예를 들면, LIF의 부재하에 BMP4에 대한 노출은 중배엽 및 내배엽 세포 유형의 유도를 초래한다. gp130 및 TGF-β 신호전달 경로의 작용제의 제거 및/또는 양자 경로의 봉쇄는 신경외배엽 표현형의 유도를 초래한다. 대안적으로, 기타 신호전달 인자가 배양 조건에 첨가되어, 기타 분화 경로- 예를 들면, 액티빈, 음향 고슴도치(shh), Wnts 및 FGFs를 유도할 수 있다.
ES 세포 배양의 말경, 분화가 개시되기 전 하나 이상의 계대에서 Smad 신호를 제거하여, 신호가 감소하고, 이은 분화 동안 신호의 잔재가 없는 것이 바람직하다. 하나의 구현예에서, FGF 수용체 길항제가 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기를 제거하면서, 1 내지 2 계대 동안 배양물에 첨가된다.
본 발명의 추가의 양태는 ES 세포의 자가 재생용 세포 배양 배지를 제공한다. 하나의 상기 배지는 하기를 포함하며:
- 기초 배지;
- Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기;
- gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제; 및
- 철-트랜스포터;
상기 배지는 임의로 혈청 및 혈청 추출액이 없다.
인간 다능성 줄기 세포에 대한 바람직한 배지는 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제 및 FGF 수용체의 작용제를 포함한다. 인간 줄기 세포 이외의 다능성 줄기 세포에 대한 바람직한 배지는 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제 및 ES 세포 분화 저해제를 포함한다.
기초 배지는 ES 세포를 위한 탄소 및/또는 비타민 및/또는 미네랄의 필수적인 공급원을 공급하는 배지이다. 상기 기초 배지는 일반적으로 단백질이 없으며, 스스로 ES 세포의 자가 재생을 지지할 수 없다. 철 트랜스포터는 철의 공급원을 제공하거나 또는 배양 배지로부터 철을 흡수하는 능력을 제공한다. 적당한 철 트랜스포터는 트랜스페린 및 아포트랜스페린을 포함한다.
배지가 추가로 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 유사 성장인자 및 알부민(바람직하게는 재조합)을 포함하며, 공급자 세포 및 공급자 세포 추출액이 없는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 배지는 부가적인 기초 배지의 존재 또는 부재하에, LIF, BMP, 인슐린, 알부민 및 트랜스페린을 포함한다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다:
- Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및
- gp130을 통해 작용하는 시토카인.
상기 배양 배지는 전술한 ES 세포의 분화 저해제, 또는 분화를 원하는 경우에, 특정 표현형으로 ES 세포의 분화를 유도하는 신호전달 인자로 임의로 보충된다.
상기 배지가 혈청 또는 혈청 추출액이 없는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 배지는 완전히 지정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 배양 배지는 gp130 수용체 결합 시토카인인 LIF를 10U/ml 내지 1000U/ml, 더욱 바람직하게는 50U/ml 내지 500U/ml, 더 더욱 바람직하게는 100U/ml의 영역의 농도로 포함한다.
특정 인간 다능성 줄기 세포 배지는 (a) LIF, (b) BMP 및 (c) FGF를 포함한다. 비-인간 다능성 줄기 세포에 대한 특정 배지는 (a) LIF, (b) BMP 및 (c) FGF 저해제를 포함한다. 배지 성분의 치환이 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 단계를 포함하는, 포배로부터 다능성 세포를 유도하는 방법을 제공한다:
(1) 포배를 수득하는 단계;
(2) gp130 하류 신호전달의 활성화제의 존재하에 상기 포배를 배양하여, 속세포덩이를 수득하는 단계;
(3) 상기 속세포덩이를 해리하는 단계;
(4) 상기 해리된 속세포덩이로부터 세포(들)을 분리하는 단계; 및
(5) gp130 하류 신호전달의 활성화제 및 Id 유전자 발현 또는 Id 유전자 발현 산물의 활성화제의 존재하에 분리된 세포(들)을 배양하는 단계.
바람직하게는, 상기 방법은 더욱 바람직하게는 2 내지 4일 동안 LIF에서 상기 포배를 배양하는 것을 포함한다.
상기 분리된 세포(들)은 바람직하게는 무혈청 배지에서 배양된다. 전형적으로, 상기 세포는 덩어리로서 재도말된다. 하기 실시예에서, 우리는 LIF 및 BMP 수용체의 작용제의 조합을 이용하여 양호한 결과를 수득하였다.
상기 포배는 또한 임의로 BMP 수용체의 작용제의 부재하에 바람직하게는 무혈청 배지에서 배양된다.
본 발명에 여전히 추가로 프로모터에 작동가능하게 연결된 Id 유전자를 포함하는 벡터가 제공된다.
상기 프로모터는 외래 인자를 이용하여 발현 조절을 제공하는 적당하게 유도성 프로모터이다. 이는 예를 들면, 하기 실시예에서 기재된 바와 같은 에피좀 벡터일 수 있다.
본 발명의 추가의 배양 배지는 수용체 중에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 물질 이외의 Id 단백질 발현을 유도하는 물질을 포함하는 것이다. 예는 피브로넥틴, 피브로넥틴 수용체의 작용제, 인테그린 신호전달의 활성화제, 나노그, 및 Id 유전자 발현 또는 Id 단백질 활성을 유도하는 전술한 모든 유사체를 포함한다.
상기 배지는 다능성 세포의 세포막을 횡단하여 Id 단백질의 수송을 촉진하기 위해, Id 단백질, 예를 들면, 수송 도메인에 연결된 Id 단백질을 포함할 수 있다.
"수송 도메인"은 자체 및/또는 기타 단백질의 수송을 수행하는 단백질 및 막 또는 지질 이중층을 횡단하는 물질의 도메인 또는 단편을 의미하며, 상기 결합 기능을 보유하는 천연 도메인 및 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. 후자의 막은 수송이 수용체 매개된 세포내이입의 과정 동안 일어날 엔도좀의 막일 수 있다. 수송 도메인은 자주 낮은 pH에서 지질막에서 측정가능한 공극을 형성할 수 있는 성질에 의해 확인될 수 있다 (Shone et al. (1987) Eur J. Biochem. 167, 175-180은 적당한 시험을 기재한다). 수송 도메인의 후자의 성질은 그리하여 본 발명의 구축물 내에서 수송 도메인으로서 기능할 수 있는 기타 단백질 도메인을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 박테리아 신경독소로부터 유도된 수송 도메인의 예는 하기와 같다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (449-871)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (441-858)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-866)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (446-862)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (423-845)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (440-864)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-863)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (458-879)
기타 적당한 수송 도메인은 TAT (예를 들면, HIV-1 유래) 및 공유적으로 연결된 펩티드를 내재화하고, 이를 전달하거나, 또는 핵으로 전달하는 아미노산의 짧은 서열인 페네트라틴(penetratin)이다. VP22, 안테나페디아(Antennapedia)의 유도체 및 기타와 같은 단백질 전달(transduction) 도메인으로서 언급되는 추가의 적당한 도메인이 Wadia 등, 2002에 기재된다.
상기 도메인은 예를 들면, 티올 작용기를 통해, 화학적으로 Id 단백질에 연결될 수 있거나, 또는 Id 단백질 및 상기 도메인을 포함하는 융합이 발현될 수 있다. 구체적인 도메인은 서열번호 5-6에 기재되며, Id 단백질 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 구체적인 융합 단백질은 서열번호 7-9에 기재된다. 동일한 것을 포함하는 연결된 분자, 융합 및 조성물은 본 발명의 또 다른 양태를 형성한다. 상기는 예를 들면, Id 유전자를 이용하여 세포를 트랜스펙션시키는 대안으로서 배양 배지에 첨가제로서 이용될 수 있다.
수송 도메인과 관련하여 "수송"은 세포 표면에 결합 후에 일어나는 내재화 사건을 의미한다. 상기 사건은 세포의 세포질 내로 물질의 수송을 초래한다.
그러므로, ES 세포로 인자의 전달을 위한 조성물은 하기를 포함한다:
상기 인자, 및
ES 세포내로 인자를 수송하는 수송 도메인, 적당하게 클로스트리디움 독소의 HN 도메인.
상기 수송 도메인은 또한 (1) 디프테리아 독소의 HN 도메인, (2) 디프테리아 독소의 HN 도메인의 수송 활성을 실질적으로 보유하는 (1)의 단편 또는 유도체, (3) 융합생성 펩티드, (4) 막 파괴 펩티드, 및 (5) (3) 및 (4)의 수송 단편 및 유도체로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 여전히 추가로 제공되는 것은 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시, 다능성 세포에서 Id 단백질 활성을 증가시키는 물질의 용도이다.
상기 물질은 적당하게 본원에 다른 곳에서 기재된 바와 같으며, 세포에서 Id 단백질의 양을 증가시키거나 또는 세포에서 Id 단백질의 활성을 증진시키는 것일 수 있다.
TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성화는 구성적으로 활성인 수용체인 TGF-β 수용체의 상류 작용제 (예를 들면, 수용체 리간드), 또는 신호전달 경로의 활성화된 하류 성분, 예를 들면, SMAD 신호 전달 분자에 의해 수행될 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 마찬가지로, gp130 신호 전달 경로의 상류 효과기 (예를 들면, 시토카인) 및 하류 효과기 (예를 들면, Stats)는 상기 경로를 또한 활성화시킬 수 있다.
그리하여, TGF-β 수용체의 하류의 신호전달의 활성화를 언급하는 본 발명의 구현예, 예를 들면, ES 세포 유도 방법은 다능성 줄기 세포의 자가 재생을 촉진하기 위해, 바람직하게는 BMP 수용체를 통해 작용하는, TGF-β 수용체 슈퍼패밀리 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 분자를 포함하는 모든 조성물을 포함한다. BMP 수용체에 대한 적당한 리간드는 BMP 및 GDF를 포함한다.
