TW200523367A - Improved control of ES cell self renewal and lineage specification, and medium therefor - Google Patents

Description

200523367 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於培養多⑨能幹細胞之培養基、培養條件及 方法’以促進幹細胞自我更新及避免或控制幹細胞的分 化。本發明另提供、分離及維持同種製備多潛能幹細胞之 方法。提供之方法及組合物適用於培養及分離多潛能幹細 胞’例如胚胎幹(ES)細胞，特別是哺乳動物(包含人類)幹細 胞0 【先前技術】 在含有血清及白血病抑制因子(LIF)之培養基建立及維 持活體外多潛能幹細胞培養係熟知的（Smith et ai (测）

Nature 3,36:688·9ΰ)。該等方法已用於維詩自經過許多繼 代之適田时系小鼠之多潛能胚胎幹⑽）細胞。多潛能幹細胞 σ養的維持及自我更新可藉由將幹細胞培養在健養細胞或 其萃取物（通常為小鼠纖維母細胞）而支持。在該條件下，可 使人類ES細胞在培養許多繼代後仍維持多潛能狀態。 在。亥領域雖然經過極度的怒六 沒的努力但仍存在的問題為ES細 胞的多潛能培養只能從少數物 ^ 裂物種取侍及長期維持，且即使 在這些物種亦非可得自所古 侍目所有胚胎。在-些案例中，多潛能 細胞可被確認但之後盔法纟立盖 天4養維持足夠時間以研究細胞或 其基因的操作。特別為嚅齒類（ ^ < 固顯1除了 一些小鼠品系之外）細胞 的案例。 最近的另一個問題為ES细晌过每 、、、田胞確實可在培養許多繼代後 維持多潛能狀態，但只可使用含 用3有血清或血清萃取物之培 200523367 養基維持，且因此不確定，或使用的培養條件其需要且他 細胞存在’例如用於維持人類£8細胞之纖維母細胞顧養细 胞。然而’ES細胞意欲進行其後的控制分化以成為所希望 的細胞型態、’其不希望使用不確定的培養基或有異 存在。 典型用於培養多潛能幹細胞之也清為船牛（牛）血清，其 已知含有細胞介素與其他訊號分子之複雜混合物。為控制 分化途徑，其不希望導人未知的細胞介素於培養基中，I 對於最、’·"化結果之影響為不可預測的，並可能為潛在有 害的。此外，每__批次▲清為獨特的且會在培養程序 變因。 因此，在該複雜培養基中培養所得之ES細胞及其分化 的後代，具有受到培養基成分及/或維持Es細胞所需之餵養 細胞污染之風險。這些因子降低ES細胞及其後代於治療及 其他應用的良好作業規範之發展。 當從ES細胞培養得到分化之細胞族群，其希望轉換高 比例ES細胞成為相同型態的後代_即盡可能維持同種= 細胞族群。然而，在操作時觀察到分化後可得到含有異種 混合細胞之細胞族群。因此，其希望ES細胞族群能夠二可 得到較純後代族群之方式或使用可得到較純後代族群之因 子進行分化。 申請人之前的申請案，WO-A-03/095628，在包含用於 促進幹細胞數個繼代之自我更新之gpl3〇 (例如及 TGF-β超家族（例如BMp4)訊號途徑之激動劑之無血清培養 200523367 -基中培養多潛能幹細胞，例如ES細胞。在gpl30訊號存在 下，TGF-β超家族訊號途徑之激動劑驚訝地提供自我更新刺 激，而非前分化訊號。 【發明内容】 本發明之一目的為提供適合多潛能幹細胞之替代的、較 佳改善的培養方法及培養基，其可支持該未分化狀態之幹 細胞於許多繼代的自我更新。本發明之另一目的為提供替 代的培養系統，其可維持活體外培養之多潛能幹細胞直到 以控制方式誘發細胞分化。本發明之更另一目的為提供促 進多潛能幹細胞之取得及分離，及促進從難以分離細胞 之生物體或從尚未被分離之多潛能幹細胞者取得及分離多 潛能幹細胞之方法及組合物。 根據本發明，在gp 130訊號存在下供應Id蛋白質於多 潛能細胞會抑制分化及促進自我更新。 在本發明中，多潛能幹細胞（例如ES細胞）係培養在包 含gpl30 (例如LIF)訊號途徑與id基因表現之激動劑之無血 清培養基中，例如經由（i)直接活化Smad途徑以表現Id 基因，或表現Id基因，或（ii)該細胞存在Id基因產物或 同等訊號。因此促進數個繼代幹細胞的自我更新。因此， 在gp 130訊號存在下，多潛能細胞中之Id基因活性提供自 我更新刺激。 本發明因此提供一種Id基因產物用於促進培養的多潛 能細胞之自我更新之用途。根據本發明，Id基因產物係有 目的地提供於細胞中，及/或Id基因或同等物係有目的地活 200523367 化。與gp 130訊號同時，特別地使用細胞介素例如LIF，可 得到多潛能細胞的自我更新。 由發明人較早的申請案已知使用LIF及活化TGF-β超 家族受體下游訊號可促進自我更新。在本發明中，Id基因 活性與LIF共同造成ES細胞的自我更新。因此本發明提供 自我更新訊號之額外方法，經由組合

Id蛋白質或增加id蛋白質活性之試劑，該試劑非為 TGF-β超家族受體下游訊號途徑之活化劑；及 gp 1 3 0下游訊號途徑之活化劑。 可參考的Id蛋白質包含Id蛋白質與其他蛋白質的融 合’例如異位域，及包含如下述Id蛋白質之組合物。⑴之 藥劑適合的為誘發Id基因表現及/或Id蛋白質活性之外來 因子，其不經由TGF-β超家族受體作用。實施例包含纖維連 接蛋白、纖維連接蛋白受體激動劑、整合素（integrin)訊號 活化劑、納諾格（nan〇g)、及所有前述誘發id基因表現或η 蛋白質活性之同系物。本發明之方法適用於培養多潛能幹 細胞’特別是胚胎幹細胞。 在以下的實施例中，我們已誘發Id基因表現以促進自 我更新。在本發明之其他實施態樣（亦描述如下）中，我們已 基因.呆作多潛能細胞以使其表現Id基因，例如藉由將包含 W基因之載體導入多潛能細胞。精確的控制可藉由使用在 載體中可誘發的啟動子而達成。#細胞用於藥物篩選時， :口修飾形式為可接受的’但當細胞或後代用於治療時 u可接受的’在此實施例中使用促進自我更新之外來 200523367 因子為較佳的。 在下述較詳細之特殊方法中，促進培養之多潛能細胞的 自我更新之方法包含（1)表現Id基因或誘發Id基因表現， 及（ii)活化gp 130下游訊號。id基因可方便地游離型表現。 本發明之進一步觀點係提供下列之組合用於促進培養 之多潛能細胞的自我更新之用途： id基因表現及/或id蛋白質活性之活化劑，其造成Id 基因表現；及 gp 1 3 0下游訊號途徑之活化劑。 本發明之另一觀點係提供下列之組合用於促進培養之 多潛能細胞的自我更新之用途：

Id基因產物；及 gp 1 3 0下游訊號途徑之活化劑。 在本發明下述較詳細之特殊實施態樣中，LIF係包含於 培養基中，其中培養持續表現ID1uS細胞。自我更新係 被促進的，其證明UF與表現的Id基因之協同作用。 本發明之優點為在細胞中直接供應1(1基因產物以促進 自我更新。直接誘發自我更新造成對於自我更新較佳的控 制’其具有較少的副作用，例如活化自我更新_之\ 的數個階段以外途徑。 可參考的Id基因意欲包含如文獻中所定義之美因 如!以、如、1(13、及1(14’及意欲包含其擬態，其〔含功: 性片段及衍生物’其表現Id基因產物的特性，抑制 因子例如my〇D及mashl的轉錄活性。特殊小 取、大鼠、 200523367 犬及人類1d蛋白質序列係列於SEQ ID NOs·· 1_4。其他特殊

