CZ309550B6 - Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití - Google Patents
Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309550B6 CZ309550B6 CZ2021-303A CZ2021303A CZ309550B6 CZ 309550 B6 CZ309550 B6 CZ 309550B6 CZ 2021303 A CZ2021303 A CZ 2021303A CZ 309550 B6 CZ309550 B6 CZ 309550B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- fgf18
- seq
- amino acid
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 107
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 107
- 102100035323 Fibroblast growth factor 18 Human genes 0.000 title claims abstract 3
- 101000878128 Homo sapiens Fibroblast growth factor 18 Proteins 0.000 title claims abstract 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 144
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 44
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 27
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000003977 fibroblast growth factor 18 Human genes 0.000 description 282
- 108090000370 fibroblast growth factor 18 Proteins 0.000 description 282
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 112
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 27
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 20
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 20
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 19
- 238000013461 design Methods 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 13
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 12
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 11
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010129 ASN 136 Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 description 1
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100027844 Fibroblast growth factor receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 description 1
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000917134 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 102220578197 Rho-related GTP-binding protein RhoJ_Y83F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 229920002000 Xyloglucan Polymers 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N beta-glycerol phosphate Natural products OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L beta-glycerolphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CC(CO)OOP([O-])([O-])=O GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229920000370 gamma-poly(glutamate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003676 hair preparation Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007040 lung development Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000003349 osteoarthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000009596 postnatal growth Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009237 prenatal development Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200127578 rs121918003 Human genes 0.000 description 1
- 102200119355 rs312262812 Human genes 0.000 description 1
- 102200135559 rs387907064 Human genes 0.000 description 1
- 102200009110 rs387907074 Human genes 0.000 description 1
- 102220061989 rs80356913 Human genes 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229950002135 sprifermin Drugs 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Termostabilní polypeptid mající biologickou aktivitu FGF18, a obsahující sekvenci o alespoň 90% sekvenční identitě se sekvencí: LYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFM (SEQ ID NO. 3) přičemž aminokyseliny vyznačené tučně a podtržením musí být zachovány. Výhodně je celková délka sekvence polypeptidu do 227 aminokyselin, výhodněji do 207 aminokyselin. Uvedený polypeptid je vhodný pro použití v regenerativní medicíně, v ortopedii, zejména pro léčbu poranění chrupavky či kosti, nebo v terapeutické či neterapeutické stimulaci růstu vlasů. Rovněž je vhodný pro použití jako složka kultivačního média pro kultivaci chondrocytů.
Description
Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká upraveného fibroblastového růstového faktoru 18 (Fibroblast Growth Factor 18, FGF18) se zlepšenou teplotní stabilitou v porovnání s divokým typem, a jeho použití ve výzkumu buněčné biologie, regenerativní medicíně a souvisejících biomedicínských aplikacích. Stávající vynález se týká zejména upraveného FGF18 pro použití pro regeneraci chrupavky při osteoartritidě a v dalších aplikacích regenerativní medicíny.
Dosavadní stav techniky
Fibroblastový růstový faktor 18, FGF18, patří do rodiny fibroblastových růstových faktorů vázajících heparin. FGF proteiny hrají ústřední roli při prenatálním vývoji, postnatálním růstu a regeneraci různých tkání regulací buněčné proliferace a diferenciace. FGF18 stimuluje proliferaci a diferenciaci mezenchymálních buněčných linií, zejména srdečních myocytů, osteoblastů a chondrocytů (US 6352971 B1). FGF18 je nezbytným regulátorem vývoje dlouhých a kalvariálních kostí (Ohbayashi, N. et. al., 2002, Genes Dev. 16: 870 až 879). FGF18 se dále podílí na alveolárním stádiu vývoje plic, podporuje vývoj tenkého střeva, jater a ledvin (Haque, T. et. al., 2007, Histol. Histopathol. 22: 97 až 105). FGF18 polypeptid signalizuje prostřednictvím specifické interakce se svým přirozeným ligandem - receptorem FGFR-3C, čímž podporuje chondrogenezi (Davidson, D. et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 20509 až 20515). FGF18 je rovněž schopen vázat se, a tudíž aktivovat receptor FGFR-2C a FGFR4. Díky schopnosti stimulovat formaci chrupavek, demonstrované jak na myším modelu osteoartrózy (Liu, Z. et. al., 2002, Genes Dev. 16: 859 až 869) tak v klinických testech na pacientech trpících osteoartritidou (Eckstein, F. et. al. 2020, Ann Rheum Dis. 79(4): 525 až 528), je hlavním terapeutickým potenciálem FGF18 regenerace kloubní chrupavky nebo kosti prostřednictvím regulace chondrogeneze, osteogeneze a endochondrální osifikace (Moore, E.E. et al., 2005, Osteoarthritis Cartilage, 13: 623 až 631). FGF18 dále účinně reguluje růst vlasů (Song, L. et al., 2014, Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 695 až 704) a zároveň má preventivní účinek vůči radiačnímu poškození vlasových folikulů (Kawano, M. et al., 2016, Adv. Radiat. Oncol. 1(3):170 až 181), a tudíž může být využit k léčbě alopecie, prevenci radiačněindukované alopecie, ale i ve vlasové kosmetice.
Mezi členy rodiny FGF proteinů, sdílí FGF18 největší sekvenční podobnost s proteinem FGF8 a FGF17. Sekvence FGF18 je vysoce konzervována napříč různými savčími druhy. Lidský FGF18 obsahuje 207 aminokyselin, z nichž prvních 27 převážně hydrofobních aminokyselin tvoří signální sekvenci, sloužící k jeho sekreci. FGF18 dále obsahuje dvě místa pro N-glykosylaci (N39 a N137), přičemž glykosylace není nezbytná pro správnou funkci proteinu, což umožňuje jeho rekombinantní produkci v prokaryotických expresních systémech. Rekombinantní produkce lidského FGF18 v různých kmenech Escherichia coli byla popsána v patentové přihlášce WO 2006/063362, kde kromě maturovaného proteinu byla produkována i zkrácená forma FGF18 polypeptidu s C -terminální delecí 11 aminokyselin, vykazující stejnou biologickou aktivitu jako maturovaný FGF18 protein. Patent US 8207115 B2 popisuje funkční FGF18 polypeptidy zkrácené na C -terminálním konci o 0 až 32 aminokyselin, ze kterých maturovaný FGF18 polypeptid (28 až 207) a FGF18 polypeptid zkrácený na C-terminálním konci o 11 aminokyselin (28 až 196) představují preferované formy FGF18 pro léčbu osteoartritických pacientů. Patentový dokument WO 2001/039788 A2 popisuje terapeutické aplikace maturovaného FGF18 polypeptidu a jeho funkčních fragmentů zkrácených na C-terminálním konci o 11 a 32 aminokyselin. Patentový dokument WO 2012/038953 A2 popisuje funkční fragmenty FGF18 polypeptidu N-terminálně zkrácené o 28 až 56 aminokyselin, které vykazují modifikovanou receptorovou specifitu, projevující se dvojnásobným zvýšením nebo snížením aktivity k jednomu z FGF receptorů, nikdy ne ke všem, přičemž jejich schopnost aktivovat přirozený receptor FGFR-3C zůstává zachována.
- 1 CZ 309550 B6
Velký aplikační potenciál FGF18 je limitován jeho přirozenou termodynamickou a procesní nestabilitou projevující se krátkým poločasem života doprovázeným rychlou ztrátou biologické aktivity a velkou náchylností k proteolytické degradaci a agregaci. Např. poločas života FGF18 po aplikaci do kloubní chrupavky je méně než 24 hodin (WO 2015/124731), což v terapeutických aplikacích může vést k potřebě častého podávání, a tudíž vysoké ceně léčby způsobené nutností opakované injekční administrace FGF18 pacientům. Kvůli nízké stabilitě FGF18 jsou buňky chrupavky vystaveny fluktuaci jeho koncentrace, což může přispívat k rychlému snížení signalizace, která je pro regeneraci kloubní chrupavky nezbytná. Termodynamická stabilita proteinu je velice důležitá v terapeutických aplikacích, protože nesložené nebo agregované formy proteinu mohou být potenciálně toxické a imunogenní. Z toho důvodu je v léčebných terapiích velká pozornost zaměřena na vývoj optimálních formulací FGF18 polypeptidu s cílem zvýšit jeho stabilitu přídavkem vhodných a kompatibilních stabilizačních aditiv. Příklady takových formulací reprezentují patentové dokumenty US 9326944 B2 (přídavek různých koncentrací sacharózy a surfaktantu poloxameru 188 do roztoku proteinu před lyofilizací), US 9610357 B2 (konjugáty funkčních fragmentů FGF18 polypeptidů s karboxypolysacharidy), WO 2004/032849 A2 (formulace FGF18 s kyselinou hyaluronovou), WO 2015/097236 A2 (formulace FGF18 v alginátových a kolagenových hydrogelech), US 10293051 B2 (formulace FGF18 v xyloglukanových hydrogelech), WO 2015/124739 A1 (FGF18 v kolagenovém nosiči). Nízkou stabilitu FGF18 lze dále překonat přídavkem heparinu (Buchtova, M. et al., 2015, Cell Mol. Life Sci. 72(12): 2445 až 2459), který chrání protein před teplotní denaturací a prodlužuje jeho poločas života. Použití heparinu ale není u většiny buněk/tkání regulovaných FGF18 in vivo fyziologické. Kvůli antikoagulačním vlastnostem heparinu a riziku možných alergických reakcí není vhodné používat takové přípravky pro medicínské a kosmetické účely. Podobně je tomu i v případě stabilizačních aditiv, které mohou vyvolat nežádoucí odpověď imunitního systému, a tudíž jejich využití v terapeutických aplikacích může přinášet celou řadu komplikací.
Alternativní způsob stabilizace FGF18 polypeptidu bez přídavku aditiv představuje modifikace jeho proteinové sekvence metodami proteinového inženýrství. Tento způsob modifikace proteinu lze využít nejen k vylepšení stability proteinu, ale i jeho aktivity nebo receptorové specifity. Nejčastěji studovanými modifikacemi aminokyselinové sekvence FGF18 jsou funkčními fragmenty (i) zkrácené na N-terminálním konci o 28 až 56 aminokyselin s počáteční aminokyselinou vždy nahrazenou za methionin (WO 2012/038953 A2) nebo (ii) zkrácené na Cterminálním konci o 0 až 32 aminokyselin (US 8207115 B2). Kromě N-terminálně zkrácených variant FGF18 polypeptidu vykazujících zvýšenou specifitu vůči FGFR-3C receptoru ve srovnání s FGF18 wt byla dále popsána FGF18 varianta obsahující kromě delece 50 N-terminálních aminokyselin i jednobodovou konzervativní substituci Leu52 za Ile (alternativně Val nebo Met) vykazující vyšší míru exprese a solubility v E. coli BL21(DE3) s nezměněnou biologickou aktivitou v porovnání s odpovídající zkrácenou variantou bez mutace (WO 2012/038953 A2). Dále byly popsány varianty FGF18 polypeptidu bez N- nebo C-terminální delece s modifikovanou receptorovou specifitou obsahující substituce Asn136 a/nebo Asn137 za jiné aminokyseliny (WO 2002/036732 A2). Efekt dosud popsaných aminokyselinových modifikací na stabilitu jednotlivých FGF18 variant však nebyl studován.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je termostabilní polypeptid, který vychází z lidského FGF18 polypeptidu, který může být použit v regenerativní medicíně, biomedicínských aplikacích a kosmetice.