세포의 배양이 부착성 배양물에서 수행되는 것이 본 발명에 따라 바람직하며, 본 발명의 실시예에서, 다능성 상태로 세포의 유지에 따라, 분화는 높은 정도의 균일성 및 높은 세포 생존률로 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. 부착성 배양은 세포 부착 단백질의 포함에 의해 촉진될 수 있으며, 본 발명의 특정 실시예에서, 젤라틴은 배양 기질에 대한 코팅으로서 이용되었다.
세포를 현탁 배양 또는 세포전 응집물로서 키우는 것이 선택이지만, 단층 배양으로 본 발명에 따라 다능성 세포를 배양하는 것이 또한 바람직하며; 세포는 또한 비드 또는 기타 적당한 스캐폴드, 예를 들면, 막 또는 기타 3차원 구조물 상에 키울 수 있다.
본 발명에 따라, 및 현재 바람직한 다능성 세포의 배양을 위한 배지의 추가의 성분은 세포의 생존 및/또는 대사를 촉진하는 인자이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 세포는 인슐린의 존재하에 배양된다. 대안적인 인자는 인슐린 유사 성장인자이며, 기타 상기 생존 및/또는 대사 촉진 인자가 대안적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 이용된 배양 배지는 바람직하게는 또한 혈청 알부민을 포함한다. 이는 정제된 또는 재조합 형태로 이용될 수 있으며, 재조합 형태라면, 이는 잠재적인 오염 인자, 시토카인 등의 부재의 이점을 가진다. 상기 배양 배지는 혈청 알부민을 포함할 필요가 없으며, 상기 성분은 생략되거나 또는 또 다른 벌크 단백질 또는 Wiles 등에 의해 기재된 합성 중합체(폴리비닐 알코올)에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 배지는 완전히 지정된 배지이다. 상기 배지는 미지정된 임의의 성분, 즉, 이의 함량이 미지이거나 또는 지정되지 않은 미지정되거나 변하는 인자를 포함할 수 있는 성분을 포함하지 않는다. 완전히 지정된 배지를 이용하는 이점은 다능성 세포의 배양에 이은 조작에 대한 효율적이고 일관된 프로토콜이 유도될 수 있다는 것이다. 또한, 다능성 상태로 세포의 유지는 고효율 및 더 큰 예상가능성을 가지고 달성될 수 있으며, 분화가 지정된 배지를 이용하여 배양된 세포에서 유도될 때, 분화 신호에 대한 반응은 미지정된 배지가 이용될 때보다 더욱 균일하다는 것이다.
본 발명에 따른 배지는 임의의 성체 조직 유래의 다능성 줄기 세포의 배양에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 기재된 바와 같이 다능성 세포를 배양하는 단계 및 세포를 분화를 허용하거나 또는 분화를 야기하는 단계를 포함하는 분화된 세포를 수득하는 방법을 포함하는데, 상기 세포는 다능성 줄기 세포를 포함하는 기타 세포 유형과 비교하여 원하는 분화된 세포에서 차별적인 발현을 할 수 있는 선택성 마커를 포함하며, 선택성 마커의 차별적인 발현은 원하는 분화된 세포의 우선적인 분리 및/또는 생존 및/또는 분열을 초래한다.
상기 분화된 세포는 조직 줄기 또는 전구체 세포일 수 있으며, 말단 분화된 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 배지에서 태아 또는 성체 유래의 배아 또는 체세포로부터 세포 또는 조직을 배양하는 것을 포함하는 다능성 줄기 세포 또는 EG 또는 EC 세포를 분리하는 방법을 제공한다:
- gp130을 통해 작용하는 시토카인; 및
- Id 단백질 또는 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및/또는
- FGF 수용체 또는 MEK/Erk의 저해제.
바람직하게는, 상기 배지는 완전히 지정된 배지이다.
또한 일반적으로, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 따라 수득된 세포로 확장된다. 본 발명의 세포는 약물 개발을 위한 분석에서 이용될 수 있다. 본 발명의 세포는 또한 세포 치료에 이용될 수 있으므로, 본 발명의 방법은 다능성 세포를 유도 및/또는 유지하기 위해 본 발명의 Id 단백질 활성 및/또는 발현 및 gp130 신호전달의 조합을 이용하고, 그로부터 세포 치료용 세포를 유도하며, 세포 치료에 상기 세포를 이용하는 것을 포함한다.
세포를 재프로그램하는 방법은 본 발명에 의해 제공되며, 비-다능성 세포로부터 다능성 세포를 수득한다. 그리하여, 다능성 세포를 수득하는 방법은 세포에서 Id 유전자를 발현하거나 또는 Id 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 Id 단백질을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고, 세포에서 gp130 하류 신호전달을 활성화하는 것을 포함하는데, 상기 세포는 태아 또는 성체의 체세포 또는 조직으로부터 수득된다. 상기 수득된 다능성 세포는 바람직하게는 Rex1, Oct4 및 나노그에 대해 양성인 특징이 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, Id 단백질을 대체하는 활성을 갖는 인자에 대한 분석법을 제공한다:
(1) Id 단백질 활성 및 gp130 하류 신호전달의 존재하에 세포를 배양하여, 다능성 상태로 세포를 유지하는 단계;
(2) Id 단백질 활성을 제거 또는 감소시키는 단계;
(3) 상기 세포 내로 상기 인자를 도입하는 단계; 및
(4) 세포가 다능성으로 존재하는지 또는 분화하는지를 결정하는 단계.
(1)에서 Id 단백질 활성의 존재하에 세포를 배양하는 단계는 적당하게 (a) Id 유전자를 발현하는 단계, (b) Id 유전자의 발현을 유도하거나 또는 (b) 세포가 배양되는 배지에 Id 단백질을 첨가하는 단계를 포함하며, 세포 내로 상기 인자를 도입하는 단계는 적당하게 (a) 상기 인자를 발현하는 단계, 또는 (b) 세포가 배양되는 배지에 상기 인자를 첨가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 추가의 양태는 그렇게 수득된 인자로 확장된다.
Id 유전자는 미분화된 ES 세포에서 BMP/Smad 신호전달의 중요한 표적이다. Id는 myoD 및 mash1와 같은 bHLH 인자의 전사 활성을 막기 위해 E 단백질을 격리하는 음성 헬릭스 루프 헬릭스(helix loop helix) 인자이며 (Jen et al., 1992; Lyden et al., 1999), 조혈의 음성 조절자에 대한 후보이다 (Nogueira et al, 200). 이는 또한 Pax 및 Ets 전사 인자와 상호작용하고, 저해할 수 있다 (Norton, 2000). 본 발명의 특정 구현예에서, Id로 트랜스펙션된 ES 세포는 LIF 단독의 첨가시 무혈청 배양에서 자가 재생하는데, 이는 BMP/Smad의 결정적인 기여가 Id 발현을 유도하는 것을 확립한다.
LIF 제거시, Id를 발현하는 ES 세포는 용이하게 분화하나, 신경 전구체를 야기하지는 않는다. 그리하여, Id 단백질은 계통 특이적인 방식으로 작용하며, 중배엽 또는 원시 내배엽 지정에 거의 또는 전혀 영향이 없이 신경 측정을 억제한다. 그러므로, Id는 STAT3에 의한 기타 계통의 봉쇄를 보충함으로써 자가 재생에 기여한다 (도 7). Id 기능의 적어도 부분은 조기에 발현된 신경-전구 인자의 작용을 봉쇄하는 것이다. Id는 그리하여 계통 프라이밍(priming)의 기능적 결과로부터 줄기 세포를 고립하기 위해 작용할 수 있다 (Hu et al., 1997).
LIF/STAT3 및 BMP/Smad는 그리하여 ES 세포 자가 재생을 지속하기 위해 조합하여 작용한다. 상기 2가지 경로는 또한 제노푸스(Xenopus) 배아의 복부화(ventralisation)를 매개한다 (Nishinakamura et al., 1999). 상기 경우에, 각각은 STAT3 및 Smad1 사이의 교차 조절의 증거 없이, 서로의 활성에 독립적으로 충분한 것 같다.
호메오도메인 단백질 나노그는 혈청 함유 배지에서 STAT3의 활성화에 대한 요건을 우회할 수 있다 (Chambers et al., 2003). 나노그는 또한 적어도 부분적으로 Id의 구성적 발현을 부여함으로써, BMP/혈청 자극에 대한 요건을 대체하기 위해 이용될 수 있다.
더욱 상세히, 하기 기재된 실시예를 참고하여, 도 1은 LIF + BMP가 무혈청 배지에서 ES 세포 자가 재생을 지속한다는 것을 보여준다:
A. 표시된 인자를 이용하여 N2B27에서 배양된 Oct4-GiP 세포의 위상차 및 형광 이미지. TuJ1 면역염색은 신경 분화를 검출하고, 녹색 형광은 미분화된 ES 세포에서 Oct4 프로모터의 활성을 반영한다. 막대: 50㎛
B. FCS + LIF 를 포함하는 통상적인 배지 또는 LIF(10ng/ml) + BMP4 (10/ng/ml)를 포함하는 N2B27에서 점진적인 계대 동안 누적 Oct4-GFP 양성 미분화된 ES 세포수의 플롯. 배양물을 세포 해리 완충액을 이용하여 48 시간마다 계대하였으며, 10cm2 웰당 4x105 세포로 재도말하였다. GFP 양성 세포의 수는 각 계대에서 FACS 분석에 의해 측정하였다.
C. (1) 6 계대 동안 LIF + BMP를 포함하는 N2B27에서 ES 세포, (2) LIF를 포함하는 혈청에서 배양된 ES 세포, (3) 8일 배상체 (4) 레틴산 처리를 한 8일 배상체에서 Oct4, 나노그, T (브라큐리(brachyury)), 및 Sox1 mRNA의 RT-PCR 분석.
