JP7131772B2 - 熱安定性fgf2ポリペプチド及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は,培養のコストを著しく下げ,培養された細胞の改良された品質,及び,より少ない操作の要求につながる熱安定性を有するFGF2を提供することを目的とする。さらに,これは再生医療,関連する医療用途又は化粧品に使用することができるであろう。
定義
本明細書で使用されるいくつかの用語の定義を下記に示す。特記しない限り,ここに使用される技術及び科学用語は全て本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
FGFタンパク質の不安定さを克服する最も興味深いアプローチは,突然変異生成によってタンパク質の特性を変えることである。そのアミノ酸配列の変更によって,FGFタンパク質はより高い熱安定性,増加した半減期,さらにタンパク質分解を生ずる劣化に対する増加した抵抗性を有し得る。それらの特性を最適化するためにタンパク質を変異させることは,ヒトの治療用途にさえ実現可能である。タンパク質のいくつかの突然変異形はFDAによってヒトの医薬として使用を承認された。
下記の実施例は本発明の実施態様を説明するために示される。示された実施例は,説明的な性質のものであり,限定することを意図してはいない。本発明の試験の中でここに記載されたものに似ているか等価である方法及び材料を使用することができるが,適切な方法及び材料を下記に述べる。
2.20Åより高い解像度の利用可能な構造のFGF2をRCSBプロテインデータバンク(Berman et al., (2000). Nucleic Acids Res. 28, 235‐242.)からダウンロードした。該構造を配位子と水分子を除去することにより,分析のために準備した。複数の鎖構造の場合には1本の鎖が選択された。構造は全てリナンバリングされ,従って,それらは位置1からスタートする。タンパク質側鎖を最小化し,最小化が正確に進んだかどうか判断するためにスコアを付けた。あらゆる単一点突然変異の安定効果はフォースフィールド計算を使用して評価された。ΔΔG自由エネルギーを集め,全ての用いられている構造に関して平均し,続いて特定の位置の20の突然変異全てについて平均した。進化の保存は同族の配列の系統発生の分析を使用して評価された。ΔΔG<-1.0kcal/molであり,保存<8である突然変異をさらなる分析のために選択した。機能領域(例えばヘパリン結合残基)に対して限られた影響のみを有する最善な位置を確認した。9つの単一点置換を実験の構築及び特性解析に選択した:R31W,R31L,H59F,C78Y,L92Y,C96Y,R118W,T121K及びV125L(表1)。これらの突然変異体のナンバリングは,野生型ヒトFGF2(以下に示す配列番号:2)の配列に相当する。
表1:自由エネルギー予測,保存分析及び目視検査によって選択された,安定する突然変異
ΔΔG:突然変異によるギブズ自由エネルギーの変化
関連するタンパク質を有するFGF2のマルチプル配列アラインメントを構築した。FGF2タンパク質配列を,クエリとしてNCBIのnrデータベースに対するPSI-BLAST(Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Res. 25, 3389‐3402)サーチに使用した。3回の反復後に集めた配列を90%の同一性閾値でCD-HIT((Li & Godzik, (2006). Bioinformatics 22, 1658‐1659))によりクラスター化した。得られた500を超える配列のデータセットを,デフォルトパラメーターを使用し,P値閾値を変えて,CLANS(Frickey & Lupas, (2004). Bioinformatics. 20, 3702‐3704)でクラスター化した。10-30のP値でFGF2でクラスター化された配列が抽出され,MUSCLEプログラム(Edgar, (2004). BMC Bioinformatics. 5, 113.)でアラインメントさせた。238の配列からなる最終アラインメントを,単純なコンセンサスアプローチを使用するバックトゥーコンセンサス分析(back-to-consensus analysis)のインプットとして分析に使用した。この分析はコンセンサスのカットオフ値0.5を使用して行なわれ,これは与えられた残基がコンセンサス残基として割り当てられるべき全ての分析された配列の少なくとも50%で,与えられた位置で存在するであろうことを意味する。