CN111574593B - 一种基于毒液的肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于毒液的肽及其应用，涉及生物分子技术领域，该肽的氨基酸序列如式1所示：X1‑X2‑X3‑X4‑X5‑X6‑X7‑X8‑X9‑X10‑X11‑X12‑X13‑X14‑X15‑X16‑X17‑X18；其中，X1、X5、X6、X9和X11均选自A、V、L、I、M、F、W和P中任意一种；X2、X3、X10、X15、X17和X18均选自G、C、S、T、Y、N和Q中任意一种；X7选自D或E；X4、X8和X16均选自K、R和H中的任意一种；X12、X13和X14均选自K、R、H、D和E中的任意一种。该肽具有能够促进人胚胎干细胞自我更新的功能。

Description

一种基于毒液的肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物分子技术领域，具体而言，涉及一种基于毒液的肽及其应用。
背景技术
来自动物诸如蝎、蜘蛛和蛇的毒液肽的优点在于，它们有稳定的结构，经过百余万年的适应性进化从而对靶分子有高度的特异性。
人胚胎干细胞(hESC)疗法已被提议用于损伤或疾病，诸如帕金森病、脊髓损伤和糖尿病后的再生医学和组织替代。尽管干细胞具有的自我更新潜能，但它们需要极高的再生条件以维持其多能性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于毒液的肽及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供了一种基于毒液的肽，其氨基酸序列如式1所示：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18；
其中，X1、X5、X6、X9和X11均选自A、V、L、I、M、F、W和P中任意一种；
X2、X3、X10、X15、X17和X18均选自G、C、S、T、Y、N和Q中任意一种；
X7选自D或E；
X4、X8和X16均选自K、R和H中的任意一种；
X12、X13和X14均选自K、R、H、D和E中的任意一种。
第二方面，实施例提供了如前述实施例所述的基于毒液的肽在促进或维持人胚胎干细胞的自我更新中的应用。
第三方面，实施例提供了一种用于培养人胚胎干细胞的培养基，其组分包括有如前述实施例所述的基于毒液的肽。
第四方面，实施例提供了一种用于激活TGF和/或FGF信号通路的制剂，其包括有如前述实施例所述的基于毒液的肽。
第五方面，实施例提供了如前述实施例所述的基于毒液的肽在制备用于激活TGF和/或FGF信号通路的试剂中的应用。
第六方面，实施例提供了一种用于促进FGFR和TGFβ受体的“二聚化”的制剂，其包括如前述实施例所述的基于毒液的肽。
第七方面，实施例提供了如前述实施例所述的基于毒液的肽在制备用于促进FGFR和TGFβ受体的“二聚化”的试剂中的应用。
第八方面，实施例提供了用于促进调控因子表达的制剂，所述制剂包括如前述实施例所述的基于毒液的肽，所述调控因子选自以下任意一种或多种的组合：OCT4、SOX2和NANOG。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于毒液的肽，该肽的氨基酸序列如式1所示：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18；其中，X1、X5、X6、X9和X11均选自A、V、L、I、M、F、W和P中任意一种；X2、X3、X10、X15、X17和X18均选自G、C、S、T、Y、N和Q中任意一种；X7选自D或E；X4、X8和X16均选自K、R和H中的任意一种；X12、X13和X14均选自K、R、H、D和E中的任意一种。该肽具有能够促进人胚胎干细胞自我更新的功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试验例1的肽对人ES细胞的存活能力及p-Erk1/2和p-Smad2的表达验证结果；
图2为本发明试验例2的肽对人ES细胞的存活能力及p-Erk1/2和p-Smad2的表达验证结果图；
图3为本发明试验例3的M6对人ES细胞的形态和自我更新能力的分析验证结果图；
图4为本发明试验例4的FITC标记的P13及其M6在人ES细胞膜中的作用位置结果图；
图5为本发明试验例5的突变体M6对人ES细胞p-Erk1/2和p-Smad2的表达验证图；
图6为本发明试验例6的小分子抑制剂对接的分子模型图；
图7为本发明试验例7的四种类型模拟系统的分子模拟图；
图8为本发明试验例7中库仑和林纳德-琼斯势计算肽与复合物之间的非键合相互作用能量结果图；
图9为本发明试验例8的FGFR在不同配体条件下的结构变化分析结果图；
图10为本发明试验例部分FGFR的示意图和自抑制模图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
名词缩写
本文中“hESC”为人胚胎干细胞，也称人ES细胞。
本文中“hPSC”为人多能干细胞。
本文中“iPS细胞”为诱导的多能干细胞。
本文中“ANOVA”为单向方差分析。
本文中“qPCR”为定量聚合酶链反应。
本文中“CPP”为细胞穿透肽。
本文中“FGFR”为成纤维细胞生长因子受体。
本文中“TGFβ”为转化生长因子β。
本文中的“X1～X18”均为氨基酸。本领域技术人员公知，氨基酸的缩写如下：G为Glycine，A为Alanine，V为Valine，L为Leucine，I为Isoleucine，M为Methinine，F为Phenylalanine，W为Tryptophan，P为Proline，S为Serine，T为Threonine，C为Cysteine，Y为Tyrosine，N为Asparagine，Q为Glutamine，D为Aspartic acid，E为Glutamic acid，K为lysine，R为Arginine，H为Histidine。
