CN112190531B - 抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法。该抗细胞衰老制剂含有过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的细胞培养上清或细胞培养上清的提取物。本发明使用哺乳动物成纤维永久细胞构建过表达FGF2基因的永久细胞，以此培养，获取细胞培养上清或细胞培养上清的提取物来制备抗细胞衰老制剂。通过严格的功能实验验证，发现该制剂具有明确的抵抗细胞衰老、维持干细胞分化潜能的作用，通过使用该制剂，可以使得皮肤触感更加光滑、弹性增加、皱纹减少，具有明显的抗衰效果。

Description

抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，尤其是涉及一种抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法。
背景技术
衰老是细胞进入终末分化后的一种不可逆的相对稳定状态。衰老细胞的主要特征包括：(1)细胞停止分裂；(2)表达特异性的衰老相关半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)；(3)细胞核内染色质凝集、端粒缩短；(4)大量合成一些基质重构蛋白、趋化因子和炎性因子，也被称为衰老相关分泌表型。衰老细胞的基因表达和性状发生改变，往往失去正常细胞的功能。不仅如此，衰老细胞还能激活炎症反应引起组织损伤，甚至具有发生癌变的潜能。
1965年，美国Leonard Hayflick等发现体外培养的人胚胎成纤维细胞经历有限次(约50次)分裂后即进入衰老状态。细胞所能经历的分裂次数也被称为Hayflick界限。Hayflick界限的存在说明正常人体细胞的寿命都是有限的。引起细胞衰老的原因有多种，例如细胞持续复制分裂使得端粒逐渐缩短，造成染色体稳定性下降；细胞代谢过程中形成的自由基攻击DNA分子；环境因子如各种辐射和化学物质造成DNA损伤。当损伤累积到一定程度超过了细胞修复能力时，细胞便开始进入衰老状态。
由于对细胞衰老的分子机制了解的还不够充分，因此目前尚缺乏有效的能阻止或者延缓细胞衰老发生的可靠方法或者药物。
发明内容
基于此，有必要提供一种抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用。
一种抗细胞衰老制剂，含有过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的细胞培养上清或细胞培养上清的提取物。
在其中一个实施例中，所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞是NIH-3T3细胞。
在其中一个实施例中，所述人FGF2基因是以人cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的扩增引物扩增出的；和/或
所述人FGF2基因是以重组表达载体的形式存在于所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞中。
在其中一个实施例中，所述重组表达载体是将以人cDNA为模板、以序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体中得到的。
一种上述任一实施例所述的抗细胞衰老制剂的制备方法，其包括如下步骤：
培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞；
收集细胞培养上清，使用该细胞培养上清或其提取物制备抗细胞衰老制剂。
在其中一个实施例中，所述培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，以及收集细胞培养上清具体包括：
将转染有人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞消化传代，按1:3的比例重新接种至新的培养皿中培养；
待细胞贴壁后加入嘌呤霉素，终浓度为1μg/ml，作用48小时后更换为不含嘌呤霉素的新鲜培养基继续培养；
待细胞生长至90％汇合度时按1:3的比例进行消化并接种至新的培养皿进行扩大培养；
此后每次接种的细胞培养48小时后收集其上清，0.4μm滤膜过滤后备用。
一种化妆品，其含有上述任一实施例所述的抗细胞衰老制剂。
此外，还有必要提供一种用于制备该抗细胞衰老制剂的细胞及其构建方法。
一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的构建方法，包括如下步骤：
培养人胚肾293细胞，提取总RNA，并逆转录制备人cDNA；
以人cDNA为模板、以序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体，构建人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2；
将NIH-3T3细胞接种至细胞培养皿中，待细胞生长至50％汇合度时开始细胞转染，将人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2与脂质体加入至培养基中，混合均匀后逐滴加入到NIH-3T3细胞培养皿中。
一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，其采用上述过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的构建方法构建得到。