FGF2タンパク質中の全ての可能な単一点突然変異の安定化効果を自由エネルギー計算によって評価した。両方の方法により平均ΔΔG≦1kcal/molと予測された突然変異のみをFGF2安定化用ホットスポットと見なした。FGF2の機能的に重要な部位は生体機能にとって潜在的に有害な突然変異として除外した。バックトゥーコンセンサス分析の結果を表2にまとめる。ナンバリングは,野生型ヒトFGF2(下記の配列番号:2)の配列に相当する。予測されたΔΔGの高い値に基づいて,10個の突然変異が除外され,3個の突然変異が,ヘパリン結合のための機能的に重要な位置での,そのロケーションに対する設計から放棄された。最後に,3つの単一点突然変異が全ての基準を通り,実験の構築及び特性解析に選択された:V52T,N80G及びS109E。
表2:50%のコンセンサスカットオフ値を使用して,FGF2中で識別されたバックトゥーコンセンサス突然変異
実験のコンストラクションに選択された突然変異は,灰色のハイライトが付けられている
Freq:マルチプルアラインメントの与えられた位置での与えられたFGF-2の残基の頻度;
RES_Top:マルチプル配列アラインメントの与えられた位置で最も保存された残基;
Freq_TOP:マルチプル配列アラインメントの与えられた位置で最も保存された残基の頻度;
ΔΔG:突然変異におけるギブズ自由エネルギーの変化。
突然変異体FGF2 R31W,R31L,V52T,H59F,C78Y,N80G,L92Y,C96Y,S109E,R118W,T121K及びV125Lを商業的に合成し,pET28b-Hisトロンビンの下流の誘導可能なT7プロモーターのNdeI及びXhoI部位にサブクローン化した。結果として生じた構築物を大腸菌Dh5αコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン(50μg.mL-1)を含む寒天平板上にプレーティングし,37℃で一晩培養した。プラスミドを分離し,ヌクレオチド配列を商業的なシーケンシングによって確認した。大腸菌BL21(DE3)細胞を発現ベクターで形質転換し,カナマイシンを含む寒天平板上にプレーティングし,37℃で一晩培養した。単一のコロニーをカナマイシン(50μg.mL-1)を含むLB培地の10mLの接種に使用し,細胞を37℃で一晩培養した。一晩の培養物を,カナマイシン含むLB培地の200mLに接種するために用いた。細胞を37℃培養した。その発現を0.25mMの終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。その後,細胞を20℃で一晩培養した。培養の終わりに,バイオマスを遠心分離によって採取し,pH7.5のバッファー(20mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム,0,5MのNaCl,10mMのイミダゾール)によって洗浄した。懸濁液内の細胞を音波処理によって破壊し,細胞ライセートを遠心分離機にかけた。タンパク質からシングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して,粗抽出液を取り除いた。ピークフラクション中のタンパク質の存在を15%のポリアクリルアミドゲル中のSDS-PAGEによって証明した。タンパク質の析出は500-750mMのNaClを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。SDS-PAGE分析(図3)で判断されるように,アフィニティークロマトグラフィーによるFGF2突然変異体の精製により,90%を超える純度の均質なタンパク質が得られた。精製されたFGF2突然変異体の収量の範囲は15~90mg.L-1であった。
エネルギーと進化に基づいたアプローチによって予測された単一点FGF2の熱安定性を,示差走査熱量測定法(DSC)分析によって測定した。500-750mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸バッファー(pH7.5)中の1.0mg/mLのタンパク質溶液の熱の変性に続いて,VPキャピラリーのDSCシステムを使用して熱容量をモニターした。その測定は1℃/分の加熱速度で20から80℃までの温度で行なわれた。Tmは,熱容量曲線が極大値に達した温度として決定された。結果を表4及び図4に示す。
表4:示差走査熱量測定法によって決定されたFGF2突然変異体の熱安定性。
組み合わされた3点及び6点突然変異体の構築のために選択された突然変異を,灰色のハイライトで示す(実施例5を参照)。