技术方案
来自动物诸如蝎、蜘蛛和蛇的基于毒液肽的优点是它们有稳定的结构和由于百余万年的适应性进化而对靶分子的高特异性。发明人所在的研究小组开发了一种高通量筛选平台，并从自己课题组开发的蝎毒库中识别出了一种毒液肽，名为Gonearrestide(18AA，MW2194，也称为P13)。而基于毒液的肽与干细胞自我更新或分化中涉及的受体之间的关系鲜有报道。
本发明实施例首先提供了一种基于毒液的肽，该肽的氨基酸序列如式1所示：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18；
其中，X1、X5、X6、X9和X11选自A、V、L、I、M、F、W和P中任意一种；
X2、X3、X10、X15、X17和X18均选自G、C、S、T、Y、N和Q中任意一种；
X7选自D或E；X4、X8和X16均选自K、R和H中的任意一种；
X12、X13和X14均选自K、R、H、D和E中的任意一种。
优选地，X1为W；
优选地，X2为C；
优选地，X3为Y；
优选地，X4为K；
优选地，X5为L；
优选地，X6为P；
优选地，X7为D；
优选地，X8为R；
优选地，X9为V；
优选地，X10为S；
优选地，X11为I；
优选地，X15为G；
优选地，X17为C；
优选地，X18为N
需要说明的是，当X1为W，X2为C；X3为Y；X4为K；X5为L；X6为P；X7为D；X8为R；X9为V；X10为S；X11为I；X15为G；X17为C；X18为N时，式1的序列为：WCYKLPDRVSI-X12-X13-X14-X15-G-X16-CN。
优选地，X12为K或E；
优选地，X13为R或E；
优选地，X14为R或K。
优选地，X16为R或K。
经发明人研究发现，具有式1所示序列的多肽具有能够有效促进人胚胎干细胞自我更新的技术效果。
优选地，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。
优选地，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
需要说明的是，在本文中，如SEQ ID No.1所示序列的多肽称为P13，如SEQ IDNo.2所示序列的多肽称为M6。
本发明实施例还提供了前述任一实施方式所述的基于毒液的肽在促进或维持人胚胎干细胞的自我更新中的应用。
人胚胎干细胞(hESC)疗法已被提议用于损伤或疾病诸如帕金森病、脊髓损伤和糖尿病后的再生医学和组织替代。尽管干细胞具有大的自我更新潜能，但它们需要极高的再生条件以维持体外的多能性。mTeSRTM1和基础8TM培养基(E8)是市场上用于人多能干细胞(hPSC)、ES细胞和iPS细胞的生长和扩增的主要产品。陈等人开发了与mTeSRTM1(19种组分)相比具有较少组分并且容易控制质量的E8培养基。E8培养基是无外源物质无饲养层培养基，具有八种组分：DMEM/F12、FGF2、TGFβ1、胰岛素、L-抗坏血酸、硒、NaHCO3以及转铁蛋白。基础6TM培养基(E6)是基于E8培养基但没有FGF2和TGFβ1两种组分的培养基，其支持体细胞的重编程和hPSC的分化。
基于发现的多肽，本发明实施例还提供了一种用于培养人胚胎干细胞的培养基，其组分包括有如前述任一实施方式所述的基于毒液的肽。
需要说明的是，培养基的组分没有具体的限制，只要是能够用于培养人胚胎干细胞就可以。
在一些实施方式中，所述基于毒液的肽在培养基中的浓度为50～200μM。具体地，肽在培养基中的浓度可以为50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、105μM、110μM、115μM、120μM、125μM、130μM、135μM、140μM、145μM、150μM、155μM、160μM、165μM、170μM、175μM、180μM、185μM、190μM、195μM或200μM。
在一些实施方式中，所述培养基还包括以下至少一种或多种组分的组合：DMEM/F12、FGF2、TGFβ1、胰岛素、L-抗坏血酸、硒、NaHCO3以及转铁蛋白。
优选地，培养基的组分：在基础培养基的基础上加入P13和/或M6，基础培养基为E6或E6+TGFβ或E6+FGF2。
本发明实施例还提供了一种用于激活TGF和/或FGF信号通路的制剂，其包括有前述任意实施方式所述的基于毒液的肽。
优选地，FGF信号通路是指FGF刺激的Erk1/2信号传导；
TGF信号通路是指TGFβ刺激的SMAD2/3信号传导。
本发明实施例还提供了如前述任意实施方式所述的基于毒液的肽在制备用于激活TGF和/或FGF信号通路的试剂中的应用。
优选地，FGF信号通路是指FGF刺激的Erk1/2信号传导。
TGF信号通路是指TGFβ刺激的SMAD2/3信号传导。
本发明实施例还提供了一种用于促进FGFR和TGFβ受体的“二聚化”的制剂，其包括如前述任意实施方式所述的基于毒液的肽。
本发明实施例还提供了如前述任意实施方式所述的基于毒液的肽在制备用于促进FGFR和TGFβ受体的“二聚化”的试剂中的应用。
此外，本发明实施例还提供了一种用于促进调控因子表达的制剂，所述制剂包括前述实施例所述的基于毒液的肽，所述调控因子选自以下任意一种或多种的组合：OCT4、SOX2和NANOG。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供基于毒液的肽P13以及P13的突变体M6。
P13的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，M6的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
