JP4185489B2 - Ｅｓ細胞自己再生および系統仕様の制御ならびにそのための培地 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞自己再生を促進しそして幹細胞の分化を抑制または制御するための培養条件、および多分化能性幹細胞の培養方法に関する。本発明はさらに、多分化能性幹細胞の均一な調製物を単離および維持するための方法を提供する。提供される方法および組成物は、胚性幹（ＥＳ）細胞のような多分化能性幹細胞を培養および単離するために適切である。

血清および白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培地の存在下におけるインビトロの多分化能性幹細胞培養の樹立および維持は周知である（Smithら (1988) Nature 336: 688-90）。このような方法は、多くの継代にわたる許容マウスの系統由来の多分化能性胚性幹（ＥＳ）細胞を維持するために使用されている。幹細胞がフィーダー細胞またはその抽出物、通常はマウス線維芽細胞、の存在下で培養される多分化能性幹細胞培養物の維持および自己再生は、さらにサポートされる。このような条件下では、培養中に多くの継代にわたりヒトＥＳ細胞を多分化能性状態で維持することが可能である。

この分野において永続している問題は、熱心な努力にもかかわらず、ＥＳ細胞の多分化能性培養が、２〜３種のみから、およびその種においてでさえもすべてではない胚から誘導されそして長期間維持され得る場合が残っていることである。いくつかの場合、多分化能性細胞は、同定され得るが、一方、細胞またはその遺伝子操作の研究を可能にするために十分な時間にわたって培養が維持され得ない。これは、特に、齧歯類（数系統のマウス以外の）細胞の場合である。

さらなる問題は、多くの継代にわたる培養において多分化能性状態で実際に維持され得るＥＳ細胞が、血清または血清抽出物を含むため非限定培地を用いて、あるいはヒトＥＳ細胞を維持するために使用される線維芽フィーダー細胞のような他の細胞の存在を必要とする細胞培養条件を用いてのみ維持され得ることである。しかし、ＥＳ細胞が所望の細胞タイプへのその後の制御された分化を受けるように意図される場合、非限定培養培地を利用することおよび異種細胞が存在することは望ましくない。

多分化能性幹細胞を培養するために代表的に使用される血清は、ウシ胎児（ウシ）血清であり、これは、サイトカイン類および他のシグナリング分子の複合混合物を含むことが知られている。分化経路を制御するために、分化の最終的な結果への影響が計算できない培養培地に未知のサイトカイン類を導入することは望ましくなく、そして潜在的に有害であり得る。さらに、各血清バッチは、独特であり、そして培養プロトコルへの改変を導入する。

結果として、このような複合培地での培養によって得られたＥＳ細胞、およびそのあらゆる分化した子孫は、培地の成分によっておよび／またはＥＳ細胞を維持するために必要とされるフィーダー細胞のような細胞によって汚染される危険にさらされる。これらの因子は、ＥＳ細胞およびその子孫の治療およびその他の適用のための適正製造基準の開発を緩める。

ＥＳ細胞培養物から分化した細胞集団を誘導する場合、ＥＳ細胞の集団を同じタイプの子孫に変換することができること、すなわち、細胞集団をできるだけ均一に維持することが所望される。しかし、実際には、分化後、異種細胞混合物を含む細胞集団が得られることが観察される。したがって、より純粋な子孫の集団を得るＥＳ細胞集団の分化を行うことができることが所望される。

ＥＰ1077254は、脂肪組織由来のストロマ細胞の分化のため方法および組成物を記載し、これはインターロイキン、ＦＧＦおよび血清、ならびに平滑筋への分化を誘導するために十分な量のＴＧＦ−βを含み得る。

ＥＰ0753574は、エクスビボでのヒト祖先細胞拡張のための方法および組成物を記載する。この培養培地は、ストロマ細胞、代表的には形質転換された線維芽細胞を含む。

ＷＯ00/05344は、ショウジョウバエ生殖系列幹細胞の維持および遺伝子操作したショウジョウバエ細胞と共培養した場合の他の種の体性幹細胞の増殖を記載している。

ＷＯ96/40866は、ペプトン、プロテアーゼインヒビター、および下垂体抽出物の少なくとも１つを含む培養培地におけるヒト造血細胞祖先および幹細胞の無血清培養を記載している。

ＵＳ2002/0028510は、臍帯血由来の多分化能性細胞の神経細胞タイプへの分化のための方法および組成物を記載している。

ＵＳ5750376は、少なくとも１つの増殖因子を補充した培養培地での多分化能性神経幹細胞の分化のための方法および組成物を記載している。

WilesおよびJohansson、Exp. Cell Research, 1999 (247) 241-248頁は、ＬＩＦおよびウシ胎児血清の存在下での未分化細胞株の維持を記載している。ＥＳ細胞が、無血清培地中で増殖される場合、これらはそのＥＳ細胞表現型を迅速に失い、そして神経外胚葉を含むある範囲の細胞タイプへ発生する。

したがって、本発明の目的は、多分化能性幹細胞を培養する方法および多分化能性幹細胞に適切な培養培地を提供することであり、これらは多くの継代の間、未分化状態でこの幹細胞の自己再生をサポートすることが可能である。本発明のさらなる目的は、細胞の分化が制御された様式で誘導されるまで、インビトロで多分化能性幹細胞培養物の維持を可能にする培養系を提供することである。本発明のよりさらなる目的は、多分化能性幹細胞の単離を増強し、そしてＥＳ細胞の単離が難しい生物からのまたは多分化能性幹細胞が未だ単離されていない生物からの多分化能性幹細胞の単離を容易にする方法および組成物を提供することである。