Tm:融解温度;ΔTm:突然変異による融解温度の変化;
1)3つの独立した実験からの平均を示す(標準偏差は10%未満であった)。
この実施例は,本発明の開示のインシリコの予測方法がFGF2における安定化突然変異の予測に役立つことを実証する。Tmを少なくとも2℃改善する突然変異は,各々3点(R31L,V52T及びH59F)及び6点(R31L,V52T,H59F,L92Y,C96Y及びS109E)の突然変異体FGFCS1及びFGF2CS2において,自由エネルギー計算を使用して組み合わせられた(実施例5を参照)。
FGF2の多点突然変異体を商業的に合成し,pET28b-Hisトロンビンの下流の誘導可能なT7プロモーターのNdeIとXhoI部位にサブクローン化した(突然変異させたヌクレオチド及びポリペプチド配列は,下記の配列番号:29~配列番号:32に示されている)。結果として生じた構築物で大腸菌Dh5αコンピテント細胞を形質転換した。細胞をカナマイシン(50μg.mL-1)を有する寒天平板上にプレーティングし,37℃で一晩増殖させた。プラスミドを分離し,ヌクレオチド配列を商業的にシーケンシングによって確認した。大腸菌BL21(DE3)細胞を発現ベクターで形質転換し,37℃でカナマイシンを有する寒天平板上にプレーティングし,一晩増殖させた。単一のコロニーをカナマイシン(50μg.mL-1)を含むLB培地10mLに接種するために使用し,細胞を37℃で一晩増殖させた。一晩の培養物をカナマイシンを含むLB培地の200mLに接種するために使用した。細胞は37℃で培養した。その発現を0.25mMの終濃度までIPTGで誘導した。その後,細胞を20℃で一晩培養した。培養の終わりに,バイオマスを遠心分離によって採取し,pH7.5のバッファー(20mMのリン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウム,0,5MのNaCl,10mMのイミダゾール)によって洗浄した。懸濁液での細胞を音波処理によって分裂させ,細胞ライセートを遠心分離機にかけた。タンパク質からシングルステップ・ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して,粗抽出液を除去した。ピークフラクション中のタンパク質の存在が15%のポリアクリルアミドゲル中のSDS-PAGEによって証明された(図5)。タンパク質の析出は750mMのNaClを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。両方の突然変異体の収量は約20mg/Lの培養液であった。DSCをタンパク質の熱安定性を特徴づけるために使用した。FGF2突然変異体をDSC実験用に1.0mg.mL-1に希釈した。DSCデータ収集は20℃~100℃の温度範囲にわたって行なわれた。Tmは,基線の手動設定の後にガウス曲線の頂点として評価した。FGF2CS1及びCS2突然変異体は,各々Tm62.8℃と68.0℃を示した(図6)。
ラット軟骨肉腫(RCS)細胞は,著しい形態的変化及び細胞間マトリックスの劣化を伴う強力な増殖阻害により,微少濃度のFGF類に応答する,不死化された表現型が安定な細胞系統である。FGFレセプター(FGFR)は,この細胞系統における細胞増殖のインヒビターとして機能する。細胞増殖を抑制するために,FGF突然変異体は,誘導された増殖阻害の濃度依存に反映されるFGF活性の測定を可能にするFGFRシグナルトランスダクションを特異的に誘導しなければならない。RCS分析の主な利点は,有毒化学物質及び偽陽性ヒットの排除である(Krejci, et al., 2007 Invest New Drugs, 25: 391‐395.)。ハイスループットな増殖阻害実験は,単純なクリスタルバイオレット染色によって測定される細胞の量を有する96ウェルプレートフォーマットで行なわれた。約40ng/mLの濃度で,突然変異させたFGF2を含む又は突然変異させたFGF2を含まない培地を,48時間36.5及び41.5℃でインキュベートし,この期間内に12時間ごとに混合した。FGF2突然変異体の劣化を評価するために,プレインキュベートされた培地を,新鮮なコントロールとしての突然変異させたFGF2と混合した。処理の一日前に,RCS細胞を250細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに播種した。細胞は各FGF2のためにプレインキュベートされたFGF2及び新鮮なコントロールの両方で各FGF2突然変異体について20ng/mLの終濃度で4日間処理した。細胞をPBSで洗浄し,4%のパラホルムアルデヒドで固定し,再び洗浄し,0.025%のクリスタルバイオレットで1時間染色した。着色された細胞を蒸留水で三回洗浄した。細胞からの色を33%の酢酸に溶解させた。吸光度を570nmで測定した。RCS増殖阻害アッセイの結果を図7に示す。この実施例は,6点FGF2CS2突然変異体がRCS細胞増殖を抑制する能力が,41.5℃で2日間のインキュベーションの後でも影響されないことを実証する。対照的に,野生型のFGF2の生物学的活性は,36.5℃でインキュベーションの後に既に減少する。