P13突变为M6：
将P13突变以合成其衍生物P13-M5(序列SEQ ID No.3所示)。文献报到碱性氨基酸精氨酸对肝素结合亲和力是赖氨酸的2.5倍，所以进一步突变得到P13-M6。
实施例2
本实施例提供用于培养人胚胎干细胞的培养基，具体如下。
(1)E6和P13；
(2)E6和M6；
(3)E8和P13；
(4)E8和M6。
需要说明的是，(1)～(4)中，P13和M6的浓度为100μM。具体地，E6培养基包括：DMEM/F12、胰岛素、L-抗坏血酸、硒、NaHCO3以及转铁蛋白；
E8培养基包括：DMEM/F12、FGF2、TGFβ1、胰岛素、L-抗坏血酸、硒、NaHCO3以及转铁蛋白。
人ES细胞培养
以E8培养基为例，使用基质胶包被的组织培养板将人ES细胞(hESC，H1)保持在E8培养基中。E8培养基具有八种组分：DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)、硒钠(14μg/L)、胰岛素(19.4mg/L)、NaHCO3(543mg/L)、转铁蛋白(10.7mg/L)以及FGF2(100μg/L)和TGFβ1(2μg/L)生长因子。
一旦细胞达到80-85％融合，每3-4天使用如前所述EDTA方法在Y-27632存在下传代细胞。E8培养基必须每天更换。在P50传代以下时使用具有正常核型的hESC。
试验例1
A、采用实施例1提供的P13处理的人ES细胞的增殖。
设置2组实验组，组1将基于毒液的肽P13(终浓度为200μM)加入到E8培养基培养的人ES细胞中，组2采用E8培养基进行人ES细胞的培养。在人ES细胞在48孔培养皿中生长24小时后，用TrypLE(Gibco)在室温下将人ES细胞解离5-8分钟，并用含有0.5％BSA的培养基中和。使用BD Accuri C6流式细胞仪测定细胞数，并归一化为铺板的原始细胞数。
使用单向方差分析(ANOVA)风险，在具有P13的E8培养基中存活的人ES细胞的数目，显著高于仅在E8培养基中培养的人ES细胞的数目。请参照图1中a，即P13促进人ES细胞的增殖。
B、P13及其突变体的存活测定。
同样使用发现P13的存活测定方法来筛选其突变体(M5、M6、M10和M11)。
其中，M5突变体是在P13的基础上，将第12位和第13位的氨基酸交换后，获得突变体P13-M5(K12E/E13K)，M5突变体的序列如SEQ ID No.3所示。
当M5中的第13位和第14位的赖氨酸被精氨酸取代时，获得突变体P13-M6(K12E/E13R/K14R)，M6突变体的序列如SEQ ID No.2所示。
将M6作为模板，两个关键氨基酸(P13的N-末端的半胱氨酸和天冬氨酸)也突变，得到两个突变体M10和M11。M10突变体的序列如SEQ ID No.4所示，M11突变体的序列如SEQ IDNo.5所示。具体参照表1。
表1 P13及其突变体的序列信息
5’-3’ SEQ ID No. MW(Da)
P13 W C Y K L P D R V S I K E K G R C N 1 2194.6
M6 W C Y K L P D R V S I E R R G R C N 2 2250.6
M5 W C Y K L P D R V S I E K K G R C N 3 2194.6
M10 W R Y K L P D R V S I E R R G R C N 4 2303.7
M11 W R Y K L P K R V S I E R R G R C N 5 2316.7
测定结果请参照附图1中b。
由图1中b可知，在E8+M5培养基中，存活的人ES细胞的数量显示出轻微的增加，但是与E8+P13培养基中的细胞数量没有显著差异。
单向ANOVA显示，E8+M6培养基中存活人ES细胞的数量显著高于E8+P13培养基中的数量。
此外，在E8+M10/M11培养基中，存活的人ES细胞的数量显著低于在E8培养基中的细胞数量。表1中列出了P13及其突变体的一级结构和分子量。
C、用P13处理的人ES细胞中的p-Erk1/2和p-Smad2的激活。
p-Erk1/2的表达情况验证
在三种不同的培养条件(E6、E6+FGF2和E8)以及用P13处理的这些条件下培养人ES细胞，以观察p-Erk1/2的表达的差异，结果请参照图1中c。
由图1中c显示，与E6对照培养基相比，在P13刺激的E6培养基中观察到的p-Erk1/2的表达水平显著上调。与E6+TGFβ1培养基中的人ES细胞相比，在具有P13和/或FGF2的E6培养基中p-Erk1/2的表达水平上调。
与E8培养基中的人ES细胞相比，在具有P13的E8培养基中p-Erk1/2的表达水平没有显著上调。
p-Smad2的表达情况验证
在三种不同的培养条件(E6、E6+TGFβ1和E8)以及用P13处理的这些条件下培养人ES细胞，以观察p-Smad2的表达的差异，结果请参照图1中d。
图1中d显示，与E6对照培养基相比，在P13刺激的E6培养基中观察到的p-Smad2的表达水平显著上调。与E6+FGF2培养基中的人ES细胞相比，在具有P13和/或TGFβ1的E6培养基中p-Smad2的表达水平上调。
与E8培养基中的人ES细胞相比，在具有P13的E8培养基中p-Smad2的表达水平上调。
试验例2
验证P13对人ES细胞的自我更新能力的影响，结果请参照附图2。
制备两组四种不同的培养基(E6、E6+TGFβ1、E6+FGF2和E8)，并分别向其中1组中的4个培养基加入肽P13；总共制备了八种不同的培养基。
在八种不同条件下，连续传代人ES细胞五次，以检测形态学和多能性标记物的差异。五次传代后观察到的形态差异结果请参照图2中a。