本発明は、ｇｐ１３０（例えば、ＬＩＦ）およびＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ４）シグナリング経路のアゴニストを含む無血清培地中で、ＥＳ細胞のような多分化能性幹細胞を培養することが、多回の継代の間の幹細胞の自己再生を促進するという観察に基づく。したがって、ｇｐ１３０シグナリングの存在下で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーシグナリング経路のアゴニストは、分化前シグナルよりもむしろ自己再生刺激を提供する。

したがって、本発明の第１の局面は、培養中に多分化能性細胞の自己再生を促進するための、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。

ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流の１以上のシグナリング経路は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。レセプターの例は、ＢＭＰレセプターおよびＴＧＦ−βレセプター、ならびにアクチビンおよびノーダルに結合されるレセプターである。１以上のシグナリング経路の活性化は、好ましくはＢＭＰレセプターのアゴニストを用いて達成される。

１以上のｇｐ１３０下流シグナリング経路の活性化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、例えば、ＬＩＦレセプターのサイトカインまたは他のアゴニストの使用によって達成され得る。

ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターのアゴニストは、適切には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナリング因子のメンバーであり、そして好ましくは、ＢＭＰ−４のような骨形成因子（ＢＭＰ）である。ＢＭＰ２およびＢＭＰ７のような、ＢＭＰ４の公知のホモログも、Drosophila melanogaster由来のデカペンタプレージック（ｄｐｐ）のような非哺乳動物種由来のホモログであるので、適切である。ＢＭＰ４、８、および２を用いて良好な結果が得られている。分泌形態でＢＭＰ４よりも容易に得られる、ＢＭＰ４とＢＭＰ８とのキメラを用いても、良好な結果が得られている。用語「アゴニスト」はまた、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターを活性化し得る、ＴＧＦ−βスーパーファミリーシグナリングポリペプチドの模倣物、融合タンパク質、またはキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体、および誘導体を包含することを意図する。

ｇｐ１３０を介して作用し、したがってｇｐ１３０シグナル伝達を活性化し得るサイトカインとしては、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプターが挙げられる。適切なサイトカインとしては、ｇｐ１３０に結合し得るおよび／またはｇｐ１３０を介するシグナリングを活性化し得る模倣物、融合タンパク質、またはキメラが挙げられる。

血清の存在下でｇｐ１３０を介して作用するサイトカインの役割は十分に確立されているが、これらのサイトカインが血清の不在下で未分化細胞を支持する能力は制限されている。

インビボおよびＥＳ細胞での両方の発生研究からのＢＭＰについてのこれまでのデータは、中胚葉および表皮分化を駆動する活性を指摘している。文献には、ＢＭＰシグナリング経路の活性化が多分化能性幹細胞において自己再生を増強し得るという証拠はない。

ＬＩＦおよびＢＭＰ４を含むＥＳ細胞分化のための化学的に限定された無血清培地が、既にJohanssonおよびWiles（Mol. Cell. Biol. (1995) 15(1): 141-51）に開示されている。しかし、未限定アルブミン成分ならびにＬＩＦおよびＢＭＰ４の両方をも含む培地は、ＥＳ細胞の中胚葉および造血細胞への分化を促進するために使用された培養培地に組み合わされたのみであった。中胚葉マーカー遺伝子、Brachyury、を発現する細胞への分化を、培養の５日後に観察した（145頁第１段落を参照のこと）。ＢＭＰ４の不在下では、非常に高濃度のＬＩＦを補充した化学的限定培地は、ＥＳ細胞を最大で３継代維持し得る（143頁第２段を参照のこと）。したがって、JohanssonおよびWilesは、ＥＳ細胞の自己再生ではなく、ＥＳ細胞の多細胞凝集の形成および分化によって誘導される分化を促進する組成物を記載している。

したがって、本発明は、１つの実施態様では、血清、血清抽出物、フィーダー細胞、およびフィーダー細胞抽出物を含み得ない培地におけるＥＳ細胞の培養物を提供する。

本発明の特定の実施態様のＬＩＦおよびＢＭＰ４含有培地を用いる場合、ＥＳ細胞の拡張した継代が可能である。１つの例では、マウスＥＳ細胞は、３カ月にわたって２０を超える継代について維持されていた。細胞を、プレーティングする細胞密度に依存して２〜４日ごとに継代したが、細胞を、時々、低密度でプレーティングした後７〜１０日目で継代した。

本発明の培養系のもう１つの利点は、ＥＳ細胞の分化が、血清の存在下での培養物と比較して減少することである。ほとんどの多分化能性ＥＳ細胞が、血清中でかなり分化する傾向にあり、その取り扱いおよび拡張を困難にするので、これは顕著である。