本发明的发明人在研究过程中，通过比较原代和衰老的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)培养上清的功能，发现原代MEF培养上清含有抗衰老物质。进一步通过比较原代和衰老的MEF基因表达差异，发现衰老细胞中成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor 2，FGF2)的表达显著降低。通过基因转染的方法提高MEF中FGF2的表达，可以刺激其分泌抗衰老物质并延缓其衰老的发生。然而原代MEF增殖能力有限，不能大量分泌抗衰老物质。
因此，本发明的发明人经过进一步地研究，使用永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞(如NIH-3T3)构建过表达FGF2基因的工具细胞，以此培养，获取细胞培养上清或细胞培养上清的提取物来制备抗细胞衰老制剂。通过严格的功能实验验证，发现该制剂具有明确的抵抗细胞衰老、维持干细胞分化潜能的作用，通过使用该制剂，可以使得皮肤触感更加光滑、弹性增加、皱纹减少，具有明显的抗衰效果。
目前市售的抗衰老化妆品多数以植物提取物为制备原料，而本发明涉及的抗细胞衰老制剂主要成分为哺乳动物细胞的培养上清，与人体皮肤的亲和性更好。在哺乳动物细胞中过表达人FGF2基因能最大限度的保持FGF2的天然构象和生物活性，同时还能激活细胞本身的抗衰老机制并分泌其它具有抗衰老功能的物质。同市售的添加某些细胞生长因子的抗衰老产品相比，本发明涉及的抗细胞衰老制剂中抗衰老物质种类更多，作用效果更显著。
附图说明
图1为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体的图谱。
图2为不同MEF形态比较；其中，A是原代MEF形态；B是对照培养基培养至第9代的MEF，SA-β-Gal染色；C是年轻培养基培养至第9代的MEF，SA-β-Gal染色；SA-β-Gal阳性细胞呈蓝色；放大倍数100倍。
图3为FGF2表达的电泳结果。
图4为不同MEF形态比较；其中，A是年轻培养基培养至第9代的MEF，SA-β-Gal染色；B是对照培养基培养至第9代的MEF，SA-β-Gal染色；C是FGF2培养基培养至第9代的MEF，SA-β-Gal染色；SA-β-Gal阳性细胞呈蓝色；放大倍数100倍。
图5为FGF2培养基维持MEF成脂分化能力结果；其中，A是第3代MEF经FGF2分化培养基培养4天，油红O染色；B是第3代MEF经对照分化培养基培养4天，油红O染色；放大倍数：左侧图片100倍，右侧图片200倍。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种抗细胞衰老制剂，其含有过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的细胞培养上清或细胞培养上清的提取物。
在一个具体示例中，所使用的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞是NIH-3T3细胞。所使用的人FGF2基因是以人cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1(5’-TGGCAGCCGGGAGCATC-3’(正向))和SEQ ID NO.2(5’-AGCTCTTAGCAGACATTGG-3’(反向))所示的扩增引物扩增出的。
进一步，人FGF2基因是以重组表达载体的形式存在于永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞中，例如，在一个示例中，该重组表达载体是将以人cDNA为模板、以序列如SEQ ID NO.3(5’-GCT CTA GAT GGC AGC CGG GAG CAT C-3’(正向))和SEQ ID NO.4(5’-GCGAAT TCAGCT CTT AGC AGA CAT TGG-3’(反向))所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体中得到的。
本发明还提供了一种抗细胞衰老制剂的制备方法，其包括如下步骤：
培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞；
收集细胞培养上清，使用该细胞培养上清或其提取物制备抗细胞衰老制剂。
在一个示例中，培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，以及收集细胞培养上清具体包括：
将转染有人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞消化传代，按1:3的比例重新接种至新的培养皿中培养；
待细胞贴壁后加入嘌呤霉素，终浓度为1μg/ml，作用48小时后更换为不含嘌呤霉素的新鲜培养基继续培养；
待细胞生长至90％汇合度时按1:3的比例进行消化并接种至新的培养皿进行扩大培养；
此后每次接种的细胞培养48小时后收集其上清，0.4μm滤膜过滤后备用。
进一步，本发明还提供了一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的构建方法，其包括如下步骤：
培养人胚肾293细胞，提取总RNA，并逆转录制备人cDNA；
以人cDNA为模板、以序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体，构建人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2；
将NIH-3T3细胞接种至细胞培养皿中，待细胞生长至50％汇合度时开始细胞转染，将人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2与脂质体加入至培养基中，混合均匀后逐滴加入到NIH-3T3细胞培养皿中。
上述培养基可以是但不限于DMEM培养基(含10％胎牛血清)。