Lidský FGF18 polypeptid má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEQ ID NO. 1, čítající 207 aminokyselin:
- 2 CZ 309550 B6
MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLVAEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG| DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA LMSAKYSGWY VGFTKKGRPR kgpktrenqq dvhfmkrypk gqpelqkpfk yttvtkrsrr IRPTHPA (SEQ ID NO. 1)
V rámci předkládaného vynálezu byly nalezeny substituce (záměny) aminokyselin, které vedou k teplotní stabilizaci polypeptidů na bázi FGF18. Bylo zjištěno, že k významné teplotní stabilizaci vede současná přítomnost tří záměn aminokyselin: L141F, S147P a Q170P.
Dále jsou pro teplotní stabilizaci příznivé jedna nebo obě záměny aminokyselin Q85W, E105G.
Sekvence MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLVA (SEQ ID NO. 2) v lidském FGF18 v sekvenci SEQ ID NO. 1 odpovídá signálnímu peptidu, který slouží k extracelulární translokaci proteinu a který je následně ze sekvence lidského vyzrálého proteinu proteolyticky odštěpen. Signální peptid tedy může či nemusí být v sekvenci polypeptidů na bázi FGF18 přítomen. V některých provedeních, jako např. v případě jeho rekombinantní produkce v E. coli, může být nahrazen jen aminokyselinou methioninem (M). Rovněž C-koncové aminokyseliny sekvence SEQ ID NO. 1 mohou být deletovány.
Podle literatury se obecně za nejkratší funkční fragment FGF18 považuje polypeptid obsahující minimálně aminokyseliny Leu57-Metl75 s nebo bez A-terminálního Met.
Dále j e známo, že polypeptidy FGF 18 různých savčích druhů maj í při přiložení cca 90% sekvenční identitu, přičemž plní analogické funkce a mají obdobné biologické aktivity.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy termostabilní polypeptid mající biologickou aktivitu FGF18, a obsahující sekvenci o alespoň 90% sekvenční identitě se sekvencí:
LYSR
GKETEFYLCM
VGFTKKGRPR
TSGKHIQVLG
NRKGKLVGKP
KGPKTRENQP
RRISARGEDG
DGTSKECVFI
DVHFM (SEQ
DKYAQLLVET
EKVLENNYTA
ID NO. 3)
DTFGSQVRIK
FMSAKYPGWY přičemž aminokyseliny vyznačené tučně a podtržením musí být zachovány.
Výhodně je celková délka sekvence polypeptidů do 227 aminokyselin, výhodněji do 207 aminokyselin.
Sekvence SEQ ID NO. 3 odpovídá fragmentu Leu57-Metl75 sekvence SEQ ID NO. 1. Aminokyseliny vyznačené v sekvenci SEQ ID NO. 3 tučně jsou v pozicích 85, 91 a 114 teto sekvence mutovány; což odpovídá záměnám aminokyselin L141F, S147P a Q170P v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1.
Termostabilní polypeptid pak v některých provedeních dále obsahuje alespoň jednu nebo obě z následujících záměn aminokyselin:
- záměnu aminokyseliny E v pozici 49 uvedené sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinou G (odpovídá E105G v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1);
- záměnu aminokyseliny Q v pozici 29 uvedené sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinou W (odpovídá Q85W v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1).
-3CZ 309550 B6
V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na A-konci sekvence SEQ ID NO. 3 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLVAEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQ (SEQ ID NO. 4). V dalších provedeních může termostabilní polypeptid nést na A-konci sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinu methionin (M).
V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na C-konci sekvence SEQ ID NO. 3 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci KRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSRR IRPTHPA (SEQ ID NO. 5). V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést v N- nebo Cterminálních částech krátké fúzní aminokyselinové sekvence (tzv. kotvy) v maximální délce až 20 aminokyselin. Uvedená provedení prodloužení na A-konci a C-konci sekvence lze kombinovat.
Ve výhodném provedení je předmětem předkládaného vynálezu termostabilní polypeptid obsahující sekvenci o alespoň 90% sekvenční identitě se sekvencí:
AEEN RRISARGEDG DGTSKECVFI DVHFMKRYPK
VDFRIHVENQ DKYAQLLVET EKVLENNYTA GQPELQKPFK
TRARDDVSRK DTFGSQVRIK FMSAKYPGWY YTTVTKRSR
QLRLYQLYSR GKETEFYLCM VGFTKKGRPR (SEQ ID NO.
TSGKHIQVLG NRKGKLVGKP KGPKTRENQP 6) přičemž aminokyseliny vyznačené tučně a podtržením musí být zachovány.
Výhodně je celková délka sekvence polypeptidu do 227 aminokyselin, výhodněji do 207 aminokyselin.
Sekvence SEQ ID NO. 6 odpovídá fragmentu sekvence SEQ ID NO. 1 bez signálního peptidu a s delecí C-terminálních 8 aminokyselin. Aminokyseliny vyznačené v sekvenci SEQ ID NO. 6 tučně jsou v pozicích 115, 121 a 144 této sekvence mutovány; což odpovídá záměnám aminokyselin L141F, S147P a Q170P v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1.
Termostabilní polypeptid pak v některých provedeních dále obsahuje alespoň jednu nebo obě z následujících záměn aminokyselin:
- záměnu aminokyseliny E v pozici 79 uvedené sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinou G (odpovídá mutaci E105G v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1);
- záměnu aminokyseliny Q v pozici 59 uvedené sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinou W (odpovídá mutaci Q85W v číslování dle sekvence SEQ ID NO. 1).
V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na A-konci sekvence SEQ ID NO. 6 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLV (SEQ ID NO. 7). V dalších provedeních může termostabilní polypeptid nést na A-konci sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinu methionin (Μ). V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na C-konci sekvence SEQ ID NO. 6 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci RIRPTHPA (SEQ ID NO. 8). V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést v A- nebo C-terminálních částech krátké fúzní aminokyselinové sekvence (tzv. kotvy) v maximální délce až 20 aminokyselin. Uvedená provedení prodloužení na A-konci a C-konci sekvence lze kombinovat.
V podrobném popisu i v příkladech provedení přihlášky se používá číslování záměn aminokyselin podle sekvence SEQ ID NO. 1, tj. vztažené na celou sekvenci lidského FGF18, a to i v případě použití zkrácených sekvencí.
Polypeptidy na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu vykazují nezměněnou biologickou aktivitu v buněčné kultuře BaF3 myších 5-lymfocytů exprimujících FGFR-3C receptor, který je přirozeným ligandem FGF18 polypetidu (viz obrázky 2, 4, 6 a 7). Polypetidy na bázi FGF18 podle
-4CZ 309550 B6 předkládaného vynálezu rovněž vykazují nezměněnou biologickou aktivitu i po dlouhodobé preinkubaci při zvýšené teplotě (jako např. 37 °C nebo 50 °C) (viz obrázek 8).
Termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu jsou výhodné zejména kvůli tomu, že jsou významně stabilnější v porovnání s divokým typem FGF18. Tato stabilita je dána inherentní (vnitřní) stabilitou molekuly FGF18; žádné další sloučeniny podporující stabilito proteinu, jako například heparin, nemusí být přidány. Přitom zůstává zachována biologická aktivita FGF18. Předmětné polypeptidy na bázi FGF18 mohou být použity v klinických a výzkumných aplikacích.
Termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu mají FGF18 aktivito a zvýšenou teploto tání o 9 až 16 °C v porovnání s polypeptidem divokého typu FGF18. Všechny termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu byly konstruovány komerční syntézou genu a místně cílenou mutagenezí, klonovány do expresního vektoru pET28b, purifikovány (s čistotou >90% podle SDS-PAGE analýzy) a následně charakterizovány z hlediska stability a biologické aktivity.
Výhodnější jsou polypeptidy na bázi FGF18 o celkové délce do 227 aminokyselin (výhodněji o celkové délce do 207 aminokyselin), obsahující sekvence vybrané z SEQ ID NO. 6, a SEQ ID NO. 9 až SEQ ID NO. 11.
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 6)
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETGFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 9)
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAWLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 10)
AEEN RRISARGEDG DGTSKECVFI DVHFMKRYPK
VDFRIHVENQ DKYAWLLVET EKVLENNYTA GQPELQKPFK
TRARDDVSRK DTFGSQVRIK FMSAKYPGWY YTTVTKRSR
QLRLYQLYSR GKETGFYLCM VGFTKKGRPR (SEQ ID NO.
TSGKHIQVLG NRKGKLVGKP KGPKTRENQP 11)
V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na V-konci kterékoliv ze sekvencí SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 9 až 11 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLV (SEQ ID NO. 7). V dalších provedeních může termostabilní polypeptid nést na V-konci kterékoliv ze sekvencí SEQ ID NO. 6 a 9 až 11 aminokyselinu methionin (M). V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést na C-konci kterékoliv ze sekvencí SEQ ID NO. 6 a 9 až 11 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci RIRPTHPA (SEQ ID NO. 8). V některých provedeních může termostabilní polypeptid nést v N- nebo C-terminálních částech krátké fúzní aminokyselinové sekvence (tzv. kotvy) v maximální délce až 20 aminokyselin. Uvedená provedení prodloužení na V-koncích a C-koncích sekvencí lze kombinovat.
- 5 CZ 309550 B6
Biologická aktivita polypeptidů na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu může být kvantifikována hodnotou střední efektivní dávky (ED50) pro proliferaci myších B-lymfocytů buněčné linie BaF3 exprimujících FGFR-3C receptor, přičemž hodnota ED50 pro tento efekt je <10 ng/ml.
Ve druhém aspektu předkládaný vynález poskytuje termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 pro použití j ako léčivo.
Zejména poskytuje předkládaný vynález termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 pro použití v regenerativní medicíně, jako například pro léčbu poranění chrupavky či poranění kostí.