Id蛋白質序列可經由公共可得的序列資料庫而獲得。Id基 因活性可藉由避免或降低bHLH基因的表現或活性或避免 戈降低E蛋白質的表現或活性而適當地模擬。其可使用基 因剔除或抑制RNA方法或藉由降低外來誘發因子而達成。 反義RNA可用於RNA標的方法，或可使用基於siRNA2 方法。 相當於增加的id蛋白質活性之訊號可由（i) bHLH基 因之抑制劑、（i〇 myoD之抑制劑、（iii) mashl之抑制劑、 (iv)增加的hes基因活性、（v)增加的hes蛋白質活性及（Vi) 所有上述之一或多個之組合提供。 在該領域中，因子例如BMP係用於活化一或多個 TGF-β超家族受體下游之訊號途徑。本發明與其不同之處在 於其在細胞中直接供應Id基因活性，例如經由載體表現Id 基因’或在於活化Id基因表現及/或I(i蛋白質活性，而非 經由TGF-β超家族之受體或直接模擬該活化的功效。本發明 可較現今技術更準確且更精確於維持自我更新表型。 一或多個gp 130下游訊號途徑之活化可藉由使用經由 gp 1 30作用之細胞介素而達成，例如細胞介素或其他lif受 體之激動劑。 可經由gpl 30作用之細胞介素，且因此活化gpl 3〇訊號 傳遞’包含LIF、CNTF、心臟營養素（cardiotrophin)、抑瘤 素（oncostatin) Μ、IL6加sIL-6受體及高IL_6。適合的細胞 介素包含擬態的、融合蛋白質或可結合於及/或經由gpl30 200523367 •活化訊號之嵌合體。在血清存在下經由gpl3〇作用之細胞 ;丨素之角色係已完整建立，但這些細胞介素在無血清存在 下支持未分化細胞的能力是有限的。 本發明因此提供，在一實施態樣中，替代的及/或改良 ， 的在無血清、血清萃取物、餵養細胞及餵養細胞萃取物之 培養基中培養ES細胞。當使用LIF及本發明特殊實施態樣 之直接Id基因表現及/或jd蛋白質活性活化培養基可延伸 ES細胞的繼代。 本培養系統之另一優點為ES細胞之分化相較於培養在 _ 含血清培養基中為降低的。其為顯著的，因通常大部分多 潛能ES細胞在血清中傾向分化，其造成操作及擴展問題。 結果顯示本發明之培養條件可使ES細胞在無血清存在下自 我更新。 胚胎幹細胞已被報告可源自數種哺乳類，包含小鼠 (Bradley et al (1984) Nature 309: 255_56)、美國紹（M〇1 Report Dev (1992) Dec:33(4): 418-31)、豬及綿羊（J Rep(m Fertil Suppl (1991); 43: 255-60)、大鼠（Dev Bi〇1 (1988) May; · 127 (1):224-7)及牛（R0UX arch Dev Biol (1992); 2〇1· 134-141)。本發明之方法及組合物評估應可適用於培養其他 哺乳類多潛能ES細胞培養，其包含靈長類，特別是人類、 齧齒類，特別是小鼠及大鼠及鳥類ES細胞。 特定地，關於人類ES細胞，已知人類ES細胞對 反應’且因此本發明之培養基及方法，丨中自我更新刺激 係由對LIF及Id蛋白質反應而得，可應用於人類Es細胞。 11 200523367 • 用於本發明方法之適合的細胞密度係根據使用的多潛 能幹細胞及任何所需的後代特性而不同。好的結果係藉由 培養胚胎幹細胞於單層培養，分離胚胎幹細胞並接著以 0·5-1·5χ104每cm2之密度單層培養胚胎幹細胞而得。細胞 以附著的單層增殖並觀察到其具有可與生長在含有金清與 LIF之ES細胞比較之倍增時間。 根據本發明之培養ES細胞及其繼代之典型表面為該領 域認為有用於細胞培養之表面，且這些表面包含塑膠、金 屬、合成物表面，雖然普遍係使用市場上廣泛可獲得的表 面例如塑膠組織培養盤。該盤通常直徑為數公分。大量使 用時’這類型培養盤可使用大很多的直徑並使用許多重複 盤單位。 培養表面更普遍為包含附著蛋白質，通常塗布於該表面 上。細胞上的受體或其他分子結合於該蛋白質或其他細胞 培養基質’且其促進附著於表面並顯示促進生長。明膠塗 布之培養盤為普遍可得的且適用於本發明，其他蛋白質亦 可使用。 在本發明之實施態樣中，至少在部分培養期間包含抑制 分化之藥劑，例如FGF受體或MEK/Erk訊號之抑制劑，於 培養基中，其發現可抑制ES細胞分化的趨勢。在一實施態 樣中，ES細胞在移除FGF受體抑制劑並以Smad訊號之直 接活化劑取代之前，培養在包含LIF及FGF受體抑制劑之 特定無血清培養基中一特定期間。FGF受體抑制劑係特別 用於人類細胞以外的細胞’且實施例包含化合物SU5402及 12 200523367 PD173074。替代地，可使用FGF受體之競爭抑制劑，適合 的以該受體之可溶型態。適合的MEK/Erk抑制劑包含 PD98059、U0126 及 PD184352。 在替代實施態樣中，視需要可不移除FGF受體或 MEK/Erk抑制劑。因此，在Id蛋白質之誘發劑存在或不存 在下，該抑制劑存在於培養基中一延長期間。因此，在[π 及FGF抑制劑存在下，ES細胞在N2B27培養基中至少可生 長培養20繼代。若該抑制劑不從培養基中移除，較佳為其 為專一抑制劑且對其他受體具有些微活性或不具活性。 _ 本發明之第二個觀點為提供一種培養ES細胞以促進 ES細胞自我更新之方法，其包含維持eS細胞在培養基中， 其含有： (1) (a)細胞内訊號途徑之活化劑，其非為經由tgf — p 超家族受體作用者，其造成Id基因表現或（b) id基因產 物；及 (2) gp 130下游訊號途徑之活化劑。 本發明之方法可用於在無血清及無血清萃取物之培養 _ 基中刺激ES細胞的自我更新。較佳地，該方法亦可在無假 養細胞及/或餵養細胞萃取物存在下進行。例如，ES細胞之 培養可以包含下列之步驟進行： -維持培養的ES細胞在多潛能狀態，視需要在餵養細 胞上’在經由gpl3〇作用之細胞介素及血清或血清萃取物 存在下； -繼代培養E S細胞至少^ —次； 13 200523367 .^ ' 養基移除血清及血清萃取物並移除餵養細胞 ^ )以使培養基無餵養細胞、血清及血清萃取物； 及

後在Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化 劑或效應劑（其非在姐< I 、、非為左由TGF_超家族受體作用者）及gpl3〇 下游訊號途徑之任^卜亦丨六+ 之活化劑存在下維持ES細胞在多潛能狀態。 在β及血π萃取物從培養基中移除時，視需要可加入 抑制刀化之4劑於培養基中，例如FGF受體抑制劑。視需 要可在Id f白貝存在下維持該細胞的同時或之後移除該分 P制背丨血巧或萃取物可在餵養細胞或萃取物移除的同 時或之前或之後移除。 本發明亦提供一種獲得經轉染的Es細胞族群之方法， 其包含： 以編碼可筛選的標記之構築體轉染多潛能Es細胞； -培養ES細胞； -在Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或 效應劑及gp 130下游訊號途徑之活化劑存在下培養該ES細 胞。 -篩選表現該可篩選的標記之細胞。 違可筛選的標記可編碼抗生素抗性、細胞表面標記或其 他可篩選的標記例如於EP-A-069535 1中描述者，及較佳為 包含編碼操作地連接於啟動子之可篩選的標記之核苦酸序 列’該啟動子在所需細胞中優先表現該可篩選的標記。 在另一實施態樣中，本發明提供一種培養ES細胞之方 200523367 法’其包含轉移單一 ES細胞至培養管（例如盤上之單一孔） 中’並在Smad訊號途徑之直接活化劑或作用劑及gpl3〇下 游訊號途徑之活化劑存在下培養ES細胞之步驟，如此得到 · ES細胞之菌落族群，所有後代皆來自單一 es細胞。 當獲得穩定、均一培養的ES細胞時，可改變培養條件 以誘導分化細胞為一或多種選自外胚層、中胚層或内胚層 細胞命運之細胞型態。加入或維持細胞介素及訊號因子可 使特定分化的細胞族群高效率分化。ES細胞分化成非神經 外胚層命運可藉由在經由gpl30作用之細胞介素及Smad訊 _ 號途徑之直接活化劑或作用劑存在下維持ES細胞，且接著 當維持Smad訊號途徑之直接活化劑或作用劑之細胞介素及 /或加入另一可誘導分化之訊號分子時移除細胞介素。上述 方法皆視需要包含獲得及/或分離分化之細胞（其為該方法 之產物）之步驟。 例如’在無LIF存在下暴露於BMP4中造成誘發中胚層 及内胚層之細胞型態。移除gpl3〇及TGF-β訊號途徑之激動 劑及/或阻斷二途控造成誘發神經外胚層表型。替代地，其 · 他訊號因子例如活化素、音速小子（s〇nic hedgeh〇g (shh))、