도 2는 LIF + BMP를 포함하는 N2B27에서 ES 세포의 집락배양(clonogenicity), 효능 및 유도를 보여준다:
A. E14Tg2a 세포의 전기천공에 의해 분리된 CAG-taugfp 트랜스펙턴트(transfectant) 콜로니 및 퓨로마이신에서 선발.
B. 단일 CAG-taugfp 트랜스펙턴트 ES 세포 및 유도체 콜로니.
C. LIF + BMP를 포함하는 N2B27에서 6 계대 후에 TP6.3 ES 세포로부터 제조된 임신 중반 태아 키메라. GFP 형광은 ES 세포 자손을 표시한다.
D. C57BI/6 배우자 및 자손을 갖는 CAG-taugfp 트랜스펙션된 ES 세포 유래의 웅성 키메라. 기니아픽 코트 색은 자손의 ES 세포 기원을 나타낸다.
E. LIF + BMP을 포함하는 N2B27에서 유도된 제1 계대 SF1 ES 세포의 콜로니. 키메라를 SF1 ES 세포로부터 생성하였다.
막대: 50㎛
도 3은 ES 세포에서 BMP 신호전달을 보여준다:
A. (1) LIF + BMP를 포함하는 N2B27, 계대 6, (2) 혈청 + LIF, 역전사 대조군 없음, (3) 혈청 + LIF, (4) LIF 또는 BMP가 없는 N2B27에서 도말 후 1일, (5) LIF 또는 BMP가 없는 5일에 Oct-GiP 세포 유래의 RNA 시료의 역전사-PCR 분석
B. N2B27에서 밤새 배양 후 15분 또는 1시간 동안 모의 처리(non) 또는 LIF, BMP, 또는 LIF+BMP를 이용한 자극에 대한 Smad1, erk 및 p38 반응을 보여주는 면역블롯.
C. LIF, BMP, 및 LIF + BMP에 대한 STAT3 티로신 인산화 반응을 보여주는 면역블롯.
D. Smad7 에피좀 트랜스펙턴트는 분화하고, 혈청 및 LIF의 존재하에 신경 전구체(Sox-GFP) 및 뉴런(TuJ) 마커를 발현한다.
E. SB203580(30μM) p38 저해제는 LIF + BMP에서 자가 재생 또는 LIF 단독에서 신경 분화를 억제하지 않는다. Oct4-GFP는 미분화된 ES 세포를 나타내며, TuJ1 면역염색은 뉴런을 확인한다.
F. ES 세포에서 활성 Smad1 및 STAT3의 동시-면역침전. 좌측 패널: FLAG는 FLAG-태깅된 Smad1을 이용한 트랜스펙션에 따라 면역침전된다. 우측 패널: STAT3는 비조작된 ES 세포로부터 면역침전된다. 세포를 1시간 동안 표시된 바와 같이 자극하였다.
막대: 50㎛
도 4는 ES 세포에서 Id의 발현 및 기능을 보여준다:
A. LIF, BMP, 또는 LIF + BMP에 반응하여 유전자 유도의 LightCycler 역전사 PCR 분석. ES 세포를 N2B27 단독으로 밤새 배양한 후, 45분 동안 자극하였다.
B. Oct4-GiP 세포에서 Id mRNA 발현의 노던 혼성화. Con: 배지 + LIF를 포함하는 혈청에서 유지된 항정 상태(steady state) ES 세포. 레인 2- 11 세포는 인자 없이 N2B27에서 밤새 배양된 후, 45분 동안 지시된 바와 같이 자극됨. Fn, 피브로넥틴.
C. 벡터 단독으로 트랜스펙션되고, LIF를 포함하는 혈청 함유 배지에서 배양된 46C ES 세포에서 Id1 단백질의 항정 상태 수준, 및 Id1 및 fId1 안정한 삽입 클론에서 및 46C/T 세포의 에피좀 슈퍼트랜스펙션 후의 과발현. 후자 블롯은 단지 10초 동안 노출시켰다. 트랜스펙션된 Id1은 FLAG 태킹되어 있으므로, 내재하는 Id1과 비교하여 이동이 지연되었다.
D. N2B27 + LIF에 배양된 Id1 안정한 삽입 ES 세포 콜로니에서 나노그 및 Oct4 mRNA의 인 시투(In situ) 혼성화. 동등한 결과를 Id2 및 Id3 트랜스펙턴트를 이용하여 수득하였다. 막대: 50㎛.
도 5는 Id가 신경 분화를 억제하며, ES 세포 자가 재생에 필요하다는 것을 보여준다:
A. 첨가된 인자 없이 N2B27에서 6일 분화 후에 벡터 및 Id3 안정한 삽입 46C 클론의 위상차 및 GFP 형광 이미지. Id1 및 Id2 트랜스펙턴트는 신경 분화의 유사한 억제를 보여주었다.
B. 상단 패널: fId1 트랜스펙턴트 46C 세포는 LIF 단독을 포함하는 N2B27에서 자가 재생 콜로니를 형성한다. 중단 패널: Cre 절단 후에, fId1C 세포는 LIF에서 분화하며, ES 콜로니 형성을 위해 LIF + BMP를 요한다. 하단 패널: 플록싱된(floxed) Id1-STOP 카세트의 절단 후에 구성적 CAG 유닛에 의해 구동된 fId1C 콜로니에서 GFP 발현.
C. fId1 세포는 N2B27에서 LIF의 제거시 비-신경 분화를 겪으며, Sox1-GFP를 활성화하거나 또는 TuJ를 발현하지 않는다. Cre 절단 후에, fId1C 세포는 TuJ 양성 뉴런 세포의 회복된 분화를 보여준다 (Sox1-GFP는 GFP의 구성적 활성화로 인해 fldC 세포를 특이적으로 검출할 수 없다).
D. ES 세포에서 및 신경 분화 동안 mash1 및 ngn2 발현의 역전사 PCR 분석. 시료는 도 3A와 같다.
E. E47의 과발현은 증가된 Id1에 의해 구조될 수 있는 ES 세포 자가 재생을 막는다. 46C/T ES 세포를 E47을 이용하여 슈퍼트랜스펙션하거나 또는 E47 + Id1 에피좀 발현 벡터를 이용하여 동시 슈퍼트랜스펙션하고, LIF를 포함하는 혈청 함유 배지에서 이중 퓨로마이신 및 제오신 선발하에 6일 동안 배양하였다.
F. 증가된 E47은 신경 분화의 Id1 억제를 극복한다. 46C/T ES 세포를 E에서와 같이 슈퍼트랜스펙션하고, 트랜스펙션 후 24시간에, 첨가된 인자 없이 N2B27로 옮기고, 이중 선발 하에 6일 동안 배양하였다.
막대:50㎛
도 6은 나노그가 Id를 유도하기 위해 BMP/혈청에 대한 요건을 우회하는 것을 보여준다:
A. EF4C 세포를 N2B27에서 또는 N2B27 + BMP에서 6일 동안 배양하였다. EF4 나노그 트랜스펙턴트를 6 계대 동안 지시된 조건하에 배양한 후, 촬영하였다. 막대: 50㎛
B 및 C. 혈청 + LIF (Con)에서 또는 인자가 없는 N2B27에서 밤새 E14Tg2a 부모 ES 세포 및 EF4 나노그 트랜스펙턴트에서 Id1 및 Id3 mRNA의 노던 혼성화, 및 mRNA 수준.
도 7은 BMP/Id 및 LIF/STAT3에 의한 협력적인 계통 제한을 도식적으로 보여준다:
ES 세포 자가 재생은 계통 지정의 억제를 요한다. BMP 또는 기타 신호에 의해 유도된 Id 유전자는 그렇지 않으면 LIF/STAT3에 의해 단지 부분적으로 방해되는 신경 계통으로 진입을 봉쇄한다. 유사하게, 중배엽 및 내배엽 분화를 유도하는 BMP의 능력은 STAT3에 의해 제한되며, 아마도 직접 및 간접적인 기작이 관여된다. 그러므로, LIF의 제거는 자가 재생을 지지하는 것에서 계통 지정을 촉진하는 것으로 BMP 작용의 전환을 초래한다.
본 발명의 서열 목록에서, 하기 서열번호는 하기에 해당한다:
1: 마우스 Id3에 대한 아미노산 서열
2: 래트 Id3에 대한 아미노산 서열
3: 개 Id3에 대한 아미노산 서열
4: 인간 Id3에 대한 아미노산 서열
5: Tat 유래의 단백질 전달(transduction) 도메인
6: 안테나페디아 유래의 단백질 전달 도메인
7: Tat-인간 Id3 융합
8: 안테나페디아-인간 Id3 융합
9: 마우스 Id3-안테나페디아 융합
도 1은 LIF + BMP가 무혈청 배지에서 ES 세포 자가 재생을 지속한다는 것을 보여주며;
도 2는 LIF + BMP를 갖는 N2B27에서 ES 세포의 집락배양(clonogenicity), 효능 및 유도를 보여주며;
도 3은 ES 세포에서 BMP 신호전달을 보여주며;
도 4는 ES 세포에서 Id의 발현 및 기능을 보여주며;
도 5는 Id가 신경 분화를 억제하며, ES 세포 자가 재생에 필요하다는 것을 보여주며;
도 6은 나노그가 Id를 유도하기 위한 BMP/혈청에 대한 요건을 우회하는 것을 보여주며;
도 7은 BMP/Id 및 LIF/STAT3에 의한 협력적인 계통 제한을 보여준다.
소태아혈청은 최소 배지에서 미분화된 ES 세포의 생존에 중요하다 (Wiles and Johansson, 1999). 그러나, N2 및 B27 보충물을 포함하는 강화 기초 배지에서, ES 세포 생존율은 높은 상태이다 (Ying and Smith, 2003). 이는 LIF가 혈청 인자의 부재하에 자가 재생의 연속적인 사이클을 진행할 수 있는지 조사하는 것을 허용하였다.