V dalších provedeních poskytuje předkládaný vynález termostabilní polypeptidy na bázi FGF18 pro použití v terapeutické stimulaci růstu vlasů, například pro léčbu i prevenci alopecie.
Dále předkládaný vynález poskytuje použití termostabilních polypeptidů na bázi FGF18 v kosmetice, zejména pro neterapeutickou stimulaci růstu vlasů.
Ve třetím aspektu předkládaný vynález poskytuje kultivační médium pro kultivace chondrocytů, zahrnující termostabilní polypeptid na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu, v koncentraci polypeptidu od 10 ng/ml do 1000 ng/ml v kultivačním médiu.
Podrobný popis vynálezu
Definice
Definice termínů, v této specifikaci použitých, jsou uvedeny níže. Pokud není definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny zde použité mají stejný význam, jak je běžně chápáno odborníkem v oboru.
V aminokyselinových sekvencích v tomto textu jsou používány standardní jednopísmenné zkratky aminokyselin:
Aminokyselina A je alanin.
Aminokyselina C je cystein.
Aminokyselina D je kyselina asparagová.
Aminokyselina E je kyselina glutamová.
Aminokyselina F je fenylalanin.
Aminokyselina G je glycin.
Aminokyselina H je histidin.
Aminokyselina I je isoleucin.
Aminokyselina K je lysin.
Aminokyselina L je leucin.
Aminokyselina M je methionin.
Aminokyselina N je asparagin.
Aminokyselina P je prolin.
Aminokyselina Q je glutamin.
Aminokyselina R je arginin.
Aminokyselina S je serin.
Aminokyselina T je threonin.
Aminokyselina V je valin.
Aminokyselina W je tryptofan.
Aminokyselina Y je tyrosin.
- 6 CZ 309550 B6
Zde použitý termín „termostabilita“ je synonymum s termínem „teplotní stabilita“ polypeptidu a zahrnuje termodynamickou a kinetickou stabilitu polypeptidu. Termodynamická stabilita polypeptidu se vztahuje k rovnováze mezi molekulami polypeptidu nacházejícími se v nativním (z angl. native), tedy správně strukturně uspořádaném, stavu a denaturovaném (z angl. unfolded), tedy strukturně neuspořádaném nebo rozvolněném, stavu polypeptidu, a je definována jako rozdíl Gibbsovy volné energie mezi těmito dvěma stavy polypeptidu. Kinetická stabilita polypeptidu reflektuje rychlost (tedy kinetiku) procesu sbalování a denaturace (strukturního rozvolňování) proteinu a vztahuje se k energetické bariéře oddělující nativní stav polypeptidu od jeho nefunkčních forem (nesložené nebo rozvolněné stavy polypeptidu, ireverzibilně denaturovaný polypeptid, agregovaný polypeptid).
Zde použitý termín „teplota tání“ (Tm, z angl. melting temperature) polypeptidu na bázi FGF18 označuje teplotu, při které je 50 % polypeptidu správně strukturně uspořádáno a 50 % polypeptidu neuspořádáno (denatureváno). Teplota tání je parametrem popisujícím termodynamickou stabilitu polypeptidu. Tm může být měřeno jakoukoli metodou vhodnou pro stanovení teploty tání, jako je např. spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD), diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) nebo diferenční skenovací fluorimetrie (DSF). CD spektroskopie je metoda vhodná pro monitorování sekundární struktury a konformačních změn proteinů. DSC je termoanalytická metoda, která sleduje tepelné změny, které nastávají u proteinů v průběhu zvyšování nebo snižování teploty, kdy dochází k jejich strukturním změnám. DSF je metoda, která měří teplotní stabilitu terciární struktury proteinu sledováním změny přirozené fluorescence proteinu. I když tyto techniky monitorují odlišné typy strukturních změn během teplotního rozkladu proteinu, relativní hodnoty ATm vypočítané jako rozdíl Tm mezi referenčním divokým typem FGF18 a polypeptidem na bázi FGF18 podle stávajícího vynálezujsou srovnatelné s variací menší než 1 °C.
Zde použitý termín „poločas proteolytického rozpadu“ polypeptidu na bázi FGF18 označuje čas potřebný k 50% proteolytické degradaci (rozštěpení) FGF18 proteinu za definovaných podmínek procesu. Poločas proteolytického rozpadu je parametrem kinetické stability proteinu. Termíny „proteolytický rozpad“, „proteolytická degradace“ a „proteolytické štěpení“ jsou zde používány jako synonyma.
Zde použitý termín „divoký typ“ označuje přirozeně se vyskytující formu FGF18 polypeptidu s nejběžnější aminokyselinovou sekvencí mezi členy druhu.
V příkladech používaný divoký typ FGF18 je rekombinantní lidský FGF18 bez C-terminálních 8 aminokyselin (RIRPTHPA, SEQ ID NO. 8) se sekvencí:
AEEN QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI VGFTKKGRPR KGPKTRENQQ DVHFMKRYPK 12)
VDFRIHVENQ TRARDDVSRK DKYAQLLVET DTFGSQVRIK EKVLENNYTA LMSAKYSGWY GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO.
s molekulovou hmotností 20,1 kDa a délkou 173 aminokyselin nebo jeho analog, který na svém Nterminálním konci obsahuje His-tag a štěpící místo pro trombin a na svém C-terminálním konci obsahuje celou sekvenci RIRPTHPA (SEQ ID NO. 8), odpovídající sekvenci:
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAQ LLVETDTFGS QVRIKGKETE FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTALMSAK YSGWYVGFTK
KGRPRKGPKT RENQQDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSRRIRPTH PA (SEQ ID NO. 13) s molekulovou hmotností 23,4 kDa a délkou 202 aminokyselin.
Krátké fúzní aminokyselinové sekvence (tzv. kotvy) v maximální délce až 20 aminokyselin usnadňují expresi a purifikaci rekombinantního polypeptidů. Odborníku v oboru je známo, že obecně připojením kotvy na N- nebo C-terminální konec polypeptidů nedojde k významnému ovlivnění jeho biologické funkce. Kotvy jsou v oboru obecně známy, stejně jako jejich sekvence a jejich použití, a zahrnují např. ALFA-tag, AviTag, C-tag, polyglutamátový tag, polyargininový tag, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, NE-tag, RholD4-tag, S-tag, Softagl, Softag3, Spottag, Strep-tag, T7-tag, TC tag, Ty tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, DogTag, nebo SdyTag.
Zde použitý termín „polypeptid na bázi FGF18“ označuje polypeptid, který má FGF18 aktivitu a obsahuje sekvenci nebo má sekvenci mající alespoň 90% sekvenční identitu se SEQ ID NO. 3 nebo SEQ ID NO. 6.
V příkladech použitý termín „tříbodový mutant FGF18“ nebo „FGF18 3b“ označuje FGF18 polypeptid nesoucí následující aminokyselinové substituce: L141F, S147P a Q170P ve srovnání s divokým typem FGF18. Tříbodový mutant FGF18 má sekvenci:
MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAQ LLVETDTFGS QVRIKGKETE FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTAFMSAK YPGWYVGFTK KGRPRKGPKT RENQPDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSRRIRPTH PA (SEQ ID NO. 14)
V příkladech použitý termín „zkrácená varianta tříbodového mutantu FGF18“ nebo „FGF18 3b+A8c-termmus“ označuje FGF18 polypeptid se sekvencí
MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAQ LLVETDTFGS QVRIKGKETE FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTAFMSAK YPGWYVGFTK KGRPRKGPKT RENQPDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSR (SEQ ID NO. 15)
Tato sekvence zahrnuje následující aminokyselinové substituce vůči divokému typu FGF18: L141F, S147P a Q170P, a dále zahrnuje deleci 8 aminokyselin v C-terminální části.
V příkladech použitý termín „čtyřbodový mutant FGF18“ nebo „FGF18 3b+E105G“ nebo „FGF18 3b+Q85W“ označuje FGF18 polypeptid zahrnující vždy následující tři aminokyselinové substituce: L141F, S147P, Q170P v kombinaci buď s mutací E105G nebo s mutací Q85W, ve srovnání s divokým typem. Konkrétněji je to polypeptid se sekvencí SEQ ID NO. 16 (zahrnující mutace L141F, S147P, Q170P a E105G) nebo polypeptid se sekvencí SEQ ID NO. 17 (zahrnující mutace L141F, S147P, Q170P a Q85W).
MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAQ LLVETDTFGS QVRIKGKETG FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTAFMSAK YPGWYVGFTK KGRPRKGPKT RENQPDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSRRIRPTH PA (SEQ ID NO. 16)
MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAW LLVETDTFGS QVRIKGKETE FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTAFMSAK YPGWYVGFTK KGRPRKGPKT RENQPDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSRRIRPTH PA (SEQ ID NO. 17)
V příkladech použitý termín „pětibodový FGF18 mutant“ nebo „FGF18 5b“ označuje FGF18 polypeptid zahrnující následující aminokyselinové substituce: L141F, S147P, Q170P, E105G a Q85W ve srovnání s divokým typem. V příkladech je to polypeptid se sekvencí SEQ ID NO. 18.
-8CZ 309550 B6
MAEENVDFRI HVENQTRARD DVSRKQLRLY QLYSRTSGKH IQVLGRRISA RGEDGDKYAW LLVETDTFGS QVRIKGKETG FYLCMNRKGK LVGKPDGTSK ECVFIEKVLE NNYTAPMSAK YPGWYVGFTK KGRPRKGPKT RENQPDVHFM KRYPKGQPEL QKPFKYTTVT KRSRRIRPTH PA (SEQ ID NO. 18)
Tříbodový, dva čtyřbodové a pětibodový mutant jsou také označovány v příkladech či tabulkách výčtem odpovídajících mutací vůči divokému typu.
Zde použitý termín „polypeptid na bázi FGF18“ je synonymem s „FGF18 mutant“ a označuje modifikovanou polypeptidovou sekvenci vykazující jakékoli substituce podle předkládaného vynálezu v porovnání s referenční přirozeně se vyskytující sekvencí divokého typu FGF18 (SEQ ID NO:1). Polypeptidy na bázi FGF18 jsou zde míněny polypeptidy spadající do rozsahu nároků této patentové přihlášky.
Zde použitý termín „polypeptid“ je synonymem s „protein“.