培養中のＥＳ細胞を検査し、そして依然としてＥＳ細胞の形態を維持しそしてＥＳ細胞マーカー（アルカリホスファターゼについて陽性染色）を発現すること見出した。ＥＳ細胞特異的なＯｃｔ−４プロモーターの制御下でＧＦＰリポーター遺伝子を用いた場合、ＥＳ細胞において緑色蛍光が見られた。同様に、Ｓｏｘ２プロモーターからのβ−ガラクトシダーゼ発現を維持した。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、およびＳｏｘ２のようなＥＳ細胞ｍＲＮＡマーカーが発現され、細胞がＥＳ細胞であることをさらに確認する。培養中の細胞の形態学的分化は、非常に低く、血清含有培地中でのＥＳ細胞の比較培養物よりも低いことが見出される。したがって、本発明の培養条件は、ＥＳ細胞が血清の不在下で自己再生することを可能にする。

マウス（Bradleyら (1984) Nature 309:255-56）、アメリカミンク（Mol Reprod Dev (1992) 12月;33(4):418-31）、ブタおよびヒツジ（J Reprod Fertil Suppl (1991);43:255-60）、ハムスター（Dev Biol (1988) 5月;127(1):224-7）、およびウシ（Roux Arch Dev Biol (1992);201:134-141）を含む多くの哺乳動物ソース由来の胚性幹細胞が報告されている。本発明の方法および組成物が、ヒト、霊長類および齧歯類を含む他の哺乳動物の多分化能性細胞培養、ならびに鳥類のＥＳ細胞の培養への適用に適切であることが理解される。

詳細には、ヒトＥＳ細胞に関して、ヒトＥＳ細胞がＬＩＦに対して応答することが公知であり、したがって、自己再生刺激がＬＩＦとＢＭＰ４との組み合わせに対する応答で得られるという本発明の培地および方法は、ヒトＥＳ細胞への適用になる。

本発明の方法に適切な細胞密度は、使用されている多分化能性幹細胞および任意の所望の子孫の性質に従って変化する。単層培養で胚性幹細胞を培養し、該胚性幹細胞を解離し、その後０．２〜２．５×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度で、より特定には０．５〜１．５×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度で培養物表面上の単層培養において該胚性幹細胞を培養することによって、良好な結果が得られている。細胞は、付着単層として増殖し、そしてＬＩＦをともに含む血清含有培地で増殖したＥＳ細胞に匹敵する倍加時間を有することが観察される。

本発明のＥＳ細胞およびそれらの子孫の培養物に代表的な表面は、細胞培養に有用であるとしてこの分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらとしては、プラスチック、金属、混合材料の表面が挙げられるが、通常は、広く市販で入手可能な、プラスチック組織培養プレートのような表面が使用される。このようなプレートは、しばしば数センチメートルの直径である。スケールアップのために、さらに大きな直径のこのタイプのプレートが使用され得、そして多くの繰り返しプレート単位が使用され得る。

培養表面についてさらに普通には、通常表面上にコーティングされた細胞付着タンパク質を含む。細胞上のレセプターまたは他の分子が、タンパク質または他の細胞培養基材と結合し、そしてこれが表面への付着を促進し、そして増殖を促進することが示唆される。ゼラチンコーティングしたプレートは通常入手可能であり、そして本発明に適切であり、そして他のタンパク質も使用され得る。

本発明の１つの実施態様では、培養期間の少なくとも一部の期間に培養培地中にＦＧＦレセプターのインヒビターのような分化を抑制する薬剤を含むことが、ＥＳ細胞が分化する傾向を抑制することが見出される。１つの実施態様では、ＦＧＦレセプターインヒビターが除去されそしてＢＭＰシグナリング経路のアゴニスト（例えば、ＢＭＰ４）に置き換えられる前の特定の期間に、ＥＳ細胞は、ＬＩＦおよびＦＧＦレセプターインヒビターを含む所定の無血清培地中で培養される。適切なＦＧＦレセプターインヒビターとしては、化合物ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４が挙げられる。あるいは、ＦＧＦレセプターの競合インヒビターが使用され得、適切にはレセプターの可溶性形態である。

別の実施態様では、必要に応じて、ＦＧＦレセプターインヒビターを除去しない。したがって、ＦＧＦレセプターインヒビターは、ＢＭＰシグナリング経路のアゴニストの存在下または不在下のいずれかで、長期間にわたり培養培地中に存在する。ＥＳ細胞は、ＬＩＦおよびＦＧＦインヒビターの存在下で、ＢＭＰの不在下で、Ｎ２Ｂ２７培地中で少なくとも２０継代にわたり培養中に増殖し得る。ＦＧＦレセプターインヒビターが培地から除去されないならば、特別なインヒビターであって、そして他のレセプターに対してほとんどまたは全く活性がないことが好ましい。

本発明の第２の局面は、ＥＳ細胞自己再生を促進するためのＥＳ細胞の培養方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
を含む培地中でＥＳ細胞を維持する工程を含む。

１つの実施態様では、ＥＳ細胞培養の方法は、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターのアゴニスト；および
（ｂ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン
を含む培地中でＥＳ細胞を維持する工程を含む。

本発明の方法は、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない培地中で、既に血清または血清抽出物の存在下で継代されているＥＳ細胞の自己再生を刺激するために使用され得る。好ましくは、このような方法はまた、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物の不在下で行われる。例えば、以下の工程を含むＥＳ細胞の培養が行われ得る：
ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清または血清の抽出物の存在下、必要に応じてフィーダー細胞上で、ＥＳ細胞を培養中に多分化能性状態に維持する工程；
該ＥＳ細胞を少なくとも１回継代する工程；
該培地がフィーダー細胞、血清、および血清抽出物を含まないように、該培地から血清または血清抽出物を除去する工程および（存在するならば）フィーダー細胞を除去する工程；および
その後、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下でＥＳ細胞を多分化能性状態に維持する工程。