N2B27 배지 단독에서, 부착성 ES 세포는 Sox1 양성 신경 전구체로 효율적으로 전환한다 (Ying et al., 2003). LIF는 상기 조건하에 신경 분화를 감소시키지만, 제거하지는 않는다. N2B27 배지 + LIF에 연속적인 계대시, 초기 증가에 이어, 미분화된 ES 세포수는 정체기에 도달한 후, 2-3 계대 후에 감소되기 시작한다는 것을 발견하였다. 상기 발견은 몇 가지 상이한 ES 세포주를 이용하여 재현되었다. 상기 배양에서 많은 세포는 신경 전구체 또는 미숙 뉴런의 형태를 가졌다.
신경 분화는 46C ES 세포에서 Sox1-GFP 신경 리포터의 활성화에 의해 확인되 었다 (Ying et al., 2003). 상기 관찰은 LIF/STAT3에 대한 부가적인 신호전달 경로가 ES 세포 자가 재생을 촉진하기 위해, 특히 신경 결정을 억제하기 위해 요구된다는 것을 나타낸다.
BMP는 척추동물 배아에서 주지된 항-신경 인자이며 (Wilson and Hemmati-Brivanlou, 1995; Wilson and Edlund, 2001), ES 세포의 신경 분화에 길항 작용하는 것으로 알려져 있다 (Tropepe et al., 2001; Ying et al., 2003). BMP는 단독으로 비-신경 운명으로 ES 세포의 분화를 촉진하므로(Johansson and Wiles, 1995; Wiles and Johansson, 1999; Ying et al., 2003), 후보 자가 재생 인자로서 초기에 나타날 것 같지 않다. 그러나, 우리는 BMP의 첨가가 LIF에 의한 동시 자극과 함께 분화의 저해에 기여할 수 있는지를 조사하였다. 우리는 LIF + BMP4 (또는 BMP2)의 조합이 N2B27에서 2 또는 3 계대 후에 미분화된 ES 세포의 매우 순수한 집단을 초래하는 자가 재생을 증진시킨다는 것을 발견하였다 (도 1A). 상기 배양은 이어서 성장 속도 또는 생존율에서 저하 없이 및 신경 분화 없이 복수의 계대 동안 확장될 수 있었다 (도 1 A, B). 상기 반응은 3개의 독립적인 유도에서 기원한 11개의 상이한 ES 세포주의 각각에서 관찰되었다. Oct4 양성 미분화된 세포 및 집단 배가 시간의 표시는 혈청 + LIF에서 수득된 것보다 현저하게 높았다 (도 1B). ES 세포 상태는 SSEA-1 및 알칼리 포스파타아제(미제시), 및 중배엽 (T) 및 신경외배엽(Sox1)의 마커의 부재하에 ES 세포 특이적인 전사 인자 나노그 및 Oct4에 대한 mRNA의 발현에 의해 확인되었다 (도 1C).
N2 및 B27 성분은 생존율을 개선하나, 자가 재생에 필수적이지는 않다. 단 지 트랜스페린으로 보충된 기초 배지에서, 자가 재생 및 미분화된 ES 세포 팽창은 LIF + BMP에 의해 복수 계대 동안 지속될 수 있었으나, LIF 단독에 의해서는 지속될 수 없었다. BMP에 대한 요건은 그러므로 B27에서 성분에 의해 유도되지 않는다.
우리는 BMP 상대적인 성장 및 분화 인자-6 (GDF-6)을 시험하였으며, LIF의 존재하에 ES 세포 자가 재생을 유사하게 지지한다는 것을 발견하였다 (도 1A). 이는 TGF-β 슈퍼패밀리의 일반적인 특징은 아니나, BMP 수용체 리간드에 제한된다. TGF-β1은 ES 세포에 대해 식별가능한 효과를 가지지 않는 반면, 액티빈은 생존율 및/또는 증식을 증가시켰으나, 분화를 억제하지는 않았다.
LIF + BMP에 의해 지지된 ES 세포 증식의 효율을 시험하기 위해, 전기천공 및 안정한 트랜스펙턴트의 선발을 수행하였다. tauGFP를 안정하게 발현하는 콜로니를 용이하게 분리하였으며(도 2A), 유전자 조작 프로토콜에서 상기 무혈청 시스템을 이용하는 가능성을 증명하면서 벌크 배양으로 증폭할 수 있었다.
분리된 ES 세포의 자가 재생을 이어서 조사하였다. 단일 ES 세포를 단지 LIF 또는 LIF + BMP4의 첨가와 함께 N2B27에서 96-웰 플레이트로 옮겼다 (도 2B). LIF 단독의 존재하에 형성된 단일 콜로니는 고비율의 분화된 세포를 포함하였으며, 추가로 팽창할 수 없었다. 대조적으로, 미분화된 콜로니가 LIF + BMP4에서 12/192 웰에서 형성되었으며, 이 중에서 10개가 혈청 없이 증폭되었다 (표).
LIF + BMP에서 배양된 ES 세포는 복수의 세대 후에 2배체 염색체 보체(complement)를 유지하였다. 이는 또한 분화 잠재력을 보유하였다. LIF 및 BMP 양자의 제거는 신경 분화를 초래하였다. BMP의 보유와 함께 LIF의 제거는 평평해진 상피 유사 세포의 시트로 분화를 야기하였다. 그리하여, BMP에 대한 자가 재생 반응은 연속적인 LIF 신호전달에 의존한 상태로 있다.
마우스 ES 세포의 결정적인 기능적인 특성은 배아 발생으로 다시 들어가서, 키메라 마우스에서 분화된 조직의 완전한 레퍼토리에 기여하는 능력이다. 우리는 3 주 동안 LIF + BMP를 포함하는 N2B27에서 증식 후에 마우스 포배 내로 GFP 리포터 ES 세포를 주입하였다. 임신 중기에 분석은 다양한 조직에 높은 ES 세포 기여를 갖는 수 개의 키메라를 확인하였다 (도 2C). 더욱 엄격한 시험으로서, 우리는 taugfp로 트랜스펙션된 ES 세포를 이용하였으며, LIF + BMP에서 선발하고, 팽창하였다. 살아서 태어난 키메라를 수득하였으며, 2개의 웅성 동물은 ES 세포 게놈을 전달하였다 (도 2D).
공급자 또는 혈청이 없는 ES 세포의 유도
우리는 BMP에 대한 반응이 배양에 대한 확립된 ES 세포의 적응인지 또는 ES 세포 유도의 초기 단계 동안 자명한지를 조사하였다. 우리는 BMP + LIF로 보충된 N2B27에서 포배를 도말하였다.
며칠 후에, 팽창된 속세포덩이(ICM)가 해리되었으며, 동일한 배양 조건으로 재도말하였다. 초기 시도에서, ES 세포 콜로니는 ES 세포 유도에 대한 표준 적기인 배양에서 5-6일 후에 ICM 해리에 따라 수득되지 않았다 (Nichols et al., 1990; Robertson, 1987). 그러나, 혈청의 부재 및 BMP의 존재하에, ICM은 감소된 성장 및 명백한 분화의 더욱 신속한 개시를 나타낸다. 그러므로, 우리는 이어서 LIF 단 독에서 포배 배양의 단지 4일 후에 ICM을 해리하였으며, 재도말시 BMP를 첨가하였다. 상기 조건하에, 일차 ES 세포 콜로니가 형성되었다 (도 2E).
이를 형태학적으로 미분화된 ES 세포로서 계대하고, 팽창할 수 있었다. 하나의 라인(SF1)을 추가로 규명하였다. LIF 및 BMP의 제거시, SF1 ES 세포는 시험관 내에서 신경 분화를 겪었다. 더욱이, SF1 세포는 광범위하게 키메라 마우스를 제조하였다 (도 2F). 12개의 키메라는 모두 웅성이었으며, 이는 매우 기여하는 XY ES 세포에 의한 성 전환을 나타낸다 (Bradley et al., 1984).
그리하여, 우리는 gp130 신호전달 및 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체로부터 하류 신호전달의 활성화제의 존재하에 재도말된 세포를 배양함으로써, 본 발명에 따라 ES 세포를 유도하였다.
미분화된 ES 세포는 기능성 BMP 신호전달 기구를 발현한다.
LIF + BMP 배양에서 단일 세포 클로닝 및 분화의 거의 완전한 부재는 BMP의 효과가 분화된 자손을 통해 매개되는 것보다 오히려 ES 세포에 직접 영향을 미칠 것 같다는 것을 제안하였다. 그러나, ES 세포 분화 동안 BMP 수용체 발현 및 BMP 반응성을 보고한 이전의 연구 (Adelman et al., 2002; Hollnagel et al., 1999)는 미분화된 상태의 ES 세포가 실제로 BMP에 반응할 수 있는지를 확립하지 않았다. 이를 확인하기 위해, Oct4 트랜스진의 활성에 대한 선발을 이용하여(Ying et al., 2002) RNA 및 단백질 분석을 위한 미분화된 세포를 정제하였다.