熱安定化させたFGF2CS2突然変異体が未分化のヒト多能性幹細胞(PSC)の長期的な増殖をサポートする能力を評価するために,2つの培養系を使用した:
(i) マウスの胚の繊維芽細胞(mEF)フィーダー層の存在下でのコロニー増殖及び(ii)マトリゲル(商標)hESC最適化マトリックス(BD Biosciences)上のフィーダーフリー単層増殖。フィーダー依存条件において,培地は15%のノックアウト血清置換,1%のMEM非必須アミノ酸,0.5%のペニシリン-ストレプトマイシン,100μMのβ-メルカプトエタノール及び4ng/mLの野生型のFGF2又はFGF2CS2突然変異体を補充したDMEM/F12(1:1)から成るものとした。フィーダーフリー単層システムでは,mEF-馴化培地がヒトPSCの増殖に必要である。そのため,培地はフィーダー細胞によって馴化された後にのみ,試験FGF2s(10ng/mL)を補充した(CM II(図14))。ヒトPSCを,試験された条件の各々において5継代で増殖させ,細胞の形態及び多能性マーカーOct4及びNanogの発現をモニターした。FGF2のない培地で培養されたヒトのPSCは,ヒトのPSCの未分化の状態のメンテナンスにおけるFGF2の重要な役割を示した。両方の試験FGF2が存在する状態で増殖させると,ヒトPSCは典型的な形態を示し,両方の培養系でフィーダー細胞及び細胞質に対して高い比率の核と共に増殖させるとしっかりと詰まったコロニーを示す(図8)。細胞形態に関しては野生型のFGF2と6点のFGF2突然変異体に違いは見られなかった。ヒトPSCの多能性状態をより詳細に調べるために,多能性マーカーOct4及びNanogの発現を免疫細胞化学的に試験した。いずれの試験条件においてもOct4又はNanogの発現の量又はパターンの差に変化は見られなかった(図9)。
増殖速度を測定するために,2つのアプローチを使用した。まず,フィーダーフリーヒトESCの数をプレーティング後に4日連続して数えた。両方の試験FGF2は,同様の効率でヒトのESCの増殖をサポートした(図10A)。FGF2の長期的なサポート能力を試験するために,フィーダーフリーヒトESCを5継代の間,試験FGF2の各々に適合させた。その後,直接の細胞カウント(図10B)又はクリスタルバイオレットカウンター染色細胞の光学濃度(図10C)のいずれかを使用して増殖を測定した。これらの分析では,6点FGF2CS2突然変異体は,野生型のFGF2よりも良好にヒトのESCの増殖をサポートした。データは,短期及び延長した増殖のいずれにおいても,熱安定化したFGF2CS2の明瞭な増殖サポート効果を示した。
FGFレセプター,及びERK1/2を含むそれらの下流のエフェクターは,FGF2で処理することにより活性化され,ヒトのPSCの多能性に寄与する(Dvorak, et al. 2005, Stem Cells 25, 1200-1211.; Eiselleova, et al. 2009, Stem Cell 27, 1847-1857)。FGF2の生物学的活性が37℃で減少するので,ERK1/2のリン酸化は低下し,ヒトPSCは容易に分化を始める。野生型のFGF2及びFGF2CS2突然変異体の熱安定性を試験するために,FGF2なしで調製されたCMに,10ng/mLの所望のFGF2を補充し,1時間,3時間,6時間,12時間,24時間,2日間,3日間,4日間又は5日間,37℃でインキュベートした。その後,FGF2を枯渇させたヒトESCを,ヒートプレインキュベートされたFGF2を含むCMで2時間処理し,リン酸化されたERK1/2についてウェスタンブロッティングを行った。野生型のFGF2の生物学的活性はヒートプレンキュベーションの時間経過に伴い低下したが,熱安定化させたFGF2CS2突然変異体は37℃で5日後でさえ完全な生物学的活性を保持した(図11)。