血清または血清の抽出物が培地から除去された頃に、必要に応じて、分化を抑制する薬剤、例えば、ＦＧＦレセプターインヒビターを培地に添加する。必要に応じて、分化のインヒビターについては、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターの存在下で細胞の維持と同時にまたはそれに続いて除去される。

本発明はまた、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法を提供し、この方法は、
選択可能マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレーティングする工程；
該ＥＳ細胞を、
（ａ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の存在下で培養する工程；および
該選択可能マーカーを発現するＥＳ細胞を選択する工程、を含む。

選択可能マーカーは、抗生物質耐性、細胞表面マーカー、または例えば、ＥＰ−Ａ−０６９５３５１に記載される他の選択可能マーカーをコードし得る。

さらなる実施態様では、本発明は、ＥＳ細胞の培養の方法を提供し、この方法は、プレート上の個々のウェルのような培養容器に個々のＥＳ細胞を移す工程、および、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；およびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で該ＥＳ細胞を培養して、すべてが単一のＥＳ細胞の子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る工程、を含む。

一旦ＥＳ細胞の安定で均一な培養物が得られると、培養条件は、外胚葉、中胚葉、または内胚葉細胞運命から選択される１つ以上の細胞タイプへの細胞の分化を指示するように変更され得る。サイトカインおよびシグナリング因子の添加または除去は、特定の分化した細胞集団への高い効率での誘導を可能にし得る。非神経外胚葉運命へのＥＳ細胞の分化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよびＢＭＰレセプターのアゴニストの存在下でＥＳ細胞を維持し、次いでＢＭＰレセプターアゴニストを維持しながらサイトカインを除去することおよび／または分化を指示し得るさらなるシグナリング分子を添加することによって達成され得る。

例えば、ＬＩＦの不在下でのＢＭＰ４への曝露は、中胚葉細胞タイプに誘導する。ｇｐ１３０およびＴＧＦ−βシグナリング経路のアゴニストの除去および／または両経路の遮断は、神経外胚葉表現型に誘導する。あるいは、他のシグナリング因子が培養条件に追加されて、他の分化経路を指示し、例えば、アクチビン、ソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）、Ｗｎｔ、およびＦＧＦが挙げられる。

ＥＳ細胞培養の終了に向けての使用において、ＢＭＰシグナルが弱まりそしてその後の分化中のＢＭＰシグナルの遺物がないことを確実にするために、分化が開始される前の少なくとも１継代でＢＭＰ４を除去することが所望される。１つの実施態様では、ＦＧＦレセプターアンタゴニストが、培地からＢＭＰを除去しながら、１〜２継代の間に培地に添加される。

本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞の自己再生のための細胞培養培地を提供する。１つのこのような培地は、
基本培地；
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；
ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター；
鉄トランスポーター
を含み、この培地は、血清および血清抽出物を含まない。

基本培地は、ＥＳ細胞に必須のソースである炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルを供給する培地である。基本培地は、一般的に、タンパク質を含まず、そしてそれ自体はＥＳ細胞の自己再生をサポートできない。鉄トランスポーターは、鉄のソースを供給し、または培養培地からの鉄を取り込む能力を提供する。適切な鉄トランスポーターとしては、トランスフェリンおよびアポトランスフェリンが挙げられる。

培地が、インスリンまたはインスリン様増殖因子をさらに含み、そしてフィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物を含まないことが好ましい。

本発明はまた、
（ａ）ＴＧＦ−βレセプターのアゴニスト；および
（ｂ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン
を含む細胞培養培地を提供する。

培養培地は、必要に応じて、ＥＳ細胞の分化のインヒビター、または分化が消耗される場合は特定の表現型へのＥＳ細胞の分化を指示するシグナリング因子が補充される。

培地が血清または血清抽出物を含まないことが好ましい。最も好ましくは、培地は完全に限定される。

本発明の好適な実施態様では、培養培地は、１０Ｕ／ｍｌと１０００Ｕ／ｍｌとの間より好ましくは５０Ｕ／ｍｌと５００Ｕ／ｍｌとの間、さらにより好ましくは１００Ｕ／ｍｌの領域の濃度で、ｇｐ１３０レセプター結合サイトカインであるＬＩＦを含む。

ＴＧＦ−βスーパーファミリーのレセプターの下流のシグナリング経路の活性化が、ＴＧＦ−βレセプターの上流アゴニスト（例えば、レセプターリガンド）、構成的に活性なレセプター、あるいはシグナリング経路の活性化された下流成分、例えば、ＳＭＡＤシグナル形質導入分子、のいずれかによってもたらされ得ることは、当業者に理解される。同様に、ｇｐ１３０シグナル形質導入経路の上流エフェクター（例えば、サイトカイン）および下流エフェクター（例えば、Ｓｔａｔ）も、この経路を活性化し得る。したがって、本発明は、多分化能性幹細胞の自己再生を促進するために、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーシグナリング経路およびｇｐ１３０シグナリング経路を活性化し得る分子を含むすべての組成物を包含する。