BMP는 유형 I 및 유형 II 세린/트레오닌 키나아제 수용체의 이형이합체를 통해 작용한다 (Shi and Massague, 2003). 미분화된 ES 세포는 유형 I Bmprlb mRNA 를 거의 또는 전혀 보여주지 않으나, 유형I Bmprla 및 유형 II Bmprll 수용체 mRNA 양자를 발현한다 (도 3A). BMP4 및 GDF6 전사체는 또한 미분화된 ES 세포에서 용이하게 검출가능하다. BMP 수용체의 하류의 주요한 효과기는 Smad 전사 인자이다 (Attisano and Wrana, 2002; von Bubnoff and Cho, 2001). R-Smad 1, 5 및 8은 활성 BMP 수용체 복합체로 동원되고, 상기 복합체에 의해 인산화된 후, Smad4와 조합되고, 핵으로 이동한다. 우리는 Smad1의 활성 세린 인산화된 형태에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역블롯팅에 의해 Smad 활성화를 조사하였다. 미분화된 ES 세포에서 Smad1의 증가된 인산화는 BMP4 첨가 후에 명백하다 (도 3B). BMP 자극은 또한 p38 및 1시간까지 erk 유사분열물질 활성화된 단백질 키나아제의 기본 활성화를 증진시킨다 (도 3B). 상기 데이타는 미분화된 ES 세포가 BMP 자극에 대한 반응성에 대한 신호 전달 기구를 가지며, 더욱이 BMP4 및 GDF 생성을 통해 자가분비 자극에 대한 잠재성을 가질 수 있다는 것을 확립한다.
BMP는 Smad 활성화를 통해 자가 재생을 지지한다.
LIF의 자가 재생 작용은 전사 인자 STAT3를 통해 매개된다 (Matsuda et al., 1999; Niwa et al., 1998). BMP 단독은 티로신 705의 인산화에 의해 측정된 STAT3를 활성화시키지 못한다 (도 3C). 또한, LIF에 의한 STAT3 활성화를 증가시키지 못한다. gp130의 하류의 Erk 활성화는 ES 세포 자가 재생에 요구되지 않으나, 분화 전 신호인 것 같다 (Burdon et al., 1999a). 그리하여, 감소된 erk 활성은 ES 세포 유도를 촉진하며 (Buehr and Smith, 2003), 자가 재생을 촉진한다 (Burdon et al., 1999b). LIF에 대한 반응에서 Erk 활성화는 그러나 BMP의 존재에 의해 인식 할 수 있게 저해되지는 않았다 (도 3B). 상기 데이타는 BMP가 ES 세포에서 gp130 신호 전달을 조절하지 않는다는 것을 나타내는데, 이는 BMP 신호전달 경로가 자가 재생에 직접 기여한다는 것을 의미한다.
우리는 저해성 Smad 패밀리 멤버인 Smad6 및 Smad7 (Shi and Massague, 2003; von Bubnoff and Cho, 2001)를 BMP 신호전달에 길항 작용하기 위해 ES 세포 내로 도입하였다. 세포를 트랜스펙션하고, 혈청 및 LIF의 존재하에 퓨로마이신 선발하에 키웠다. Smad6 또는 Smad7 발현 벡터는 빈 벡터를 이용한 트랜스펙션과 비교하여 수가 더 적고, 크기가 더 적은 ES 세포 콜로니를 제조하였다. 더욱이, Smad6 및 심지어 더 Smad7 트랜스펙턴트는 계대 후에 불량하게 팽창하였다. 높은 수준의 분화는 트랜스펙션된 세포 집단에서 명백하였다. 신경 분화는 부착성 배양에서 혈청에 의해 정상적으로 억제되었으나, Smad7 트랜스펙션 후에 용이하게 명백하였다 (도 3D).
Smad 활성을 봉쇄하는 것 외에, Smad6/7은 또한 BMPR의 하류의 TAK/p38 경로를 저해할 수 있다 (Kimura et al., 2000). ES 세포에서 p38의 잠재적인 기여를 평가하기 위해, 우리는 특이적인 저해제 SB203580를 이용하였다 (Cuenda et al., 1995). 상기 시약은 자가 재생을 지지하는 BMP의 능력에 주목할만한 효과를 주지 않았다 (도 3E). LIF 단독으로, SB203580는 자가 재생 및 신경 분화 사이의 균형을 변경하지 못하였으나, 전체 세포 생존율을 증진시키는 것 같으며, 이는 기타 세포 유형에서처럼 ES 세포에서 p38이 프로-아폽토시스라는 것을 제안한다 (Kimura et al., 2000). Smad 경로는 그러므로 자가 재생 신호의 그럴듯한 변환기이다.
Smad 및 STAT3 사이의 협력적인 전사 조절 기작은 신경상피 세포에서 규명되었다 (Nakashima et al., 1999; Sun et al., 2001). 이는 편재하는 전사 동시 활성화제 p300에 의해 매개되는 3성분 복합체의 형성을 포함하며, 아교세포 특이적인 프로모터의 상승적인 활성화를 초래한다. 우리는 STAT3 및 Smad를 포함하는 복합체가 LIF + BMP를 이용하여 촉진된 ES 세포에서 형성될 수 있는지를 조사하였다.
FLAG-태깅된 Smad1을 이용한 트랜스펙션에 이은 면역침전은 활성화된 STAT3 및 Smad1이 동시 배치될 수 있다는 것을 나타내었다 (도 3F). 상기 결론은 LIF + BMP 촉진에 이은 내재하는 인산화된 Smad1 및 STAT3의 동시 면역침전에 의해 확인되었다 (도 3F).
ES 세포에서 BMP 표적 유전자.
ES 세포 자가 재생을 달성하기 위해, BMP/Smad 및 LIF/STAT3 신호전달은 별개의 표적 유전자 상에 유사하게 작동할 수 있고/있거나 예를 들면 p300과 3성분 복합체를 통해, 공통의 표적 유전자 상에 집중될 수 있다. 우리는 Oct 선발된 ES 세포에서 LIF, BMP, 또는 LIF + BMP에 의한 유도를 위한 후보 유전자를 조사하기 위해 실시간 RT-PCR을 이용하였다 (도 4A). 2개의 공지된 LIF 표적인 tis11 및 c-fos는 BMP에 대한 반응을 보여주지 않았다. 2개의 다른 junB 및 특히 socs3 는 BMP의 존재하에 LIF에 의해 매우 유도되는 것 같다. 상기 데이타는 STAT3 표적 유전자의 서브세트가 BMP를 이용한 동시 자극에 반응성일 수 있다는 것을 제안한다. 그러나, JunB 또는 Socs3 어느 것도 자가 재생의 효과기에 대한 후보가 아니며; junB 없는 ES 세포는 결함을 보여주지 않으며(Schorpp-Kistner et al., 1999), SOCS3는 과발현될 때 자가 재생을 막는 gp130 신호전달의 음성 피드백 조절자로서 기능한다 (Schmitz et al., 2000).
우리는 또한 음성 bHLH 인자를 코딩하는 Id 유전자의 발현을 조사하였으며, 신경상피 세포 (Nakashima et al., 2001) 및 C2C12 근육모세포 (Lopez-Rovira et al.,2002)에서 BMP/Smad에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. BMP에 의한 Id mRNA 유도는 또한 분화하는 ES 세포 배양에서 보고되었다(Hollnagel et al., 1999). 우리는 Id1 및 Id3가 BMP (및 GDF, 데이타 미제시)에 의해 강하게 유도되나, LIF에 의해 유도되지 않는다는 것을 발견하였다 (도 4A). 노던 혼성화는 상기 발견을 확인하였으며, 이를 Id2로 확장하였다 (도 4B). 액티빈 (데이타 미제시) 또는 TGF-β1 어느 것도 Id 유전자 발현을 유도하지 않았는데, 이는 상기 반응이 BMP 수용체의 하류의 Smad에 특이적이라는 것을 나타낸다.
Id 유전자는 또한 BMP에 의해 더 적은 정도로 유도되지만, 소태아혈청 및 피브로넥틴에 의해 유도된다 (도 4B). 혈청에서 배양된 ES 세포는 용이하게 검출가능한 항정 상태의 양의 Id mRNA를 보여준다. 우리는 Id2 및 Id3를 유도하는 피브로넥틴이 N2B27 배양물에서 BMP를 대체할 수 있는지를 조사하였다. LIF와 조합된 가용성 피브로넥틴은 BMP에서보다 더 많은 분화 및 더 느린 집단 팽창이 있지만, 적어도 10 계대 동안 미분화된 Oct4-GiP 세포를 팽창할 수 있었다.
구성적인 Id는 ES 세포 자가 재생에 대한 BMP 또는 혈청 요건을 우회한다.
우리는 Id 유도가 STAT3의 자가 재생 활성을 보충하기 위해 신경 분화의 특정 제한을 제공할 수 있다고 가정하였다. 따라서, 우리는 Id1, Id2 및 Id3에 대한 발현 구축물을 제조하였으며, 상기 구축물을 ES 세포 내로 도입하였다. 콜로니를 에피좀 슈퍼트랜스펙션 및 통상적인 안정한 혼입 양자에 의해 용이하게 회수하였다. Id1에 대해, 증가된 단백질 발현은 면역블롯팅에 의해 확인되었다 (도 4C). 트랜스진의 과발현은 내재하는 Id1 단백질의 감소와 관련되는 것 같으며, 이는 피드백 또는 자가조절 루프의 작동을 의미한다.
강제적인 Id 발현은 혈청의 존재하에 ES 세포 자가 재생을 손상시키지 않고, 분화를 막지도 않는다. 상기 조건하에, 트랜스펙턴트는 부모 ES 세포 또는 빈 벡터 트랜스펙턴트와 명백하게 상이하지는 않다. 대조적으로, 무혈청 N2B27에서, LIF 의존성으로 남아 있는 동안 Id 트랜스펙턴트는 BMP에 대한 요건으로부터 해방되었다. 상기 세포는 LIF + BMP에서 부모 ES 세포처럼 신속하게 및 적은 분화로 LIF 단독에서 증식하였다. 상기 배양은 미분화된 형태 또는 인자 의존성에 변화 없이 복수회 계대할 수 있었다. ES 세포 표현형은 Oct4 및 나노그 mRNA의 발현에 의해 확인되었다 (도 4D). 혈청 또는 BMP/GDF를 대체하는 Id 발현의 능력의 엄격한 시험으로서, 우리는 N2B27에 단일 세포를 도말하였다. 미분화된 계대가능한 콜로니가 LIF + BMP에서 분리된 세포로부터 콜로니 형성과 필적할만한 빈도(10%)로 LIF 단독에서 형성되었다 (표).
