RU2004135816A - Регуляция самообновления es-клеток и спецификации направления дифференцировки и среда для этого - Google Patents

Claims (53)

1. Применение комбинации:

(а) активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β; и

(b) активатора пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса,

в стимуляции самообновления плюрипотентных клеток в культуре.

2. Применение по п.1, где активатором путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β является агонист рецептора суперсемейства TGF-β.

3. Применение по п.2, где агонистом рецептора суперсемейства TGF-β является костный морфогенетический белок (ВМР).

4. Применение по п.3, где агонистом рецептора суперсемейства TGF-β является ВМР4.

5. Применение по любому из пп.1-4, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса является цитокин, действующий через gp130.

6. Применение по п.5, где этим цитокином является LIF.

7. Применение по любому из пп.1-4, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса является растворимый IL-6 в комбинации с растворимым IL-6-рецептором.

8. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют также в присутствии агента, подавляющего дифференцировку.

9. Применение по п.8, где ES-клетки культивируют в присутствии ингибитора FGF-рецептора.

10. Применение по п.9, где ингибитором FGF-рецептора является SU5402 или PD173074.

11. Применение по любому из пп.8-10, где ES-клетки сначала культивируют в присутствии агента, подавляющего дифференцировку, а затем этот агент удаляют.

12. Применение по п.1 для культуры плюрипотентных клеток, выбранных из плюрипотентных клеток млекопитающих и птиц.

13. Применение по п.12 для культуры плюрипотентных стволовых клеток, выбранных из плюрипотентных стволовых клеток грызунов (например, крысы, мыши), коров, свиней, овец и приматов.

14. Применение по п.12 для культуры клеток человека.

15. Применение по п.12 для культуры ES-клеток, выбранных из ES-клеток млекопитающих и птиц.

16. Применение по п.15 для культуры ES-клеток, выбранных из ES-клеток грызунов (например, крысы, мыши), коров, свиней, овец и приматов.

17. Применение по п.15 для культуры клеток человека.

18. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют в среде, не содержащей сыворотки, экстракта сыворотки, питающих клеток и экстракта питающих клеток.

19. Применение по п.1, где ES-клетки культивируют в среде полностью определенного состава.

20. Способ культивирования ES-клеток таким образом, чтобы стимулировать самообновление ES-клеток, предусматривающий поддержание ES-клеток в среде, содержащей:

(а) активатор пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β; и

(b) активатор пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса.

21. Способ по п. 20, где активатором путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β является агонист рецептора суперсемейства TGF-β.

22. Способ по п.20 или 21, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса является цитокин, действующий через gp130.

23. Способ по п.21, где агонистом рецептора суперсемейства TGF-β является агонист ВМР-рецептора.

24. Способ по любому из п.20 или 21, где активатором путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса является LIF или IL-6 плюс растворимый IL-6-рецептор.

25. Способ по п.20, где эта среда дополнительно содержит ингибитор FGF-рецептора.

26. Способ культивирования ES-клеток, предусматривающий поддержание ES-клеток в плюрипотентном состоянии в культуре, необязательно на питающих клетках, в присутствии цитокина, действующего через gp130, и сыворотки или экстракта сыворотки; пассирование этих ES-клеток, по меньшей мере, один раз; удаление сыворотки или экстракта сыворотки из среды и удаления питающих клеток, если они присутствуют, так что эта среда не содержит питающих клеток, сыворотки и экстракта сыворотки; и затем поддержание ES-клеток в плюрипотентном состоянии в присутствии

(а) активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β и

(b) активатора пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса.

27. Способ по п.26, предусматривающий культивирование ES-клеток в присутствии агента, подавляющего дифференцировку.

28. Способ по п.27, где агент, подавляющий дифференцировку, добавляют к культуральной среде приблизительно в то время, когда удаляют сыворотку или экстракт сыворотки.

29. Способ по п.28, где во время поддержания клеток в присутствии активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β или после этого агент, подавляющий дифференцировку, удаляют.

30. Способ получения трансфицированной популяции ES-клеток, предусматривающий:

трансфекцию ES-клеток конструкцией, кодирующей селектируемый маркер; посев этих ES-клеток; культивирование ES-клеток в присутствии активатора путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β; и активатора путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса; и отбор на ES-клетки, которые экспрессируют селектируемый маркер.

31. Способ по п.30, где селектируемый маркер кодирует устойчивость к антибиотику или маркер клеточной поверхности.