由图2中a可知，在E6和E6+TGFβ1培养基中，人ES细胞的集落形成特征消失。然而，在E6+P13和E6+TGFβ+P13条件下，人ES细胞在五次传代后仍然保持其集落形态。在E6+P13培养基中，人ES细胞形成集落和分散细胞的混合状态。然后，当P13分别加入到E6+FGF2和E8培养基中时，人ES细胞连续培养五代后在形态学上没有显示出显著的差异。
使用定量聚合酶链反应(qPCR)方法检测人ES细胞的自我更新标记。
在上述八种不同的培养基的培养条件下，检测OCT4、SOX2和NANOG的mRNA的差异表达。检测结果请参照图2中b。
由结果可知，与其它条件相比，E6和E6+TGFβ1中，OCT4、SOX2和NANOG保持低的mRNA表达水平，这与在形态学图2中a中观察到的结果一致。
与E6和E6+TGFβ1培养基相比，其它六种条件下，人ES细胞的OCT4、SOX2和NANOG上调。单向ANOVA(***p＜0.001)显示NANOG的mRNA表达与E6培养基相比显著上调。
试验例3
验证M6对人ES细胞的自我更新能力的影响，实验结果请参照附图3。
基于初步结果，制备三组四种不同的培养基(E6、E6+TGFβ1、E6+FGF2和E8)，并分别向其中1组中的四种培养基中加入肽M6，另一组加入P13作为对照。这样总共制备十二种不同的培养基。
将人ES细胞在12种不同条件下连续传代五次，以检测形态学和多能性标记物的差异。五次传代后的形态学差异结果请参照附图3中a。
由图3中a可知，E6、E6+P13、E6+M6和E6+TGFβ培养基中人ES细胞的集落形成特征完全消失。然而，与E6+TGFβ培养基相比，E6+TGFβ+P13和E6+TGFβ+M6条件下人ES细胞在五次传代后保持其集落形成形态。在E6+TGFβ+P13和E6+TGFβ+M6培养基条件下，人ES细胞显示出集落和分散细胞的混合状态。然后将P13和M6分别加入E6+FGF2和E8培养基中，并且人ES细胞在连续培养五代后在它们的形态上没有显示出显著的差异。
使用qPCR分析来检测人ES细胞的自我更新标记物。
在12种不同条件下，检测OCT4、SOX2和NANOG的mRNA的差异表达，检测结果请参照图3中b(图中，样本从左至右依次为E6、E6+P13、E6+M6、E6+TGFβ1、E6+TGFβ1+P13、E6+TGFβ1+M6、E6+FGF2、E6+FGF2+P13、E6+FGF2+M6、E8、E8+P13和E8+M6)。
与其它条件相比，E6、E6+P13、E6+M6和E6+TGFβ1中OCT4、SOX2和NANOG保持低的mRNA表达水平，这与上述形态学图3中a中观察到的结果一致。与E6+TGFβ1培养基相比，E6+TGFβ1+p13和E6+TGFβ1+M6条件下人ES细胞的OCT4、SOX2和NANOG上调。单向ANOVA显示，与E6培养基相比，E6+FGF2、E6+FGF2+P13、E6+FGF2+M6、E8+P13和E8+M6培养基中SOX2和NANOG的表达水平显著上调(***p＜0.001)。
试验例4
验证P13和M6在人ES细胞中的细胞穿透能力，结果请参照附图4。
一些多肽可以作为细胞穿膜肽(CPP)，其穿透细胞膜以执行它们的功能或作为载体以将某些分子运输到细胞中。本试验例的目的是确定P13和M6是否能进入细胞以执行它们各自的功能。
各自用FITC荧光标记的P13和M6处理人ES细胞24小时，并借助与胞质膜染料组合的核染料的免疫染色通过共聚焦显微镜来确认肽的位置。
荧光标记的P13/M6对人ES细胞的免疫染色：在无菌盖玻片上培养人ES细胞，并且用基质凝胶以1mg/ml的浓度包被12孔板1-2小时。24小时后用DMEM-F12培养基洗涤细胞，并且更换E8培养基，并用荧光标记的肽处理24小时。然后，使用CellMaskTM深红质膜(ThermoFisher，赛默飞世尔)对细胞膜染色，并在37℃孵育10分钟。除去染色溶液，并将200μL4.0％甲醛加入培养基中，并在37℃孵育10分钟。然后除去培养基，并用1×PBS洗涤细胞三次。用10μl DAPI(DNA染色剂)和封固剂孵育细胞一分钟，并封固盖玻片。用指甲油密封盖玻片以防止干燥。使用Carl Zeiss共焦LSM710显微镜对样品成像。
结果如图4(图4中a为P13-FITC，图4中b为M6-FITC)可见，蓝色荧光代表胚胎干细胞的细胞核，红色荧光代表细胞膜，绿色荧光标记的P13和M6与质膜结合，并且在细胞质中没有发现绿色荧光标记的P13和M6。这表明P13和M6不属于CPP家族。
试验例5
A、验证突变体M6对人ES细胞p-Erk1/2和p-Smad2的表达。
首先，比较P13和M6刺激的人ES细胞中p-Erk1/2和p-Smad2的表达的差异。
结果请参照图5中a(试验例5的结果请参照附图5)，发现与E6培养基中的人ES细胞相比，加入P13和M6的E6培养基中p-Erk1/2和p-Smad2的表达水平分别显著上调。与加入P13的E6培养基中的人ES细胞相比，在加入M6的E6培养基中，p-Erk1/2和p-Smad2的表达水平没有显著上调。
B、在小分子抑制剂情况下，突变体M6对人ES细胞p-Erk1/2和p-Smad2的表达验证。
小分子抑制剂对人ES细胞中p-Erk1/2和p-Smad2的表达试验方法：将人ES细胞(H1)接种到具有E8培养基的12孔板中。24小时后将培养基换成E6。人ES细胞在5％CO2和37℃下孵育20-24小时，加入P13和/或M6肽，并且1小时后使用RIPA缓冲液收获细胞。
将人ES细胞(H1)接种到具有E8培养基的12孔板中。24小时后将培养基换成E6。将人ES细胞在5％CO2和37℃下孵育20-24小时，并根据布局加入一定浓度的FGFR抑制剂—AZD4547、PD173074和TGFβ受体抑制剂LDN193189、SB431542和A8301—并孵育三小时；然后加入一定浓度的P13和M6肽，1小时后使用RIPA缓冲液收集细胞。然后采用免疫印迹的方法检测p-Erk1/2和p-Smad2的表达情况。