Id 단백질은 ES 세포 분화에 대해 계통 특이적인 봉쇄를 한다.
우리의 배양에서, LIF는 Id가 ES 세포 분화에 완전한 봉쇄를 가하지 않기 때문에, Id 트랜스펙턴트의 자가 재생에 필수적이다. LIF가 혈청 함유 배지에서 제거된다면, Id 트랜스펙턴트 세포는 부모 ES 세포처럼 분화한다.
부착성 배양에서, 이는 일부 섬유모세포와 함께 대개 평평해진 상피 유사 세포를 생성하였다. 응집시, 이는 중배엽 (T) 및 내배엽 (Hnf4) 마커 발현의 활성화와 함께 배상체를 형성하였으며 (데이타 미제시), 심근세포 분화의 표시인 자발적인 수축성을 나타내었다. 그러나, LIF의 부재하에 N2B27에서, Id 트랜스펙턴트는 기타 ES 세포와 상이하게 행동하였다. 형태 및 Sox1-GFP의 활성에 의해 평가된 신경 분화는 최소이었다 (도 5A). 대신에, 트랜스펙턴트는 BMP 단독에 노출된 부모 ES 세포와 유사한, 평평한 상피모양 세포의 시트로 분화하였다 (도 1A 참고).
우리는 신경 분화의 자가 재생 및 봉쇄가 연속적인 Id 발현에 의존하는지를 시험하기 위해 복귀가능한 발현 구축물을 제조하였다. 우리는 플록싱된(floxed) Id1(fId1 세포)를 발현하는 46C ES 세포를 생성하였으며, 이어서 Id1 트랜스진이 잘린 Cre 처리된 유도체 클론(fId1C)를 생성하였다. Cre 절단 후에, fId1C 세포는 FLAG-Id1의 부재 및 내재하는 Id1의 회복된 수준을 부여준다 (도 4C). fId1 및 fId1C 세포를 LIF 또는 LIF + BMP를 포함하는 N2B27에서 클론 밀도로 도말하였다. fId1 세포는 LIF 단독에서 줄기 세포 콜로니를 효율적으로 형성하였으나, 상기 능력은 BMP 없이 LIF에서 단지 분화된 세포를 생성한 fId1C 세포에서 상실되었다 (도 5B). N2B27 단독으로, fId1 세포는 비-신경 분화를 경험한 반면, fId1C 세포는 고비율의 TuJ 양성 뉴런을 생성하면서 부모 ES 세포와 동일한 방식으로 행동하였다 (도 5C).
상기 관찰은 Id 발현이 특이적으로 신경 계통 지정을 봉쇄하고, 분화하는 ES 세포를 LIF의 부재하에 BMP 처리에 대해 관찰된 대안적인 운명으로 전환한다는 것 을 나타낸다 (Ying et al., 2003). Id를 발현하는 ES 세포는 그리하여 비신경 계통 지정의 저해 및 다능성의 유지를 위해 LIF/STAT3에 전적으로 의존한다.
신경성 bHLH 전사 인자는 발생하는 CNS에서 Id 단백질에 의해 길항 작용하는 것으로 알려져 있다 (Lyden et al., 1999). 생체 내에서, 상기 bHLH 인자는 신경관형성 전에 보고되지 않았다. 그러나, 배양된 ES 세포는 분화하는 계통에서 단지 발견되리라 예상되는 mRNA의 발현을 보여준다 (Ramalho-Santos et al., 2002). 그러므로, 우리는 Oct4 선발된 ES 세포에서 2개의 bHLH 유전자, mash1 및 neurogenin2의 잠재적인 발현을 조사하였다. neurogenin2 mRNA가 백그라운드 수준 이상으로 검출가능하지 않지만, mash1 mRNA는 비교적 풍부한 것 같다 (도 5D). 우리는 그러므로 Id 발현이 mash1 및 기타 신경 전구 bHLH 인자의 조숙한 발현에 의해 야기된 ES 세포의 연속적인 신경 분화를 막는데 필요할 수 있다는 것을 제안한다. 상기 작용은 또한 비-bHLH 파트너, 예를 들면, Pax 및 Ets 인자를 포함할 수 있다 (Norton, 2000).
Id 단백질은 높은 결합력으로 편재하는 HLH 인자인 E 단백질에 결합한다 (Norton, 2000). 이 중의 하나의 과발현은 다른 것의 활성을 격리하고 봉쇄할 것이다. Id 단백질이 정상적으로 ES 세포 증식에 필요한지를 평가하기 위해, 우리는 단독으로 또는 Id1 또는 Id3과 동시 트랜스펙션으로 에피좀 슈퍼트랜스펙션에 의해 E47 단백질을 과발현하였다. 단독으로 또는 빈 벡터와 동시 트랜스펙션에서 E47은 수가 적고, 매우 작으며, 병든 콜로니를 생성하였다 (도 5E). 대조적으로, 건강한 ES 세포 콜로니가 E47 및 Id 벡터의 동시 트랜스펙션으로부터 생성되었다. 동시 트랜스펙턴트 콜로니는 혈청 함유 배지에서 Id 단독 또는 빈 벡터로 트랜스펙션된 세포와 구별이 어려운 것 같았다. 이는 증가된 E47이 본질적으로 독성이 아니나, Id의 격리로 인해 특이적인 성장 저해 작용을 갖는다는 것을 제안한다. 특정 수준의 유리 Id는 기타 세포 유형에서 관찰된 바와 같이 ES 세포 증식에 필요할 수 있다 (Norton, 2000). LIF 또는 BMP 없는 N2B27에 옮길 때, 동시 트랜스펙턴트는 Sox1-GFP의 활성화에 의해 보여준, 비신경 분화보다 오히려 신경 분화를 경험하였다 (도 5F). 그리하여, E47은 Id의 신경 억제 효과를 중화한다. 이는 Id가 신경전구 bHLH 인자와 제휴하기 위한 E 단백질의 유용성을 제한하기 위해 작용하는 제안과 일치한다.
나노그는 BMP 또는 혈청에 대한 요건을 우회할 수 있다.
증가된 수준의 변이체 호메오도메인 단백질 나노그는 혈청의 존재하에 ES 자가 재생을 LIF/STAT3와 독립적이게 한다 (Chambers et al., 2003). 우리는 LIF 및/또는 BMP가 N2B27에서 ES 세포를 과발현하는 나노그의 자가 재생에 요구되는지를 조사하였다. 도 6A는 플록싱된(floxed) 나노그 트랜스진을 발현하는 EF4 세포가 LIF 또는 BMP 없이 N2B27에서 증식될 수 있다는 것을 보여준다. 상기 양상은 나노그 트랜스진이 Cre 재조합효소에 의해 절단된 유도체 EF4C 세포가 급격하게 신경 분화를 경험하기 때문에, 나노그에 직접 기인가능하다. BMP 단독의 첨가는 일부 분화가 명백하게 될 때 6일 이상 동안 계대 없이 배양이 유지되지 않는다면, EF4 세포에 명백한 효과를 가지지 않는다 (논의 참고). BMP의 존재 또는 부재하에 LIF의 첨가시, EF4 세포는 배양 접시에 더욱 균일하게 부착하며 (도 6A), 집단 배가 속도가 증가한다. 이는 ES 세포에서 LIF/STAT3 및 나노그의 조합 효과의 이전 표시와 일치한다 (Chambers et al., 2003).
나노그는 BMP 또는 혈청 자극을 불필요하게 하기 때문에, 우리는 EF4 세포가 Id를 발현하는지를 조사하였다. LIF 또는 BMP 없는 N2B27에서 밤새 배양 후에, Id1 및 Id3의 발현은 부모 E14Tg2a 세포에서 현저하게 하향 조절되었다. 대조적으로, EF4 세포에서 Id1 mRNA는 여전히 인식가능하지만 감소되었으며, Id3 mRNA는 실제로 증가되었다 (도 6B). 그리하여, 나노그의 과발현은 Id 발현의 실제적인 수준을 구성적으로 유지하기 위해 이용될 수 있다.
실험 절차
ES 세포 배양
ES 세포를 공급자 세포 없이 유지하였다. 무혈청 배양을 위해, ES 세포를 10ng/ml LIF (Sigma) 및 10ng/ml BMP4 또는 200ng/ml GDF6 (R & D Systems)로 보충된 N2B27 배지에서 젤라틴 코팅된 플레이트 상에서 도말하였다 (Ying and Smith, 2003). 세포를 무효소 세포 해리 완충액(Invitrogen) 또는 0.025% 트립신/1% 병아리 혈청을 이용하여 2-4일 마다 계대하였다. 해리된 세포를 N2B27에서 수확하고, 펠렛팅하였다. 상층액을 흡입하고, 세포 펠렛을 N2B27에서 재현탁하고, 직접 재도말하였다. 단일 세포 클로닝을 위해, N2B27로 미리 적재된 미세하게 뽑은 파스퇴르 피펫을 이용하여 10㎕ 방울로 개개의 세포를 취하였다. 방울을 이어서 LIF 또는 LIF + BMP4를 포함하는 웰당 150㎕ N2B27로 미리 적재된 96 웰 플레이트에 하나 씩 옮겼다. 8일 후에, ES 세포 콜로니를 확인하고 계대하였다. 키메라를 생성하기 위해, ES 세포를 C57BI/6 포배 내에 주사하였다. 생식세포 전달을 웅성 키메라와 C57BI/6 자성을 교배함으로써 시험하였다.