野生型のFGF2の不安定さのため,ヒトPSCの多能性を維持するには,培地の交換が不可欠である。従って,我々は,熱安定化させたFGF2CS2突然変異体の使用で,この要求を回避できるかどうか試験した。そのために,ヒトのESCを,標準4ng/mL又は減少させた1ng/mLのFGF2突然変異体を含む培地中でフィーダー細胞上にプレーティングし,培地を交換せずにコロニーを引き続き3~4日増殖させた。図12に示される結果は,1ng/mLの濃度でさえ,熱安定化させたFGF2CS2突然変異体が,ヒトのESCの未分化の形態及び多能性マーカーOct4の発現を維持し,培地を毎日交換する必要がないことを実証する。
野生型のFGF2はCMの調製の間に不活性化されて劣化するので,フィーダー細胞による馴化の前後に培地にFGF2を補う必要がある。従って,我々は,熱安定化させた6点FGF2CS2の,フィーダー細胞による馴化後に培地に補充しなくともヒトPSCの未分化の増殖を維持する能力を試験した(CM III(図14))。フィーダーフリーのヒトPSCを,野生型及びFGF2突然変異体の両方を用いて5継代の間に増殖させ,多能性マーカーの発現及び増殖をモニターした。多能性マーカーの発現が影響されないままであり(図13A),6点FGF2突然変異体は野生型FGF2と比較して優れた増殖サポート力を示す(図13B)。
さらなる安定化突然変異を明らかにする飽和突然変異誘発のための位置を,フォースフィールド計算を使用して提案した。突然変異は,ギブズ自由エネルギー(ΔΔG)の予測された変化により3つの群に分けた。ΔΔG<-1.0kcal/molの突然変異を安定として,1.0<ΔΔG<-1.0を中程度として,そしてΔΔG>1.0を不安定として分類した。最も高い安定化数と低い不安定化数の位置11個(K30,E54,E67,C78,R90,S94,C96,E108,N113,T121及びS152)の突然変異を,飽和突然変異誘発に選んだ(表5)。
表5:エネルギーベースのアプローチによって予測されたFGF2の選択された位置における安定化及び不安定化突然変異
FGF2の11個の単一部位飽和突然変異誘発ライブラリー全てを遺伝子合成によって作製した。pET28bベクターにサブクローン化した6xHisタグ及びトロンビン切断認識部位を含むN末端配列に融合した野生型のFgf2 cDNA(図2)を,突然変異誘発のためのテンプレートとして使用した。このライブラリーは,ヌクレオチド配列における縮退コドンに対応する位置においてタンパク質を構成するアミノ酸20個のみが生じることを可能にする「フィックスドオリゴ(Fixed Oligo)」技術を使用して構築された。ライブラリーは凍結乾燥されたプラスミドDNAとしてデリバリーされた。DNAペレットを250ngμL―1の終濃度で滅菌水に溶解した。各ライブラリーからの1μlの量を,新たに調製したE. coli XJb (DE3)自己融解細胞100μlにエレクトロポレーションで入れた。細胞を終濃度50μg.mL-1のカナマイシンを含む11個の個々のLB寒天平板に広げ,37℃で一晩インキュベートした。11個のLB寒天平板各々からの単一のコロニーを,カナマイシン(50μg.mL-1)を含むLB培地250μlを含む,1mL96ディープウェルプレートの個々のウェルの接種に使用した。プレートを,高湿チャンバーで200rpmで震盪しながら37℃で一晩培養した。発現は,各々終濃度50μg.mL-1,0.25mM及び3mMのカナマイシン,IPTG及びL-アラビノースを含む新鮮なLB培地の添加によってそれぞれ誘導された。プレートを,震盪しながら20℃で一晩インキュベートした。22時間後,プレートを遠心分離機にかけ,上澄みを排出させた。細胞ペレットを含むマイクロタイタープレート全体を-70℃で冷凍した。その後,ライシスバッファー(20mMリン酸ナトリウムバッファー,150mMNaCl,pH7.0)100μlを加え,各々ウェルプレートを30℃で20分間インキュベートした。結果として生じる細胞ライセートから細胞デブリスを除去し,各プレートごとに可溶のタンパク質の総量をブラッドフォード法を使用して測定した。可溶のタンパク質の総量に対するFGF2の含有量は,SDS-PAGE及びデンシトメトリーによって測定した。個々のライブラリーの選択された粗抽出液サンプル中の全可溶のタンパク質の濃度は,0.2~0.3mg.mL-1まで変動した。粗抽出液中のFGF2の含量は可溶のタンパク質の総量の5%~7%まで変動した。