Zde použitý termín „aktivita FGF 18“ je synonymem s termínem „biologická aktivita FGF18“. Myslí se tím biologická aktivita FGF18 polypeptidů nebo polypeptidů na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu. Aktivním (funkčním) polypeptidem se myslí intaktní část aminokyselinové sekvence a struktury předmětného FGF18 proteinu nesoucí všechny funkčně významné aminokyseliny zodpovědné za vazbu na buňku a interakci s heparan sulfáty nebo jejich strukturním analogem heparinem. Biologická aktivita polypeptidů na bázi FGF18 je založena na jejich schopnosti vázat se (interagovat) alespoň s jedním z FGF receptorů, FGFR 1-3, nacházejících se na povrchu buněk. Z izoforem FGF receptorů „B“ (IIIB) a „C“ (HIC), vzniklých alternativním sestřihem extracelulární imunoglobulinové domény III, vykazují předmětné FGF 18 polypeptidy nejvyšší vazebnou specifitu k FGFR-3C receptorů. Vazebná interakce polypeptidů na bázi FGF 18 s FGF receptory vede k dimerizaci a autofosforylaci těchto receptorů, konkrétně k fosforylaci jejich tyrosin kinázové domény. Tímto způsobem aktivované FGF receptory následně indukují intracelulární signální dráhu vedoucí k fosforylaci i dalších proteinů (jako např. Raf-1, MEK a ERK), které stimulují proliferaci, mobilitu a diferenciaci buněk, což je nezbytné pro jejich správnou biologickou funkci in vivo, ale i in vitro. Takové buňky mohou zahrnovat například buňky mezenchymálního původu, zejména chondrocyty a osteocyty a buňky s chondrogenním a osteogenním potenciálem, dále také buňky ve specifických mozkových oblastech, játrech, tenkém střevě, v plicních alveolech a další, známe ve stavu techniky tím, že exprimují jeden nebo více FGF receptorů nebo jsou jiným způsobem responzivní na FGF 18. Biologickou aktivitu dle předkládaného vynálezu lze měřit metodami známými ve stavu techniky, například testem buněčné proliferace nebo diferenciace buněk nebo alternativně fosforylaci substrátu.
Polypeptid na bázi FGF 18 podle předkládaného vynálezu je považován za mající biologickou aktivitu FGF18, pokud má hodnotu ED50 měřenou testem buněčné proliferace s využitím buněčné linie BaF3 myších 5-lymfocytů exprimujících FGFR-3C receptor (Ellsworth, J. L. et al. 2002, Ostoearthritis and Cartilage 10: 308 až 320) <10 ng/ml, což v případě komerčně dostupného FGF 18 wt (SEQ ID NO. 12) koresponduje s hodnotou <0,50 nM a v případě rekombinantně připraveného FGF 18 wt (SEQ ID NO. 13) s hodnotou <0,43 nM.
Termín „střední efektivní dávka“ je synonymem s“EDso“ a vyjadřuje koncentraci polypeptidů na bázi FGF 18 nebo jeho fragmentu nebo jeho varianty potřebnou k vyvolání 50 % biologického účinku, tedy k dosažení 50 % maximální biologické aktivity.
Pro biologickou aktivitu je potřebná přítomnost funkčního fragmentu FGF 18 polypeptidů, který si zachovává FGF 18 aktivitu. Funkčním fragmentem se myslí intaktní část FGF 18 polypeptidové sekvence a struktury nesoucí všechny fúnkčně významné aminokyseliny, tedy aminokyseliny zodpovědné za interakci proteinu s FGF receptory a interakci s heparan sulfáty. Z literatury je
-9CZ 309550 B6 známo, že biologická aktivita zůstává zachována i po N-terminální deleci až 56 aminokyselin, nebo C-terminální deleci až 32 aminokyselin, nebo jejich kombinace. Podle stávajícího poznání lze za nejkratší funkční fragment považovat FGF18 polypeptid obsahující minimálně aminokyseliny Leu57-Met175 s nebo bez N-terminálního methioninu (číslováno dle SEQ ID NO. 1). Funkční fragmenty FGF18 u savců mají při přiložení cca 90% sekvenční identitu s referenční sekvencí (příslušný funkční fragment sekvence SEQ ID NO. 1). 90% sekvenční identita tedy nenarušuje biologickou aktivitu. V některých provedeních se jedná o alespoň 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo 100% sekvenční identitu. Polypeptid na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu dále vykazuje také alespoň tři nebo více substitucí v určených pozicích pro zvýšení termostability. Tyto substituované polypeptidy na bázi FGF18 podle předkládaného vynálezu mají zvýšenou teplotu tání, například Tm zvýšenou o alespoň 9 °C, nebo o alespoň 14 °C, nebo o alespoň 16 °C v porovnání s divokým typem FGF18 (nebo jeho odpovídajícím fragmentem), a také jsou schopny vázat se na alespoň jeden FGF receptor přítomný na povrchu buňky a spustit růst, proliferaci nebo přežití kultivovaných buněk vzhledem k neošetřeným kontrolním buňkám.
Zde použitý termín „mutant“ je synonymem s „varianta“ a označuje polypeptidy na bázi FGF18 nesoucí stabilizující aminokyselinové substituce dle předkládaného vynálezu, které mají zachovanou biologickou aktivitu. Dále mohou polypeptidy na bázi FGF18 nést další mutace (bodové substituce, bodové inserce a bodové delece), pokud je zachována alespoň 90% sekvenční identita v oblasti funkčního fragmentu, tj. v oblasti sekvence SEQ ID NO. 3, resp. sekvence SEQ ID NO. 6. To znamená, že polypeptidy na bázi FGF18 nesou stabilizující aminokyselinové substituce dle stávajícího vynálezu, a alespoň 90 % nebo více % aminokyselin funkčního fragmentu (tj. sekvence SEQ ID NO. 3, resp. sekvence SEQ ID NO. 6). 10% sekvenční variabilita je výhodně reprezentována tzv. konzervativními substitucemi, kdy má nově vkládaná aminokyselina podobné fyzikálně-chemické vlastnosti jako původní nahrazovaná aminokyselina, a u nichž se dle stávajícího poznání v oboru předpokládá nulový nebo minimální dopad na aktivitu a stabilitu proteinu. Příklady konzervativních substitucí zahrnují substituce jedné aminokyseliny s hydrofobním postranním řetězcem za jinou aminokyselinu s hydrofobním postranním řetězcem, nebo substituce jedné nabité nebo polární aminokyseliny za jinou nabitou nebo polární aminokyselinu. Za konzervativní substituce lze považovat například substituce aminokyselin v rámci každé z následujících skupin: (i) glycin, alanin, valin, leucin a isoleucin, (ii) fenylalanin, tyrosin a tryptofan, (iii) serin a threonin, (iv) kyselina asparagová a kyselina glutamová, (v) glutamin a asparagin a (vi) lysin, arginin a histidin.
Termín „sekvenční identita“ jak je v oboru známo, je vztah mezi dvěma polypeptidovými sekvencemi vyjadřující procentuální aminokyselinovou poziční identitu zjištěnou z porovnání přiložených sekvencí. Procenta sekvenční identity jsou vypočtena podílem počtu vzájemně si odpovídacích pozic, ve kterých se nachází identické aminokyseliny v porovnávaných sekvencích, a celkového počtu pozic v segmentu, který je porovnáván s referenční sekvencí, kdy získaný výsledek se následně vynásobí 100. Procentuální sekvenční identita může být snadno vypočtena bioinformatickými metodami známými v oboru techniky. Metody pro zjištění sekvenční identity jsou zakódovány ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodné metody založené na počítačových programech zahrnují bez omezení např. BLASTP, MatGAT, Water (EMBOSS), Matcher (EMBOSS), LALIGN. Pro zjištění sekvenční identity může být také použit dobře známý Smith - Watermanův algoritmus.
Aminokyselinová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí FGF18 polypeptidu, tj. může mít 100% identitu, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu aminokyselinových změn (odpovídacích max. 10% sekvenční variabilitě) ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento sekvenční identity je nižší než 100 %. Tyto změny se volí ze skupiny alespoň jedné substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, delece, nebo inserce, přičemž uvedené změny se mohou vyskytovat v N-terminálních nebo C terminálních pozicích referenčního polypeptidu, nebo kdekoliv mezi těmito koncovými částmi referenčního polypeptidu, rozprostřené buď jednotlivě mezi aminokyselinami referenčního polypeptidu nebo v jedné nebo více souvislých skupinách referenční sekvence.
- 10 CZ 309550 B6 ctggtgccgcgcggcagc
U savců, jako např. člověka, opic, myší, krys, králíků, prasat nebo krav jsou sekvence FGF18 polypeptidů vysoce konzervované, s 90% nebo vyšší sekvenční identitou v široké škále jednotlivých savčích druhů. Odborníku v oboru bude zřejmé, že 10% sekvenční variabilita (odpovídající v tomto vynálezu popsané 90% sekvenční identitě) fůnkčního fragmentu může být také dosažena použitím sekvence FGF18 polypeptidu z jiného savčího druhu než člověka.
Polypeptidy na bázi FGF18 mohou být připraveny genovou syntézou nebo mutagenezí. Obecně je gen kódující polypeptid na bázi FGF18 klonován do expresního vektoru a následně exprimován v transformovaných hostitelských organismech, výhodně v mikroorganismech. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen za produkce FGF18 při daných expresních podmínkách. Gen kódující polypeptid na bázi FGF18 může být také připraven v eukaryotech, jako například v kvasinkách nebo v lidských buňkách.
Níže je uveden příklad nukleotidové sekvence rekombinantního divokého typu FGF18 (5’-3’) s částí expresního vektoru pET28b. Start kodon atg a stop kodon TAA jsou označeny šedě, Nterminální His-tag (6 x His) je označen tučně s podtržením, štěpící místo pro trombin je označeno černě a restrikční místa pro Ncol, Ndel a Xhol umožňující klonování do expresního vektoru pET28b jsou podtržena (ccatgg - 5’ Ncol, CATATG - 5’ Ndel a CTCGAG - 3’ Xhol). Kódující sekvence divokého typu FGF18 začíná start kodonem atg a končí stop kodonem TAA.
ccatgggc agcag ccatcatcatcatcatcacagcagcggc
ATGTGGATTTTCGCATCCATGTTGAAAATCAGACCCGTGCACGTGATGATGTTAGCCGTAAACAGCTGCGTCTGT ATCAGCTGTATAGCCGTACCAGCGGTAAACATATTCAGGTTCTGGGTCGTCGTATTAGCGCACGTGGTGAAGATG GTGATAAATATGCACAGCTGCTGGTTGAAACCGATACCTTTGGTAGCCAGGTTCGTATTAAAGGTAAAGAAACCG AATTCTATCTGTGCATGAACCGCAAAGGTAAACTGGTTGGTAAACCGGATGGCACCAGCAAAGAATGTGTGTTTA TTGAAAAAGTGCTGGAAAACAACTACACCGCACTGATGAGCGCAAAATATAGCGGTTGGTATGTTGGCTTTACCA AAAAAGGTCGTCCGCGTAAAGGTCCGAAAACACGCGAAAATCAGCAGGATGTTCATTTCATGAAGCGTTATCCGA AAGGTCAGCCGGAACTGCAGAAACCGTTCAAATATACCACCGTTACCAAACGTAGCCGTCGTATTCGTCCGACAC ATCCGGCATAATAGCTCGAG (SEQ ID NO. 19)
FGF18 polypeptid použitý pro inzerci substitucí zde popsaných může být z jakéhokoliv savčího zdroje, jako například myší, krys, králíků, primátů, prasat, psů, krav, koní a lidí. Výhodně je FGF18 polypeptid odvozen z lidského zdroje. Mohou být však použity jakékoli biologicky aktivní varianty savčího FGF18 polypeptidu s alespoň 90% nebo s 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo 100% aminokyselinovou sekvenční identitou k aminokyselinové sekvenci lidského proteinu FGF18 (SEQ ID NO. 1) nebo jejím fůnkčním fragmentům (např. SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 6).