更进一步，本发明还提供了一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，其采用上述过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的构建方法构建得到。
本发明使用永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞(如NIH-3T3)构建过表达FGF2基因的工具细胞，以此培养，获取细胞培养上清或细胞培养上清的提取物来制备抗细胞衰老制剂。通过严格的功能实验验证，发现该制剂具有明确的抵抗细胞衰老、维持干细胞分化潜能的作用，通过使用该制剂，可以使得皮肤触感更加光滑、弹性增加、皱纹减少，具有明显的抗衰效果。
以下结合具体实施例对本发明的抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法作进一步详细的说明。
实施例1原代MEF分泌抗衰老物质研究
取孕12.5天C57/BL6小鼠一只，麻醉后腹部皮肤酒精消毒，眼科剪顺次打开腹腔和子宫，剥离并取出胎鼠，置于PBS中快速清洗一次。于超净工作台中剪去胎鼠头尾部、四肢并内脏，剩余躯干部分剪刀充分剪碎，加胰酶5ml于37℃恒温箱中消化10分钟。离心收集沉淀，加DMEM培养基(含10％胎牛血清)重悬后接种到10cm培养皿，二氧化碳培养箱中培养4小时后细胞贴壁，更换新鲜DMEM培养基(含10％胎牛血清)并清除大块胎鼠组织。48小时后收集培养上清，此原代MEF培养上清即为“年轻上清”。此后待细胞生长至90％汇合度时即按1:3消化传代。观察到传至第5代时细胞增殖速度明显下降，传至第9代时，约有50％的细胞SA-β-Gal染色呈阳性，提示细胞进入衰老状态。收集第5代至第8代的细胞培养上清，即为“对照上清”。
分别用“年轻上清”和“对照上清”来培养原代MEF，方法为：“年轻上清”与DMEM培养基(含10％胎牛血清)等体积混合，成为“年轻培养基”，“对照上清”与DMEM培养基(含10％胎牛血清)等体积混合，成为“对照培养基”；分别用“年轻培养基”和“对照培养基”培养原代MEF，待细胞生长至90％汇合度时即按1:3消化传代。结果如图2所示，“对照培养基”培养原代MEF至第9代时，约有一半细胞发生衰老，SA-β-Gal染色阳性；而用“年轻培养基”培养原代MEF至第9代时，SA-β-Gal染色阳性率低于10％。这一结果说明“年轻培养基”中含有原代MEF分泌的抗衰老物质。
实施例2衰老细胞中FGF2表达情况研究
将原代MEF和用DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养至第9代的MEF分别用RIPA裂解液裂解提取总蛋白，15％SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭后与抗FGF2单克隆抗体(1:100稀释)4℃孵育过夜，洗涤多余抗体后与HRP标记的二抗室温孵育1小时，加入ECL发光液，凝胶成像仪中进行条带检测。用抗GAPDH单克隆抗体作为内参照。抗FGF2单克隆抗体和抗GAPDH单克隆抗体均购自Abcam公司。结果如图3所示，第9代(P9)即衰老的MEF中FGF2的表达较原代细胞(P1)显著下降。
实施例3过表达人FGF2的NIH-3T3细胞培养上清抗衰老作用研究
克隆人FGF2基因，构建FGF2表达载体pCDH-CMV-FGF2：培养人胚肾293细胞，收取细胞，用TriZol法裂解并提取总RNA；取2μg总RNA反转录为cDNA；以该cDNA为模板进行PCR克隆人FGF2基因，扩增引物为：5’-GCT CTA GAT GGC AGC CGG GAG CAT C-3’(正向)/5’-GCGAAT TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG-3’(反向)；将PCR产物进行胶回收后用xbaI和EcoRI双酶切并再次回收，与同样经双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体相连，构建人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2。经DNA测序后与NCBI人转录组数据库中的FGF2mRNA序列进行比对，验证人FGF2基因表达载体构建正确。
将构建好的人FGF2过表达质粒pCDH-CMV-FGF2用Lipofectamine 3000转染至NIH-3T3细胞，转染48小时后将NIH-3T3细胞消化传代，按1:3重新接种至新的6cm培养皿。待细胞贴壁后加入嘌呤霉素，终浓度为1μg/ml，作用48小时后更换为不含嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基(含10％胎牛血清)继续培养。48小时后收集培养上清，即为“FGF2上清”。将“FGF2上清”与DMEM培养基(含10％胎牛血清)等体积混合，成为“FGF2培养基”。
分别用“FGF2培养基”、“年轻培养基”和“对照培养基”培养原代MEF至第9代，SA-β-Gal染色。结果如图4显示，“FGF2培养基”培养的MEF发生衰老的比率远低于“对照培养基”，说明过表达人FGF2的NIH-3T3细胞同原代MEF类似，也能分泌抗衰老物质。
实施例4过表达FGF2的NIH-3T3细胞培养上清维持细胞分化潜能的作用研究
原代MEF具有干细胞特性，在特定培养条件下能分化成脂肪细胞或者成骨细胞。分别将“FGF2培养基”和“对照培养基”与成脂诱导培养基(2×)按1:1体积比混合，成为“FGF2分化培养基”和“对照分化培养基”。成脂诱导培养基(2×)用DMEM培养基(含10％胎牛血清)配制，组分如下：地塞米松2.0μM、胰岛素20μg/ml、吲哚美辛400μM、IBMX 1.0mM。