本発明によれば、細胞の培養が付着培養で行われることがさらに好ましく、そして本発明の例では、多分化能性状態での細胞の維持の後に、分化が高度の均一性および高い細胞生存性で誘導され得ることが見出された。付着培養は、細胞付着タンパク質の含有によって促進され得、そして本発明の特定の例では、培養基材についてのコーティング剤として、ゼラチンが使用されている。

本発明によれば、単層培養において多分化能性細胞を培養することが好ましいが、必要に応じて、細胞を懸濁培養中でまたはプレ細胞凝集物として増殖させる；細胞はまた、ビーズ上であるいはメンブランまたは他の３次元構造物のような他の適切な足場で増殖され得る。

本発明の多分化能性細胞の培養のための培地のさらなる成分は、存在することが好ましいが、細胞の生存および／または代謝を促進する因子である。本発明の特定の実施態様では、細胞は、インスリンの存在下で培養される。代わりの因子は、インスリン様増殖因子であり、そして他のこのような生存および／または代謝促進因子が代わりに使用され得る。

本発明の実施例で使用される培養培地はまた、好ましくは、血清アルブミンを含む。これは、精製または組換え形態で使用され得、そして組換え形態ならば、これは、潜在的に混入する因子であるサイトカインなどが不在であるという利点を有する。この培養培地は、血清アルブミンを含む必要がなく、そしてこの成分は、省略され得るか、あるいは他の嵩高いタンパク質にまたはＷｉｌｅｓらに記載されるような合成ポリマー（ポリビニルアルコール）に置き換えられ得る。

本発明の特に好適な培地は、完全に限定されているものである。この培地は、限定されていないあらゆる成分、すなわち含量が未知であるか、または特定されていない未限定または種々の因子を含み得る成分を含まない。完全限定培地を使用する利点は、多分化能性細胞の培養およびその後の操作のために効率的なおよび一貫したプロトコルが得られ得ることである。さらに、多分化能性状態での細胞の維持が、より高い効率およびより大きな予測可能性で達成可能であり、そして分化が限定培地を用いて培養された細胞で誘導される場合に、分化シグナルに対する応答が、非限定培地を用いる場合よりも均一であることが見出される。

本発明の培地は、あらゆる成体組織由来の多分化能性幹細胞の培養に使用され得る。

本発明の方法はまた、記載のように多分化能性細胞を培養する工程、および該細胞に分化を可能にするまたは引き起こす工程を含む、分化した細胞を得る方法を包含し、ここで、該細胞は、多分化能性幹細胞を含む他の細胞タイプと比較して所望の分化した細胞中で分別発現を可能にする選択可能マーカーを含み、それによる該選択可能マーカーの分別発現により、該所望の分化した細胞を優先単離および／または生存および／または分割させる。

分化した細胞は、組織幹細胞または祖先細胞であり得、そして最終分化細胞であり得る。

本発明はまた、多分化能性幹細胞またはＥＧもしくはＥＣ細胞を単離する方法を提供し、該方法は、
（ａ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン；および
（ｂ）ＴＧＦ−βレセプターのアゴニスト；および／または
（ｃ）ＦＧＦレセプターのインヒビター
を含む培地中で、胚、胎児、または成体由来の組織を培養する工程を含む。

好ましくは、この培地は、完全限定培地である。

さらなる実施態様では、本発明は、培養中に多分化能性細胞の自己再生を促進するための、
（ａ）ＦＧＦレセプターシグナリングのインヒビター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の組み合わせの使用を提供する。

本発明の方法および組成物は、添付の図面で説明される。

本発明は、以下の実施例による使用において説明される。

実施例１．血清を含まない、フィーダー細胞を含まない限定培養培地中でＥＳ細胞を培養する方法
Ｎ２Ｂ２７ （改変Ｎ２（２５μｇ／ｍｌのインスリン、１００μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６μｇ／ｍｌのプトレシン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＢ２７を補充した神経基本培地との１：１混合物）

ＥＳ細胞を、ＬＩＦ（１００Ｕ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＮ２Ｂ２７培地中、０．１％ゼラチンコーティングしたディッシュにおいて培養した。継代のために、標準のタンパク質を含まない細胞解離緩衝液を用いて、細胞を解離した。

細胞のプレーティング密度は、約１〜５×１０^４／ｃｍ^２であった。

培養の開始時に、培地にさらにＳＵ５４０２（５μＭ）を補充して分化を抑制した。２継代後、細胞を、ＳＵ５４０２を含まない培地に移した。

ＥＳ細胞を、３カ月にわたり２０継代についてこれらの無血清条件中で維持した。細胞を、プレーティング密度に依存して２〜４日ごとに正常に継代した。時々、細胞を、低クローン密度でプレーティングした後、７〜１０日で継代した。

ＥＳ細胞は、多数回の継代後に多分化能性を維持した。ＬＩＦおよびＢＭＰ４の除去時に、ＥＳ細胞は、Ｓｏｘ１発現神経前駆細胞に分化した。ＢＭＰ４存在下であるがＬＩＦの不在下で、ＥＳ細胞は、特徴的な形態の大きな平坦な細胞に分化した。

