JP4185489B2 - Es細胞自己再生および系統仕様の制御ならびにそのための培地 - Google Patents
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Description
(a)TGF−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター;および
(b)gp130下流シグナリング経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。
(a)TGF−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター;および
(b)gp130下流シグナリング経路のアクチベーター
を含む培地中でES細胞を維持する工程を含む。
(a)TGF−βスーパーファミリーのレセプターのアゴニスト;および
(b)gp130を介して作用するサイトカイン
を含む培地中でES細胞を維持する工程を含む。
gp130を介して作用するサイトカインおよび血清または血清の抽出物の存在下、必要に応じてフィーダー細胞上で、ES細胞を培養中に多分化能性状態に維持する工程;
該ES細胞を少なくとも1回継代する工程;
該培地がフィーダー細胞、血清、および血清抽出物を含まないように、該培地から血清または血清抽出物を除去する工程および(存在するならば)フィーダー細胞を除去する工程;および
その後、TGF−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターおよびgp130下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下でES細胞を多分化能性状態に維持する工程。
選択可能マーカーをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレーティングする工程;
該ES細胞を、
(a)TGF−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター;および
(b)gp130下流シグナリング経路のアクチベーター
の存在下で培養する工程;および
該選択可能マーカーを発現するES細胞を選択する工程、を含む。
基本培地;
TGF−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター;
gp130下流シグナリング経路のアクチベーター;
鉄トランスポーター
を含み、この培地は、血清および血清抽出物を含まない。
(a)TGF−βレセプターのアゴニスト;および
(b)gp130を介して作用するサイトカイン
を含む細胞培養培地を提供する。
(a)gp130を介して作用するサイトカイン;および
(b)TGF−βレセプターのアゴニスト;および/または
(c)FGFレセプターのインヒビター
を含む培地中で、胚、胎児、または成体由来の組織を培養する工程を含む。
(a)FGFレセプターシグナリングのインヒビター;および
(b)gp130下流シグナリング経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。
N2B27 (改変N2(25μg/mlのインスリン、100μg/mlのアポトランスフェリン、6ng/mlのプロゲステロン、16μg/mlのプトレシン、30nMの亜セレン酸ナトリウム、および50μg/mlのウシ血清アルブミン)を補充したDMEM/F12培地とB27を補充した神経基本培地との1:1混合物)
Oct4GFP(クローンC1)ES細胞を、0.1%ゼラチンコーティングしたディッシュにおいて、LIFおよびSU5402を補充したN2B27培地(実施例1を参照のこと)中で培養した。2継代後、細胞をLIFおよびBMP4を補充したN2B27培地中で培養した。さらに2継代後、形態を示すために位相差下で細胞の光学顕微鏡画像を撮し、GFPの発現を示すためにUV蛍光を測った。顕微鏡画像を図1に示す。
E14 TG2A ES細胞を、N2−B27付加物を補充しそしてLIFおよびBMP4も補充したDMEM F12+神経基本培地中で培養した。細胞を、0.1%ゼラチンコーティングしたプレート上で増殖し、採取し、そしてpPCAG−tauGFP−IPとともに電気泳動した。トランスフェクトした細胞を、105〜106/ディッシュの密度で10cm径のディッシュ上に再プレーティングした。24時間後、0.5μg/mlのピューロマイシンを添加して、陽性コロニーを選択した。
上記実施例3に記載のように得たGFP発現ES細胞を、胚盤胞に注射した。GFP発現ES細胞は、図3(11日目胚)に示すように、キメラマウス胚において広範な細胞タイプに寄与した。キメラコートを有する生きて生まれたキメラマウスを得、細胞が真のES細胞であることを確認した。