将第3代MEF消化后用接种至六孔板中，分别用“FGF2分化培养基”和“对照分化培养基”培养4天，经甲醛固定后用油红O染色液染色15分钟，PBS洗涤后显微镜下观察拍照。图5结果提示，“FGF2分化培养基”培养的MEF中油红O染色阳性细胞比率明显高于“对照分化培养基”培养的MEF。这一结果证明“FGF2培养基”能更好地维持MEF的干细胞特性。
实施例5皮肤抗衰老测试
将上述“FGF2上清”作为抗细胞衰老制剂。募集25至40岁的女性志愿者50名，平均年龄36.3岁。要求受试者清水洗手后用棉签蘸取本抗衰老制剂均匀涂抹于左手背部，右手背部不做处理，每天一次，持续两周，两周后回访。以右手背部皮肤为参照，由使用者报告左手背部皮肤的抗衰老效果。回访结果如下表1所示，结果说明上述制备的抗细胞衰老制剂能使皮肤触感更加光滑、弹性增加、减少皱纹，具有明显的抗衰效果，无不良反应。
表1
Figure BDA0002100059410000101
此外，本发明还对不同批次构建的过表达人FGF2基因的NIH-3T3细胞进行表达和抗衰效果实验，结果显示一致性好，说明本发明的过表达人FGF2基因的NIH-3T3细胞及其构建方法重复性好，一致性高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北医药学院
<120> 抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcagccgg gagcatc 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctcttagc agacattgg 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctagatg gcagccggga gcatc 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgaattcag ctcttagcag acattgg 27

Claims (8)

1.一种抗细胞衰老制剂，其特征在于，含有过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的细胞培养上清或细胞培养上清的提取物；所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞是NIH-3T3细胞；
所述人FGF2基因是以人cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的扩增引物扩增出的，且所述人FGF2基因是以重组表达载体的形式存在于所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞中。
2.如权利要求1所述的抗细胞衰老制剂，其特征在于，所述重组表达载体是将以人cDNA为模板、以序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体中得到的。
3.如权利要求1～2任一项所述的抗细胞衰老制剂，其特征在于，所述抗细胞衰老制剂是将所述细胞培养上清或所述细胞培养上清的提取物溶于甘油中制备得到。
4.一种权利要求1～3中任一项所述的抗细胞衰老制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞；所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞是NIH-3T3细胞；所述人FGF2基因是以人cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的扩增引物扩增出的，且所述人FGF2基因是以重组表达载体的形式存在于所述永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞中；
收集细胞培养上清，使用该细胞培养上清或其提取物制备抗细胞衰老制剂。
5.如权利要求4所述的抗细胞衰老制剂的制备方法，其特征在于，所述培养过表达人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，以及收集细胞培养上清具体包括：
将转染有人FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞消化传代，按1:3的比例重新接种至新的培养皿中培养；
待细胞贴壁后加入嘌呤霉素，终浓度为1μg/ml，作用48小时后更换为不含嘌呤霉素的新鲜培养基继续培养；
待细胞生长至90％汇合度时按1:3的比例进行消化并接种至新的培养皿进行扩大培养；
此后每次接种的细胞培养48小时后收集其上清，0.4μm滤膜过滤后备用。
6.一种化妆品，其特征在于，含有如权利要求1～3中任一项所述的抗细胞衰老制剂。
7.一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养人胚肾293细胞，提取总RNA，并逆转录制备人cDNA；
以人cDNA为模板、以序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的带有双酶切位点的扩增引物扩增出的基因片段双酶切后插入至同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒载体，构建人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2；
将NIH-3T3细胞接种至细胞培养皿中，待细胞生长至50％汇合度时开始细胞转染，将人FGF2基因过表达载体pCDH-CMV-FGF2与脂质体加入至培养基中，混合均匀后逐滴加入到NIH-3T3细胞培养皿中。
8.一种过表达FGF2基因的永生化哺乳动物胚胎成纤维细胞，其特征在于，采用如权利要求7所述的构建方法构建得到。
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