Následující příklady prezentují charakterizaci polypeptidů na bázi FGF18, demonstrují účinek vložených substitucí na stabilitu a aktivitu polypeptidů a dále způsob jejich využití v kultivaci chondrocytů. Primární myší chondrocyty použité v příkladech byly připraveny dle Mirando, A.J., et al., 2014, Mol. Biol., 1130: 267-277, BaF3 myší lymfocyty exprimující hlavní varianty FGF receptorů byly připraveny dle Ornitz, D. M. et al. 1996, J. Biol. Chem. 271(25): 15292 až 15297.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 ukazuje SDS-PAGE gely po expresi a purifikaci FGF 18 wt a tříbodového mutanta FGF18 (3b) nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P. Rekombinantně produkovaný FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 13), stejně jako jeho mutant, obsahuje 202 aminokyselin (včetně V-terminální histidinové kotvy a štěpícího místa pro trombin) a má molekulovou hmotnost 23,4 kDa (viz šipka v obrázku). Sloupec wt: rekombinantní FGF 18 wt; sloupec 3b: tříbodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P); sloupec Mw: hmotnostní marker.
- 11 CZ 309550 B6
Obrázek 2 ukazuje porovnání biologické aktivity tříbodového mutanta FGF18 (3b) (z prvního kola designu) s rekombinantně připraveným FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 13) a komerčně dostupným FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 12). Biologická aktivita FGF18 proteinů byla měřená testem proliferace s využitím BaF3 buněk exprimujících FGFR-3C receptor. Graf zobrazuje data ze dvou nezávislých opakování (každý bod pak průměr z celkem 12 hodnot). Naměřená data byla použita jako podklad pro stanovení střední efektivní dávky EC50 (FGF18 wt (SEQ ID NO. 12) 5,4 ng/ml; FGF18 wt (SEQ ID NO. 13) 3,1 ng/ml; FGF18 3b 3,2 ng/ml.
Obrázek 3 ukazuje SDS-PAGE gel po expresi a purifikaci zkrácené varianty tříbodového mutanta FGF18 nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P a C-terminální deleci 8 aminokyselin (3b+ΔC-terminus). Rekombinantní tříbodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P) s C -terminální delecí obsahuje 194 aminokyselin (včetně N-terminální histidinové kotvy a štěpícího místa pro trombin) a má molekulovou hmotnost 22,5 kDa. Sloupec CE: bezbuněčný extrakt; sloupec 3b+Δ8Cterminus: tříbodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P) s delecí 8 aminokyselin na Cterminálním konci; sloupec Mw: hmotnostní marker.
Obrázek 4 ukazuje porovnání biologické aktivity FGF18 wt (SEQ ID NO. 12), tříbodového mutanta FGF18 3b (L141F+S147P+Q170P) a zkrácené varianty tříbodového mutanta FGF18 nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P a C-terminální deleci 8 aminokyselin (3b+ΔC-tα'minus). Biologická aktivita FGF18 proteinů byla měřená testem proliferace s využitím BaF3 buněk exprimujících FGFR-3C receptor. Graf zobrazuje data ze čtyř nezávislých opakování.
Obrázek 5 ukazuje SDS-PAGE gely po purifikaci FGF18 wt, tříbodového mutanta FGF18 (3b) nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P, čtyřbodového mutanta FGF18 (3b+E105G) nesoucího mutace jako mutant tříbodový (L141F+S147P+Q170P) + mutaci E105G, čtyřbodového mutanta FGF18 (3b+Q85W) nesoucího mutace jako mutant tříbodový (L141F+S147P+Q170P) + mutaci Q85W a pětibodového mutanta FGF18 (5b) nesoucího mutace
L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W. Rekombinantně produkovaný FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 13), stejně jako jeho mutanti, obsahuje 202 aminokyselin (včetně Nterminální histidinové kotvy a štěpícího místa pro trombin) a má molekulovou hmotnost 23,4 kDa. Sloupec 3b: tříbodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P); sloupec 3b+E105G: čtyřbodový mutant FGF18 nesoucí mutace jako mutant tříbodový a mutaci E105G; sloupec 3b+Q85W: čtyřbodový mutant FGF18 nesoucí mutace jako mutant tříbodový a mutaci Q85W; sloupec 5b: pětibodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W); sloupec Mw: hmotnostní marker.
Obrázek 6 ukazuje porovnání biologické aktivity pětibodového mutanta FGF18 5b (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W) s rekombinantně připraveným FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 13) a komerčně dostupným FGF18 wt (odpovídající sekvenci SEQ ID NO. 12). Biologická aktivita FGF18 proteinů byla měřená testem proliferace s využitím BaF3 buněk exprimujících FGFR-3C receptor. Graf zobrazuje data ze tří nezávislých opakování.
Obrázek 7 ukazuje výsledky testování receptorové specifity FGF18 wt (SEQ ID NO. 12), tříbodového mutanta FGF18 3b (L141F+S147P+Q170P) a pětibodového mutanta FGF18 5b (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W). Buněčné linie BaF3 myších B-lymfocytů exprimujících hlavní varianty FGF receptorů: FGFR-1B, 1C, 2B, 2C, 3B a 3C byly stimulovány testovanými FGF18 variantami v koncentracích 0 až 10 nM za přítomnosti heparinu (2 μg/ml) po dobu 48 hodin. Buněčná proliferace indukovaná jednotlivými proteiny byla detekována pomocí proliferačního testu s využitím resazurinu. Grafy znázorňují naměřené hodnoty fluorescence metabolizovaného resazurinu.
Obrázek 8 ukazuje testování in vitro stability pětibodového mutanta FGF18 5b (Q85W+E105G+L141F+S147P+Q170P) ve srovnání s FGF18 wt (SEQ ID NO. 12) v buněčné
- 12 CZ 309550 B6 kultuře BaF3 exprimující FGFR-3C receptor. Grafy znázorňují schopnost proteinů indukovat buněčnou proliferaci po preinkubaci proteinů při různých teplotách (v koncentraci 100 pg/ml).
Obrázek 9 ukazuje resistenci (odolnost) pětibodového mutanta FGF18 5b nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W vůči proteolytické degradaci trypsinem ve srovnání s FGF18 wt (SEQ ID NO. 13). FGF18 polypeptidy byly štěpeny trypsinem při 37 °C v molárním poměru 1 : 20. Produkty degradační reakce byly vizualizovány pomocí SDS-PAGE analýzy a následně kvantifikovány denzitometrickou analýzou. Stanovený poločas proteolytického rozpadu pětibodového mutanta FGF18 5b byl šestnáctkrát vyšší ve srovnání s FGF18 wt.
Obrázek 10 ukazuje porovnání proliferace myších chondrocytů po 19denní stimulaci pětibodovým mutantem FGF18 5b (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W) a FGF18 wt (SEQ ID NO. 13). Oba proteiny byly testovány v koncentraci 1000 ng/ml.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1. In silico design stabilizujících mutací v FGF18
Pro první kolo in-silico designu potenciálně stabilizujících mutací v proteinu FGF18 byla použita aminokyselinová sekvence lidského FGF18 (http://www.uniprot.org/uniprot/O76093) a krystalová struktura (PDB ID 4CJM) v rozlišení 2,7 Á začínající 50. aminokyselinou a končící 190. aminokyselinou. Struktura proteinu byla před výpočty upravena odstraněním ligandů (iontů) a molekul vod. Pro výpočty byly použity všechny čtyři proteinové řetězce, přičemž výpočty probíhaly na každém řetězci zvlášť. Stabilizační účinky všech možných jednobodových mutací v jednotlivých pozicích proteinu byly nejprve analyzovány výpočtem změny Gibbsovy volné energie (ΔΔG) po vnesení příslušné jednobodové mutace do proteinu s využitím metody na principu empirického silového pole, kdy hranice ΔΔG pro stabilizující mutace byla stanovena na hodnotu menší než 0 kcal.mol-1. Vnitromolekulární interakce byly dále analyzovány na základě posouzení jejich geometrických parametrů a veškeré mutace, které by narušovaly tyto interakce, byly vyřazeny z dalších analýz. Stejně tak byly vyřazeny mutace v residuích důležitých pro biologickou funkci proteinu (např. residua zodpovědná za interakci s receptory či heparan sulfáty). V dalším kroku byly provedeny výpočty ΔΔG metodou založenou na principu fyzikálního silového pole zohledňujícím flexibilitu proteinové páteře. Hodnota minimální energie z celkem 50 iterací byla použita jako finální parametr popisující stabilizační efekt. Současně byla analyzována konzervovanost jednotlivých residuí v daných pozicích analýzou mnohonásobného sekvenčního přiložení pomocí Jensen-Shannon divergence algoritmus. Pro finální výběr stabilizujících mutací byla použito následující kritérium, při kterém změna energie (ΔΔG) predikovaná oběma metodami byla menší než 0 kcal/mol, hodnota konzervovanosti rezidua na dané pozici byla <8 a vnesené mutace nezpůsobily narušení solných můstků. Tímto kritériem bylo identifikováno 19 stabilizujících mutací, ze kterých byly vybrány 3, které byly zkombinovány do tříbodové varianty (L141F+S147P+Q170P). Číslování mutací odpovídá sekvenci lidského FGF18 (SEQ ID NO:1).