個々のFGF2突然変異体を含む細胞ライセートの生物学的活性を,RSCを使用して増殖阻害アッセイによって測定した。FGF2とコントロールの突然変異体を含む粗抽出液を含むマイクロタイタープレートを室温で溶かし,41.5℃で48時間プレインキュベートした。プレインキュベートされた粗抽出液を,新鮮なマイクロタイタープレートの中で20ng.mL-1の終濃度まで増殖させた軟骨細胞に加え,軟骨細胞の増殖の抑制を,細胞の光学濃度の測定によりコントロールを含むサンプルと比較した(図15)。より安定したFGF2の突然変異体が添加された粗抽出液の中に存在するほど,増殖抑制は明白であった。生育抑制はさらに上昇した温度中でプレインキュベートしないサンプルについても測定した。野生型FGF2を含むサンプルよりも高い生育抑制を引き起こすサンプルをポジティブヒットとした。ポジティブヒットの各々については,上に記載されるような全体のスクリーニング法を繰り返した。変異させたFgf2遺伝子は,サンガー法によって順番に並べられた。結果として生じる配列は,挿入された突然変異(表6)を証明するために野生型のFGF2の配列と並べた。
表6:FGF2の11の飽和突然変異誘発ライブラリーの検査からの結果の概観
大腸菌BL21(DE3)細胞を,発現ベクターpET28b-His-thrombin::fgf2x(x=32個の異なるFGF2突然変異体)で形質転換し,カナマイシン(50μg.mL-1)を含む寒天平板上にプレーティングし,37℃で一晩増殖させた。単一のコロニーを用いてカナマイシンを含むLB培地10mLに接種し,細胞を37℃で一晩増殖させた。その発現をIPTGで0.25mMの終濃度まで誘導した。その後,細胞を20℃で一晩培養した。培養の終わりに,バイオマスは遠心分離機にかけ,細胞ペレットを-70℃で凍結させた。このペレットを解凍し,FastBreak(商標)Cell Lysis Reagent 1X中に再懸濁した。溶解した細胞を,震動するプラットフォーム上で室温で10~20分間インキュベートした。MagneHis(商標)Ni粒子を細胞ペレットに添加した。MagneHis(商標)粒子への結合を改善するために,500mMのNaClを,ボリューム(volume)細菌培養液に添加した(ライセート1.0mLあたりNaCl0.03g)。分裂した細菌細胞を含む管を,室温で2分間インキュベートし,次に,MagneHis(商標)Ni粒子を捕らえるために約30秒間磁気スタンドに配置した。上澄みを注意深く除去した。未結合の細胞タンパク質を洗い流すために,500mMのNaClを含むMagneHis(商標)結合/洗浄バッファー(Bonding/Wash Buffer)を添加した。上澄みを注意深く除去した。洗浄工程を2回繰り返した。結合したタンパク質の溶出は500mMのNaClを含むMagneHis(商標)溶出バッファー(Elution Buffer)105μlを加えることにより行なった。精製されたタンパク質を含む上澄みを除去するために,溶出混合物を室温で2分間インキュベートし,続いて管を約30秒間適切な磁気スタンドに置いた。全てのFGF2突然変異体の存在は15%のポリアクリルアミドゲル中でSDS-PAGEによって確認された(図16)。精製されたFGF2突然変異体の収量は10~100mg.L-1であり,FGF2突然変異体の大部分は野生型FGF2と同レベルかそれより高いレベルで発現した。サーマルシフトアッセイを標的タンパク質の熱安定性の測定のために使用した。その測定は96マイクロタイタープレート中で行なわれた。各ウェルは,2μLのサイプロオレンジ(Sypro Orange)染料(水中で40倍に希釈)及び次の方程式を使用して計算された適切な量のFGF2突然変異体からなっていた:
VFGF2var=(CFGF2var*Vdv)/Cdc
VFGF2var=(CFGF2var*1)/2.5
式中,VFGF2varはFGF2突然変異体の量であり,CFGF2varはFGF2突然変異体の濃度であり,Cdcは決められた濃度2.5mg.mL-1であり,Vdvは1μLとして定義される。溶出バッファーは最後に,ウェル中の全量が25μLとなるように添加された。サーマルシフトアッセイは,リアルタイムPCRシステムを用いて25℃の温度で始めて,1℃ずつ上げて最終温度95℃まで行われた。Tm値は,ボルツマン派生法(Boltzmann-derived method,)により,蛍光溶解曲線プロット(表7)の変曲点からTm値を得ることにより求めた。
表7:サーマルシフトアッセイによって測定された飽和突然変異誘発からのFGF2突然変異体の熱安定性。
サーマルシフトアッセイによって決定された野生型FGF2のTmは51℃であった。さらなるコンピューター分析(実施例13を参照)により選択されたアミノ酸置換に灰色のハイライトを付している。