免疫印迹：对于可溶性蛋白的免疫印迹，使用具有核酸酶(benzonase)、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液收获人ES细胞。使用PierceTM BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher，赛默飞世尔)测量蛋白浓度。使用12％SDS-PAGE凝胶，并将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。在1×PBST缓冲液中使用5％脱脂奶在室温下通过振荡封闭膜一小时，用一级抗体(兔单克隆磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)：细胞信号传导技术(CST)4370S；兔p44/42MAPK(Erk1/2)：CST 9102S；兔单克隆磷酸-Smad2(Ser465/467)(138D4)：CST 3108S；兔Smad2(D43B4)XP：CST 5339S；鼠GAPDH：Proteintech 60004-1-Ig)在4℃下孵育过夜，然后用二级抗体HRP孵育一小时。在每个孵育的抗体步骤结束时，用1×PBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。使用PierceTM ECL免疫印迹底物在ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)上检测化学发光。
B-1.用TGFβ家族受体抑制剂LDN189193、SB431542和A8301处理人ES细胞，以研究p-Erk1/2和p-Smad2的表达水平。
其中，LDN193189具有抑制ALK1(ACVRL1)、ALK2(ACVR1A)、ALK3(BMPR1A)和ALK6(BMPR1B)的能力(分别为IC50＝0.8、0.8、5.3和16.7nM)，并且是骨形态发生蛋白(BMP)通路的强效抑制剂。
SB431542抑制ALK4(ACVR1B)和ALK5(TGFβR1)(分别为IC50＝140nM、94nM)，并且是TGF-β/活化素/NODA通路的选择性的强效抑制剂。
A8301为I型活化素/nodal受体ALK4、TGFβI型受体ALK5激酶和I型nodal受体ALK7(ACVR1C)的选择性抑制剂(分别为IC50＝45、12和7.5nM)。
结果如图5中b所示，由图5中b的通道3-9可知，与对照E6培养基(通道3)相比，1.0μmol LDN189193能抑制p-Smad2的表达，0.2μmol LDN189193不能抑制p-Smad2的表达；然而，与具有1.0μmol LDN189193的E6培养基中的干细胞相比，在用TGFβ和M6处理的各个E6培养基中，p-Smad2的表达上调。
通道11-16(SB431542)和17-22(A8301)显示，1.0μmol SB431542和0.2μmol A8301不能抑制p-Smad2的表达。然而，较高浓度的SB431542(10μmol)和A8301(1.0μmol)能显著抑制p-Smad2的表达；具有M6的E6培养基中p-Erk1/2的表达上调，但在具有TGFβ的E6培养基中却观察不到p-Erk1/2的表达上调。
B-2.用FGF家族受体抑制剂AZD4547和PD173074处理人ES细胞，以观察p-Erk1/2和p-Smad2的表达水平。
其中，AZD454724是对FGFR4具有较弱活性的强FGFR1/2/3抑制剂(分别为IC50＝0.2、2.5和1.8nM)。多西他赛(Docetaxel，AZD4547)已经进入II/III期试验，治疗IV期肺鳞状细胞癌患者(https://clinicaltrials.gov)。
PD173074在无细胞测定中是强效的FGFR1抑制剂(IC50＝25nM)。
结果如图5中c所示。
由图5中c中的通道2～8显示，与对照E6培养基(通道2)和用P13、M6和/或FGF2处理的E6培养基相比，0.2μmol AZD4547能够抑制p-Erk1/2的表达。然而，与对照E6培养基和具有0.2μmol AZD4547的E6培养基相比，用P13、P13+FGF2、M6和M6+FGF2处理的E6培养基中的p-Smad2的表达上调。
图5中c中的通道9-14显示，与对照E6培养基和具有P13、M6和/或FGF2的E6培养基相比，1.0μmol PD173074能够抑制p-Erk1/2的表达。然而，与对照E6培养基和具有1.0μmolPD173074的E6培养基相比，具有P13、P13+FGF2、M6和M6+FGF2的E6培养基中的p-Smad2的表达上调。
B-3、用FGF受体抑制剂AZD4547(0.2μmol)和/或TGFβ受体抑制剂A8301(1.0μmol)处理人ES细胞，以研究p-Erk1/2和p-Smad2的表达。
结果如图5中d所示，图中通道1-2验证了FGF2和FGF受体抑制剂AZD4547的功能；FGF2上调p-Erk1/2的表达，并且AZD4547抑制p-Erk1/2的表达，即使在加入FGF2的E6培养基中也是如此。
通道3-4验证了TGFβ1和TGFβ受体抑制剂A8301的功能；TGFβ1上调p-Smad2的表达，但A8301也抑制p-Smad2的表达，即使在加入TGFβ1的E6培养基中也是如此。
通道7-10验证了用M6处理的人ES细胞的单抑制剂和双重抑制剂(FGF和TGFβ)中p-Erk1/2与p-Smad2之间的表达差异。其中，通道7-8显示，即使在具有M6的E6培养基中，0.2μmol AZD4547也抑制p-Erk1/2的表达。并且通道9-10显示，即使在具有M6的E6培养基中，1.0μmol A8301也抑制p-Smad2的表达。