Tabulka 1. Přehled stabilizačních mutací FGF18 vybraných v prvním kole in silico designu. Mutace vybrané pro konstrukci tříbodového mutanta jsou zvýrazněny tučně.
| Substituce | Metoda empirického silového pole ΔΔG (kcal/mol) | Metoda fyzikálního silového pole ΔΔG (kcal/mol) | Konzervovanost | Aminokyseliny vyskytující se na dané pozici (z MSA) |
| R71F | -0,053 | -1,868 | 5 | N,P,K,G,Q,R,L |
| R71M | -0,258 | -0,403 | 5 | N,P,K,G,Q,R,L |
| R71P | -0,898 | -1,834 | 5 | N,P,K,G,Q,R,L |
- 13 CZ 309550 B6
| R71W | -0,341 | -2,842 | 5 | N,P,K,G,Q,R,L |
| R72Q | -0,040 | -2,639 | 5 | Y,S,R,D,P,T,A,N,K |
| S74F | -0,067 | -1,231 | 5 | M,T,N,K,G,S,V,L,R,D |
| Y83F | -0,365 | -0,039 | 6 | H,Y,F,N |
| Q85W | -0,235 | -2,799 | 7 | E,Q,R,L,S,K,N,T |
| Q96F | -0,719 | -2,005 | 7 | H,Q,R,K |
| Q96Y | -0,283 | -2,401 | 7 | H,Q,R,K |
| T104V | -0,093 | -0,174 | 8 | P,T,S |
| V128I | -0,067 | -0,483 | 5 | A,M,T,F,I,L,Q,Y,V |
| V128W | -0,028 | -3,044 | 5 | A,M,T,F,I,L,Q,Y,V |
| L141F | -1,431 | -3,087 | 7 | F,Y,L,W,H |
| L141Y | -1,537 | -2,159 | 7 | F,Y,L,W,H |
| S147P | -1,819 | -2,191 | 1 | T,A,N,K,G,V,S,L,R,D,E,P |
| S147Y | -1,100 | -1,152 | 1 | T,A,N,K,G,V,S,L,R,D,E,P |
| R166S | -0,411 | -1,064 | 5 | I,H,Q,L,R,S,G,K,A,T |
| Q170P | -1,944 | -1,750 | 7 | E,K,N,R,Q,G |
Pro druhé kolo in silico designu potenciálně stabilizujících mutací v proteinu FGF18 byl jako templát použit tříbodový mutant, jehož stabilita byla ve srovnání s FGF18 wt o 9 °C vyšší se současným zachováním biologické aktivity (viz příklady 3 a 4 níže). Strukturní modely tříbodového mutanta FGF18 byly predikovány softwarem Rosettta s využitím protokolu 16. Z predikovaných strukturních modelů byly následně vybrány 3 modely s nejnižší energií, které byly použity pro výpočty stabilizujících mutací oběma metodami silových polí, stejně jako v prvním kole in silico designu. Pro finální výběr stabilizujících mutací bylo použito přísnější kritérium, tedy změna energie (ΔΔG) predikovaná oběma metodami nižší než -1,0 kcal/mol, hodnota konzervovanosti rezidua na dané pozici <7 a neporušení solných můstků. Tímto kritériem byly identifikovány dvě nové stabilizující mutace.
Tabulka 2. Stabilizační mutace FGF18 vybrané ve druhém kole in silico designu, kde byl jako templát použit tříbodový mutant FGF18 (L141F+S147P+Q170P) identifikovaný v prvním kole designu.
| Substituce | Metoda empirického silového pole ΔΔG (kcal/mol) | Metoda fyzikálního silového pole ΔΔG (kcal/mol) | Konzervovanost | Aminokyseliny vyskytující se na dané pozici (z MSA) |
| Q85W | -1,04 | -2,54 | 7 | E,Q,R,L,S,K,N,T |
| E105G | -2,08 | -1,91 | 2 | K,G,P,D,Q,S,R,N,E,A |
Příklad 2. Syntéza tříbodového mutanta FGF18 z prvního kola in silico designu, jeho exprese a purifikace afinitní chromatografií
Gen kódující navržený tříbodový mutant FGF18 (nesoucí mutace L141F+S147P+Q170P) byl komerčně syntetizován. Expresní plazmidy (pET28b) nesoucí gen kódující tříbodovou variantu FGF18 nebo FGF18 wt byly transformovány do chemokompetentních buněk E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs). Buňky byly vysety na agarové misky s obsahem kanamycinu (50 μg/ml) a následně inkubovány přes noc při 37 °C. Další den bylo vždy jednou kolonií zaočkováno 10 ml LB media s kanamycinem. Buňky byly kultivovány přes noc při 37 °C za stálého třepání. Noční kultura byla použita k zaočkování LB média s kanamycinem. Kultivace probíhala za stálého třepání. Exprese byla indukována pomocí isopropyl-β-D-1-thiogalaktopyranosidu (IPTG) ve výsledné koncentraci 0,1 mM. Buňky byly dále kultivovány přes noc při 20 °C. Kultura byla sklízena centrifugací (15 min při 8000 g a 4 °C) a získaný pelet byl rozsuspendován v purifikačním nanášecím pufru (20 mM fosfátový pufr obsahující 500 mM NaCl a 10 mM imidazol, pH 7,5) a uchován při -80 °C.
- 14 CZ 309550 B6
Rozmražené kultury byly za stálého chlazení dezintegrovány ultrazvukovou sonikací a lyzáty byly následně centrifugovány. K purifikaci proteinů byla využita niklová afinitní chromatografie. Eluce proteinů probíhala v lineárním gradientu elučního pufru s postupně se zvyšující koncentrací imidazolu (10 až 500 mM). Přítomnost proteinu v jednotlivých frakcích byla verifikována pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Vypurifikované proteiny byly dialyzovány přes noc při 4 °C proti 20 mM fosfátovému pufru (pH 7,5) obsahujícím 750 mM NaCl a filtrovány přes sterilní filtr s velikostí pórů 0,22 μm. Koncentrace proteinů byla určena pomocí metody dle Bradfordové a čistota byla zkontrolována pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Jednokroková purifikace vedla k získání proteinů s čistotou vyšší než 90 % (obrázek 1). Výtěžky testovaných proteinů ihned po purifikaci se pohybovaly v rozmezí 9 až 10 mg z litru buněčné kultury. Nicméně u divokého typu FGF18 wt docházelo po dialýze k masivnímu vysrážení proteinu, takže konečný výtěžek FGF18 wt po dialýze byl 5 mg a po lyofilizaci a následné rekonstituci proteinu do roztoku jen 2 mg z 1 litru kultury.
Příklad 3. Stanovení termostability tříbodového mutanta FGF18 získaného z prvního kola in silico designu
Po ověření správného strukturního uspořádání tříbodového mutanta FGF18 pomocí spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD) byla následně testována jeho stabilita s využitím CD spektroskopie a diferenční skenovací fluorimetrie, která byla následně porovnána se stabilitou FGF18 wt. Termální denaturace proteinů byla oběma technikami sledována v teplotním rozsahu 25 až 90 °C s rychlostí teplotní rampy 1 °C/min. Naměřené hodnoty teplotní stabilizace jsou shrnuty v tabulce 3. U nově zkonstruovaného tříbodového mutanta FGF18 nesoucího mutace L141F+S147P+Q170P byl pozorován nárůst teplotní stability o více než 9 °C v porovnání s divokým typem FGF18.
Tabulka 3. Teploty tání1 FGF18 wt a tříbodového mutanta FGF18 z prvního kola designu měřené dvěma technikami - spektroskopií cirkulárního dichroismu (CD) a diferenční skenovací fluorimetrií (DSF).
| FGF18 | CD Tm (°C) | CD ΔTm (°C) | DSF Tm (°C) | DSF ΔTm (°C) |
| wt (SEQ ID NO. 13) | 47,3 | - | 43,3 | - |
| L141F+S147P+Q170P | 57,0 | 9,7 | 52,5 | 9,2 |
TΉ - teplota tání; ΔTm - změna teploty tání po mutaci; 1 Prezentován je průměr ze tří nezávislých experimentů (průměrné standardní odchylky stanovených teplot tání byly ±2 °C).
Příklad 4. Ověření biologické aktivity tříbodového mutanta FGF18 získaného po prvním kole in silico designu
Biologická aktivita tříbodového mutanta FGF18 byla testována proliferační esejí s využitím myších B-lymfocytů, buněčné linie BaF3 exprimující FGFR-3C receptor. Protein byl analyzován v 96jamkových destičkách za použití resazurinového testu (Ellsworth, J. L. et al. 2002, Ostoearthritis and Cartilage 10: 308 až 320). Proliferační aktivita tříbodového mutanta FGF18 (obrázek 2) byla srovnána s aktivitou komerčně dostupného FGF18 wt (PeproTech, SEQ ID NO. 12) a aktivitou rekombinantně připraveného FGF18 wt (SEQ ID NO. 13). Ze získaných výsledků vyplývá, že míra schopnosti vyvolat proliferační odpověď je téměř totožná u komerčně dostupného FGF18 (ED50 5,4 ng/ml), rekombinantního FGF18 (ED50 3,1 ng/ml) a tříbodové varianty FGF18 (ED50 3,2 ng/ml), protože křivka dávka-odpověď je pro všechny tyto faktory téměř totožná.
Příklad 5. Konstrukce a charakterizace zkrácené varianty tříbodového mutanta FGF18 demonstrující, že delece v C -terminální části proteinu nemá vliv na jeho stabilitu ani aktivitu
- 15 CZ 309550 B6
Zkrácená forma tříbodového mutanta FGF18 byla konstruována a charakterizována s cílem ověřit, že delece 8 aminokyselin v jeho C-terminální části nebude mít žádný vliv na stabilitu proteinu získanou vnesením tří stabilizujících substitucí a současně neovlivní aktivitu proteinu. Zkrácení Cterminální části proteinu vychází z rekombinantní formy FGF18, zkrácené o 11 aminokyselin v Cterminální části, označované jako Sprifermin a v současné době testované jako potenciální terapie na léčbu osteoartritidy. Zkrácená forma tříbodového mutanta FGF18 byla konstruována cílenou mutagenezí s využitím vhodně navrženého primeru dle protokolu QuickChange kitu od firmy Agilent, kdy tříbodový mutant FGF18 byl použit jako templát. Připravený konstrukt v expresním vektoru pET28b obsahující v N-terminální části histidinovou kotvou a štěpící místo pro trombin byl následně transformován do chemokompetentních buněk E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), kultivován při 37 °C a exprimován při OD (600 nm) 0,5 přídavkem IPTG při 20 °C přes noc. Vyprodukovaná biomasa byla sklízena centrifugací (15 min při 8000 g a 4 °C) a získaný pelet byl rozsuspendován v purifikačním nanášecím pufru (20 mM fosfátový pufr obsahující 500 mM NaCl a 10 mM imidazol, pH 7,5) a uchován při -80 °C.