Wnts及FGFs可加入於培養條件中以誘導其他分化途徑。 在使用上，接近ES細胞培養的末期，則希望在分化開 始前移除Smad訊號至少一個繼代，以確定該訊號降低及在 之後的分化過程中無該訊號的遺留。在一實施態樣中，當 移除Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或作用 劑時’加入FGF受體拮抗劑於培養中一至二個繼代。 15 200523367 • 本發明之另一觀點為提供一種用於ES細胞的自我更新 之培養基。一種該培養基包含： -基礎培養基； _ -Id基因表現及/或id蛋白質活性之直接活化劑或效應 劑； - gp 130下游訊號途徑之活化劑；及 -鐵轉運子 其中該培養基視需要無血清或血清萃取物。 用於人類多潛能幹細胞之較佳培養基包含Η基因表現 鲁 及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效應劑；gpl3〇下游訊 號途控之活化劑及FGF受體激動劑。用於人類幹細胞以外 的多潛能幹細胞之較佳培養基包含Id基因表現及/或M蛋 白質活性之直接活化劑或效應劑；gp丨3〇下游訊號途徑之活 化劑及ES細胞分化之抑制劑。 基礎培養基為提供ES細胞碳及/或維他命及/或礦物質 之必須來源之培養基。基礎培養基通常無蛋白質且其本身 無法支持ES細胞的自我更新。鐵轉運子提供鐵的來源或提 · 供從培養基中獲得鐵的能力。適合的鐵轉運子包含運鐵蛋 白及脫鐵轉鐵蛋白。 培養基較佳為另包含一或多種胰島素或類胰島素生長 因子及白蛋白（較佳為重組蛋白），且無餵養細胞及餵養細胞 举取物。 本發明之特殊培養基包含LIF、BMP、胰島素、白蛋白 及運鐵蛋白，含或不含額外的基礎培養基。 16 200523367 • 本發明亦提供一種細胞培養基；其包含： _ w基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效應 劑；及 -經由gp 1 3 0作用之細胞介素。 4培養基視需要添加如上述之Es細胞分化之抑制劑， 或當希望分化時，添加誘導ES細胞分化成特殊表型之訊號 因子。 。亥坨養基較佳為無血清或血清萃取物。更佳地，該培養 基為元全特定的。 在本發明之較佳實施態樣中，該培養基包含gpl30受體 結合細胞介素’ LIF，濃度為介於1〇u/ml及1〇〇〇u/ml，更 佳為介於50U/ml及500U/ml，再更佳為在i〇〇u/ml之範圍。 一種特殊的人類多潛能幹細胞培養基包含（a) lIF、（b) BMP及（c) FGF。一種非人類多潛能幹細胞之特殊培養基 包含（a)LIF、（b)BMP及（c)FGFi抑制劑。培養基成分 可如本文中所述置換。 本發明另提供一種從囊胚取得多潛能細胞之方法，其包 含： (1) 獲得囊胚； (2) 在gpl30下游訊號途徑之活化劑存在下培養囊胚， 以獲得内細胞群； (3) 分離内細胞群； (4) 從分離的内細胞群分離細胞；及 (5) 在gp 13 0下游訊號途徑之活化劑及Id基因或I^義 17 200523367 因表現產物之活化劑存在下培養該分離之細胞。 較佳地，該方法包含在UF中培養囊 至4天的期間。 文住地坨香2 該分離之細胞較佳係培養在無血清培養基。典型地，細 胞係以團塊狀再培養。在以下實 ⑺r，我們已使用LIF 及證受體激動劑之組合得到良好的結果。 囊胚較佳亦可培養在無血清卷 體激動劑。 …基，視需要無請受 本發明更另提供一種裁I# 1七人 之Id_。 輯體其包⑼作地連接於啟動子 該啟動子適合地為可誘發的啟動子，其提供使用外來因 子控制表現。其可為附加載體，例如以下實施例所述。 本發明之另—種培養基為包含誘發Id蛋白質表現之試 劑之培養基，該試劑非為經由TGF_超家族受體作用者。例 子包含纖維連接蛋白、纖維連接蛋白受體之激動劑、整合 素訊號之活化劑、納諾格及所有前述誘發Id基因表現或Id 蛋白質活性之同系物。 該培養基可包含1(1蛋白質，例如連接於異位域之1(1蛋 白質，以促進Id蛋白質異位穿過多潛能細胞細胞膜。 「異位域」代表作用為轉移本身及/或其他蛋白質及物 質穿過細胞膜或脂雙層之蛋白質域或片段，並包含原始域 及保留此結合功能之；^，變異及衍生物。後者的膜可為 内體，其異位發生於受體媒介之胞飲作用過程中。異位域 通㊉可由低pH時在脂質膜中形成可測量之孔的性質而測定 18 200523367 • (Shone ei α/· (198 7) Eur J· Biochem· 167, 175-180 描述適合 的測試）。異位域的後者特性因此可用於測定本發明中之構 築體中之其他可作用為異位域之蛋白質域。取得自細菌神 經毒素之異位域之實施例如下： 肉毒桿菌型態A神經毒素 -胺基酸殘基（449-871) 肉毒桿菌型態B神經毒素 -胺基酸殘基（441-85 8) 肉毒桿菌型態C神經毒素 -胺基酸殘基（442-866) 肉毒桿菌型態D神經毒素 ·胺基酸殘基（446-862) 肉毒桿菌型態E神經毒素 -胺基酸殘基（423-845) 肉毒桿菌型態F神經毒素 -胺基酸殘基（440-864) 肉毒桿菌型態G神經毒素 _胺基酸殘基（442-863) 破傷風神經毒素 -胺基酸殘基（458-879) 其他適合的異位域為TAT (例如得自HIV-1)及穿透 胜’内化共價鍵結之胜肽並運輸，或使其被運輸至細胞核 之胺基酸短序列。其他適合的域係指蛋白質轉導域，例如 Wadia等人，2000所述之VP22、觸角衍生物及其他。這些 域可化學性連接於Id蛋白質，例如經由硫代官能基或可被 表現包含Id蛋白質及該域之融合物。特殊域係列於seq ID N〇s: 5-6及包含Id蛋白質及蛋白質導入域之特殊融合蛋白 質係列於SEQ ID NOs: 7-9。連接的分子、融合物及組合物 包含與本發明之另一觀點相同者。這些可用作例如培養基 的添加物以作為Id基因轉染細胞之替代物。 「異位」關於異位域，表示結合於細胞表面後發生的内 化事件。這些事件造成物質轉移入細胞的細胞質。 200523367 • 一種傳送因子至ES細胞之組合物，其包含： 該因子，及 異位域其異位該因子進入ES細胞，適合為梭菌毒素的