通道11-12显示，即使在具有M6的E6培养基中，p-Erk1/2和p-Smad2的表达也被双重抑制剂0.2μmol AZD4547和1.0μmol A8301抑制。
试验例6
小分子抑制剂的分子建模，请参照附图6。
PDB ID 3TZM代表TGFβ受体1型的细胞内激酶结构域。
3TZM实际上是一种三维晶体结构，其包括小分子抑制剂SB431542和TGFβ受体。CDOCKER删除了SB431542，并将A8301对接在FGFR细胞内激酶结构域中。小分子抑制剂A8301结合TGFβ受体1型的细胞内激酶结构域结合袋请参照图6中A。
需要说明的是，CDOCKER是基于CHARMM的分子动力学(MD)方案，通过采用高温动力学将配体对接入受体结合位点，以寻找配体分子的柔性构象空间并模拟退火以在活性受体位点处映射各构象。选择TGFβ受体1型(PDB ID：3TZM)作为受体；除去晶体结构中含有的小分子抑制剂，并从PDB位点记录中选择位点球。然后，选择A8301作为配体。参数设置如下：1000个随机构象动力学步骤，1000k动力学目标温度；2000个模拟退火加热步骤，700k加热目标温度，5000个冷却步骤，以及300k冷却目标温度；力场：CHARMM50。使用DiscoveryStudio v17.2.0商业软件。
图6中A-a为A8301的2D结构；图6中A-b显示出了与TGFβ受体细胞内激酶结构域的口袋结合的A8301；图6中A-c是活性分子窗口中A8301与TGFβ之间的相互作用的2D模型，标记与受体和配体相互作用的氨基酸。小分子抑制剂与受体的激酶结构域结合，有效地抑制下游分子的磷酸化。
PDB ID 4WUN代表FGFR1的细胞内激酶结构域。
小分子抑制剂AZD4547结合FGFR细胞内激酶结构域的实体带状建模请参照图6中B。
图6中B-a为代表AZD4547的2D结构；图6中B-b为与FGFR细胞内激酶结构域的口袋结合的AZD4547；图6中B-c为活性分子窗中AZD4547与FGFR之间的相互作用的2D模型，并且受体与配体之间相互作用的氨基酸已被标记。
试验例7
A、使用分子动力学(MD)模拟研究P13和M6对FGFR二聚体的结构和动力学的影响。
使用PDB条目1FQ9(
Figure BDA0002513843150000091
分辨率)作为受体、其配体和辅因子的起始结构。该PDB含有结合在稳定的三元复合物中的两个FGF、两个FGFR和两个硫酸乙酰肝素(HS)分子。另一方面，使用PEP-FOLD3服务器通过预测获得P13和M6肽的起始坐标。根据实验形式将两种肽的C-末端酰胺化。构造具有四种不同设置的模拟系统：晶体2:2:2FGF：FGFR：HS复合物、载脂蛋白2:2FGFR：HS复合物以及与P13或M6的链结合的2:2FGFR：HS复合物。
将二十条链的肽加入到系统的溶剂相中，并使其在蛋白质复合物周围平衡。分析了蛋白质复合物在肽存在下的结构和动力学，并与天然的2:2:2FGF：FGFR：HS(FGF结合的)，和载脂蛋白(apo)2:2FGFR：HS(无FGF)复合物进行比较，具体如下。
使用CHARMM-GUI web界面生成用于模拟系统的拓扑文件，具有以下选项：1)固定FGFR链B中缺失的内部残基(残基293至307)；2)建模四种建议的二硫键(FGFR链A和B的178和230、277和341)；3)两个肝素分子的糖基化，4)加入反离子以中和系统，以及5)在矩形盒中用水分子使整个复合物溶剂化。所制备的系统在13.0×13.0×13.0nm3的盒中含有约200000个原子。所有模拟都是使用GROMACS版本5.0.7在周期性边界条件下进行的。
通过CHARMM36m力场对蛋白质、肽和肝素建模，并且通过TIP3P55对水分子建模。利用始于1.0nm的用于范德华相互作用的转换电位，在1.2nm处切断短程相互作用。通过傅里叶间距为0.12nm的Ewald颗粒筛56处理远程相互作用。使用LINCS57和SETTLE58算法来约束具有氢原子的键，因此可以使用2fs的时间步长。在等温等压(NPT)集合中进行生产模拟。在300K下使用Nosé Hoover恒温器，耦合常数为1.0ps。用Parrinello-Rahman恒压仪60将压力保持在1atm，并且耦合常数为5.0ps。所有初始系统均首先通过具有速度产生的正则系综(NVT)平衡。通过NPT系综产生生产轨迹，并且每10ps保存坐标用于分析。
图7显示出了四种类型系统的500-ns模拟的初始和最终快照。其中，图7中a为晶体FGF：FGFR：HS复合物；图7中b为载脂蛋白FGFR：HS复合物；图7中c为具有20链的P13的FGFR：HS复合物；图7中d为具有20链的M6的FGFR：HS复合物。需要说明的是，为了清楚起见，除去了不与蛋白质接触的少量肽。
由图7可知，多个肽在受体的上部D2和下部D3结构域中均与复合物缔合。M6似乎更强且更紧密地与复合物结合，而P13在模拟过程中显示出更松散的结合，具有频繁的附着以及分离事件。
B、从库仑和林纳德-琼斯势计算了肽与复合物之间的非键合相互作用能量，以确定肽结合的因素。
结果如图8所示，肽与复合物的结合主要由静电相互作用驱动。通过比较M6的能量值与P13的能量值，可看到存在HS-肽的显著的静电和范德华相互作用(分别为dE＝-774.6和-109.2kJ/mol)。
另一方面，P13在静电相互作用中显示与蛋白质更强的结合(dE＝-441.9kJ/mol)。与P13的-7690.3kJ/mol相比，M6的总非键合相互作用能量为-8142.2kJ/mol，其差为-451.9kJ/mol。
因此，M6和P13与复合物的差异结合诱导了复合物结构的不同变化。
试验例8