実施例２．Ｏｃｔ４−ＧＦＰ発現は、無血清条件下で培養されたＥＳ細胞で維持される
Ｏｃｔ４ＧＦＰ（クローンＣ１）ＥＳ細胞を、０．１％ゼラチンコーティングしたディッシュにおいて、ＬＩＦおよびＳＵ５４０２を補充したＮ２Ｂ２７培地（実施例１を参照のこと）中で培養した。２継代後、細胞をＬＩＦおよびＢＭＰ４を補充したＮ２Ｂ２７培地中で培養した。さらに２継代後、形態を示すために位相差下で細胞の光学顕微鏡画像を撮し、ＧＦＰの発現を示すためにＵＶ蛍光を測った。顕微鏡画像を図１に示す。

形態およびＧＦＰの発現の両方とも、無血清培地での４継代後に、ＥＳ細胞が多分化能性表現型を維持したことを示すことは明らかである。

実施例３．ＥＳ細胞の安定なトランスフェクション
Ｅ１４ ＴＧ２Ａ ＥＳ細胞を、Ｎ２−Ｂ２７付加物を補充しそしてＬＩＦおよびＢＭＰ４も補充したＤＭＥＭ Ｆ１２＋神経基本培地中で培養した。細胞を、０．１％ゼラチンコーティングしたプレート上で増殖し、採取し、そしてｐＰＣＡＧ−ｔａｕＧＦＰ−ＩＰとともに電気泳動した。トランスフェクトした細胞を、１０^５〜１０^６／ディッシュの密度で１０ｃｍ径のディッシュ上に再プレーティングした。２４時間後、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加して、陽性コロニーを選択した。

８〜１０日後、単一のＧＦＰ陽性コロニーを、９６ウェルプレートの各単一のウェルに取り出し、そして細胞を、上記と同じ培地中で培養した。

図２に示すような、形態学的に未分化のＥＳ細胞のＧＦＰ蛍光および拡張によるＥＳ細胞の安定なトランスフェクションを観察した。

実施例４．キメラマウス
上記実施例３に記載のように得たＧＦＰ発現ＥＳ細胞を、胚盤胞に注射した。ＧＦＰ発現ＥＳ細胞は、図３（１１日目胚）に示すように、キメラマウス胚において広範な細胞タイプに寄与した。キメラコートを有する生きて生まれたキメラマウスを得、細胞が真のＥＳ細胞であることを確認した。

実施例５．ＥＳ細胞のクローン自己再生
個々のＥＳ細胞を取り出し、そして９６ウェルプレートのウェルに移し、そして上記実施例３に記載のように培地中で培養した。

発明者らは、少なくとも１継代について予め無血清培地中で増殖したこれらのＥＳ細胞のクローニングの効率が、血清含有培地を用いて得られ得る効率と同様であること、すなわち、約１０％効率であることを見出した。クローンは増殖し、そして図４に示すように、ＬＩＦおよびＢＭＰ４の存在下で未分化ＥＳ細胞としてさらに継代および増殖され得た。

これまでの実験において（データは公開していない）、発明者らは、血清含有培地中で増殖したＥＳ細胞が、無血清培地に直接移した場合に、より低いクローンコロニーの形成を示すことを発見した。

実施例６．完全限定培地におけるＥＳ細胞の増殖
ＥＳ細胞を、ＩＧＦ−１ １０μｇ／ｍｌ（または５〜２５μｇ／ｍｌのインスリン）、アポトランスフェリン １００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン ６μｇ／ｍｌ、プトレシン １６μｇ／ｍｌ、および亜セレン酸ナトリウム ３０ｎｍｏｌを補充したＤＭＥＭ Ｆ１２＋神経基本培地（１：１の割合）を含む、完全限定のアルブミンを含まない培地中で増殖した。

Ｏｃｔ４ＧＦＰ ＥＳ細胞を、細胞解離緩衝液を用いて６回継代し（細胞を６〜８日ごとに継代した）、そして各継代後に低密度で再プレーティングした。３継代後に撮影した顕微鏡画像を図５に示す。

実施例７．無血清培地および一時的増殖因子刺激の使用
ＥＳ細胞を、最初に、Ｎ２−Ｂ２７を補充したＤＭＥＭ Ｆ１２＋神経基本培地（１：１の割合）を含む培地中で増殖した。ＥＳ細胞を、３．５ｃｍ径プレート上に約１０００〜１０，０００細胞の非常に低密度でプレーティングし、そしてＬＩＦおよびＢＭＰ４を補充した同じ培地中で増殖した。

断続的に、１〜２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βまたは５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを培養培地に添加し、そして細胞を再度増殖させた。

発明者らは、未分化ＥＳ細胞の数が増えたことを観察し、これは、増殖の増加またはＥＳ細胞の生存の増加、あるいはその両方を示す。したがって、効率の等級順は、
ＬＩＦ／ＢＭＰ４／アクチビンＡ（５ｎｇ／ｍｌ）＞ＬＩＦ／ＢＭＰ４／ＴＧＦ−β（１〜２ｎｇ／ｍｌ）＞ＬＩＦ／アクチビンＡ＞ＬＩＦ／ＢＭＰ４＞ＬＩＦ／ＴＧＦ−β１＞ＬＩＦのみ
であることが見出された。

さらなる（５〜６）継代後、効率の等級順は、
ＬＩＦ／ＢＭＰ４＞ＬＩＦ／ＢＭＰ４／アクチビンＡ＞ＬＩＦ／ＢＭＰ４／ＴＧＦ−β＞ＬＩＦ／アクチビンＡ＝ＬＩＦのみ
に変化した。