Hn域。 該異位域可選自（1)白喉毒素的HN域，（2)實質上保 留白喉毒素的HN域之異位活性之（1)的衍生物或片段，（3) 致融(fusogenic)胜肽，（4)膜分裂胜肽，及（5) (3)及（句的異 位片段及衍生物。 本發明更另提供一種在多潛能細胞中誘發Id蛋白質活 性之試劑用於促進該多潛能細胞自我更新之用途。 該試劑係如本文中其他處所述適合者，及可為增加細胞 中Id蛋白質的量或提高細胞中id蛋白質的活性者。 熟習該項技術者應樂見，TGF-β超家族受體下游的訊號 途徑可藉由TGF-β受體之上游激動劑（例如受體配位體）、持 續活化的受體、或該訊號途徑活化的下游成分作用而活 化’例如SMAD訊號傳遞分子。同樣地gpl30訊號傳遞途 徑的上游作用劑（例如細胞介素）及下游作用劑（例如Suts) 亦可活化該途徑。因此，本發明有關活化TGF-β受體下游訊 號之實施態樣，例如ES細胞取得之方法，包含所有包含可 活化TGF-β受體超家族訊號途徑之分子之組合物，較佳地經 由BMP受體作用以促進多潛能幹細胞的自我更新。適合的 BMP受體之配位體包含BMPs及GDF。 更佳地，根據本發明，細胞培養係以附著培養進行，並 於本發明之實施例發現，維持細胞於多潛能狀態之後，其 20 200523367 分化可以高一致度及高鈿貽六i + 、、、已存活率誘發。附著培養可藉由 含入細胞附者蛋白而促谁 日+ 從進且在本發明之特殊實施例中明 膠係用作用於培養基質之塗布。 亦較佳地，根據本發明之多潛能細胞培養為單層培養， 雖然細胞可視需要以懸浮培養或為前細胞聚集生長；細胞 亦可生長在顆粒或其他適合的架上例如膜或其他三度空間 結構。 根據本發明之多潛能細胞培養基的另一培養基成分，且 其較佳為存在的，為促進細胞生存及/或代謝之因子。在本 發明之特殊實施態樣中，細胞在胰島素存在下培養。替代 因子為類胰島素生長因子及其他此類細胞生存及/或代謝促 進因子亦可替代使用。 用於本發明之實施例之培養基較佳亦包含血清白蛋 白。其可以純化或重組的型態使用，且若以重組的型態則 其具有無潛在污染因子、細胞介素等之優點。培養基不需 要含有血清白蛋白，且該成分可被省略或以如wnes等人所 述之/、他大里蛋白質或合成的聚合體（聚乙烯醇）取代。 本發明之特殊較佳的培養基為完全特定的。該培養基不 任何非特定的成分’即其内含物為未知成分或含有未 界定之非特定或變化因子。使用完全特定的培養基之優點 為可以有效率及一致的步驟培養及其後操作多潛能細胞。 此外’發現維持細胞於多潛能狀態可高效率及較高預測性 達成’且培養細胞中使用特定培養基分化誘發則對分化訊 號的反應較使用未特定培養基均一。 21 200523367 . 根據本發明之培養基可用於培養得自任合成體組織之 多潛能細胞。 本發明之方法亦包含一種獲得分化細胞之方法，其包含 培養如描述之多潛能細胞，及使得或造成該細胞分化，其 中該細胞含有可篩選的標記，其可差異性表現以比較所希 * 望的分化細胞與其他細胞型態，其包含多潛能幹細胞，其 中可筛選標記的差異性表現造成所希望的分化細胞優先分 離及/或生存及/或分裂。 該分化細胞可為組織幹細胞或前驅細胞，且可為最終分 _ 化細胞。 本發明亦提供一種分離多潛能幹細胞或EG或EC細胞 之方法’其包含在培養基中培養源自胚胎之細胞或組織， 或源自胎兒或成體之體細胞於培養基，該培養基包含： -經由gp 130作用之細胞介素；及 _ Id蛋白質或Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接作 用劑或活化劑；及/或 FGF受體或MEK/Erk之抑制劑。 _ 較佳地，該培養基為完全特定培養基。 通常，本發明延伸至根據本發明在本文中描述之任何方 法所得之細胞。本發明之細胞可用於藥物開發分析。本發 明之細胞亦可用於細胞治療，且因此本發明之方法包含使 用本發明之gp 130訊號及Id蛋白質活性及/或表現之組合以 取得及/或維持多潛能細胞，由此取得細胞用於細胞治療且 使用這些細胞於細胞治療。 22 200523367 • 本發明提供—種再程序化細胞之方法，從非潛能細胞產 生多潛能細胞。因此獲得多潛能細胞之方法包含在細胞中 表現id基因或誘發1(1基因表現，或在含有id蛋白質之培 養基中培養細胞，及在該細胞中活化gpl3〇下游訊號其 中該細胞係從胎兒或成體的體細胞或組織得到。該所得之 多潛能細胞較佳其特徵在於其對Rexl、〇ct4及納諾格為正 反應。 本發明提供一種具有取代Id蛋白質活性之因子之分 析’其包含： (1) 在Id蛋白質活性及gpl3〇下游訊號存在下培養細 胞，因此維持該細胞在多潛能狀態。 (2) 移除或減少該id蛋白質活性； (3) 導入該因子於該細胞；及 (4) 測定該細胞是否仍為多潛能或分化的。 在id蛋白質活性存在下培養該細胞（1)適合地包含（a) 表現Id基因，（b)誘發Id基因表現或（b)加入u蛋白質 於培養該細胞之培養基，及導入該因子於細胞，該細胞適 合地包含（a)表現Id基因或（b)誘發Id基因表現。本發 明之另一觀點延伸至其所得之因子。 在未分化之ES細胞中Id基因為BMP/Smad訊號之主 要標的。Ids為負螺旋-環-螺旋因子其分離e蛋白質以避免 bHLH因子例如myoD及mashl之轉譯活性（Jen等人，1992; Lyden等人，1999)，且為造血作用之負調節物之候選者 (Nogueira等人，2000)。其亦可交互作用及抑制pax及Ets 23 200523367 . 轉譯因子（Norton，2000)。在本發明之特殊實施態樣中，以 /A轉染之EC細胞在無血清培養單獨加入LIF中自我更 新，建立BMP/Smad於誘發/d表現之重要貢獻。 當移除LIF時，Id表現之ES細胞輕易地分化但不產生 神經前驅物。因此Id蛋白質係以譜係專一方式作用，以少 量或無作用於中胚層或原始的内胚層抑制神經的確定。Ids 因此藉由補償因STAT3阻斷的其他譜系而有助於自我更新 (圖7)。至少部份Id功能可阻斷前成熟表現之前神經因子的 作用。Ids因此作用於使幹細胞隔絕於譜系起始之功能性結 果（Hu 等人，1997)。 LIF/STAT3及BMP/Smad因此組合作用以支持ES細胞 自我更新。此二途徑亦調控爪蟾胚胎之 ventralisation (Nishinakamura等人，1999)。在此案例中，每一個顯示足 夠彼此獨立的活性，且無證據顯示STAT3及Smadl間的交 互調控。 在含血清培養基中同源結構域蛋白質納諾格可避開 STAT3活性的需要（Chamber等人，2003)。納諾格亦可用於 置換BMP/血清刺激的需要，至少部分藉由給予Id持續的表 現。 以下例示本發明之實施例，並結合圖式。 更詳細參考列於下之實施例，圖1顯示在無血清培養基 中LIF加BMP支持ES細胞自我更新： A. 以培養在含有指定因子之N2B27之Oci心Gip細胞 的相位差及螢光影像。TuJl免疫染色偵測神經分化，綠色 24 200523367 . 螢光反應未分化之ES細胞中Oct4啟動子的活性。條帶： 50μιη 〇 Β. 在含有FCS加LIF或含有LIF (10ng/ml)加ΒΜΡ4 (10ng/ml)之N2B27之傳統培養基進行繼代的過程中累積的 Oc/4-GFP陽性未分化之ES細胞數之作圖。使用細胞分離緩 衝溶液每48小時繼代培養並以每10cm2孔4x105細胞培 養。GFP陽性細胞數目於每一繼代以FACS分析測定。 C. RT-PCR分析在 （1)含有LIF加BMP之N2B27中 之ES細胞6個繼代，（2) ES細胞培養在含有LIF之血清， (3)第8天的胚胎體，（4)以網膜酸處理第8天的胚胎體， 中之 Oct4、納諾格、T (brachyury)及 Soxl mRNA。 圖2顯示在含有LIF加BMP之N2B27中ES細胞的成 株性、潛力及取得： A. CAG-iawg·力7轉染之菌落以E14Tg2a細胞電穿孔及 以嘌黴素篩選而分離。 B. 挑選CAG-i⑽轉染之ES細胞及取得菌落。 C. 從在含有LIF及BMP之N2B27中6個繼代後之 TP6.3 ES細胞於產生之懷孕中期胎兒嵌合體。GFP螢光標 示ES細胞子代。 D. 從CAG-ί⑽g/p轉染之ES細胞之雄性嵌合體與 C5 7BI/6交配並產生子代。刺豚鼠外表顏色表示子代的ES 細胞來源。 E. 從含有LIF及BMP之N2B27中取得之第一繼代 SF1 ES細胞菌落。嵌合體從SF1 ES細胞產生。 200523367 • 條帶：50μιη。 圖3顯示ES細胞中之BMP訊號： A. 反轉錄_PCR分析得自在（1)含有LIF及BMP之 N2B27中，第6繼代，（2)含有LIF之血清中，無反轉錄酶 控制組，（3)加LIF之血清中，（4)培養在不含LIF或BMP 之N2B27中後第一天，（5)不含LIF或BMP第5天，中之 Oct-GiP細胞之RNA樣本。 B. 免疫轉潰顯示Smadl、erk及P38對假處理（無）或 在N2B27中過夜培養後以LIF、BMP或LIF加BMP刺激 1 5分鐘或1小時之反應。 C. 免疫轉潰顯示STAT3酪胺酸磷酸化對LIF、BMP 及LIF加BMP之反應。 D. Smad7附加轉染體在血清及LIF存在下分化及表 現神經前驅物（Soxl-GFP)及神經（TuJ)標記。 E. SB203580 (30μΜ) p38 抑制劑不抑制在 LIF 加 BMP 中之自我更新或在單獨LIF中之神經分化。Oct4-GFP標記 未分化之ES細胞及TuJ 1免疫染色確認的神經元。 F. 共免疫沉殿ES細胞中之活化的Smadl及STAT3。 左部分：以FLAG-標記之Smadl轉染後之FLAG免疫沉澱。 右部分：未操作之ES細胞之STAT3免疫沉殿。細胞如指 示刺激1小時。 條帶：50μηι。 圖4顯示ES細胞中Ids的表現及功能： A. LightCycler反轉錄PCR分析反應LIF、BMP或 200523367 . LIF + ΒΜΡ之基因誘發。細胞培養在單獨N2B27過夜，接著 刺激4 5分鐘。 B. 北方雜合Oct4-GiP細胞中之Id mRNA表現。Con : 穩定狀態的ES細胞維持在含有培養基加LIF之血清。道 2-11細胞培養於不含因子之N2B27過夜再如指示刺激45 分鐘。F η，纖維連接蛋白。 C. 以單獨載體轉染並培養在含有LIF之含血清培養 基之46C ES細胞中之Idl蛋白質之穩定態程度，並在46C/T 細胞之附加超轉染後過度表現Idl及fldl穩定插入選殖 株。後者的作圖僅曝光10秒。轉染之Idl為FLAG標記且 因此較内生Idl具有延遲的移動。 D. 原位雜合於培養在加LIF之N2B27中之Idl穩定 插入ES細胞菌落中之納諾格及Oct4 mRNA。Id2及Id3轉 染體可得到相同結果。條帶：50μιη。 圖5顯示Id抑制神經分化及對於ES細胞自我更新是必 須的·β Α. 載體及Id3穩定插入46C選殖株在不加因子之 N2B27中分化6天後之相位差及GFP螢光影像。Idl及Id2 轉染體顯示相似的神經分化抑制。 B. 上部分：在含有單獨LIF之N2B27中fldl轉染46C 細胞形成自我更新菌落之。中部分：Cre切除後fldl細胞在 LIF中分化並需要LIF加BMP以形成ES菌落。下部分：fldl 菌落中之GFP表現在兩側裝接上Idl-STOP卡座移除後以持 續表現的CAG單位驅使。 200523367 . C. N2B27中移除LIF後fldl細胞進行非神經分化， 且無活化心W-GFP或表現TuJ。Cre切除後，fldl細胞顯 示TuJ陽性之神經細胞的恢復分化。（*^x/-GFP在fldl細胞 中因GFP的持續活化而無法專一性偵測）。 D. 反轉錄PCR分析ES細胞中及神經分化過程中表現 之mashl及ngn2。樣本如圖3A。 E. E47之過表現阻斷ES細胞自我更新，其可藉由增 加Idl而恢復。46C/T ES細胞以E47超轉染或以E47加Idl 附加表現載體共轉染，並在含有LIF之含血清培養基中以 雙重的嗓黴素及zeocin篩選下培養6天。 F. 增加的E47克服Idl抑制的神經分化。46C/T ES 細胞如E中超轉染，接著轉染後24小時轉移入不添加因子 之N2B27並在雙重篩選下培養6天。 條帶：50μιη。 圖6顯示納諾格避開BMP/血清的需要以誘發Id : A. EF4C細胞在N2B27或N2B27加BMP中培養6天。 EF4納諾格轉染體培養在指示條件下6個繼代並照相。條 帶：50μηι 〇 Β及C. 北方雜合在血清加LIF(Con)或在無添加因子 之N2B27中過夜中之E14Tg2a親本ES細胞及EF4納諾格 轉染體中之Idl及Id3 mRNA，及mRNA量。 圖7顯示BMP/Id及LIF/STAT3之合作譜系限制： ES細胞自我更新需要抑制譜系約束。由BMP或其他訊 號誘發之Id基因阻斷進入神經譜系，其只有被LIF/STAT3 200523367 . 部分抑制。同時，BMP誘發中胚層及内胚層的能力係由 STAT3驅使，可能包含直接及間接的機制。移除LIF因此 造成BMP作用從支持自我轉換為促進譜系約束。 本發明之序列表所列SEQ ID Nos與下列符合： 小鼠Id3之胺基酸序列 大鼠Id3之胺基酸序列 犬Id3之胺基酸序列 人類Id3之胺基酸序列 來自Tat之蛋白質傳遞區域 來自觸角之蛋白質傳遞區域 Tat-人類Id3融合 觸角-人類Id3融合 小鼠Id3-觸角融合 【實施方式】 實施例 胎牛血清對未分化E S細胞在基礎培養基中生存是重要 的（Wiles and Johansson，1999)。然而，ES 細胞在含有 N2 及B27添加物之豐富基礎培養基中維持高生存率（Ying and Smith，2003)。其可使我們試驗在無血清因子中LIF是否可 驅使自我更新之持續循環。 在單獨N2B27培養基中附著的ES細胞有效率地轉變為 陽性神經前體細胞（Yiing等人，2003)。在這些條件下 LIF降低但不去除神經分化。在N2B27培養基加LIF中連 續的繼代下我們發現其在開始增加後，未分化之E S細胞數 200523367 目達到停滯期並在2-3個繼代後開始衰減。此發現在數種不 同的ES細胞株可重現。在這些培養中的許多細胞具有神經 前驅物或未成熟神經元的型態。神經分化係由在46C ES細 胞中Sox厂GFP神經報告物（rep0rter)的活化而確定（Yiing等 人，2003)。這些觀察顯示LIF/STAT3之外的訊號途徑對促 進E S細胞自我更新及特別是抑制神經是需要的。 BMPs在脊椎動物胚胎中為習知的抗神經因子（wils〇n and Hemmati-Brivanlou ^ 1995 ； Wilson and Edlund ^ 2001) 且已證實可拮抗ES細胞之神經分化（Tr〇pepe等人，2〇(H ;