对于M6，FGFR：HS复合物的结构类似于平衡的FGF-结合的结构，其中D2和D3结构域伸展，并且两条链的D3结构域保持近端距离。相反，对于P13，FGFR：HS复合物的结构更接近平衡的无FGF结构，其经历了大的构象变化以在其天然配体丧失时采取显著不同的折叠(fold)。对此，对FGFR在不同配体条件下的结构变化进行分析，请参照附图9。
图9中a中蛋白质骨架相对于其初始结构的均方根偏差(RMSD)和9中b的两个FGFR链的D3结构域之间的质量中心分离距离的比较揭示了P13和M6二者的复杂结构的变化几乎立即发生，但变化的结构在300ns处达到稳定性。
P13和M6中的D3结构域的紧密相互作用均是稳定的，尽管在稍微大的分隔距离(两个结构域的质心大约为3nm，而在晶体模拟的平衡的FGF结合状态下为2nm)。该发现与使用基于FRET的技术使激活的两个FGF受体的D3更接近的结果一致。
进一步地，通过主成分分析(PCA)分析了模拟过程中复合物的构象变化。连接待比较的四个模拟轨迹，即FGF结合的、无FGF的、P13和M6，并计算蛋白质主链原子的位置波动的协方差矩阵。将该矩阵对角化；获得表示原子运动轴和沿这些轴的均方波动的特征向量和相关特征值。图9中c显示出了模拟轨迹在第一和第二PCA模式上的2维投影，即蛋白质的最大和第二大原子运动的轴。
PCA分析的结果显示，蛋白质从初始状态到活性状态(平衡的FGF结合形式)的构象变化仅涉及短距离原子运动，而到非活性状态(平衡的无FGF形式)的变化涉及对应于两条链的D2-D3结构域的闭合作用的大规模运动。
投影数据揭示，在M6肽的结合时，蛋白质保持与初始和FGF-结合形式相似的构象状态一段时间，然后其转变为接近FGF结合形式的构象状态。使用P13时，蛋白经历了相对较大的运动，以停留在初始状态与无FGF状态之间的中间构象状态。
根据上述试验例1～7的试验结果，研究P13和M6在FGF2(16.4kDa)和TGFβ1(25.6kDa二硫键连接的同二聚体)中发挥的作用。
1)P13和M6对FGF2的影响
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是由三个结构域：细胞外配体结合区、单个跨膜部分和细胞内激酶结构域组成的跨膜蛋白34(请参照图10中a和表2)；胞外区由三个免疫球蛋白样区域：D1、D2和D3组成。
表2 FGFR的具体信息
Figure BDA0002513843150000101
在D1和D2区域之间存在酸性盒(AB)。D1和酸性盒在FGFR分子的自我调节中发挥关键作用，而D2和D3是配体结合区。激酶结构域磷酸化下游分子，并且可以被诸如AZD4547和PD173074的小分子抑制剂抑制。D2区包括肝素结合位点。
FGFR具有它们自身的一组分子内调节机制—“自身抑制”，请参照图10中b。D1竞争性地结合由D2和D3形成的配体结合位点。同时，酸性盒结合相同受体中带正电荷的“峡谷”，其也是肝素结合位点(FGFR1中的18AA：KMEKKLHAVPAAKTVKFK(六个赖氨酸残基)和FGFR2中的18AA：KMEKRLHAVPAANTVKFR(三个赖氨酸残基和两个精氨酸残基))。
当D1和酸性盒占据它们的分子内结合位点时，FGFR单体采用“闭合”和自抑制构型；然而，当FGF和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)单独竞争配体结合位点和酸性盒时，闭合构型中的FGFR被打开并激活。基于上述无偏见的证据，推测毒液肽P13(18AA：WCYKLPDRVSIKEKGRCN(三个赖氨酸残基和两个精氨酸残基))及其突变体M6(18AA：WCYKLPDRVSIERRGRCN(一个赖氨酸残基和四个精氨酸残基))具有竞争酸性盒以减轻FGFR的自身抑制的能力。
二聚体复合物(PDB ID：1FQ9)的X射线晶体结构(三元FGF-FGFR-肝素复合物)证实了FGFR激活的两个必要先决条件：成为二聚体的两分子FGFR和两分子肝素的参与。
参与FGFR激活的分子是细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，并且用在晶体中的两种肝素仅便于体外结晶。X射线晶体结构包括比例为2:2:2的FGFR1、FGF2和肝素的胞外区。肝素同时结合3D结构的两个FGF2配体和两个FGFR1受体分子。
结合试验例7，以该三元晶体复合物(PDB ID：1FQ9)作为模板，进行MD模拟以研究与FGFR蛋白复合物结合的多个肽的能量学和动力学。使一批20链的P13或M6肽在去除了FGF的2:2FGFR：HS复合物周围平衡。在复合物受到位置限制的平衡过程中，观察到肽由于其与FGFR和HS分子的强静电吸引而快速地与复合物结合。随后，在平衡后的经典MD模拟中，蛋白质复合物经历由结合的P13或M6肽诱导的不同构象变化。
结合试验例8，理解这些构象变化对FGFR的生物学功能的影响。将肽模拟与复合物的FGF结合(天然)和无FGF(载脂蛋白)模拟进行了比较。模拟揭示了复合物的FGF结合和无FGF形式的构象显著不同。平衡中的FGF结合复合物类似于其晶体结构，其中D2和D3结构域伸展，两个HS分子紧密结合D2和FGF二者，并且重要的是，两个D3结构域结合在一起。D3结构域的更接近表明复合物结构处于其活性状态，与基于FRET的实验结果一致。
相反，在载脂蛋白模拟中，失去FGF配体的FGFR：HS复合物通过将FGFR链的下部D3结构域朝相对的FGFR链的上部D2结构域移动而经历大的铰链运动。这种运动自发地发生，并且在200ns的短模拟时间内完成。此后，FGF结合位点保持部分封闭。天然和载脂蛋白模拟揭示，D2-D3构象和D3-D3结构域接触对于活化的FGFR及其失活的对应物是不同的。
比较在肽模拟与天然和载脂蛋白模拟中，P13和M6的结合后FGFR：HS复合物的结构变化和能量学。RMSD和PCA结果表明，两种肽都具有将复合物的构象维持为FGFR的活性和失活状态之间的一些中间形式的能力。