32. Способ культивирования ES-клеток, предусматривающий перенос индивидуальной ES-клетки в культуральный сосуд; и культивирование этой ES-клетки в присутствии

(а) активатора пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β и

(b) активатора пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса

таким образом, чтобы получить клональную популяцию ES-клеток, все из которых являются потомством единственной ES-клетки.

33. Способ по п.32, где культуральный сосуд является индивидуальной лункой на планшете.

34. Способ направления дифференцировки ES-клеток в направлении нейроэктодермального типа клеток, предусматривающий поддержание ES-клетки в присутствии агонистов, действующих через gp130 и ВМР-рецептор; и удаление этих агонистов из среды.

35.Способ направления дифференцировки ES-клетки в направлении не нейроэктодермального типа клеток, предусматривающий поддержание ES-клетки в присутствии цитокина, действующего через gp130, и агониста ВМР-рецептора и удаление цитокина при

(I) сохранении агониста ВМР-рецептора и/или

(II) добавлении дополнительной молекулы передачи сигнала, способной направлять дифференцировку.

36. Среда для самообновления ES-клеток, содержащая:

базальную (минимальную) среду; активатор путей передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β; активатор путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса; переносчик железа; причем эта среда не содержит сыворотку или экстракт сыворотки.

37. Среда по п.36, дополнительно содержащая инсулин или инсулиноподобный фактор роста.

38. Среда по п.36 или 37, где эта среда не содержит питающих клеток или экстракт питающих клеток.

39. Среда для культуры ES-клеток, содержащая:

(а) агонист TGF-β-рецептора;

(b) цитокин, действующий через gp130; и

(с) агент, подавляющий дифференцировку ES-клеток.

40.Среда по п.39, дополнительно содержащая агент, подавляющий дифференцировку ES-клеток.

41. Среда по п.39, где цитокином, действующим через gp130, является LIF в концентрации, по меньшей мере, 10Е/мл, предпочтительно по меньшей мере 50 Е/мл.

42. Среда по п.39 для культуры плюрипотентных стволовых клеток из ткани взрослого индивидуума.

43. Среда для культуры ES-клеток, содержащая:

(а) агонист TGF-β-рецептора;

(b) цитокин, действующий через gp130;

причем эта среда не содержит сыворотку и не содержит экстракт сыворотки.

44. Среда по п.43, где цитокином, действующим через gp130, является LIF в концентрации, по меньшей мере, 10Е/мл, предпочтительно по меньшей мере 50 Е/мл.

45. Среда по п.43 для культуры плюрипотентных стволовых клеток из ткани взрослого индивидуума.

46. Среда для культуры ES-клеток, содержащая:

(а) агонист TGF-β-рецептора;

(b) цитокин, действующий через gp130;

причем эта среда является средой полностью определенного состава.

47.Способ получения дифференцированной клетки, предусматривающий культивирование плюрипотентной клетки по любому из пп.20-32 и обеспечение возможности или вызывание дифференцировки плюрипотентной клетки, где эта плюрипотентная клетка содержит селектируемый маркер, который способен к дифференциальной экспрессии в желаемой дифференцированной клетке по сравнению с другими типами клеток, в том числе плюрипотентными клетками, посредством чего дифферециальная экспрессия этого селектируемого маркера приводит к предпочтительному выделению и/или выживанию и/или делению желаемых дифференцированных клеток.

48. Способ по п.47, где дифференцированная клетка является стволовой клеткой или клеткой-предшественником ткани.

49. Способ по п.47, где дифференцированная клетка является терминальной дифференцированной клеткой.

50. Способ выделения плюрипотентной стволовой клетки или ES-клетки, предусматривающий культивирование ткани из эмбриона, плода или взрослого в среде, содержащей:

(а) цитокин, действующий через gp130; и

(b) агонист TGF-β-рецептора и/или

(с) ингибитор FGF-рецептора.

51. Способ по п.50, где среда является средой полностью определенного состава.

52. Применение комбинации:

(а) ингибитора передачи сигнала FGF-рецептора и

(b) активатора путей передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса

в стимуляции самообновления плюрипотентных клеток в культуре.

53.Способ получения дифференцированных клеток, предусматривающий:

поддержание ES-клеток в среде, содержащей

(а) активатор пути передачи сигнала ниже по ходу процесса от рецептора суперсемейства TGF-β; и

(b) активатор пути передачи сигнала с участием gp130 ниже по ходу процесса;

удаление одного или обоих из (а) и (b) из среды;

необязательно, добавление других факторов передачи сигналов

к этой культуре и получение посредством этого желаемых дифференцированных клеток.