무혈청 배지에서 ES 세포의 유도
세포주 129 마우스를 임신 3일째 난소를 절개하고, 휴면기의 배아를 4일 후에 씻었다 (Nichols et al., 1990). 본래의 포배를 LIF(10ng/ml)로 보충된 N2B27에서 젤라틴 코팅된 플라스틱 상에서 도말하였다. 3-6일 후에, 각 체외이식조직의 중앙 덩어리를 취하고, PBS에 세정하고, 수 분 동안 트립신 방울에 위치하였다. 세포 덩어리를 트립신의 최소 전달을 확신하는 배지로 미리 적재된 미세하게 뽑은 파스퇴르 피펫에 취하고, LIF 및 BMP4(10ng/ml)로 보충된 N2B27에서 신선한 웰로 부드럽게 분쇄하면서 내보냈다. 생성된 일차 ES 세포 콜로니를 96 웰 플레이트의 웰에 개별적으로 계대하였다. 그 후에, 세포를 재도말 전에 원심분리 및 흡입과 함께 전체 배양물의 트립신 처리에 의해 팽창시켰다.
RNA 분석
Oct4GiP ES 세포 (Ying et al., 2002)를 분화된 세포를 제거하기 위해 4-6일 동안 퓨로마이신의 존재하에 배양하였다. 정제된 ES 세포를 완전 배지 + LIF에서 24시간 동안 배양한 후, PBS로 1회 세정하고, 20ng/ml LIF, 50ng/ml BMP4, LIF + BMP4, 10ng/mlTGF-β1 (모두 R & D Systems) 또는 15% FCS를 이용하여 45분 동안 자극 전에 밤새 N2B27 배지로 옮겼다. 정량적인 RT-PCR을 LightCycler 기구(Roche)를 이용하여 수행하였다. 데이타를 Oct4 증폭에 대해 표준화하였다. 프 라이머 쌍 및 반응 조건은 요구시 유용하다. 노던 혼성화를 총 RNA의 5㎍ 분취량에서 수행하였다.
플라스미드 구축 및 트랜스펙션
Smad6 및 Smad7 플라스미드는 Hitoshi Niwa에 의해, FLAG-태깅된 Id1은 Tetsuya Taga에 의해 친절하게 제공받았다. 마우스 Id2, Id3 및 E47 개방형 해독틀(ORF)을 PCR에 의해 증폭하고, pCR2.1 내로 클로닝하고, 서열 분석에 의해 돌연변이가 없다는 것을 확인하였다. 발현 벡터를 ES 세포 내로 에피좀으로 또는 안정한 삽입에 의해 도입하였다. 플록싱된 Id1 및 Cre-절단된 유도체 ES 세포주를 Chambers et al., 2003에 기재된 전략을 이용하여 유도하였다.
면역화학
미리 선발된 Oct4GiP ES 세포를 15분 또는 1시간 동안 LIF (20ng/ml), BMP4 (50ng/ml) 또는 LIF + BMP4를 이용하여 자극 전에 밤새 N2B27 배지로 옮겼다. 인산화된 stat3, smad1, erk1/2 및 p38을 면역블롯팅에 의해 검출하였다 (세포 신호전달 기술). 세포 용해 및 면역침전 (Nakashima et al., 1997)은 항-FLAG (Sigma) 또는 항-Stat3 (Transduction Labs)을 이용하였다. 면역염색을 기재된 바와 같이 수행하였다 (Ying et al., 2003).
참고문헌
Figure 112006026131249-PCT00001
Figure 112006026131249-PCT00002
Figure 112006026131249-PCT00003
Figure 112006026131249-PCT00004
Figure 112006026131249-PCT00005
Figure 112006026131249-PCT00006
Figure 112006026131249-PCT00007
Figure 112006026131249-PCT00008
[표]
Id 트랜스펙션 후에 LIF + BMP 또는 LIF 단독을 포함하는 무혈청 배지에서 단일 ES 세포의 증식
부모 ES 세포 Id1 트랜스펙턴트
LIF LIF + BMP4 LIF LIF + BMP4
취한 단일 세포수 96 192 192 192
8일에 형성된 콜로니수 1 12 19 22
팽창된 콜로니수 0 10 16 20
SEQUENCE LISTING <110> University of Edinburgh <120> Improved Control Of ES Cell Self Renewal And Lineage Specification, And Medium Therefor <130> P37821WO <140> PCT/GB2004/004401 <141> 2004-10-15 <150> GB 0324270.8 <151> 2003-10-16 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Thr Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 35 40 45 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 50 55 60 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 65 70 75 80 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 85 90 95 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Thr Pro Glu Leu Val Ile Ser Lys 100 105 110 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 2 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ala Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 35 40 45 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 50 55 60 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 65 70 75 80 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 85 90 95 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Thr Pro Glu Leu Val Ile Ser Lys 100 105 110 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His 115 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Canis sp. <400> 3 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Gly Pro 20 25 30 Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 35 40 45 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 50 55 60 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 65 70 75 80 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 85 90 95 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Ala Pro Glu Leu Val Ile Ser Asn 100 105 110 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Gly Pro 20 25 30 Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 35 40 45 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 50 55 60 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 65 70 75 80 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 85 90 95 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Ala Pro Glu Leu Val Ile Ser Asn 100 105 110 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His 115 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Antennapedia <400> 6 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Lys Ala Leu Ser 1 5 10 15 Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys Leu Ser Glu Arg Ser 20 25 30 Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Gly Pro Ala Ala Glu Glu Pro 35 40 45 Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr Ser Arg Leu Arg Glu 50 55 60 Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu Ser Gln Val Glu Ile 65 70 75 80 Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu Gln Val Val Leu Ala 85 90 95 Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His Leu Pro Ile Gln Thr 100 105 110 Ala Glu Leu Ala Pro Glu Leu Val Ile Ser Asn Asp Lys Arg Ser Phe 115 120 125 Cys His 130 <210> 8 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 20 25 30 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Gly Pro 35 40 45 Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 65 70 75 80 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 85 90 95 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 100 105 110 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Ala Pro Glu Leu Val Ile Ser Asn 115 120 125 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His 130 135 <210> 9 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 9 Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Arg Gly Cys Tyr Glu Ala Val Cys Cys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Ser Leu Ala Ile Ala Arg Gly Arg Gly Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Thr Glu Glu Pro Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Asn His Cys Tyr 35 40 45 Ser Arg Leu Arg Glu Leu Val Pro Gly Val Pro Arg Gly Thr Gln Leu 50 55 60 Ser Gln Val Glu Ile Leu Gln Arg Val Ile Asp Tyr Ile Leu Asp Leu 65 70 75 80 Gln Val Val Leu Ala Glu Pro Ala Pro Gly Pro Pro Asp Gly Pro His 85 90 95 Leu Pro Ile Gln Thr Ala Glu Leu Thr Pro Glu Leu Val Ile Ser Lys 100 105 110 Asp Lys Arg Ser Phe Cys His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn 115 120 125 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 130 135

Claims (55)

  1. 배양에서 다능성(pluripotent) 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때, Id 유전자 산물의 용도.
  2. 제 1 항에 있어서,
    Id 유전자 산물과 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 조합의 용도.
  3. 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때,
    (i) Id 단백질 발현 또는 활성을 증가시키는 물질; 및
    (ii) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 조합의 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제는 LIF인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다능성 세포는 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 배아 줄기 세포는 마우스 세포 또는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질 (i)은 피브로넥틴, 피브로넥틴 수용체의 작용제, 인테그린 신호전달의 활성화제, 나노그(nanog), 및 Id 유전자 발현 또는 Id 단백질 활성을 유도하는 전술한 모든 유사체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Id 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Id 유전자를 발현하도록 다능성 세포를 유전적으로 조작하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Id 유전자를 포함하는 벡터를 다능성 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Id 유전자 산물이 Id 단백질인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 하기 단계를 포함하는, 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시키는 방법:
    (1) 세포에서 Id 유전자를 발현 또는 Id 유전자의 발현을 유도하는 단계, 또는 Id 단백질을 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계, 및 (2) GP130 하류 신호전달을 활성화시키는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서,
    세포에서 에피좀으로(episomally) Id 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    유도성 프로모터를 포함하는 에피좀 벡터로부터 Id 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    gp130을 통해 작용하는 시토카인을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 gp130 하류 신호전달을 촉진하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 시토카인이 LIF, CNTF, 카디오트로핀, 온코스타틴 M 및 IL-6 + sIL-6 수용체의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 배양에서 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때,
    (a) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기(effector); 및
    (b) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 조합의 용도.
  18. 하기를 포함하는 배지에서 ES 세포를 유지하는 것을 포함하는 ES 세포 자가 재생을 촉진시키기 위한 ES 세포의 배양 방법:
    (a) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 단백질 또는 Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및
    (b) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
  19. 하기 단계를 포함하는, ES 세포의 배양 방법:
    (a) gp130 및 혈청 또는 혈청 추출액을 통해 작용하는 시토카인의 존재하에, 임의로 공급자(feeder) 상에, 배양에서 다능성 상태로 ES 세포를 유지하는 단계;
    (b) 1회 이상 ES 세포를 계대하는 단계;
    (c) 상기 배지로부터 혈청 또는 혈청 추출액 및 존재한다면 공급자를 제거하 여, 배지에 공급자, 혈청 및 혈청 추출액이 없는 단계; 및
    (d) 이어서 하기의 존재하에 다능성 상태로 ES 세포를 유지하는 단계:
    (i) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및
    (ii) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
  20. 하기 단계를 포함하는, ES 세포의 트랜스펙션된 집단을 수득하는 방법:
    (a) ES 세포에서 우선적으로 선택성 마커를 발현시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택성 마커를 코딩하는 구축물로 ES 세포를 트랜스펙션하는 단계;
    (b) 상기 ES 세포를 도말하는 단계;
    (c) 상기 ES 세포를 (i) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 활성화제 이외의, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및 (ii) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제의 존재하에 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 선택성 마커를 발현하는 세포를 선발하는 단계.