Ying等人，2003)。BMP單獨促進ES細胞分化為非神經命 運（Johansson and Wiles，1995 ; Wiles and J〇nhanss〇n， 1999 ; Ying等人，2003)且因此開始顯現不像作為自我更新 因子候選者。然而，我們試驗BMP的加入是否有助於結合 LIF的共刺激而抑制分化。我們發現UF加BMp4 (或 之組合可促進自我更新，造成在N2B27中2至3個繼代後 未分化ES細胞之高純度族群（圖1A)。這些培養可接著擴展 為具有生長率及生存率不會衰退及無神經分化之多個繼代 (圖ΙΑ、B)。此反應在每一種來自三種獨立來源之“種不 同ES細胞可觀察到。如4陽性未分化細胞的表現及族群倍 增時間些微高於由在血清加UF所得者（圖1B)。Μ細胞狀 況由SSH及鹼性磷酸酶（無顯示）及ES、細胞之獨特轉錄 因子納諾格及Qet4之mRNA而確定，且無中胚層⑺及神 經内胚層（Soxl)之標記（圖ic)。 更新所必須。在基 N2及B27成分促進生存率但非自我 30 200523367 . 礎培養基中只提供運鐵蛋白，自我更新及未分化ES細胞擴 展可由LIF加BMP支持數個繼代，但非單獨由LIF。因此 BMP之需要非由B27中的成分所誘發。 我們測試BMP相關生長及分化因子-6 (GDF_6)發現在 LIF存在下類似地支持ES細胞自我更新（圖1A)。此非為 TGF-β超家族之一般特徵，然而其限定為BMP受體配基之 特徵。當活化素增加的生存率及/或增殖但不抑制分化時， TGF-β 1對ES細胞無可分別的效果。 為測試由LIF加BMP支持的ES細胞繁殖效率，我們 進行電穿孔及篩選穩定轉染體。穩定表現MwGF尸之菌落可 輕易地分離（圖2A)並可放大成大量培養，顯示在基因操作 步驟中使用無血清系統的可行性。 接著研究分離ES細胞的自我更新。單一 ES細胞轉移 至96孔盤及加入單獨LIF或LIF加BMP4之N2B27中（圖 2B)。在單獨LIF存在下形成之單一菌落包含高比例的分化 細胞且無法再擴展。相反的，未分化的菌落在12/192孔LIF 加BMP4中形成及其中10個在不含血清下複製（表）。 ES細胞培養在LIF加BMP4於多代後維持雙套染色 體。其亦維持分化的能力。去除LIF及BMP4造成神經分 化。移除LIF保留BMP造成分化為片狀或扁平表皮狀細 胞。因此對BMP之自我更新反應仍依賴持續的LIF訊號。 老鼠ES細胞之定義的功能性有助於為其重新進入胚胎 發育及有助於嵌合體老鼠中分化組織的所有細目之能力。 在含有LIF加BMP4之N2B27中繁殖3週後將GFP報告物 31 200523367 . ES細胞注射入老鼠囊胚。在懷孕中期分析以確認數個具有 高比例ES細胞之組織之嵌合體（圖2C)。作為較嚴格的測試 我們使用/⑽轉染之ES細胞並在LIF加BMP4中篩選及 擴展。獲得生產的嵌合體且兩隻雄性動物遺傳ES細胞基因 體（圖2D)。 不含餵養細胞或血清之ES細胞取得 研究對BMP之反應是否為建立ES細胞於培養之適應 反應或於ES細胞取得起始階段過程中所顯現的。培養囊胚 於添加BMP加LIF之N2B27中。數天後分離擴展的内細胞 團（ICM)並培養於相同的培養條件。在起始試驗培養分離的 ICM 5-6天（取得ES細胞之標準時間）後，並無獲得ES細胞 菌落（Nichols 等人，1990 ; Robertson，1987)。然而，在無 血清存在且BMP存在下，ICM顯現生長降低並較快速開始 明顯的分化。因此在培養在只有LIF之囊胚只4天後分離 ICM，並於再培養時加入BMP4。在這些條件下可形成初級 ES細胞菌落（圖2E)。這些可被繼代培養及擴展成形態上未 分化之ES細胞。一品係（SF1)進一步被確定特徵。移除LIF 及BMP時，SF1 ES細胞進行活體外神經分化。此外，SF1 細胞產生的大量嵌合體老鼠（圖2F)。12隻嵌合體皆為雄 性，顯示性別轉換高度地由XY ES細胞所促成（Bradley等 人，1984)。 因此，根據藉由在gpl30訊號及從TGF-β超家族的受體 的下游訊號之活化劑的存在下培養再培養細胞之發明取得 ES細胞。 32 200523367 未分化之ES細胞表現功能性BMP訊號機制 單一細胞選殖及在LIF加BMP培養下幾乎完全無分 化，顯示BMP的功效可能直接作用於ES細胞而非經由分 化之後代作用。然而，之前的研究報告在ES細胞分化過程 中之BMP受體表現及BMP反應（Adelman等人，2002 ; Hollnagel等人，1999)並未證實ES細胞在未分化階段是否 確實可對BMP反應。為確認這點我們使用選擇OcW轉置基 因活性（Ying等人，2002)以純化未分化細胞用於RNA及蛋 白質分析。 BMP經由型態1及型態2絲胺酸/羥丁胺酸激酶之異質 雙合體作用（Shi and Massague，2003)。未分化之ES細胞顯 示少量或無型態I万所mRNA，但同時表現型態I 及型態II 受體mRNA (圖3A)。BMP4及GDF6轉錄 亦可輕易在未分化之ES細胞中偵測到。BMP受體之下游主 要作用物為 Smad 轉譯因子（Attisano and Wrana，2002 ; von Bubnoff and Cho，2001)。R-Smads 1、5 及 8 被〉、舌 4匕的 BMP 受體複合物補充及磷酸化，並接著與Smad4組合及轉位至 細胞核中。使用對Smadl之活化的絲胺酸磷酸化形式專一 性之抗體之免疫轉潰法研究Smad活化。在未分化之ES細 胞中Smadl鱗酸化的增加在BMP4加入後為明顯的（圖 3B)。BMP的刺激亦促進p38及erk經分裂素活化之蛋白質 激酶（1小時）之基礎活化（圖3B)。 這些資料證實未分化之ES細胞擁有反應BMP刺激之 訊號傳遞機制，且另可具有經由產生BMP4及GDF之自迴 200523367 . 分泌刺激潛力。 BMP經由Smad活化支持自我更新。 LIF之自我更新作用為經由轉譯因子STAT3媒介 (Matsuda 等人，1999 ; Niwwa 等人，1998)。單獨 BMP 無 法活化STAT3，其以酪胺酸705之磷酸化測量（圖3C)。其 亦無法增加LIF活化STAT3°ES細胞自我更新不需要gpl30 下游的Erk活化，但其似乎為一前分化訊號（Burdon等人， 1999a)。因此降低Erk活性會促進ES細胞分化（Buehr and Smith，2003)及促進自我更新（Burdon等人，1999b)。因此 反應LIF之Erk活化不受BMP的存在而抑制（圖3B)。這些 資料指出BMP並無調節ES細胞中之gp 130訊號傳遞，其 暗示BMP訊號途徑直接造成自我更新。 我們將抑制Smad家族成員，Smad6及Smad7 (Shi and Massaque，2003 ; von Bubnoff and Cho，2001)，導入 ES 細 胞中以拮抗BMP訊號。細胞被轉染並在經嘌呤黴素篩選及 血清及LIF存在下生長。Smad6或Smad7表現載體相較於 以空的載體轉染產生較少量及較小的ES細胞菌落。此外， Smad6及即使Smad7轉染體在繼代培養後之擴展較差。高 度的分化在此轉染的細胞族群中被證實。在附著培養中神 經分化通常被血清抑制，但在Smad7轉染後輕易地出現（圖 3D)。 除了阻斷Smad活性，Smad6/7亦可抑制BMPR下游之 TAK/p38途徑（Kimura等人，2000)。為評定p38在ES細胞 中潛在的作用，我們使用專一性抑制物SB203580 (Cuenda 200523367 • 等人，1995)。該試劑對BMP支持自我更新的能力無顯著效 果（圖3E)。在單獨LIF中，SB203580並無改變自我更新及 神經分化間的平衡，但顯現提升整體細胞活性，顯示在ES 細胞及其他細胞型態中p38為前細胞凋亡（Kimura等人， 2000) 〇 Smad途徑因此可能為自我更新訊號之轉導器。