ＴＧＦ−βまたはアクチビンＡのいずれかが連続的に存在する場合、ＥＳ細胞の分化の進行を観察した。

ＬＩＦおよびＢＭＰ４の投与は、ＳＭＡＤ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴ３のリン酸化を導くことが観察され（図６および７を参照のこと）、これは、ＢＭＰおよびｇｐ１３０レセプターの下流の経路の活性があることを示す。

実施例８．血清を含まないおよび血清を含む培地中で増殖したＥＳ細胞の比較
発明者らは、０．１％ゼラチンコーティングした６ウェルプレートにおいて、４×１０^５細胞／ウェルの密度で、以下の培地中にてＯｃｔ４ＧＦＰ ＥＳ細胞を培養した：Ｎ２Ｂ２７＋ＬＩＦ、Ｎ２Ｂ２７＋ＬＩＦ＋ＢＭＰ４、およびＧＭＥＭ １０％ＦＣＳ＋ＬＩＦ。結果を表１に示す。細胞解離緩衝液を用いて、細胞を解離させた。５継代後、Ｎ２Ｂ２７＋ＬＩＦ中で増殖した細胞の数は、培養を続けるには十分ではなかった。

したがって、本発明は、多くの種のＥＳ細胞の自己再生のための培地および方法を提供する。

本発明の無血清限定培地中での高または低のいずれかの細胞密度で増殖したＥＳ細胞の光学顕微鏡画像を示す；ＥＳ細胞特異的プロモーターのＯｃｔ４の制御下でＧＦＰタンパク質を発現する細胞は蛍光を発する。 ＬＩＦおよびＢＭＰ４の存在下、無血清培地中でｐＰＣＡＧ−ｔａｕＧＦＰ−ＩＰで安定にトランスフェクトしたＥＳ細胞の光学顕微鏡画像を示す。 図２のＧＦＰ発現ＥＳ細胞を注射した胚盤胞から生成したキメラマウス胚（１１日目胚）を示す。 ＬＩＦおよびＢＭＰ４の存在下、低密度でプレーティングした個々のＥＳ細胞、ならびにプレーティング後６日目のそれに由来する集団の位相差および蛍光画像を示す。 ＩＧＦ−１あるいはインスリン、アポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、および亜セレン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ Ｆ１２培地＋神経基本培地（１：１）中で培養したＯＳ２５およびＯｃｔ４ＧＦＰ ＥＳ細胞（３継代）を示す。 ＥＳ細胞への、１以上のＬＩＦ／ＢＭＰ４／ＴＧＦ−β１／血清の投与後１５分および１時間での、ｐ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓｍａｄ１、およびｐ−Ｓｍａｄ２のリン酸化を証明するイムノブロットを示す。 ＥＳ細胞への、ＬＩＦ＋ＢＭＰ４＋ＴＧＦ−β１の投与後０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間での、ＥＲＫ、ｐ３８、Ｓｍａｄ１および２、ならびにＳＴＡＴ−３のリン酸化を証明するイムノブロットを示す。投与後１時間でのリン酸化パターンを、ＬＩＦ＋血清の投与後１時間のパターンと比較する。

Claims (39)