Tm:融解温度
ΔTm:突然変異による融解温度の変化;
n.d,乏しいタンパク質変性のため測定できなかった
相反する効果のない組み合わせ可能な突然変異を決定するため,及び,非常に安定したFGF2の多重部位突然変異体の設計のためにフォースフィールド計算を使用した。ライブラリースクリーニング(実施例12を参照)から次の突然変異が詳しい分析に選択された:K30I,E54D,S94I,C96N,E108H及びT121P。これらの突然変異を,FGF2CS2突然変異体(R31L,V52T,H59F,L92Y,C96Y及びS109E)からの既存の突然変異と組み合わせた。二重点突然変異体の組み合わせは全て個々の突然変異の相加性を予測するためにインシリコで構築した。予測されたΔΔGと個々の単一点突然変異の合計との差が>1kcal.mol-1である二重点突然変異体は相反するものと考慮した。従って,3つの異なる多重点突然変異体をさらなる特性解析のために設計した。3つの突然変異体は全て既に設計されたFGF2CS2,FGF2CS3突然変異体(R31L,V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109E,K30I,E54D及びE108H)をベースとし,サーマルシフトアッセイにおいて最も高い安定効果を有する3つの追加の突然変異を含んでいた。FGF2CS4(R31L,V52T,H59F,L92Y,S109E,E54D,S94I,C96N及びT121P)を,タンパク質機能を保存する目的で設計した。FGF2とFGFR1又はFGFR2のレセプターの間のインターフェース又は二量化にとって重要な位置を標的とする突然変異を全て排除し,一方,突然変異C96Yを実験的に確認されたより良い安定効果のためにC96Nに交換した。FGF2CS5突然変異体(R31L,V52T,H59F,L92Y,S109E,K30I,E54D,S94I,C96N,E108H及びT121P)が,タンパク質の熱安定性影響を最大限にするために選択され,これはサーマルシフトアッセイ(実施例12)中にFGF2を安定させることが見出された突然変異の全てを含む。
FGF2の重複点突然変異体を商業的に合成し,pET28b-Hisトロンビンの下流の誘導可能なT7プロモーターのNdeIとXhoI部位にサブクローン化した(突然変異させたヌクレオチド及びポリペプチド配列は配列番号:33~配列番号:38に示される)。得られた構築物を大腸菌Dh5αコンピテント細胞に形質転換した。細胞を37℃でカナマイシン(50μg.mL-1)を含む寒天平板上にプレーティングし,一晩増殖した。プラスミドを分離し,ヌクレオチド配列を商業的なシーケンシングによって確認した。大腸菌BL21(DE3)細胞を発現ベクターで形質転換し,カナマイシンを含む寒天平板上にプレーティングし,37℃で一晩増殖させた。単一のコロニーを使用してカナマイシン(50μg.mL-1)を含むLB培地の10mLに接種し,細胞を37℃で一晩増殖させた。一晩培養した培養液を使用してカナマイシンを含むLB培地200mLに接種した。細胞を37℃で培養した。その発現はIPTGで0.25mMの終濃度まで誘導された。その後,細胞を20℃で一晩培養した。培養の終わりに,バイオマスを遠心分離によって採取し,バッファー(20mMリン酸カリウムバッファー,pH7.5及び0.5MのNaCl,10mMのイミダゾール)によって洗浄した。懸濁液中の細胞を音波処理によって破壊し,細胞ライセートを遠心分離機にかけた。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して,粗抽出液からタンパク質を精製した。ピークフラクションにおけるタンパク質の存在を,15%ポリアクリルアミドゲル中のSDS-PAGEによって証明した(図17)。タンパク質の析出は750mMのNaClを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。突然変異体の収量は5mg/lと10mg/lの間であった。DSCを使用してタンパク質の熱安定性を特徴づけた。FGF2突然変異体をDSC実験用に1.0mg.mL-1に希釈した。データ収集は1℃/分の速度で20℃から90℃の温度領域にわたり行なわれた。FGF2CS3,FGF2CS4及びFGF2CS5突然変異体は各々Tm72.6,72.2及び72.7℃を示した。