Smad及STAT3之間的共轉譯調節機制在神經上皮細胞 中已確認（Nakashima等人，1999; Sun等人，2001)。其包 括由普遍存在的轉譯共活化劑p300架橋連結所形成的三元 複合物，且造成神經膠細胞專一性啟動子之協同活化。我 們探討在ES細胞中以LIF加BMP刺激是否會形成含有 STAT3及Smads之複合物。免疫沉澱接著以FLAG標記之 Smadl轉染指出活化的STAT3及Smadl可共集中在一處（圖 3F)。此結論由LIF加BMP刺激後内生磷酸化之Smad 1及 STAT3之共免疫沉澱而證實（圖3F)。 ES細胞中之BMP標的基因

為造成ES細胞自我更新，BMP/Smad及LIF/STAT3訊 號可同時在不同標的基因上操作及/或集中在一般標的基 因，例如經由具有p300之三元複合物。我們使用即時 RT-PCR檢視在Oct篩選的ES細胞中可由LIF、BMP、或 LIF加BMP誘發之候選基因（圖4A)。兩個已知LIF標的 及顯示對BMP無反應。另外兩個，>/25及特別是 ，在BMP存在下可由LIF高度誘發。這些資料顯示 STAT3標的基因之亞群可對以BMP共刺激反應。然而，JunB 或Socs3皆非自我更新之作用劑的候選者：万無效之ES 35 200523367 , 細胞顯示無缺失（Schorpp-Kistner等人，1999)，且SOCS3 作用為gp 130訊號之負回饋調節劑作用（Schmitz等人， 2000)，當過表現時其阻斷自我更新。 我們亦試驗/^/基因的表現，其編碼出負bHLH因子並 已證明其在神經上皮細胞 （Nakashima等人，2001)及C2C12 肌纖維母細胞（Lopez_Rovira等人，2002)中由BMP/Smad誘 發。由BMP誘發之mRNA亦報告在分化之ES細胞培養 中（Hollnagel等人，1999)。我們發現/W及/W強烈地由 BMP (及GDF，無顯示）誘發，但不由LIF誘發（圖4A)。北 方雜合確認這些發現並擴展至Id2 (圖4B)。活化素（資料無 顯示）及TGF-βΙ皆無誘發/3基因表現指出該反應對BMP 受體下游之Smads具專一性。 /3基因亦可由胎牛血清及纖維連接蛋白所誘發，雖然 比由BMP誘發較少擴展（圖4B)。培養在血清中之ES細胞 顯示可輕易彳貞測穩定量之Id mRNA。我們試驗誘發Id2及 Id3之纖維連接蛋白是否可在N2B27培養中取代BMP。可 溶纖維連接蛋白組合LIF可延展未分化之Oct4-Gip細胞至 少10個繼代，雖然比在BMP中具有較多分化且族群擴展 較慢。 避開ES細胞自我更新對BMP或血清之需要構成Id 我們假設Id誘發可提供專一性神經分化限制以補償 STAT3之自我更新活性。據此準備用於Idl、Id2及Id3之 表現構築並將這些構築導入ES細胞中。菌落輕易地由游離 型超轉染及傳統的穩定插入而恢復。對於Idl，提高的蛋白 200523367 - 質表現係由免疫轉潰法確認（圖4C)。轉殖基因的過度表現 似乎與内生性Idl蛋白質降低有關，其暗示有回饋或自動調 節迴路的操作。 . 強迫之Id表現並無減少ES細胞自我更新且無阻斷在血 清存在下之分化。在這些條件下轉染物與親本ES細胞或空 的載體轉染物無明顯不同。相反的，在無血清N2B27中， 保留LIF依賴性之Id轉染物則不再需要BMP。這些細胞在 LIF單獨存在時之增殖與在lif加BMP中之具有少量分化 之親本ES細胞同樣快速且只有一點不同。該培養可被繼代 籲 培養數次且不改變未分化型態或因子依賴性。ES細胞表型 由OeW及心心客mRNA之表現而確認（圖4D)。作為/3表 現以取代血清或BMP/GDF之能力的嚴格測試，我們在 N2B27中培養單一細胞。在單獨LIF中形成之未分化可繼 代之菌落對於從LIF加BMP中分離之細胞所形成之菌落具 有比較性頻率（10%)(表）。

Id蛋白質對於£8細胞分化施予譜系專一性阻斷 在我們的培養中，LIF對id轉染體之自我更新為必須癱 的，因Ids並未完全阻斷Es細胞分化。若uf從含血清培 養基中去除，則Id轉染細胞分化如同親本ES細胞。在附 著坧養中其大部分產生具有一些纖維母細胞之扁平化表皮 Γ也在聚集時其形成具有中胚層⑺及内胚層（仙⑷標 記表現之活化之胚體（資料無顯示）並發展心肌細胞分化的 自發性收縮指標。麩而，/— τ …、而在無LIF之Ν2Β27中，Id轉染體 之行為不同於其他ρς 4 S旧胞。神經分化藉由形態學及 37 200523367 - Sox/-GFP之活化而確定為最小的（圖5A)。取代分化成扁平 狀表皮細胞的薄片之轉染體，類似暴露於單獨BMP中之親 本ES細胞（cf圖1A)。 我們製備可回復表現之構築以測試自我更新及神經分 化之阻斷是否依賴持續的Id表現。我們產生表現兩側接上 Idl之46C ES細胞（fldl細胞）及接著產生Cre處理之分化克 隆（fldlC)，其中/W轉殖基因被移除。Cre移除後，fldlC 細胞顯示無FLAG-Idl及内生Idl的回覆程度（圖4C)。fldl 及fldlC細胞以克隆密度培養在含有LIF或LIF加BMP之 N2B27中。fldl細胞在單獨LIF中有效形成幹細胞菌落， 但這種能力在fldlC細胞中失去，其在不含BMP之LIF中 只產生分化細胞（圖5B)。在N2B27單獨中，fldl細胞進行 非神經分化，然而其fldl C細胞以與親本ES細胞同樣的方 式作用，其產生高比例之TuJ陽性神經元（圖5C)。 這些觀察指出Id表現專一性阻斷神經譜系並轉換分化 ES細胞成其他命運，例如在無LIF存在下以BMP處理之觀 察（Ying等人，2003)。Id表現之ES細胞因此完全依賴 LIF/STAT3以抑制非神經譜系及多能性的維持。 神經性的bHLH轉譯因子已知可由發展中的CNS中之 Id蛋白質拮抗（Lyden等人，1999)。活體内這些bHLH因子 在神經管生成前並無報告。然而，培養之ES細胞顯示mRNA 的表現預期只在分化的譜系中發現（Ramalho-Santos等人， 2002)。因此我們探討以Oct4篩選之ES細胞中之兩個bHLH 基因，及之潛在表現。其neurogenin2 38 200523367 . mRNA偵測無高於背景值，mashl mRNA則顯示相對充足（圖 5D)。我們假設Id表現對於避免ES細胞由mashl的早熟表 現及其他前神經bHLH因子所誘發之持續神經分化為必須 的（Norton，2000) 〇