Rozmrazená kultura byly za stálého chlazení dezintegrována ultrazvukovou sonikací a lyzát byl centrifugován. K purifikaci proteinu byla využita niklová afinitní chromatografie. Eluce proteinu probíhala v lineárním gradientu elučního pufru s postupně se zvyšující koncentrací imidazolu (10 až 500 mM). Přítomnost proteinu v jednotlivých frakcích byla verifikována pomocí SDSPAGE elektroforézy. Vypurifikovaný protein byl dialyzován přes noc při 4 °C proti 20 mM fosfátovému pufru (pH 7,5) obsahujícím 750 mM NaCl a filtrován přes sterilní filtr s velikostí pórů 0,22 μm. Koncentrace proteinu byla stanovena metodou dle Bradfordové a čistota byla zkontrolována pomocí SDS-PAGE elektroforézy (obrázek 3). Po purifikaci byl protein připraven ve stejné čistotě jako tříbodový mutant (>90 %). Stabilita zkrácené formy tříbodového mutanta FGF18 byla testována CD spektroskopií (tabulka 4), aktivita testem proliferace s využitím BaF3 buněčné linie exprimující FGFR-3C receptor (obrázek 4). Získané výsledky prokázaly, že delece 8 aminokyselin v jeho C -terminální části nemá žádný vliv na stabilitu a aktivitu proteinu.
Tabulka 4. Porovnání teploty tání1 tříbodového mutanta FGF18 z prvního kola designu s jeho zkrácenou formou obsahující deleci 8 aminokyselin v C-terminální části. Teploty tání byly měřeny spektroskopií cirkulárního dichroismu (CD).
| FGF18 | CD Tm (°C) | CD ΔTm (°C) |
| wt (SEQ ID NO. 13) | 47,3 | — |
| L141F+S147P+Q170P | 57,0 | 9,7 |
| L141F+S147P+Q 170P+Δ8C temmus | 56,0 | 9,6 |
Tm - teplota tání; ΔTm - změna teploty tání po mutaci; 1 Prezentován je průměr ze tří nezávislých experimentů (průměrné standardní odchylky stanovených teplot tání byly ±2 °C).
Příklad 6. Konstrukce vícebodových mutantů FGF18 po druhém kole in silico designu, jejich exprese a purifikace afinitní chromatografií
Vícebodové varianty FGF18 navržené po 2 druhém kole in silico designu, zahrnující dvě čtyřbodové a jednu pětibodovou variantu, byly konstruovány metodou místně cílené mutageneze s využitím vhodně zvolených primerů nesoucích požadované jednobodové a dvoubodové mutace, které byly vnášeny do tříbodové varianty (L141F+S147P+Q170P) jako templátu dle protokolu QuickChange kitu od firmy Agilent. Přítomnost požadovaných mutací byla u nově konstruovaných FGF18 mutantů verifikována sekvenováním. Získané konstrukty v expresním vektoru pET28b obsahující v N-terminální části histidinovou kotvou a štěpící místo pro trombin byly transformovány do chemokompetentních buněk E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), kultivovány při 37 °C a exprimovány při OD (600 nm) 0,5 přídavkem IPTG při 20 °C podobně jako v případě tříbodového mutanta FGF18 z prvního kola designu. Vyprodukovaná biomasa byla sklízena centrifugací (15 min při 8000 g a 4 °C) a získaný pelet byl rozsuspendován v purifikačním
- 16 CZ 309550 B6 nanášecím pufru (20 mM fosfátový pufr obsahující 500 mM NaCl a 10 mM imidazol, pH 7,5) a uchován při -80 °C.
Rozmrazené kultury byly za stálého chlazení dezintegrovány ultrazvukovou sonikací a lyzáty byly následně centrifugovány. K purifikaci proteinů byla využita niklová afinitní chromatografie. Eluce proteinů probíhala v lineárním gradientu elučního pufru s postupně se zvyšující koncentrací imidazolu (10 až 500 mM). Přítomnost proteinu v jednotlivých frakcích byla verifikována pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Vypurifikované proteiny byly dialyzovány přes noc při 4 °C proti 20 mM fosfátovému pufru (pH 7,5) obsahujícím 750 mM NaCl a filtrovány přes sterilní filtr s velikostí pórů 0,22 μm. Koncentrace proteinů byla určena pomocí metody dle Bradfordové a čistota byla zkontrolována pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Jednokroková purifikace vedla k získání proteinů s čistotou vyšší než 90 % (obrázek 5). Výtěžky nově zkonstruovaných mutantů FGF18 ihned po purifikaci se pohybovaly v rozmezí 7 až 12 mg z litru buněčné kultury. Nejvyšší průměrný výtěžek proteinu po purifikaci vykazoval pětibodový mutant FGF18 (Q85W+E105G+L141F+S147P+Q170P), který současně vykazoval i nejvyšší odolnost vůči precipitaci během dialýzy. Průměrný výtěžek pětibodového mutanta FGF18 po dialýze byl 10 mg z litru kultury.
Příklad 7. Stanovení termostability vícebodových FGF18 mutantů získaných po druhém kole in silico designu
Termální stabilita čtyřbodových a pětibodového mutanta FGF18 byla stanovena pomocí CD spektroskopie a diferenční skenovací fluorimetrie v teplotním rozsahu 25 až 90 °C s rychlostí teplotní rampy 1 °C/min. Naměřené hodnoty teplotní stability FGF18 mutantů jsou shrnuty v tabulce 5. U všech tří nově zkonstruovaných mutantů FGF18 byl pozorován nárůst teplotní stability o 4 až 6 °C ve srovnání s použitým templátem (tříbodovým mutantem FGF18 nesoucím mutace L141F+S147P+Q170P) a tudíž o 14 až 16 °C ve srovnání s FGF18 wt. Nejvyšší teplotu tání vykazoval pětibodový mutant FGF18, jehož teplota tání vzrostla o 16 °C v porovnání s divokým typem FGF18.
Tabulka 5. Teploty tání1 vícebodových mutantů FGF18 z druhého kola designu měřené dvěma technikami - spektroskopií cirkulárního dichroismu (CD) a diferenční skenovací fluorimetrií (DSF).
| FGF18 | CD Tm (°C) | CD ΔTm (°C) | DSF Tm (°C) | DSF ΔTm (°C) |
| wt (SEQ ID NO. 13) | 47,3 | - | 43,3 | - |
| L141F+S147P+Q170P | 57,0 | 9,7 | 52,5 | 9,2 |
| E105G+L141F+S147P+Q170P | 62,0 | 14,7 | 58,2 | 14,9 |
| Q85W+L141F+S147P+Q170P | 61,3 | 14,0 | 57,8 | 14,5 |
| Q85W+E105G+L141F+S147P+Q170P | 62,8 | 15,5 | 58,8 | 15,5 |
Tm - teplota tání; Δ Tm - změna teploty tání po mutaci; 'Prezentován je průměr ze tří nezávislých experimentů (průměrné standardní odchylky stanovených teplot tání byly ±2 °C).
Příklad 8. Biologická aktivita pětibodového mutanta FGF18
Biologická aktivita pětibodové varianty FGF18 5b (Q85W+E105G+L141F+S147P+Q170P) byla testována proliferační esejí s využitím myších B-lymfocytů, buněčné linie BaF3 exprimující FGFR-3C receptor a porovnána s aktivitou komerčně dostupného FGF18 wt (PeproTech, SEQ ID NO. 12) a aktivitou rekombinantně připraveného FGF18 (SEQ ID NO. 13). Proteiny byly testovány v 96jamkových destičkách pomocí resazurinového testu (přídavek resazurinu do média detekuje a kvantifikuje buněčnou viabilitu na základě přeměny nefluorescenčního modrého resazurinu na červený fluorescenční resorufin). Z naměřených výsledků vyplývá, že pětibodová varianta FGF18 5b vykazuje porovnatelnou schopnost indukce proliferace jako oba divoké typy FGF18
- 17 CZ 309550 B6 (obrázek 6), korelující s očekávanou hodnotou ED50 pro tento efekt <10 ng/ml (FGF18 5b 0,5 ng/ml; FGF18 wt (SEQ ID NO. 12) 8.6 ng/ml; FGF18 wt (SEQ ID NO. 13) 1,0 ng/ml).
Biologická aktivita pětibodové varianty FGF18 5b (Q85W+E105G+L141F+S147P+Q170P) byla dále testována stanovením receptorové specificity s využitím buněčných linií BaF3 myších B lymfocytů exprimujících hlavní varianty FGF receptorů: FGFR-1B, 1C, 2B, 2C, 3B a 3C. Tyto klony jsou závislé na přídavku FGF pro indukci proliferace, a proto jsou ideálním systémem pro testování receptorové specificity FGF proteinů. Pokud se testovaný FGF váže na určitý FGFR exprimovaný v daném klonu BaF3 buněk, dojde k proliferaci buněk, a tím nárůstu jejich počtu a celkové metabolické aktivity v médiu. Receptorová specificita byla testována pomocí resazurinového testu. Naměřená data ukázala, že vnesené stabilizující mutace do pětibodového mutanta FGF18 nijak neovlivnily jeho receptorovou specifitu, neboť v závislosti na koncentraci vyvolává, stejně jako FGF18 wt (SEQ ID NO. 12), proliferační odpověď na buněčné linii exprimující receptory FGFR-3C a FGFR-2C. Zatímco u ostatní testovaných linií BaF3 buněk nebyla po přídavku proteinu do média proliferace buněk pozorována téměř vůbec nebo jen až ve velmi vysokých koncentracích (obrázek 7).
Příklad 9. Pětibodový mutant FGF18 vykazuje zvýšenou termostabilitu v buněčné kultuře myších B-lymfocytů buněčné linie BaF3 produkujících FGFR-2C receptor
Následně byl proveden test teplotní stability pětibodové varianty FGF18 (Q85W+E105G+L141F +S147P+Q170P) v buněčné kultuře ve srovnání s FGF18 wt (SEQ ID NO. 12), při kterém byla testována schopnost proteinů indukovat proliferaci buněk po vystavení různým teplotním podmínkám preinkubace. Preinkubované proteiny byly následně použity ke stimulaci proliferace buněčného klonu BaF3 exprimující FGFR-2C receptor, který v předchozích testech receptorové specifity vykazoval silný proliferační signál vyvolaný přídavkem FGF18. Podmínky preinkubace pro obě varianty FGF18 byly shodné a probíhaly současně při: i) -20 °C, ii) 37 °C po dobu 7 dní a iii) 50 °C po dobu 24 hodin (obrázek 8). Po vystavení všem testovaným teplotám vykazoval pětibodový mutant FGF18 5b schopnost indukce proliferace BaF3 buněk při výrazně nižších koncentracích ve srovnání s FGF18 wt. Dokonce i po 24hodinové preinkubaci při 50 °C si FGF18 5b udržel svou biologickou aktivitu, zatímco FGF18 wt byl prakticky neaktivní. Naměřené výsledky potvrzují zvýšenou stabilitu pětibodového mutanta FGF18 5b.