NIH/3T3株細胞を,40,000個の細胞/cm2の密度で,1ウェルあたり190μlの培地(DMEM31966,Gibco(登録商標)+P/S+10%ウシ新生児血清)に接種した。24時間後,培地を,飢餓(DMEM31966,GibcoR + P/S + 0.5%ウシ新生児血清)に変えた。16時間後,細胞を滅菌水に希釈し,FGF2CS4を0.01~20ng/mLの終濃度まで添加することにより処理し,細胞を37℃でさらに48時間培養した。細胞増殖はCyQuant(登録商標)蛍光分析(図18)を使用して測定された。実験は3回繰り返して行なわれた。FGF2CS4のためのEC50,つまり,2分の1の最大応答を生じるFGF2CS4の濃度は,NIH/3T3株細胞の増殖反応測定法により測定され,0.6-1.1ng/mLである。
Claims (15)
- FGF2活性を有し,かつ配列番号:2の配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有し,かつ,少なくともアミノ酸置換R31Lを含む熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号:2を有し,かつ少なくともアミノ酸置換R31Lを含むことを特徴とする請求項1記載の熱安定性ポリペプチド。
- V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109E,K30I,E54D,S94I,C96N,E108H,T121Pから成る群から選択される少なくとも2つのアミノ酸置換をさらに含む請求項1記載の熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがアミノ酸置換R31L,V52T及びH59Fを含むことを特徴とする請求項3記載の熱安定性ポリペプチド。
- V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109E,K30I,E54D,S94I,C96N,E108H,T121Pから成る群から選択される少なくとも5つのアミノ酸置換をさらに含む請求項1,3,4いずれか1項記載の熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが,アミノ酸置換R31L,V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109Eを含むことを特徴とする請求項5記載の熱安定性ポリペプチド。
- V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109E,K30I,E54D,S94I,C96N,E108H,T121Pから成る群から選択される少なくとも8個のアミノ酸置換をさらに含む請求項1,3~6いずれか1項記載の熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが,アミノ酸置換K30I,R31L,V52T,E54D,H59F,L92Y,C96Y,E108H,S109Eを含む請求項7記載の熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが,アミノ酸置換R31L,V52T,E54D,H59F,L92Y,S94I,C96N,S109E,T121Pを含む請求項7記載の熱安定性ポリペプチド。
- V52T,H59F,L92Y,C96Y,S109E,K30I,E54D,S94I,C96N,E108H,T121Pから成る群から選択される少なくとも10個のアミノ酸置換をさらに含む請求項1,3~9いずれか1項記載の熱安定性ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが,アミノ酸置換K30I,R31L,V52T,E54D,H59F,L92Y,S94I,C96N,E108H,S109E,T121Pを含む請求項10記載の熱安定性ポリペプチド。
- 再生医療及び他の医療用途で使用される請求項1~11のいずれか1項に記載の熱安定性ポリペプチド。
- 化粧品のための請求項1~11のいずれか1項に記載の熱安定性ポリペプチドの使用。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載された有効量の熱安定性ポリペプチドを培地の1.0ng/μl~100ng/μlの範囲で含む未分化状態のヒト多能性幹細胞を培養するのに適する培地。
- 前記ポリペプチドが,請求項4,6,8,9及び11いずれか1項記載のアミノ酸置換を含む請求項14記載の培地。
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