重要的是，两种肽都需要D3的更紧密的结构域间接触，这对FGFR的信号转导功能至关重要。值得注意的是，与P13相比，M6结合的FGFR的结构更接近活化的FGFR，这可能是由于其对FGFR：HS复合物的更高的亲和力。因此，计算结果提供了对P13和M6与FGFR的肽结合模式的一些了解，得出的M6有更好的增殖活性。
2)P13和M6对TGFβ受体的影响
2008年，在
Figure BDA0002513843150000111
的分辨率测定了与异四聚体TGFβRI/TGFβRII(2PJY)结合的TGFβ3的两个分子的晶体结构。然而，与相应受体结合的TGFβ的晶体结构是复杂的异源四聚体。
TGFβ受体是参与TGFβ信号通路的Ser/Thr激酶受体的家族，并且超过三十个成员决定了它们的多功能性质。TGFβ受体的主要功能包括胚胎干细胞的自我更新、原肠胚形成、分化、器官形态发生和成人组织稳态。TGFβ超家族受体将信号发送给细胞内Smad蛋白激酶的家族，这些激酶进一步进入细胞核以调节相关基因的表达。TGFβ受体的激活机制可以分为三个部分：
第一，TGFβ直接结合组成型活性激酶TGFβ受体II；
第二，TGFβ被受体I识别，受体II募集受体I以形成四聚体复合物；
第三，TGFβ受体II磷酸化受体I，然后将信号传递至下游底物。
对TGFβ受体激活过程的深入研究揭示了锚定在细胞膜上的糖蛋白参与激活过程，包括膜锚定的β蛋白聚糖(Betaglycan)和内皮糖蛋白(Endoglin)，并促进与TGFβ受体的配体结合。
TGFβ受体的细胞外结构具有与三指毒素相似的结构，并且FGFR的细胞外结构也具有免疫球蛋白样支架。尽管这两种受体的细胞外结构之间存在一些差异，但共同特征之一是信号通路激活时，具有单独结构域的胞外蛋白聚糖的参与。
FGFR的激活模式是将两个单体受体“拉/拖”成二聚体，而TGFβ受体的激活模式是将TGFβ受体II同源二聚体，和TGFβ受体I同源二聚体再二聚化成异源四聚体，以激活下游信号通路。
假设任何分子都具有使FGFR和TGFβ受体“二聚化”并激活其相应信号通路的能力，基于上述实验数据，推测毒液肽P13及其突变体M6的潜在分子机制对硫酸乙酰肝素具有较高的亲和力，并且具有协同蛋白聚糖以激活TGF和FGF信号通路的能力。
综上，P13及其突变体是通过该研究发现的第一个基于毒液的肽，其作用于FGF和TGF-β信号通路以促进hESC的自我更新能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 澳门大学
<120> 一种基于毒液的肽及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Cys Tyr Lys Leu Pro Asp Arg Val Ser Ile Lys Glu Lys Gly Arg
1 5 10 15
Cys Asn
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Cys Tyr Lys Leu Pro Asp Arg Val Ser Ile Glu Arg Arg Gly Arg
1 5 10 15
Cys Asn
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Trp Cys Tyr Lys Leu Pro Asp Arg Val Ser Ile Glu Lys Lys Gly Arg
1 5 10 15
Cys Asn
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Trp Arg Tyr Lys Leu Pro Asp Arg Val Ser Ile Glu Arg Arg Gly Arg
1 5 10 15
Cys Asn
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Trp Arg Tyr Lys Leu Pro Lys Arg Val Ser Ile Glu Arg Arg Gly Arg
1 5 10 15
Cys Asn

Claims (7)

1.一种基于毒液的肽，其特征在于，所述基于毒液的肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的基于毒液的肽在制备促进或维持人胚胎干细胞的自我更新的试剂中的应用。
3.一种用于培养人胚胎干细胞的培养基，其特征在于，其组分包括有如权利要求1所述的基于毒液的肽。
4.根据权利要求3所述的用于培养人胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述基于毒液的肽在培养基中的浓度为50～200μM。
5.根据权利要求3所述的用于培养人胚胎干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基还包括以下至少一种或多种组分的组合：DMEM/F12、FGF2、TGFβ1、胰岛素、L-抗坏血酸、硒、NaHCO3以及转铁蛋白。
6.一种用于激活TGF和/或FGF信号通路的制剂，其特征在于，其包括有如权利要求1所述的基于毒液的肽，其中FGF信号通路是指FGF刺激的Erk1/2信号传导；TGF信号通路是指TGFβ刺激的SMAD2/3信号传导。
7.如权利要求1所述的基于毒液的肽在制备用于激活TGF和/或FGF信号通路的试剂中的应用，其中FGF信号通路是指FGF刺激的Erk1/2信号传导；TGF信号通路是指TGFβ刺激的SMAD2/3信号传导。
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