個々のES細胞を取り出し、そして96ウェルプレートのウェルに移し、そして上記実施例3に記載のように培地中で培養した。
ES細胞を、IGF−1 10μg/ml(または5〜25μg/mlのインスリン)、アポトランスフェリン 100μg/ml、プロゲステロン 6μg/ml、プトレシン 16μg/ml、および亜セレン酸ナトリウム 30nmolを補充したDMEM F12+神経基本培地(1:1の割合)を含む、完全限定のアルブミンを含まない培地中で増殖した。
ES細胞を、最初に、N2−B27を補充したDMEM F12+神経基本培地(1:1の割合)を含む培地中で増殖した。ES細胞を、3.5cm径プレート上に約1000〜10,000細胞の非常に低密度でプレーティングし、そしてLIFおよびBMP4を補充した同じ培地中で増殖した。
LIF/BMP4/アクチビンA(5ng/ml)>LIF/BMP4/TGF−β(1〜2ng/ml)>LIF/アクチビンA>LIF/BMP4>LIF/TGF−β1>LIFのみ
であることが見出された。
LIF/BMP4>LIF/BMP4/アクチビンA>LIF/BMP4/TGF−β>LIF/アクチビンA=LIFのみ
に変化した。
発明者らは、0.1%ゼラチンコーティングした6ウェルプレートにおいて、4×105細胞/ウェルの密度で、以下の培地中にてOct4GFP ES細胞を培養した:N2B27+LIF、N2B27+LIF+BMP4、およびGMEM 10%FCS+LIF。結果を表1に示す。細胞解離緩衝液を用いて、細胞を解離させた。5継代後、N2B27+LIF中で増殖した細胞の数は、培養を続けるには十分ではなかった。
Claims (39)
- 培養中に多分化能性細胞の自己再生を促進するための組成物であって、
(a)BMP4;および
(b)LIF
を含む、組成物。 - 分化を抑制する薬剤の存在下でのES細胞の培養のための、請求項1に記載の組成物。
- 前記薬剤が、分化を抑制し得るFGFレセプターインヒビターである、請求項2に記載の組成物。
- 前記FGFレセプターインヒビターが、SU5402またはPD173074である、請求項3に記載の組成物。
- 分化を抑制する薬剤の存在下で最初に、そして続いてこの薬剤が回収される培地中でのES細胞の培養のための、請求項2から4のいずれかの項に記載の組成物。
- 哺乳動物および鳥類の多分化能性細胞から選択される多分化能性細胞の培養のための、請求項1から5のいずれかの項に記載の組成物。
- 哺乳動物および鳥類のES細胞から選択されるES細胞の培養のための、請求項1から6のいずれかの項に記載の組成物。
- 齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類の多分化能性幹細胞から選択される多分化能性幹細胞の培養のための、請求項1から7のいずれかの項に記載の組成物。
- 齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類のES細胞から選択されるES細胞の培養のための、請求項1から8のいずれかの項に記載の組成物。
- ラットまたはマウスの細胞の培養のための、請求項6または7に記載の組成物。
- ヒト細胞の培養のための、請求項6または7に記載の組成物。
- 血清、血清抽出物、フィーダー細胞、およびフィーダー細胞抽出物を含まない培地中でのES細胞の培養のための、請求項1から11のいずれかの項に記載の組成物。
- 完全限定培地中でのES細胞の培養のための、請求項1から12のいずれかの項に記載の組成物。
- ES細胞の自己再生を促進するための非ヒトES細胞の培養方法であって、
(h)BMP4;および
(i)LIF
を含む培地中で該ES細胞を維持する工程
を含む、方法。 - 前記培地が、分化を抑制し得るFGFレセプターインヒビターをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 非ヒトES細胞の培養方法であって、
gp130を介して作用するサイトカインおよび血清または血清の抽出物の存在下、必要に応じてフィーダー上で、該ES細胞を培養中に多分化能性状態で維持する工程;
該維持する工程と同じ条件下で該ES細胞を少なくとも1回継代する工程;
培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないように、該培地から該血清または血清抽出物を除去し、そして存在する場合は該フィーダーを除去する工程;および
続いて、
(h)BMP4;および
(i)LIF