Příklad 10. Resistence pětibodového mutanta FGF18 vůči proteolytické degradaci
Ke zjištění odolnosti FGF18 wt (SEQ ID NO. 13) a pětibodového mutanta FGF18 (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W) vůči proteolytické degradaci byl proveden test štěpení proteolytickým enzymem. Oba FGF18 polypeptidy byly štěpeny trypsinem při 37 °C v molárním poměru 1 : 20 a následně analyzovány pomocí SDS-PAGE analýzy (obrázek 9). Následná kvantifikace produktů proteolytického štěpení na SDS-PAGE gelu odhalila, že pětibodový mutant FGF18 vykazuje nejen zvýšenou termostabilitu, ale i vyšší odolnost vůči proteolytické degradaci. Stabilní FGF18 5b podléhá degradaci trypsinem přibližně 16krát pomaleji než FGF18 wt.
Příklad 11. Efektivita pětibodového mutanta FGF18 při indukci proliferace myších chondrocytů
Primární myší chondrocyty získané z chrupavčitých segmentů hrudního koše novorozených myší byly týden kultivovány v kompletním kultivačním médiu (DMEM medium, 10% fetální bovinní sérum, 1 % penicilin-streptomycin) do dosažení plné konfluence s výměnou média každé dva dny. Poté byly buňky přeneseny do 12jamkových kultivačních destiček obsahujících starvační médium (DMEM, 0,5% fetální bovinní sérum, 1% penicilin-streptomycin) v množství 200 x 103 buněk na jamku. Po 24hodinové inkubaci ve starvačním médiu bylo médium znovu vyměněno za i) kompletní kultivační médium nebo ii) chondrocytární maturační médium (kompletní kultivační médium, 50 μg/ml kyselina askorbová, 10 mM β-glycerolfosfát). Kultivace vmaturačním médiu probíhala bez přístupu světla jako prevence degradace kyseliny askorbové v médiu. Pro účely testování biologické aktivity stabilního pětibodového mutanta FGF18 5b
- 18 CZ 309550 B6 (L141F+S147P+Q170P+E105G+Q85W) byly chondrocyty kultivovány za standardních kultivačních podmínek (37 °C, 5 % CO2) a stimulovány přídavkem růstového faktoru v koncentraci 1000 ng/ml. Stimulační účinky FGF18 na nezralé chondrocyty (kultivované v kompletním kultivačním médiu) nebo na dozrávající chondrocyty (kultivované v maturačním médiu) byly 5 detekovány pomocí proliferačního testu založeném na metabolické buněčné konverzi nefluorescenčního resazurinu na fluorescenční resorufin, který je detekován při emisní vlnové délce 590 nm po excitaci při 560 nm. Výsledky srovnání proliferační aktivity FGF18 wt (SEQ ID NO. 13) a pětibodového mutanta FGF18 5b jsou ukázány na obrázku 10. Tento příklad ukazuje, že efektivita pětibodového mutanta FGF18 indukovat proliferaci myších chondrocytů je srovnatelná 10 s aktivitou divokého typu FGF18.
- 19 CZ 309550 B6
Claims (13)
1. Polypeptid mající biologickou aktivitu FGF18, a obsahující sekvenci o alespoň 90% sekvenční identitě se sekvencí:
LYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFM (SEQ ID NO. 3) přičemž aminokyseliny vyznačené tučně a podtržením musí být zachovány.
2. Polypeptid podle nároku 1, který má celkovou délku sekvence polypeptidu do 227 aminokyselin, výhodněji do 207 aminokyselin.
3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, obsahující dále alespoň jednu z následujících záměn aminokyselin nebo obě následující záměny aminokyselin:
- záměnu aminokyseliny E v pozici 49 uvedené sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinou G;
- záměnu aminokyseliny Q v pozici 29 uvedené sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinou W.
4. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, dále nesoucí:
- na N-konci sekvence SEQ ID NO. 3 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci MYSAPSACTC LCLHFLLLCF QVQVLVAEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQ (SEQ ID NO. 4), nebo
- na N-konci sekvence SEQ ID NO. 3 aminokyselinu methionin M; a/nebo
- na C -konci sekvence SEQ ID NO. 3 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci KRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSRR IRPTHPA (SEQ ID NO. 5);
a/nebo
- v N- nebo C -terminální části fúzní aminokyselinové sekvence-kotvy v maximální délce až 20 aminokyselin.
5. Polypeptid podle nároku 1, mající nebo obsahující sekvenci o alespoň 90% sekvenční identitě se sekvencí:
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 6) přičemž aminokyseliny vyznačené tučně a podtržením musí být zachovány.
6. Polypeptid podle nároku 5, který má celkovou délku sekvence polypeptidu do 227 aminokyselin, výhodněji do 207 aminokyselin.
7. Polypeptid podle nároku 5 nebo 6, obsahující alespoň jednu z následujících záměn aminokyselin nebo obě následující záměny aminokyselin:
- záměnu aminokyseliny E v poloze 79 uvedené sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinou G;
- záměnu aminokyseliny Q v poloze 59 uvedené sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinou W.
8. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, dále obsahující:
- na N-konci sekvence SEQ ID NO. 6 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci MYSAPSACTC
LCLHFLLLCF QVQVLV (SEQ ID NO. 7), nebo
- na N-konci sekvence SEQ ID NO. 6 aminokyselinu methionin M; a/nebo
- na C-konci sekvence SEQ ID NO. 6 alespoň část sekvence nebo celou sekvenci RIRPTHPA (SEQ ID NO. 8);
a/nebo
- 20 CZ 309550 B6
- v N- nebo C-terminální části fúzní aminokyselinové sekvence - kotvy v maximální délce až 20 aminokyselin.
9. Polypeptid podle nároku 1, mající nebo obsahující sekvenci vybranou z:
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 6);
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAQLLVET DTFGSQVRIK GKETGFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 9);
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAWLLVET DTFGSQVRIK GKETEFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 10);
AEEN VDFRIHVENQ TRARDDVSRK QLRLYQLYSR TSGKHIQVLG RRISARGEDG DKYAWLLVET DTFGSQVRIK GKETGFYLCM NRKGKLVGKP DGTSKECVFI EKVLENNYTA FMSAKYPGWY VGFTKKGRPR KGPKTRENQP DVHFMKRYPK GQPELQKPFK YTTVTKRSR (SEQ ID NO. 11);
přičemž celková délka sekvence polypeptidu je do 227 aminokyselin.
10. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro použití jako léčivo.
11. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro použití pro léčbu poranění chrupavky či kosti, nebo v terapeutické stimulaci růstu vlasů.
12. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 v kosmetice, zejména pro neterapeutickou stimulaci růstu vlasů.
13. Kultivační médium pro kultivaci chondrocytů, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 v rozsahu koncentrací polypeptidu 10 ng/μl až 1000 ng/μl.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-303A CZ309550B6 (cs) | 2021-06-15 | 2021-06-15 | Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-303A CZ309550B6 (cs) | 2021-06-15 | 2021-06-15 | Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2021303A3 CZ2021303A3 (cs) | 2022-12-28 |
| CZ309550B6 true CZ309550B6 (cs) | 2023-04-05 |
Family
ID=84534559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021-303A CZ309550B6 (cs) | 2021-06-15 | 2021-06-15 | Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309550B6 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150299280A1 (en) * | 2012-11-28 | 2015-10-22 | National Institute Of Radiological Sciences | Medical treatment use of cell-membrane-permeable fibroblast growth factor |
| WO2017089016A1 (en) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Masarykova Univerzita | Thermostable fgf2 polypeptide, use thereof |
-
2021
- 2021-06-15 CZ CZ2021-303A patent/CZ309550B6/cs unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150299280A1 (en) * | 2012-11-28 | 2015-10-22 | National Institute Of Radiological Sciences | Medical treatment use of cell-membrane-permeable fibroblast growth factor |
| WO2017089016A1 (en) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Masarykova Univerzita | Thermostable fgf2 polypeptide, use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BUCHTOVA, Marcela, et al. Instability restricts signaling of multiple fibroblast growth factors. Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72.12: 2445-2459, ISSN: 1420-682X. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2021303A3 (cs) | 2022-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100361058B1 (ko) | 골발육촉진성단백질의돌연변이체 | |
| EP2401293B1 (en) | Designer ligands of tgf-beta superfamily | |
| KR102650035B1 (ko) | 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 | |
| CN103998462A (zh) | Wnt组合物及此类组合物的治疗应用 | |
| CN104024273A (zh) | 用于治疗代谢疾病的双功能蛋白 | |
| KR20150087130A (ko) | 지속형 인슐린 및 그 용도 | |
| CN105793277B (zh) | 原毒素-ii变体及其使用方法 | |
| AU2021200400A1 (en) | Protoxin-II variants and methods of use | |
| CN112574982A (zh) | 用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶 | |
| WO2014000042A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TGF-β FAMILY LIGANDS | |
| KR20170134542A (ko) | 프로톡신-ii 변이체 및 사용 방법 | |
| AU2016359722A1 (en) | Thermostable FGF2 polypeptide, use thereof | |
| CN1340102A (zh) | 高肝素结合力的多肽变异体 | |
| EP3636663A1 (en) | Mutant human fgf21 and preparation method and use thereof | |
| CZ309550B6 (cs) | Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití | |
| US20240262878A1 (en) | Photoactivatable gasdermin proteins | |
| CN104039820B (zh) | 用于诱导软骨形成的gdf‑5突变体 | |
| US20220348623A1 (en) | Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11 | |
| KR102404717B1 (ko) | Tgf-베타 슈퍼패밀리의 ab6 패밀리 디자이너 리간드 | |
| EP4183796A1 (en) | Thermostable fgf10 polypeptide or fragment thereof use thereof | |
| KR102631925B1 (ko) | 신규 fgf21 변이체 개발 및 이의 생산기법과 용도 | |
| JP4235708B2 (ja) | カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの活性断片 | |
| Violand et al. | Purification and characterization of progenipoietins produced in Escherichia. coli | |
| KR20190005239A (ko) | Tgf-베타 슈퍼패밀리의 ab6 패밀리 디자이너 리간드를 포함하는 간질환 치료용 조성물 및 그의 이용 |