1. 培養中に多分化能性細胞の自己再生を促進するための組成物であって、
   （ａ）ＢＭＰ４；および
   （ｂ）ＬＩＦ
   を含む、組成物。
2. 分化を抑制する薬剤の存在下でのＥＳ細胞の培養のための、請求項１に記載の組成物。
3. 前記薬剤が、分化を抑制し得るＦＧＦレセプターインヒビターである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ＦＧＦレセプターインヒビターが、ＳＵ５４０２またはＰＤ１７３０７４である、請求項３に記載の組成物。
5. 分化を抑制する薬剤の存在下で最初に、そして続いてこの薬剤が回収される培地中でのＥＳ細胞の培養のための、請求項２から４のいずれかの項に記載の組成物。
6. 哺乳動物および鳥類の多分化能性細胞から選択される多分化能性細胞の培養のための、請求項１から５のいずれかの項に記載の組成物。
7. 哺乳動物および鳥類のＥＳ細胞から選択されるＥＳ細胞の培養のための、請求項１から６のいずれかの項に記載の組成物。
8. 齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類の多分化能性幹細胞から選択される多分化能性幹細胞の培養のための、請求項１から７のいずれかの項に記載の組成物。
9. 齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類のＥＳ細胞から選択されるＥＳ細胞の培養のための、請求項１から８のいずれかの項に記載の組成物。
10. ラットまたはマウスの細胞の培養のための、請求項６または７に記載の組成物。
11. ヒト細胞の培養のための、請求項６または７に記載の組成物。
12. 血清、血清抽出物、フィーダー細胞、およびフィーダー細胞抽出物を含まない培地中でのＥＳ細胞の培養のための、請求項１から１１のいずれかの項に記載の組成物。
13. 完全限定培地中でのＥＳ細胞の培養のための、請求項１から１２のいずれかの項に記載の組成物。
14. ＥＳ細胞の自己再生を促進するための非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
    （ｈ）ＢＭＰ４；および
    （ｉ）ＬＩＦ
    を含む培地中で該ＥＳ細胞を維持する工程
    を含む、方法。
15. 前記培地が、分化を抑制し得るＦＧＦレセプターインヒビターをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
    ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清または血清の抽出物の存在下、必要に応じてフィーダー上で、該ＥＳ細胞を培養中に多分化能性状態で維持する工程；
    該維持する工程と同じ条件下で該ＥＳ細胞を少なくとも１回継代する工程；
    培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないように、該培地から該血清または血清抽出物を除去し、そして存在する場合は該フィーダーを除去する工程；および
    続いて、
    （ｈ）ＢＭＰ４；および
    （ｉ）ＬＩＦ
    の存在下で、該ＥＳ細胞を多分化能性状態で維持する工程、を含む、方法。
17. 分化を抑制する薬剤の存在下で、前記ＥＳ細胞を培養する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記分化を抑制する薬剤が、血清または血清抽出物が除去される時期に培養培地に添加される、請求項１７に記載の方法。
19. ＢＭＰ４の存在下での細胞の維持と同時またはそれに続いて、前記分化を抑制する薬剤が除去される、請求項１８に記載の方法。
20. 非ヒトＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得るための方法であって、
    非ヒトＥＳ細胞を、選択可能マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程；
    該ＥＳ細胞をプレーティングする工程；
    （ａ）ＢＭＰ４；および
    （ｂ）ＬＩＦ
    の存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
    該選択可能マーカーを発現するＥＳ細胞を選択する工程
    を含む、方法。
21. 前記選択可能マーカーが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項２０に記載の方法。
22. 非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
    個々の非ヒトＥＳ細胞を培養容器に移す工程；および
    （ａ）ＢＭＰ４；および
    （ｂ）ＬＩＦ
    の存在下で該ＥＳ細胞を培養して、すべてが該ＥＳ細胞の子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る工程
    を含む、方法。
23. 前記培養容器が、プレート上の個々のウェルである、請求項２２に記載の方法。
24. 非ヒトＥＳ細胞の神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
    （ａ）ＢＭＰ４および（ｂ）ＬＩＦの存在下で、該ＥＳ細胞を維持する工程；および
    培地から（ａ）および（ｂ）の両方を除去する工程
    を含む、方法。
25. 非ヒトＥＳ細胞の非神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
    ＬＩＦおよびＢＭＰ４の存在下で、該ＥＳ細胞を維持する工程；および
    （Ｉ）該ＢＭＰ４を維持しながら；および／または
    （ＩＩ）分化を指示し得るさらなるシグナリング分子を添加しながら
    該ＬＩＦを除去する工程
    を含む、方法。
26. ＥＳ細胞の自己再生のための培地であって、
    基本培地；
    ＢＭＰ４；
    ＬＩＦ；および
    鉄トランスポーター；
    を含み、該培地が、血清または血清抽出物を含まない、培地。
27. インスリンまたはインスリン様増殖因子をさらに含む、請求項２６に記載の培地。
28. 前記培地が、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を含まない、請求項２６または２７に記載の培地。
29. ＥＳ細胞培養培地であって、
    （ａ）ＢＭＰ４；
    （ｂ）ＬＩＦ；および
    （ｃ）ＥＳ細胞分化を抑制する薬剤
    を含む、培地。
30. ＥＳ細胞培養培地であって、
    （ａ）ＢＭＰ４；および
    （ｂ）ＬＩＦ
    を含み、該培地が、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない、培地。
31. ＥＳ細胞培養培地であって、
    （ａ）ＢＭＰ４；および
    （ｂ）ＬＩＦ
    を含み、該培地が、完全に限定されている、培地。
32. ＥＳ細胞の分化を抑制する薬剤をさらに含む、請求項３０または３１に記載の培地。
33. 前記ＬＩＦが、少なくとも１０Ｕ／ｍｌの濃度である、請求項２６から３２のいずれかの項に記載の培地。
34. 分化した細胞を得る方法であって、請求項１４から２２のいずれかの項に記載の多分化能性細胞を培養する工程および該多分化能性細胞の分化を可能にするまたは引き起こす工程を含み、該多分化能性細胞が、多分化能性幹細胞を含む他の細胞タイプと比較して所望の分化した細胞中で分別発現を可能にする選択可能マーカーを含み、それによる該選択可能マーカーの分別発現により、該所望の分化した細胞を優先単離および／または生存および／または分割させる、方法。
35. 前記分化した細胞が、組織幹細胞または組織祖先細胞である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記分化した細胞が、最終分化細胞である、請求項３４に記載の方法。
37. 多分化能性幹細胞または非ヒト胚を単離する方法であって、
    （ａ）ＬＩＦ；
    （ｂ）ＢＭＰ４；および
    （ｃ）分化を抑制し得るＦＧＦレセプターインヒビター
    を含む培地中で、胎児、成体、または非ヒト胚由来の組織を培養する工程
    を含む、方法。
38. 前記培地が、完全限定培地である、請求項３７に記載の方法。
39. 分化した細胞を得る方法であって、
    （ａ）ＢＭＰ４；および
    （ｂ）ＬＩＦ
    を含む培地中で非ヒトＥＳ細胞を維持する工程；
    該培地から（ａ）および（ｂ）の１つまたは両方を除去する工程；
    必要に応じて、該培地に他のシグナリング因子を添加する工程；および
    それによって所望の分化した細胞を得る工程
    を含む、方法。

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