の存在下で、該ES細胞を多分化能性状態で維持する工程、を含む、方法。 - 分化を抑制する薬剤の存在下で、前記ES細胞を培養する工程を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記分化を抑制する薬剤が、血清または血清抽出物が除去される時期に培養培地に添加される、請求項17に記載の方法。
- BMP4の存在下での細胞の維持と同時またはそれに続いて、前記分化を抑制する薬剤が除去される、請求項18に記載の方法。
- 非ヒトES細胞のトランスフェクトされた集団を得るための方法であって、
非ヒトES細胞を、選択可能マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレーティングする工程;
(a)BMP4;および
(b)LIF
の存在下で該ES細胞を培養する工程;および
該選択可能マーカーを発現するES細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 前記選択可能マーカーが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項20に記載の方法。
- 非ヒトES細胞の培養方法であって、
個々の非ヒトES細胞を培養容器に移す工程;および
(a)BMP4;および
(b)LIF
の存在下で該ES細胞を培養して、すべてが該ES細胞の子孫であるES細胞のクローン集団を得る工程
を含む、方法。 - 前記培養容器が、プレート上の個々のウェルである、請求項22に記載の方法。
- 非ヒトES細胞の神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
(a)BMP4および(b)LIFの存在下で、該ES細胞を維持する工程;および
培地から(a)および(b)の両方を除去する工程
を含む、方法。 - 非ヒトES細胞の非神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
LIFおよびBMP4の存在下で、該ES細胞を維持する工程;および
(I)該BMP4を維持しながら;および/または
(II)分化を指示し得るさらなるシグナリング分子を添加しながら
該LIFを除去する工程
を含む、方法。 - ES細胞の自己再生のための培地であって、
基本培地;
BMP4;
LIF;および
鉄トランスポーター;
を含み、該培地が、血清または血清抽出物を含まない、培地。 - インスリンまたはインスリン様増殖因子をさらに含む、請求項26に記載の培地。
- 前記培地が、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を含まない、請求項26または27に記載の培地。
- ES細胞培養培地であって、
(a)BMP4;
(b)LIF;および
(c)ES細胞分化を抑制する薬剤
を含む、培地。 - ES細胞培養培地であって、
(a)BMP4;および
(b)LIF
を含み、該培地が、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない、培地。 - ES細胞培養培地であって、
(a)BMP4;および
(b)LIF
を含み、該培地が、完全に限定されている、培地。 - ES細胞の分化を抑制する薬剤をさらに含む、請求項30または31に記載の培地。
- 前記LIFが、少なくとも10U/mlの濃度である、請求項26から32のいずれかの項に記載の培地。
- 分化した細胞を得る方法であって、請求項14から22のいずれかの項に記載の多分化能性細胞を培養する工程および該多分化能性細胞の分化を可能にするまたは引き起こす工程を含み、該多分化能性細胞が、多分化能性幹細胞を含む他の細胞タイプと比較して所望の分化した細胞中で分別発現を可能にする選択可能マーカーを含み、それによる該選択可能マーカーの分別発現により、該所望の分化した細胞を優先単離および/または生存および/または分割させる、方法。
- 前記分化した細胞が、組織幹細胞または組織祖先細胞である、請求項34に記載の方法。
- 前記分化した細胞が、最終分化細胞である、請求項34に記載の方法。
- 多分化能性幹細胞または非ヒト胚を単離する方法であって、
(a)LIF;
(b)BMP4;および
(c)分化を抑制し得るFGFレセプターインヒビター
を含む培地中で、胎児、成体、または非ヒト胚由来の組織を培養する工程
を含む、方法。 - 前記培地が、完全限定培地である、請求項37に記載の方法。
- 分化した細胞を得る方法であって、
(a)BMP4;および
(b)LIF
を含む培地中で非ヒトES細胞を維持する工程;
該培地から(a)および(b)の1つまたは両方を除去する工程;
必要に応じて、該培地に他のシグナリング因子を添加する工程;および
それによって所望の分化した細胞を得る工程
を含む、方法。
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