Id蛋白質以高度結合性結合普遍存在的HLH因子，E 蛋白質（Norton，2000)。任一個的過度表現將隔離並阻斷另 一個的活性。為確定Id蛋白質對於ES細胞增殖是否為正 常所需，我們藉由以單獨游離型超轉染或與Idl或Id3共轉 染而過度表現E47蛋白質。E47單獨或與空的載體共轉染產 生少量、非常小及缺乏生氣的菌落（圖5E)。相反的，健康 的ES細胞菌落可由五47與/d載體共轉染產生。在含血清 培養基中以Id單獨或以空的載體轉染的細胞之共轉染菌落 顯示無法區別。其顯示增加的E47為非毒性但因隔離Id而 具有專一性生長抑制作用。特定程度之游離的Id對於ES 細胞增殖是必須的，如在其他細胞形態所觀察（Norton， 2000)。當轉移至不含LIF或BMP之N2B27中，共轉染進 行神經而不是非神經的分化，由厂GFP活化而顯示（圖 5F)。因此E47中和Id的神經抑制效果。此與Id作用於限 制E蛋白質用於與前神經bHLH因子共同作用之效用一致。 納諾格可避開BMP或血清之需要 增加量之不同的同源域蛋白質納諾格使得ES在血清存 在下不依賴LIF/STAT3之自我更新（Chambers等人，2003)。 我們試驗LIF及/或BMP對於在N2B27中過度表現納諾格 之ES細胞是否為必須的。圖6A顯示EF4細胞表現兩側接 39 200523367 上勿諾袼轉殖基因可在不含LIF或BMP之N2B27中增殖。 此行為可直接歸因於納諾格，因取得之EF4C細胞其中勿諾 袼已被Cre重組酶移除，其可快速進行神經分化。單獨加入 BMP對於EF4細胞無明顯效果，除非當一些分化變成明顯 時，不繼代培養維持培養6天以上（見討論）。加入LIF，含 或不含BMP，EF4細胞在培養盤上附著較平均（圖6A)且族 群倍增率增加。此與先前指出的LIF/STAT3及納諾格對ES 細胞之組合效果一致（Chamber等人，2003)。 因為納諾格使得BMP或血清刺激為多餘的，我們探討 EF4細胞是否表現Ids。在不含LIF或BMP之N2B27中培 養過夜後，Idl及Id3的表現在親本E14Tg2a細胞中為明顯 地降調節。相反的，在EF4細胞中Idl mRNA為降低的但 仍相當可觀，且Id3 mRNA確實為增加的（圖6B)。因此射 諾#的過度表現可用於持續維持Id表現的實質量。 實驗步驟 ES細胞培養 ES細胞以不含餵養細胞維持。於無血清培養，ES細胞 培養在明膠塗布之盤上及 N2B27培養基中（Ying and Smith，2003)，添力a 10ng/ml 之 LIF (Sigma)及 lOng/ml 之 BMP4 或 200ng/ml 之 GDF6 (R&D System)。細胞每 2-4 天以 無酵素細胞分離緩衝液（Invitrogen)或0.025%之胰蛋白酶 /1 %雞血清繼代培養。分離的細胞收集於N2B27中並形成團 塊。吸除上清液且將細胞團塊再懸浮於N2B27中並直接再 培養。於單一細胞選殖時，使用預先裝填N2B27之細的拉 200523367 ， 長巴斯德吸管挑取個別細胞成10μΐ之水滴。水滴個別轉移 至每孔預先裝填150μ1含有LIF或LIF加ΒΜΡ4之Ν2Β27 之96孔盤。8天後，確定ES細胞菌落並繼代培養。為產生 嵌合體，將ES細胞注射入C5 7B/6囊胚細胞中。性腺遺傳 (germline transmission )係以交配雄嵌合體與雌C57B/6測 試。 於無血清培養基中ES細胞之取得 129品係小鼠在懷孕後第3天去卵巢且胚胎在休眠期4 天後沖出（Nichols等人，1990)。完整的囊胚培養在明膠塗 布之塑膠上及在添加LIF (10ng/ml)之N2B27中。3-6天後 挑取每一個培植體的中心團，以PBS清洗並置於一滴胰蛋 白酶中數分鐘。細胞團以預先裝填N2B27之細的拉長巴斯 德吸管吸取，確定胰蛋白酶殘留為最少量，並以輕微摩碎 移出至添加LIF及BMP4 (10ng/ml)之N2B27之新的孔中。 所得初級ES細胞菌落單獨繼代培養至96孔盤的每一孔 中。之後，細胞係藉由胰蛋白酶化整個培養並在培養前離 心及吸除而擴展。 RNA分析

Oct4GiP ES細胞（Ying等人，2002)係在嘌呤黴素存在 下培養4-6天以除去分化之細胞。純化之ES細胞係培養在 加LIF之完整培養基中24小時，接著以PBS清洗一次並在 以 20ng/ml 之 LIF、50ng/ml 之 BMP4、LIF 加 BMP4、10ng/ml 之TGF-βΙ (皆為R&D System)或15% FCS刺激45分鐘之前 轉移至N2B27培養基中過夜。定量RT-PCR使用LightCycler 200523367 設備（Roche)進行。數據以Oct4增殖相對標準化。引子對及 反應條件在要求下可得。北方雜合係以全部RNA的5pg劑 量進行。 質體構築及轉染

Smad6 及 Smad7 質體係由 Hitoshi Niwa 提供及 FLAG-標記之Idl係由Tetsuya Taga提供。大鼠Id2、Id3及E47 開放讀碼區（ORF)係以PCR增殖，選殖入pCR2.1，並以無 突變序列分析確認。表現載體係以游離型或穩定插入導入 ES細胞。兩側接上Idl及Cre移除之分化ES細胞株係利用 Chamber等人於2003年所述之方法取得0 免疫化學 預先篩選之Oct4GiP ES細胞在以LIF (20ng/ml)、BMP4 (50ng/ml)或LIF加BMP4刺激15分鐘至1小時之前轉移至 N2B27培養基中過夜。鱗酸化之stat3、smadl、erkl/2及 p38係以免疫轉潰法偵測（Cell Signalling Technology)。細胞 溶解及免疫沉澱（Nakashima等人，1997)使用抗-FLAG (Sigma)或抗 _Stat3 (Transduction Labs)。免疫染色如所述進 行（Ying 等人，2003)。 參考資料

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Id轉染後單一 ES細胞在含LIF加BMP或含LIF單獨之無 血清培養基中之繁殖 親代ES細胞 Idl轉染體 LIF LIF+BMP4 LIF LIF+BMP4 挑選之單一細胞數目 96 192 192 192 在第8天形成之菌落數目 1 12 19 22 擴展之菌落數目 0 10 16 20 【圖式簡單說明】 圖1顯示在無血清培養基中LIF加BMP支持ES細胞 自我更新； 圖2顯示在含有LIF加BMP之N2B27中ES細胞的成 株性、潛力及取得； 圖3顯示ES細胞中之BMP訊號； 圖4顯示ES細胞中Ids的表現及功能； 圖5顯示Id抑制神經分化及對於ES細胞自我更新是必 須的； 圖6顯示納諾格避開BMP/血清的需要以誘發Id ;及 圖7顯示BMP/Id及LIF/STAT3之合作譜系限制。 【主要元件符號說明】 無 53 200523367 序列表_ 用於本發明特定實施態樣之序列及本發明特定融合蛋白之序列係列 於下。 SEQ ID No： 1 小鼠Id3之胺基酸序列 2 大鼠Id3之胺基酸序列 3 犬Id3之胺基酸序列 4 人類Id3之胺基酸序列 5 來自Tat之蛋白質傳遞區域 6 來自觸角之蛋白質傳遞區域 7 Tat-人類Id3融合 8 觸角-人類Id3融合 9 小鼠Id3-觸角融合 SEQIDNo: 1 小鼠 Id3

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HLPIQTAELTPELVISKDKRSFCH SEQ ID No: 2-大鼠 Id3

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HCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQWLAEPAPGPPDGP 54 200523367 - HLPIQTAELTPELVISKDKRSFCH SEQIDNo:3-犬 Id3

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HLPIQTAELAPELVISKDKRSFCH SEQIDNo:4_人類Id3

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HLPIQTAELAPELVISKDKRSFCH SEQ ID No: 5-來自Tat之蛋白質傳遞區域

YGRKKRRQRRR SEQ ID No: 6 _來自觸角之蛋白質傳遞區域

RQIKIWFQNRRMKWKK SEQ ID No: 7 - Tat-人類 Id3 融合 55 200523367

YGRKKRRQRRRKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAA

EEPLSLLDDMNHCYSRRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLA

EPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISKDKRSFCH SEQ ID No: 8 -觸角-人類Id3融合

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KGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILD

LQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISKDKRSFCH SEQ ID No: 9 -小鼠Id3-觸角融合

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HLPIQTAELTPELVISKDKRSFCHRQIKIWFQNRRMKWKK

56

Claims (1)

1. 200523367 十、申請專利範圍： 1·種Id基因產物用於促進典盖私 心遣^蚕物中多潛能細胞的自 我更新之用途。 2.根據中請專利範圍第i項之用途，其係使用w基因 產物及gp 13 0下游訊號途徑之活化劑之組合。 3·-種用於促進培養物中多潛能細胞的自我更新之組 合的用途，該組合為 (i) 增加Id蛋白質表現或活性之試劑；及 (ii) gpl30下游訊號途徑之活化劑 之組合。 4·根據申請專利範圍第丨至3項中任一項之用途，其中 該gp 1 30下游訊號途徑之活化劑為lif。 5·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中 該多潛能細胞為胚胎幹細胞。 6·根據申請專利範圍第5項之用途，其中該胚胎幹細胞 為小鼠細胞或人類細胞。 7·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該試劑⑴係選 自誘發Id基因表現或Id蛋白質活性之纖維連接蛋白 (fibronectin)、纖維連接蛋白受體之激動劑、整合素（integrin) 訊息的活化劑、納諾格（nanog)及前述之同系物。 8. 根據申請專利範圍第1項之用途，其包含誘發Id基 因表現。 9. 根據申請專利範圍第1項之用途，其包含基因操作多 潛能細胞以使其表現Id基因。 57 200523367 10·根據申請專利範圍第1項之用途，其包含將包含Id 基因之載體導入多潛能細胞中。 11 ·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該Id基因產 物為Id蛋白質。 12·一種促進培養物中多潛能細胞的自我更新之方法， 其包含（1)在細胞中表現Id基因或誘發Id基因表現，或 將細胞培養在含有Id蛋白質之培養基中，及（2)活化 GP130下游訊號。

   13.根據申請專利範圍第12項之方法，其包含在細胞中 附加地表現Id基因。 14.根據申請專利範圍第13項之方法，其包含由包含可 誘發的啟動子之附加載體表現Id基因。 15·根據申請專利範圍第12至14項中任一項之方法， 八〇 s藉由培養该細胞在包含經由gp丨3〇作用之細胞介素 之培養基中而刺激gpl 3〇下游訊號。 1 6·根據申請專利範圍第1

   乂 木13項心万沄，其中該細胞介 係選自LIF、CNTF、心臟簦盖妾+ t 纖呂養素（Cardiotrophin)、抑瘤 (〇nc〇statin) M、及 IL_6 及 sa_6 受體之組合。 17.-種用於促進培養物中多潛能細胞的自我 丨 合的用途，該組合為 、 ⑽基因表現及/iUd蛋白f活性之直接活化劑或效應 诏，其非為經由TGF-超家族受體作用者；及 一 ''' (ii)gpl30下游訊號途徑之活化劑之組合。 細胞自我更新之方法， 18·—種培養ES細胞以促進ES 58 200523367 " 其包含維持該ES細胞在含有： (i)id蛋白質或Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接 活化劑或效應劑，其非為經由TGF_超家族受體作用者；及 〇i)gp 1 30下游訊號途徑之活化劑 之培養基中。 1 9· 一種培養ES細胞之方法，其包含： (a) 在經由gpl30作用之細胞介素及血清或血清萃取物 存在下維持該ES細胞在培養物中多潛能狀態，視需要在餵 養細胞上； (b) 繼代培養該ES細胞至少一次； (c) 從孩培養基移除該血清及血清萃取物及移除該餵養 細胞（若其存在），以使該培養基無餵養細胞、血清及血清萃 取物，及 (d) 之後在 (i) Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效應 劑’其非為經由TGF_超家族受體作用者；及 (ii) gpl30下游訊號途徑之活化劑 存在下維持ES細胞在多潛能狀態。 2〇· 一種獲得經轉染的ES細胞族群之方法，其包含： —p (a)以編碼有可篩選的標記的構築體轉染es細胞，該可 師選的標記係操作地連接於一啟動子，該啟動子在ES細胞 中優先表現該可篩選的標記； (b) 培養該g；S細胞； (c) 在 59 200523367 (i)Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效應 劑，其非為經由TGF-超家族受體作用者；及 (i〇gpl30下游訊號途徑之活化劑 存在下培養該ES細胞；及 (d)篩選出表現該可篩選的標記之細胞。 21·21·—種培養ES細胞之方法，其包含轉移單一 es細 胞至培養管及在 U)Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效 應劑’其非為經由TGF-超家族受體作用者；及 (b)gp 1 3 0下游訊號途徑之活化劑 存在下培養該ES細胞，以獲得Es細胞之菌落族群， 其皆為單一 ES細胞的繼代。 22.22.—種誘導ES細胞分化為非神經外胚層之方法， 其包含： (M 在經由gP 130作用之細胞介素 及1d基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效應 劑，其非為經由TGF_超家族受體作用者，存在下維持Μ 細胞；及 (b)移除該細胞介素其間； (cl)維持該Id基因表現及/或id蛋白質活性之直接活化 劑或效應劑；及/或 (c2)加入額外的可誘導分化之訊號分子。 23·—種用於Es細胞的自我更新之培養基，其包含： (1)基礎培養基； 200523367 J (2)Id基因表現及/或Id蛋白質活性之直接活化劑或效 應劑’其非為經由TGF-超家族受體作用者； (3) gp 130下游訊號途徑之活化劑；及 (4) 鐵轉運子； 其中該培養基無血清或血清萃取物。 24·—種從囊胚取得多潛能細胞之方法，其包含： (1) 獲得囊胚； (2) 在gp 130下游訊號途徑之活化劑存在下培養囊胚， 以獲得内細胞群； _ (3 )分離内細胞群·， (4) 從分離的内細胞群分離細胞；及 (5) 在gp 130下游訊號途徑之活化劑及Id基因或Id基因 表現產物之活化劑存在下培養該分離的細胞。 25·25·根據申請專利範圍第24項之方法，其包含在LIF 中培養該囊胚。 26·根據申請專利範圍第24或25項之方法，其包含在 LIF及BMP受體激動劑之組合中培養該分離的細胞。 · 27·根據申請專利範圍第24項之方法，其包含培養該囊 胚自2至4天之期間。 28·根據申請專利範圍第24項之方法，其包含培養該分 離的細胞在無血清之培養基中。 29·根據申請專利範圍第24項之方法，其包含培養該囊 胚在無血清之培養基中。 30.根據申請專利範圍第24項之方法，其包含在無BMp 61 200523367 受體激動劑存在下培養該囊胚。 31. —種載體，其包含操作地連接於 32. 根據申請專利範圍帛31項、文動子之Η基因 可誘發的啟動子。 、 ，其中該啟動子3 33_根據申請專利範圍第31 載體。 ’ 、之載體，其為附办 34·—種包含誘發1(1蛋白質表 劑非為經由TGF_超家族受體作用者。1之培養基，該言i

   35·—種包含Id蛋白質之培養基。 36. 根據申請專利範圍第35項之培養 異位域之1d蛋白質，以促進Η蛋白質異位穿過多：：接於 細胞膜。 貞吳位穿過夕潛能細胎 37. 根據中請專利範圍第35或％項之培養基，其勺a 連接於TAT、VP22或穿透胜（Penetratin)之ld蛋白質。匕3 38·一種組合物，其包含1d蛋白質及異位域。 39.根據申請專利範圍第％項之組合物，其包含融 白。 ϋ龙

   4〇·根據申請專利範圍第38或39項之組合物，其_ 融合蛋白包含TAT、VP22或穿透胜。 ^ 41·一種在多潛能細胞中誘發“蛋白質活性之試劑的用 途其係用於促進該多潛能細胞自我更新。 42·根據申請專利範圍第41項之用途，其中該試劑增加 該細胞中Id蛋白質的量。 田 43·根據申請專利範圍第41項之用途，其中該試劑包含 62 200523367 ， 根據申請專利範圍第3 8項之組合物。 44· 一種藉由在gp 130訊號及活化及/或η蛋白質表現^ 在下活體外培養多潛能細胞而獲得之細胞。 45·—種獲得分化之細胞之方法，其包含 (la) 在細胞中表現id基因或誘發id基因表現，及 (lb) 在該細胞中活化GP130下游訊號， (2) 分化該細胞；及 (3) 獲得分化之細胞。 46.根據申請專利範圍第25項之方法，其中步驟（〇的 細胞包含一構築體，其中 編碼可筛選的標記之核苷酸係操作地連接於在希望的 細胞中優先表現該可篩選的標記之啟動子。 47·根據申請專利範圍第46項之方法，其包含筛選表現 該可篩選的標記之細胞。 48·—種藉由根據申請專利範圍第45至47項任一項之 方法所獲得之細胞。 49. 一種獲得多潛能細胞之方法，其包含 在細胞中表現Id基因或誘發Id基因表現，或在含有Id 蛋白質之培養基中培養細胞，及在該細胞中活化Gpi3〇下 、參Λ號其中该細胞係從胎兒或成體的體細胞或組織獲得。 5〇·根據申請專利範圍第49項之方法，其中該多潛能細 胞特徵在於其對Rexl、〇ct4及納諾格為正反應。 5 1 · 一種藉由根據申請專利範圍49至50項中任一項之 方法而獲得之細胞。 63 200523367 52·一種具有取代Id蛋白質活性之因子之分析，其包含： (1)在Id蛋白質活性及gpl %下游訊號存在下培養細 胞，因此維持該細胞在多潛能狀態； (2) 移除或減少該Id蛋白質活性； (3) 將該因子導入該細胞中；及 (4)測定該細胞是否仍為多潛能或分化的。 53.根據申請專利範圍第52項之分析，其中在Id蛋白 質活性存在下培養該細胞⑴包含⑷表現^基因⑻誘

   發Η基因表現或（b)加入Id蛋白質於培養該細胞之培養 基0 其中導入 加入該因

   54.根據申請專利範圍第52或53項之分析， 該因子於該細胞中包含⑷表現該因子，^ ’ 子於培養該細胞之培養基。 54項之方法而獲得 55·—種藉由根據申請專利範圍第 之因子。 十一、圖式： 如次頁 64