  21. 모두가 단일 ES 세포의 자손인 ES 세포의 클론 집단을 수득하기 위해,
    배양 용기에 개개의 ES 세포를 옮기는 단계, 및 하기의 존재하에 ES 세포를 배양하는 단계를 포함하는, ES 세포의 배양 방법:
    (a) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 유전자 발 현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기; 및
    (b) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제.
  22. 하기 단계를 포함하는, 비-신경외배엽 운명으로 ES 세포의 분화를 유도(direct)하는 방법:
    (a) gp130을 통해 작용하는 시토카인 및 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기의 존재하에 ES 세포를 유지하는 단계; 및
    (b) 시토카인을 제거하는 반면,
    (c1) Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기를 유지하는 단계; 및/또는
    (c2) 분화를 유도할 수 있는 추가의 신호전달 분자를 첨가하는 단계.
  23. 하기를 포함하는, ES 세포의 자가 재생용 배지로서:
    (1) 기초 배지;
    (2) TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 유전자 발현 및/또는 Id 단백질 활성의 직접적인 활성화제 또는 효과기;
    (3) gp130 하류 신호전달 경로의 활성화제; 및
    (4) 철-트랜스포터;
    상기 배지는 임의로 혈청 및 혈청 추출액이 없는 배지.
  24. 하기 단계를 포함하는, 포배로부터 다능성 세포를 유도하는 방법:
    (1) 포배를 수득하는 단계;
    (2) gp130 하류 신호전달의 활성화제의 존재하에 상기 포배를 배양하여, 속세포덩이(inner cell mass)를 수득하는 단계;
    (3) 상기 속세포덩이를 해리하는(dissociate) 단계;
    (4) 상기 해리된 속세포덩이로부터 세포를 분리하는 단계; 및
    (5) gp130 하류 신호전달의 활성화제 및 Id 유전자 발현 또는 Id 유전자 발현 산물의 활성화제의 존재하에 분리된 세포를 배양하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서,
    LIF에서 상기 포배를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    LIF 및 BMP 수용체의 작용제의 조합에서 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 내지 4일의 기간 동안 상기 포배를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    무혈청 배지에서 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    무혈청 배지에서 상기 포배를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    BMP 수용체의 작용제의 부재하에 상기 포배를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 프로모터에 작동가능하게 연결된 Id 유전자를 포함하는 벡터.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 프로모터가 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    에피좀 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  34. 수용체 중에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 수용체를 통해 작용하는 것 이외의, Id 단백질 발현을 유도하는 물질을 포함하는 배양 배지.
  35. Id 단백질을 포함하는 배양 배지.
  36. 제 35 항에 있어서,
    다능성 세포의 세포막을 횡단하여 Id 단백질의 수송을 촉진하기 위해, 수송 도메인에 연결된 Id 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 배지.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    TAT, VP22 또는 페네트라틴(penetratin)에 연결된 Id 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 배지.
  38. Id 단백질 및 수송 도메인을 포함하는 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서,
    상기 수송 도메인은 TAT, VP22 또는 페네트라틴(penetratin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 다능성 세포의 자가 재생을 촉진시킬 때, 다능성 세포에서 Id 단백질 활성을 증가시키는 물질의 용도.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 물질이 세포에서 Id 단백질의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 용도.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 물질이 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  44. gp130 신호전달 및 Id 단백질의 활성화 및/또는 발현의 존재하에 다능성 세포의 시험관 내 배양에 의해 수득된 세포.
  45. 하기 단계를 포함하는, 분화된 세포를 수득하는 방법:
    (1a) 세포에서 Id 유전자를 발현 또는 Id 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및
    (1b) 세포에서 gp130 하류 신호전달을 활성화시키는 단계;
    (2) 상기 세포를 분화시키는 단계; 및
    (3) 분화된 세포를 수득하는 단계.
  46. 제 45 항에 있어서,
    단계 (1)의 세포는 선택성 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 원하는 세포에서 상기 선택성 마커를 우선적으로 발현시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 구축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 선택성 마커를 발현하는 세포를 선발하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 세포.
  49. 세포에서 Id 유전자를 발현하거나 또는 Id 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 Id 단백질을 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포에서 gp130 하류 신호전달을 활성화하는 단계를 포함하는 다능성 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 세포는 태아 또는 성체의 체세포 또는 조직으로부터 수득되는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 다능성 세포는 Rex1, Oct4 및 나노그(nanog)에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 따른 방법에 의해 수득된 세포.
  52. 하기 단계를 포함하는, Id 단백질을 대체하는 활성을 갖는 인자에 대한 분석법:
    (1) Id 단백질 활성 및 gp130 하류 신호전달의 존재하에 세포를 배양하여, 다능성 상태로 세포를 유지하는 단계;
    (2) Id 단백질 활성을 제거 또는 감소시키는 단계;
    (3) 상기 세포 내로 상기 인자를 도입하는 단계; 및
    (4) 상기 세포가 다능성으로 남아 있는지 또는 분화하는지를 결정하는 단계.
  53. 제 52 항에 있어서,
    단계 (1)에서 Id 단백질 활성의 존재하에 세포를 배양하는 단계는 (a) Id 유전자를 발현하는 단계, (b) Id 유전자의 발현을 유도하는 단계 또는 (b) 세포가 배양되는 배지에 Id 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서,
    세포 내로 상기 인자를 도입하는 단계는 (a) 상기 인자를 발현하는 단계, 또는 (b) 세포가 배양되는 배지에 상기 인자를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  55. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 인자.
KR1020067007271A 2003-10-16 2004-10-15 Ｅｓ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한배지 KR20070030164A (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0324270.8 2003-10-16
GB0324270A GB0324270D0 (en) 2003-10-16 2003-10-16 Improved control of ES cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
GB0324378.9 2003-10-17
GB0324378A GB0324378D0 (en) 2003-10-17 2003-10-17 Improved control of ES cell self-renewal and lineage specification,and medium therefor
GB0325007A GB0325007D0 (en) 2003-10-27 2003-10-27 Improved control of ES cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
GB0325007.3 2003-10-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070030164A true KR20070030164A (ko) 2007-03-15

Family

ID=34468184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067007271A KR20070030164A (ko) 2003-10-16 2004-10-15 Ｅｓ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한배지

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20070178439A1 (ko)
EP (1) EP1673444A2 (ko)
JP (1) JP2007508026A (ko)
KR (1) KR20070030164A (ko)
AU (1) AU2004281309A1 (ko)
CA (1) CA2542276A1 (ko)
IL (1) IL174388A0 (ko)
NZ (1) NZ547105A (ko)
TW (1) TW200523367A (ko)
WO (1) WO2005038010A2 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1640449A4 (en) * 2003-06-27 2009-03-25 Asahi Chemical Ind CELL DIFFERENTIATION INHIBITOR AGENT, CELL CULTURE METHOD USING THE SAME, CULTURE MEDIUM AND CULTIVATED CELL LINE
US7744717B2 (en) 2006-07-17 2010-06-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for enhancing the resolution of a thermally transferred pattern
WO2009104825A1 (en) * 2008-02-18 2009-08-27 Kaist Method for inducing the defferentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
AU2009225665B9 (en) 2008-03-17 2015-01-15 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
CN102317442B (zh) * 2008-12-17 2014-08-13 斯克里普斯研究所 干细胞的产生和保持
WO2011047300A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The Scripps Research Institute Induction of pluripotent cells
AU2011235212B2 (en) 2010-03-31 2014-07-31 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
EP2580320B1 (en) 2010-06-14 2018-08-01 The Scripps Research Institute Reprogramming of cells to a new fate
CN105457016B (zh) * 2010-09-22 2022-06-24 科罗拉多大学董事会 Smad7的治疗应用
CN103380212B (zh) 2010-12-22 2017-04-05 菲特治疗公司 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台
WO2014138670A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Ptd-smad7 therapeutics
KR102460549B1 (ko) 2014-03-04 2022-10-28 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼
SG11201802957PA (en) 2015-10-16 2018-05-30 Fate Therapeutics Inc Platform for the induction & maintenance of ground state pluripotency

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4959313A (en) * 1987-06-22 1990-09-25 The Jackson Laboratory Cellular enhancer for expressing genes in undifferentiated stem cells
US5871961A (en) * 1991-11-20 1999-02-16 Trustees Of Dartmouth College Nucleic acids encoding CR2 polypeptides, vector and transformed cell thereof, and expression thereof
GB9701492D0 (en) * 1997-01-24 1997-03-12 Univ Edinburgh Transfection of embryonic stem cells
US6280718B1 (en) * 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
CN1708582A (zh) * 2002-10-31 2005-12-14 独立行政法人理化学研究所 多能干细胞培养用的组合物及其使用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007508026A (ja) 2007-04-05
AU2004281309A1 (en) 2005-04-28
EP1673444A2 (en) 2006-06-28
WO2005038010A2 (en) 2005-04-28
US20070178439A1 (en) 2007-08-02
NZ547105A (en) 2009-02-28
TW200523367A (en) 2005-07-16
IL174388A0 (en) 2006-08-01
CA2542276A1 (en) 2005-04-28
WO2005038010A3 (en) 2005-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8658352B2 (en) Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
CA2566177C (en) Feeder independent extended culture of embryonic stem cells
JP4185489B2 (ja) Ｅｓ細胞自己再生および系統仕様の制御ならびにそのための培地
WO2007002210A2 (en) Embryonic stem cell culture compositions and methods of use thereof
KR20120017019A (ko) 줄기 세포 배양 방법 및 조성물
KR20070030164A (ko) Ｅｓ 세포 자가 재생 및 계통 지정의 조절, 및 이를 위한배지
JP2016508365A (ja) 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法
WO2009055868A1 (en) Process and compositions for culturing cells
KR20050023254A (ko) Ｅｓ 세포 자가 증식 및 계통 특정화의 조절 및 그를 위한배지

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid