CN103998462A - Wnt组合物及此类组合物的治疗应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新的Wnt多肽和编码本发明的Wnt多肽的多核苷酸,所述Wnt多肽具有改良的生产特性、溶解度、全身性递送和组织吸收。本发明的Wnt多肽可在治疗上用于例如,预防或治疗肌肉减少和/或促进肌肉肥大和生长的方法中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请基于35U.S.C.§119(e)要求于2011年9月16日递交的美国临时申请第61/535,913号的权益,其通过引用整体并入本文。
关于序列表的申明
与本申请相关的序列表提供了文本格式以代替纸件副本,其在此通过引用并入本说明书中。含有该序列表的文本文件的名称为FATE_109_01WO_ST25.txt。该文本文件大小为76KB,创建于2012年9月10日,并通过EFS-Web电子递交。
发明背景
技术领域
本发明总体涉及Wnt组合物和使用其的治疗方法。本发明的Wnt多肽及其组合物可在治疗上用于,例如通过促进干细胞扩增和肌肉肥大来促进肌肉再生。
相关技术描述
Wnt家族基因编码超过20种富含半胱氨酸的分泌型Wnt糖蛋白,其通过结合至靶细胞上的卷曲(Fzd)受体而发挥作用。卷曲受体为G蛋白偶联受体蛋白家族。所述Wnt家族的不同成员结合至所述Fzd家族的某些成员能够通过几种不同通路中的一种来启动信号转导。在“经典通路”中,信号转导分子蓬乱蛋白(Disheveled)导致糖原合成酶激酶-3(GSK3β)——细胞质丝氨酸-苏氨酸激酶的失活。GSK-3β靶标——β-连环蛋白因而得以稳定并转移至细胞核,在那里其激活特定启动子的TCF(T-细胞-因子)依赖性转录(Wodarz,1998,Dierick,1999)。“非经典的”Wnt通路激活并未得到充分定义,但包括Wnt和Fzd之间的一部分的相互作用,其可激活Ca2+通路信号转导和可能的PI3K信号转导、Rho通路信号转导,以及平面细胞极性(PCP)通路信号转导。
Wnt为分泌型糖蛋白,其作为旁分泌或自分泌信号活跃于几种原始细胞类型中。尽管Wnt蛋白分泌自细胞,但它们被发现为疏水性的,且被认为是通过在保守半胱氨酸残基和保守丝氨酸残基上添加脂质基团而进行了翻译后修饰。人们普遍认为这些脂质修饰对于Wnt蛋白的生物活性和分泌非常重要。然而,在配制过程中当未使用清洁剂时,脂化的Wnt的脂化和低溶解度与低的生产收率有关,并因此对Wnt的临床规模生产提供了独特的挑战。因此,虽然Wnt具有在各种临床情况下用作治疗剂的巨大潜力,由于Wnt的不溶性和相应的作为纯化的生物活性治疗剂的生产不足,Wnt的治疗潜力还有待于充分实现。
因此,本领域需要保留Wnt生物活性的可溶性Wnt多肽、在临床规模上生产所述Wnt的方法,以及应用所述Wnt来促进组织形成、再生、维持和修复的方法。
发明概述
本发明总体上提供新的Wnt组合物和用于通过促进干细胞扩增和肌肉肥大来促进肌肉再生的治疗方法。
在一个实施方案中,本发明部分地包括包含N端缺失的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失去除了一个或多个脂化位点。
在一个具体实施方案中,所述N端缺失包含300个N端氨基酸的缺失。
在另一个具体实施方案中,所述N端缺失包含250个N端氨基酸的缺失。
在又一个具体实施方案中,所述N端缺失包含200个N端氨基酸的缺失。
在又一个具体实施方案中,所述N端缺失包含150个N端氨基酸的缺失。
在一个实施方案中,所述N端缺失去除了一个脂化位点。
在另一个实施方案中,所述N端缺失去除了至少两个脂化位点。
在又一个实施方案中,所述N端缺失去除了所有脂化位点。
在一个相关的实施方案中,所述分离的Wnt多肽还包含一个或多个C端氨基酸的C端缺失。
在另一个相关的实施方案中,所述分离的Wnt多肽还包含至少10个C端氨基酸的C端缺失。
在又一个相关的实施方案中,所述分离的Wnt多肽还包含至少20个C端氨基酸的C端缺失。
在又一个相关的实施方案中,所述分离的Wnt多肽还包含至少50个C端氨基酸的C端缺失。
在一个具体实施方案中,所述分离的Wnt多肽包含具有生物活性的Wnt多肽。
在某个具体的实施方案中,所述分离的Wnt多肽保留了非经典的Wnt信号转导活性。
在相关的具体实施方案中,所述分离的Wnt多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的产品收率。
在又一个具体实施方案中,所述分离的Wnt多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的分泌特性。
在又一个具体实施方案中,所述Wnt多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的稳定性或半衰期。
在各种实施方案中,本发明部分地提供了Wnt融合多肽,其包含根据本文所述实施方案中任一个方案的分离的Wnt多肽。
在一个实施方案中,所述Wnt融合多肽包含Fc结构域。
在另一个实施方案中,所述Wnt融合多肽不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在一个具体实施方案中,相比天然存在的Wnt多肽,所述Wnt融合多肽具有改良的产品收率。
在某个实施方案中,相比天然存在的Wnt多肽,所述Wnt融合多肽具有改良的分泌特性。
在某个具体的实施方案中,相比天然存在的Wnt多肽,所述Wnt融合多肽具有改良的稳定性或半衰期。
在某个另外的实施方案中,所述Wnt融合多肽包含天然信号肽、异源信号肽,或天然和异源信号肽的杂合体。
在另外的某个实施方案中,所述Wnt融合多肽包含选自以下的异源信号肽:CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒信号肽。
在另一个实施方案中,所述异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽或IgGμ信号肽。
在另一个相关的实施方案中,所述Wnt融合多肽包含异源蛋白酶切割位点。
在具体的相关实施方案中,所述异源蛋白酶切割位点选自:烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。
在一个实施方案中,所述Wnt融合多肽包含选自以下的表位标签:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
在各种实施方案中,本发明部分地包括这样的组合物,其包含根据本文公开的实施方案中任一个方案的Wnt多肽,或根据本文公开的实施方案中任一个方案的Wnt融合多肽。
在具体的实施方案中,所述组合物包含药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
在某个实施方案中,所述赋形剂增加了所述组合物的Wnt多肽或Wnt融合多肽的半衰期。
在又一个实施方案中,所述赋形剂增加了所述组合物的Wnt多肽或Wnt融合多肽的稳定性。
在一个实施方案中,本发明部分地包括分离的Wnt7a多肽,其包含:与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有至少80%的同一性的氨基酸序列,并且还包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的至少220个氨基酸的N-端缺失;与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列有至少80%的同一性的氨基酸序列;与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列有至少85%的同一性的氨基酸序列;与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列有至少80%的同一性的氨基酸序列;或包含与SEQ ID NO:3-5中任一序列所示氨基酸序列相同的至少70个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中,分离的Wnt7a多肽包含:与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有至少95%的同一性的氨基酸序列,并且还包含SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的至少220个氨基酸的N端缺失;与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列有至少95%的同一性的氨基酸序列;与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列有至少95%的同一性的氨基酸序列;与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列有至少95%的同一性的氨基酸序列;或包含与SEQ ID NO:3-5中任一序列所示氨基酸序列相同的至少70个连续氨基酸的氨基酸序列。
在某个实施方案中,分离的Wnt7a多肽包含:可与SEQ ID NO:3的序列进行最优比对而产生至少220的相似性得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1;可与SEQ ID NO:3的序列进行最优比对而产生至少e-74的e-值得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1;可与SEQ ID NO:4的序列进行最优比对而产生至少210的相似性得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1;可与SEQ ID NO:4的序列进行最优比对而产生至少e-66的e-值得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1;可与SEQ ID NO:5的序列进行最优比对而产生至少170的相似性得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1;或者,可与SEQ ID NO:5的序列进行最优比对而产生至少e-52的e-值得分的氨基酸序列,比对使用BLOSUM62矩阵进行,空位存在罚分为11,且空位延伸罚分为1。
在具体的实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽还包含一个或多个C端氨基酸的C端缺失。
在某些实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽还包含至少10个C端氨基酸的C端缺失。
在其他实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽还包含至少20个C端氨基酸的C端缺失。
在其他的实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽包含具有生物活性的Wnt7a多肽或保留了Wnt7a生物活性。
在一个实施方案中,根据本文公开的实施方案中任一个方案的分离的Wnt7a多肽保留了非经典的Wnt7a信号转导活性。
在一个具体实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,根据本文所公开的实施方案中任一个方案的分离的Wnt7a多肽具有改良的产品收率。
在某个实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,根据本文所公开的实施方案中任一个方案的分离的Wnt7a多肽具有改良的分泌特性。
在又一个实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,根据本文所公开的实施方案中任一个方案的分离的Wnt7a多肽具有改良的稳定性或半衰期。
在一个实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽包含SEQ ID NO:3-5中任一序列所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续氨基酸。
在某个实施方案中,相比具有SEQ ID NO:2和18-23中任一序列所示氨基酸序列的Wnt多肽,所述分离的Wnt7a多肽具有增加的溶于水溶液的溶解度。
在某个具体的实施方案中,所述分离的Wnt7a多肽结合细胞表面上的卷曲受体。
在又一个具体实施方案中,所述细胞为骨骼肌卫星干细胞。
在另一个实施方案中,相比缺少所述分离的Wnt7a多肽下的卫星干细胞扩增,所述分离的Wnt7a多肽与卷曲受体的结合增加了卫星干细胞扩增。
在又一个实施方案中,Wnt7a融合多肽包含根据本文所公开的实施方案中任一个方案的分离的Wnt7a多肽。
在一个实施方案中,根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a融合多肽包含Fc-结构域。
在另一个实施方案中,Wnt7a融合多肽不具有ADCC或CDC活性。
在某个实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,Wnt7a融合多肽具有改良的产品收率。
在一个具体实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,Wnt7a融合多肽具有改良的分泌特性。
在另一个实施方案中,相比天然存在的Wnt7a多肽,Wnt7a融合多肽具有改良的稳定性或半衰期。
在一些实施方案中,所述Wnt7a融合多肽包含天然信号肽、异源信号肽,或天然和异源信号肽的杂合体。
在一个实施方案中,所述Wnt7a融合多肽包含选自以下的异源信号肽:CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒信号肽。
在一个具体实施方案中,所述异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽或IgGμ信号肽。
在另一个实施方案中,所述Wnt7a融合多肽包含异源蛋白酶切割位点。
在又一个具体实施方案中,所述Wnt7a融合多肽包含选自以下的异源蛋白酶切割位点:烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。
在另外的某个实施方案中,所述Wnt7a融合多肽包含选自以下的表位标签:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
在又一个实施方案中,本发明提供了这样的多核苷酸,其编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽。
在某个实施方案中,本发明提供了这样的载体,其包含编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的多核苷酸。
在某个具体的实施方案中,本发明提供了包含载体的宿主细胞,所述载体包含编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的多核苷酸。
在又一个实施方案中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
在另一个实施方案中,根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽由所述宿主细胞产生。
在一个实施方案中,本发明部分地包括:一种组合物,其包含根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽,或根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a融合多肽;一种多核苷酸,其编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽,或根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a融合多肽;或者,一种载体,所述载体包含编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a多肽或根据本文所公开的实施方案中任一个方案的Wnt7a融合多肽的多核苷酸。
在一个具体实施方案中,所述组合物包含药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
在某个实施方案中,所述组合物可溶于水溶液。
在又一个实施方案中,所述组合物被配制用于注射。
在另一个实施方案中,所述组合物被配制用于以下的一种或多种:静脉内注射、心脏内注射、皮下注射、腹腔内注射或直接注射至肌肉。
在各种实施方案中,所述组合物促进了组织形成、再生、维持或修复。
在具体的实施方案中,所述组织为肌肉。
在相关的实施方案中,所述肌肉为骨骼肌、心肌或平滑肌。
在一个具体实施方案中,所述组合物促进了干细胞扩增。
在另一个实施方案中,所述干细胞为成体干细胞。
在某个实施方案中,所述成体干细胞为卫星干细胞。
在某个另外的实施方案中,所述组合物促进肌肉肥大或预防肌肉萎缩。
在一个实施方案中,本发明部分地包括治疗或预防肌肉减少的方法,其包括将以下物质给予至对象:根据本文所公开的实施方案中任一个方案的截短的Wnt多肽、包含编码根据本文所公开的实施方案中任一个方案的截短的Wnt多肽的多核苷酸的载体,或者根据本文所公开的实施方案中任一个方案的组合物。
在一个实施方案中,所述赋形剂增加了所述组合物的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的半衰期。
在另一个实施方案中,所述赋形剂增加了所述组合物的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的稳定性。在一个具体实施方案中,所述组合物可溶于水溶液。
在又一个实施方案中,所述组合物被配制用于注射。
在一个实施方案中,所述组合物被配制用于以下的一种或多种:静脉内注射、心脏内注射、皮下注射、腹腔内注射或直接注射至肌肉。
在另一个实施方案中,所述对象患有影响肌肉的疾病或病症,或者有患影响肌肉的疾病或病症的风险。
在一个具体实施方案中,所述疾病为退行性疾病。
在另一个具体实施方案中,所述退行性疾病为肌肉萎缩症。
在某个具体的实施方案中,所述肌肉萎缩症选自:杜氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克氏肌肉萎缩症(BMD)、埃-德二氏肌肉萎缩症、兰-迪二氏肌肉萎缩症、面肩胛臂肌肉萎缩症(FSH)、肢-带型肌肉萎缩症、冯·格雷菲-福克斯(von Graefe-Fuchs)肌肉萎缩症、眼咽型肌肉萎缩症(OPMD)、强直性肌肉萎缩症(斯坦纳特病)和先天性肌肉萎缩症。
在又一个具体实施方案中,所述影响肌肉的疾病或病症为消耗性疾病、肌肉衰减、肌肉萎缩、ICU引起的虚弱、长期废用性肌萎缩(prolongeddisuse)、手术引起的虚弱或肌肉退行性疾病。
在又一个具体实施方案中,所述病症是与肌肉废用、长期固定不动(immobilization)、手术引起的虚弱或损伤有关的肌肉萎缩症。
在又一个实施方案中,给予所述组合物可预防肌肉萎缩。
在某个实施方案中,给予所述组合物促进了肌肉肥大。
在一个具体实施方案中,所述肌肉为骨骼肌或心肌。
在一个实施方案中,给予所述组合物促进了卫星干细胞扩增。
附图说明
图1所示为人Wnt多肽和果蝇(Drosophila)多肽WntD的多重比对。
图2所示为Wnt7a和Wnt3a的二级结构预测。A)展示了带有编号(10X)的野生型人Wnt7a的氨基酸序列。显示了ProteinPredict二级结构预测软件结果(Prof sec),其中H=α螺旋,E=折叠,且L=环或当无法确定确切结构时为空白。显示了每个预测的相对置信度分数(Rel Sec),并列出了85%以上置信度的区域(SUB sec)。B)展示了带有编号(10X)的野生型人Wnt3a的氨基酸序列。显示了ProteinPredict二级结构预测软件结果,其中H=α螺旋,E=折叠,且L=环或当无法确定确切结构时为空白。显示了每个预测的相对置信度分数(Rel Sec),并列出了85%以上置信度的区域(SUB sec)。
图3所示为构建具有优选的药物特性的Wnt蛋白。示意图为按实施例1中所述设计和构建Wnt7a蛋白。除了野生型蛋白(wtWnt7a)外,所有蛋白中的信号肽都被突出显示为外源性的。在文本中描述了经设计以产生去脂化蛋白形式的点突变,并在示意图中将其突出显示。显示了截短物和FC-融合物。
图4所示为各种Wnt7a蛋白形式的表达产率。按实施例4中所述表达了Wnt7a蛋白形式。显示了Wnt蛋白修饰和每升哺乳动物细胞培养基的Wnt蛋白产率。
图5所示为各种纯化的Wnt7a蛋白形式的考马斯染色SDS-PAGE凝胶。按实施例4中所述表达并纯化了蛋白。将500ng的各Wnt7a蛋白加样至各泳道:1)可从R&D systems商购的Wnt7a;2)将内源信号序列替换为IgGκ-链信号序列而表达和分泌的全长Wnt7a;3)用IgGκ信号序列突变、去脂化的Wnt7a;4)表达并纯化为Fc-融合蛋白的去脂化Wnt7a;5)表达并纯化为Fc-融合蛋白的Wnt7a氨基酸264-349;6)表达并纯化为Fc-融合蛋白的Wnt7a氨基酸264-349,其中TEV蛋白酶位点位于Wnt和Fc结构域之间,随后经蛋白水解消化并经色谱法净化以制备纯化的Wnt7a氨基酸264-249。以最左侧泳道中的标记显示分子量。
图6所示为Wnt7a在体外诱导了肌纤维肥大。如实施例5中所述,C2C12小鼠成肌细胞分化为肌纤维并经Wnt7a蛋白处理。以制剂对照(添加1%CHAPS的磷酸盐缓冲盐水)与wt Wnt7a对比。
图7所示为Wnt7a蛋白形式的体外肌纤维肥大数据。如实施例5中所述,C2C12小鼠成肌细胞分化为肌纤维并经Wnt7a蛋白处理。对纤维直径进行定量,并显示为来自200个测量值的平均纤维直径。将制剂对照(添加1%CHAPS的磷酸盐缓冲盐水)与wt Wnt7a、wtWnt7a-Fc-融合蛋白或Wnt7a264-349-Fc-融合蛋白对比。在CHAPS清洁剂存在和不存在的情况下测量所有Wnt蛋白。
图8所示为Wnt7a蛋白形式的体外肌纤维肥大数据。如实施例5中所述,C2C12小鼠成肌细胞或原代人抗肌萎缩病(dystrophinopathy)成肌细胞分化为肌纤维并经Wnt7a蛋白处理。对纤维直径进行定量,并显示为来自100个测量值的平均纤维直径。A)制剂对照(添加1%CHAPS的磷酸盐缓冲盐水(PBSC))与wt Wnt7a和小鼠C2C12肌纤维的截短的Wnt7a氨基酸235-349比较。B)将制剂对照(添加1%CHAPS的磷酸盐缓冲盐水(PBSC))与wt Wnt7a和人抗肌萎缩病肌纤维的截短的Wnt7a氨基酸235-349比较。C)截短的Wnt7a氨基酸264-349的剂量反应。
图9所示为各种Wnt7a蛋白的加速的蛋白稳定性评估的定量。各种Wnt7a蛋白形式——(A)wtWnt7a-FC、(B)Wnt7a aa264-349-FC和(C)Wnt7a264-349以相同的蛋白浓度于4℃或37℃孵育0、1、4或7天。评估了3种不同的赋形剂制剂:0.2%CHAPS/PBS、0.05%聚山梨醇酯80(PS80)或仅PBS。用蛋白印迹分析评估剩余的蛋白,然后用像素密度测定法将其转换为剩余蛋白部分相比起始量(时间为0)的值。
图10所示为来自加速的稳定性研究的Wnt7a样品的肌纤维肥大评估。各种Wnt7a蛋白形式以相同的蛋白浓度于4℃或37℃孵育0、1、4或7天。评估了赋形剂制剂0.2%CHAPS/PBS。如实施例5和6中所述,在体外肌纤维肥大测定中评估了剩余蛋白的活性。使用了阴性制剂对照和阳性的可市购的Wnt7a蛋白对照。将A)Wnt7a和Wnt7a-Fc-融合物,以及B)截短的Wnt7a264-349和截短的Wnt7a264-349-Fc-融合蛋白进行比较。
图11所示为来自加速的稳定性研究的Wnt7a样品的肌纤维肥大评估。各种Wnt7a蛋白形式以相同的蛋白浓度于4℃或37℃孵育0、1、4或7天。评估了赋形剂制剂0.05%聚山梨醇酯80(吐温)/PBS。如实施例5和6中所述,在体外肌纤维肥大测定中评估了剩余蛋白的活性。使用阴性制剂对照和阳性的可市购的Wnt7a蛋白对照。将A)Wnt7a和Wnt7a-Fc-融合物,以及B)截短的Wnt7a264-349和截短的Wnt7a264-349-Fc-融合蛋白进行比较。
图12显示Wnt7a蛋白形式并非经典Wnt信号转导通路的激活剂。将pBAR经典Wnt报告系统引入至来自不同组织的四个细胞系中。测定以下每个系对Wnt信号转导的应答:A)A549系、B)KG-1a系、C)NALM-6系,和D)TF-1a系。Wnt3a在所有测定的系中均产生了清楚的荧光素酶报告子应答。全长Wnt7a(FTV500)和截短的Wnt7a aa264-349-Fc融合物(FTV526)没有在任何测定浓度下诱导经典的Wnt报告子。
图13显示Wnt7a在体内诱导了明显的肥大。就其单次注射至C57Bl6小鼠胫骨前肌后诱导肥大的能力,将全长Wnt7a与制剂对照或IGF-1进行比较。A)层粘连蛋白的免疫组织化学染色显示了用制剂对照或Wnt7a处理的肌肉中的纤维横切面。B)针对每个处理组,从每动物1000个值计算了纤维菲雷特(Feret)直径的中值,并绘制了以下每个处理组的中值的动物间均值:对侧的(未处理的)对照、制剂对照、IGF-L或Wnt7a。C)所有的纤维菲雷特直径/处理组均作为群体分析进行标绘,其中标绘了中值和四分位值。D)针对中值、均值和统计显著性(*p≤0.05)的处理组之间的值。
图14显示了Wnt7a aa264-349在体内诱导了明显的肥大。就其单次注射至MDX抗肌萎缩病小鼠模型的胫骨前肌后诱导肥大的能力,将Wnt7a aa264-349-Fc-融合蛋白与Fc-融合物对照进行比较。A)从每动物1000个值计算了纤维菲雷特直径的中值,并绘制了以下每个处理组的中值的动物间均值:对侧的(未处理的)对照、Fc-融合物对照或用或不用CHAPS清洁剂配制的Wnt7a264-349-Fc-融合蛋白。B)所有纤维菲雷特直径/处理组均作为群体分析进行标绘,其中标绘了中值和四分位值。C)针对中值、均值和统计显著性(*p≤0.05)的处理组之间的值。
图15显示了Wnt7a蛋白形式的药代动力学分析。于C57Bl6小鼠中,在单次静脉内给药PK研究中评估了各种Wnt7a蛋白形式。比较了全长Wnt7a(FTV500)、Wnt7a-Fc-融合物(FTV512)、Wnt7a aa264-349片段(FTV529)和Wnt7a aa264-349-Fc-融合蛋白(FTV526)。A)绘制了所示时间点的对小鼠血浆的Wnt7a特异性ELISA。B)显示了排除FTV526后的展开的的数据集。
序列标识说明
SEQ ID NO:1所示为人Wnt7a的cDNA序列。
SEQ ID NO:2所示为由SEQ ID NO:1编码的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3所示为SEQ ID NO:2的氨基酸221-349。
SEQ ID NO:4所示为SEQ ID NO:2的氨基酸235-349。
SEQ ID NO:5所示为SEQ ID NO:2的氨基酸264-349。
SEQ ID NO:6-9所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10-13所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14-17所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18所示为小鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19所示为大鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20所示为鸡Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21所示为斑马鱼Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22所示为猪Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23所示为牛Wnt7a多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24-26所示为用于构建Wnt表达载体的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:27所示为编码CD33信号肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:28所示为由SEQ ID NO:27的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29所示为编码IgGκ信号肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:30所示为由SEQ ID NO:29的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31-32所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33-34所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35-36所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37-38所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39-40所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41-42所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43-44所示为融合多肽的氨基酸序列,所述融合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
发明详述
A.综述
虽然Wnt的翻译后脂化被认为是生物活性和蛋白分泌所必需的,本发明仍部分地提供了新的截短的具有Wnt生物活性的Wnt多肽,包括缺少一个或多个脂化位点的截短形式的Wnt。本发明的多肽保留了Wnt生物活性,因此本发明提供了修饰的Wnt多肽和包含其的组合物以及此类Wnt多肽的治疗应用,所述Wnt多肽或组合物具有改良的类生物药特性,如改良的溶解度、生产、剂型、全身性递送和组织吸收。针对由Wnt多肽的不溶性引起的问题,本发明还提供了新的解决方案,且进一步提供了独创性的Wnt多肽,其适于临床规模上的生产和治疗应用。本发明Wnt多肽的治疗应用包括,例如,促进干细胞扩增、组织形成,以及细胞和/或组织再生、修复或维持。
除非另有明确的说明,本发明的实施可利用本技术领域中以下方面的常规方法:化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞学,为说明的目的其中许多在下文有描述。这类技术在文献中有完整的说明。参见,例如,Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatiset al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月更新);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of ComplexGenomes,(Academic Press,New York,1992);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning(1984);以及Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此均通过引用整体并入本文。
B.定义
除非另有说明,本发明所用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同。尽管在本发明的实施或测试中,可使用任何类似或等同于本文所述的那些的方法和材料,本文描述了组合物、方法和材料的优选实施方案。为本发明的目的对下列术语定义如下。
本文所用冠词是指一个/种或多于一个/种(即,至少一个/种)的所述冠词的语法客体。例如,“元件”是指一个或多于一个的元件。
如本文所用,术语“约(about/approximately)”是指相对于参考的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度,数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化差不多为30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在具体的实施方案中,术语“约(about/approximately)”位于数值前时表示该数值加或减15%、10%、5%或1%的范围。
在本说明书中提及“一个实施方案”、“一实施方案”、“一个具体实施方案”、“一个相关实施方案”、“某个实施方案”、“另一个实施方案”或“又一个实施方案”或其组合是指描述的与该实施方案相关的具体特征、结构或特性包含于本发明的至少一个实施方案中。因此,在整个本说明书的不同地方出现上述词语,并不一定都指相同的实施方案。而且,所述具体特征、结构或特性能以任何合适的方式组合于一个或多个实施方案中。
如本文所用,术语“干细胞”是指未分化的细胞,其能够:(1)长期自我更新,或能够产生原始细胞的至少一个相同拷贝,(2)在单细胞水平上分化为多种且在某些情况下仅为一种特化的细胞类型,以及(3)在体内进行组织的功能性再生。根据它们的发展潜力,将干细胞再分类为:全能干细胞(totipotent)、多能干细胞(pluripotent)、专能干细胞(multipotent)和寡能/单能干细胞(oligo/unipotent)。
如本文所用,术语“成体干细胞(adult stem cell/somatic stem cell)”是指在发育后或发育中的生物体中所发现的干细胞;通常在生物体的特定组织中。可通过细胞分裂进行分裂的成体干细胞为专能干细胞或单能干细胞,其随后进行分化以增加、替代或再生失去的细胞和/或组织。成体干细胞包括但不限于,外胚层干细胞、内胚层干细胞、中胚层干细胞、神经干细胞、造血干细胞、肌肉干细胞、卫星干细胞等。肌肉干细胞是常规上被认为属于单能干细胞的干细胞的实例,其仅产生肌肉细胞。
如本文所用,术语“卫星干细胞”是指产生肌原性细胞谱系例如成肌细胞和肌细胞的成体干细胞类型。在一个实施方案中,所述卫星干细胞为Pax7+/Myf5-肌肉干细胞。在一个具体实施方案中,所述卫星干细胞为骨骼肌干细胞。
如本文所用,术语“祖细胞”是指能够进行自我更新并分化为更成熟细胞的细胞,但其定向(commit)于一种谱系(例如,造血祖细胞定向于血液谱系),然而干细胞不一定受此限制。成肌细胞为祖细胞的实例,其仅能够分化为一种细胞类型,但其本身没有完全成熟或完全分化。成肌细胞可分化为肌细胞。
如本文所用,术语“肌细胞”或“肌纤维”是指肌肉中发现的分化细胞类型。每个肌细胞含有肌原纤维即肌节长链,其为肌肉细胞的收缩单元。有各种特定形式的肌细胞:心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞,其具有本领域已知的各种性能。
如本文所用,术语“自我更新”是指具有产生不变的子细胞以及产生特化细胞类型(潜力)的独特能力的细胞。自我更新能以至少两种方式实现。不对称的细胞分裂产生一个与母细胞相同的子细胞和一个与母细胞不同的子细胞,其为祖细胞或分化细胞。因此,不对称的细胞分裂不增加与母细胞相同的子细胞的数目,但维持母细胞类型的细胞数目。反之,对称的细胞分裂产生两个各自与母细胞相同的子细胞。因此,对称的细胞分裂增加了与母细胞相同的细胞的数目,扩增了母细胞群体。在具体的实施方案中,对称的细胞分裂和细胞扩增例如干细胞群体扩增可互换使用。
如本文所用,术语“分化”是指细胞借以特化为具有特定功能的发育过程,例如,其中细胞获得了不同于原始细胞类型的一种或多种形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定向和末期分化过程。例如,可通过利用本领域技术人员已知的免疫组织化学或其他方法评估或监测生物标记的存在或不存在,评估未分化或分化状态。
如本文所用,术语“谱系定向”是指干细胞借以定向为形成具体限定范围的分化细胞类型的过程。例如,当干细胞在不对称细胞分裂期间产生了祖细胞时,谱系定向就发生了。定向的祖细胞通常能够自我更新或进行细胞分裂。
如本文所用,术语“末期分化”是指细胞最后分化为成熟细胞,即完全分化的细胞。通常末期分化与退出细胞周期和停止增殖有关。
如本文所用,术语“肌肉肥大”是指肌肉大小的增加,并且可包括单根纤维体积的增加和/或肌纤维横截面积的增加,并且还可包括每根肌纤维中细胞核数目的增加。肌肉肥大也可包括整个肌肉的体积和质量的增加;然而,肌肉肥大可能分化自肌肉增生,其形成新肌肉细胞。在一个实施方案中,肌肉肥大是指肌动蛋白和肌球蛋白收缩蛋白的数目增加。
如本文所用,术语“促进”、“增强”、“刺激”或“增加”通常是指相比由媒介物(vehicle)或对照分子/组合物引起的响应,本发明的Wnt多肽或组合物能够产生或引起更大的生理响应(即可测量的下游效应)。一种这类可测量的生理响应包括但不限于,相比不对称的细胞分裂,对称的干细胞分裂的增加,例如,相比正常的、未处理的或对照处理的肌肉细胞,卫星干细胞的增加和/或肌肉肥大的增加。相比天然下发现的Wnt多肽,本发明的Wnt多肽和组合物也可具有“改良的”、“增加的”、“增强的”或“更大的”物理和药代动力学特性。例如,本发明Wnt多肽的生理响应、物理特性或药代动力学特性可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更大。在另一个非限制性实例中,相比天然Wnt,本发明Wnt组合物的独创性Wnt多肽的生理响应、物理特性或药代动力学特性可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更大。“增加的”或“增强的”响应或特性通常为“具有统计学意义的”,并且可包括这样的增加,其相比媒介物(无药剂)或对照Wnt组合物,为1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包含其间的且大于1的所有整数和小数值,例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
如本文所用,术语“保留”、“维持”通常是指本发明的Wnt组合物能够产生或引起生理响应(即可测量的下游效应),其与天然存在的Wnt氨基酸或核苷酸序列的Wnt组合物所产生的响应特性类似。例如,本发明的Wnt组合物展现了Wnt生物活性,并因此保留了Wnt活性。本发明的组合物还能产生生理响应如肌肉肥大,其与天然存在的Wnt多肽所产生的响应特性类似。本发明的产生类似生理响应的Wnt组合物可产生的生理响应为包含天然存在的Wnt氨基酸或核苷酸序列的组合物所产生的生理响应水平的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或约100%。
如本文所用,术语“减少”或“降低”或“减轻”或“减小”或“缩减”通常是指相比媒介物或对照分子/组合物所产生的响应,本发明Wnt组合物能够产生或引起更小的生理响应(即下游效应),例如降低的细胞凋亡。在一个实施方案中,所述降低可为基因表达的降低或通常与细胞活性降低有关的细胞信号转导的降低。“降低”或“减小”的响应通常为“具有统计学意义的”响应,并且可包括这样的降低,其相比媒介物(无药剂)或对照组合物,所产生的响应降低1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包含其间的且大于1的所有整数和小数值,例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
C.Wnt信号转导通路
Wnt信号转导通路是古老且进化上保守的通路,其在发育期间和成体整个一生中调控细胞命运决定、细胞迁移、细胞极性、神经模式形成和器官发生的关键方面。Fzd受体下游的Wnt信号转导通路已被确认包括经典的或Wnt/β-连环蛋白依赖性通路以及非经典的或β-连环蛋白非依赖性通路,其可进一步分为平面细胞极性通路、Wnt/Ca2+通路等。
Wnt蛋白结合至卷曲(Fzd)受体家族的N-端胞外半胱氨酸富集结构域。在人体中有10个Fzd受体。Fzd蛋白是与G-蛋白偶联受体具有拓扑学同源性的7次跨膜蛋白。此外,对于Wnt和Fzd之间的相互作用,还需要共受体来介导Wnt信号转导。例如需要低密度脂蛋白相关的蛋白5/6(LRP5/6)来介导经典的Wnt信号,而受体酪氨酸激酶RYK可能是非经典功能所必需的。另一水平上的Wnt信号转导调控在存在不同数量的分泌的Wnt拮抗剂下发生于胞外环境中。Wnt结合至受体复合体后,信号被转导至胞质磷蛋白蓬乱蛋白(Dsh/Dvl)。Dsh能直接与Fzd相互作用。在Dsh水平上,所述Wnt信号分支成3个主要级联——经典的(β-连环蛋白)、平面细胞极性和Wnt/Ca2+。而且,G-蛋白偶联受体信号转导也可刺激生长和存活通路如PI3K。
1.经典的Wnt信号转导通路
从果蝇(Drosophila)的遗传筛选中首先确认并描述了经典的Wnt信号转导通路,且对苍蝇、蠕虫、青蛙、鱼和小鼠中的深入研究已使得确认了基本的分子信号转导框架。经典的Wnt通路的标志为粘合连接相关蛋白β-连环蛋白的积累并转移至细胞核。在无Wnt信号转导的情况下,胞质的β-连环蛋白被β-连环蛋白分解复合体降解,所述复合体包含轴蛋白(Axin)、腺瘤性结肠息肉(APC)蛋白、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和酪蛋白激酶1α(CK1α)。该复合体内的β-连环蛋白通过CK1α和GSK3β磷酸化将其作为目标,用于泛素化和随后的通过蛋白酶体机制进行的蛋白水解分解。Wnt结合至其由Fzd和LRP5/6组成的受体复合体,通过CK1和GSK3-β诱导了LRP6的双磷酸化,这使得能够将含轴蛋白的蛋白复合体从胞液转移至细胞质膜。Dsh也被募集至所述膜并结合至Fzd,且轴蛋白结合至磷酸化的LRP5/6。在膜上的Fzd/LRP5/6处形成的该复合体,通过轴蛋白的隔离和/或降解引起β-cat稳定。β-连环蛋白转移至细胞核中,在那里其与Lef/Tcf家族成员复合以介导靶基因的转录诱导。
经典的Wnt信号转导影响前部的头结构的形成和神经外胚层模式发生、后部模式发生和尾形成,以及各种器官系统包括心、肺、肾、皮肤和骨等的形成。
2.非经典的Wnt信号转导通路
非经典的通路通常被称为β-连环蛋白非依赖性通路,但其不像经典的通路那样得到充分定义,该通路可进一步分为至少两个不同分支——平面细胞极性通路(或PCP通路)和Wnt/Ca2+通路,其中本文仅详细论述PCP。PCP通路出现于对果蝇的遗传研究,其中发现Wnt信号转导元件包括卷曲蛋白和蓬乱蛋白的突变使上皮结构包括表皮毛发和感觉刚毛方向随机化。已知上皮细胞具有确定的顶部-基底侧极性,但此外它们还沿着上皮层的平面具有极性。该刚性组织决定了结构的方向,包括毛囊的方向、感觉刚毛和眼睛中六角形小眼排列的方向。在脊椎动物中,已表明该组织构成了肌肉细胞、内耳的感觉上皮的静纤毛、毛囊组织的组织和方向,以及经历原肠胚形成的背部中胚层细胞形态和迁移行为的基础。
Wnt信号转导通过独立于LRP5/6的Fzd进行转导,其导致Dsh的激活。Dsh通过Daam1介导Rho的激活,其转而激活Rho激酶(ROCK)。Daam1还通过结合肌动蛋白的前纤维蛋白(Profilin)介导肌动蛋白聚合。Dsh还介导Rac的激活,其转而激活JNK。在原肠胚形成期间,来自Rock、JNK和前纤维蛋白的信号被整合用于细胞骨架改变,以用于细胞极化和运动。
3.肌肉细胞发育中的Wnt信号转导
卫星干细胞为产生肌肉细胞的成体干细胞。成体骨骼肌中的卫星细胞位于其宿主肌纤维的肌纤维膜和基膜之间的小凹陷中。在受到损伤时,如物理创伤、反复锻炼或生病时,卫星细胞被激活而增殖,并产生表达肌原性调控因子(MRF)——MyoD和Myf5的肌原性前体细胞(成肌细胞)群体。在再生的过程中,成肌细胞经历多轮分裂,然后定向于末期分化,与宿主纤维融合或产生新的肌纤维以重建受损组织(Charge和Rudnicki,2004)。在骨骼肌再生过程中,所述卫星干细胞群体通过干细胞亚群得以扩增和维持,从而允许组织的体内平衡和个体寿命期间的多轮再生(Kuang et al.,2008)。卫星干细胞(Pax7+/Myf5-)代表约10%的成体卫星细胞库,并通过不对称的顶部-底部细胞分裂产生子代卫星肌原细胞(Pax7+/Myf5+)。
Wnt信号转导在调控整个胚胎发育的发育程序和调控成体组织的干细胞功能中起着关键作用(Clevers,2006)。Wnt对于轴旁中胚层的胚胎肌原性诱导(Borello et al.,2006;Chen et al.,2005;Tajbakhsh et al.,1998)以及肌肉纤维发育期间的分化控制(Anakwe et al.,2003)是必需的。最近,有人认为Wnt平面细胞极性(PCP)通路与肌节发育中调控肌细胞生长方向有关(Gros et al.,2009)。在成体中,Wnt信号转导被认为对于急性损伤后肌肉组织中成体干细胞的肌原性定向是必需的(Polesskaya et al.,2003;Torrente et al.,2004)。其他研究表明,Wnt/β-连环蛋白信号转导通过激活和募集储备的成肌细胞来调控肌原性分化(Rochat et al.,2004)。此外,成体肌肉中卫星细胞的Wnt/β-连环蛋白信号转导似乎是通过限制Notch信号转导来控制肌原性谱系发展,从而促进分化(Brack et al.,2008)。
最近已确定,在静止的卫星干细胞中,Wnt受体Fzd7被明显地上调。此外,进一步研究揭示,在肌肉再生期间,Wnt7a被表达并通过其受体Fzd7和Vangl2(平面细胞极性(PCP)通路的元件)发挥作用,从而诱导对称的卫星干细胞扩增并有力地促进肌肉再生。
在PCP通路中抑制受体或效应分子例如Fzd7或Vangl2被认为消除了Wnt7a对卫星干细胞的影响(Le Grand et al.,2009)。已经进一步证明,给予脂化的Wnt7a多肽或编码Wnt7a多肽(其随后通过脂化进行翻译后修饰)的多核苷酸,在体内和体外均显著地增加了卫星干细胞的数目,并促进了体内组织形成,导致损伤和患病肌肉组织中的修复和再生增加(LeGrand et al.,2009)。
不希望受到任何具体理论的束缚,预计导致促进损伤和患病肌肉组织中的修复和再生增加Wnt7a作用机制有两条途径:Wnt7a可通过PCP通路刺激肌肉卫星(干)细胞的对称扩增,从而产生随后能够分化为成肌细胞的较大细胞库;其次,通过G-蛋白偶联受体(卷曲蛋白),Wnt7a可刺激成肌细胞和肌纤维中的磷脂酰肌醇3-激酶/Akt(蛋白激酶B)/哺乳动物雷帕霉素靶标(PI3K/Akt/mTOR)通路信号转导,其已被表明能刺激肥大(Bodine et al.,Nature Cell Biology.2001;vol.3;pp.1014-1017;Glass et al.,Nature Cell Biology.2003;vol.5;pp.87-90;Ciciliot and Schiaffino,CurrentPharmaceutical Design.2010;16(8);pp.906-914)。Wnt7a可通过G-蛋白偶联受体卷曲蛋白7发出信号,且该Wnt/Frz相互作用能有助于两种生物效应。
在各种实施方案中,组合物包含修饰的Wnt,尤其是Wnt融合多肽(例如,Fc-融合物)或者缺少N端和/或C端氨基酸的截短的Wnt多肽。本发明的截短的Wnt多肽缺少一个或多个脂化位点,但仍然出人意料地保留了Wnt生物活性、受体结合特异性,并相比脂化的Wnt具有改良的溶解度、生产、全身性递送和组织吸收。在具体的实施方案中,本发明的组合物包含修饰的Wnt7a,尤其是Wnt7a融合多肽或者缺少N端和/或C端氨基酸的截短的Wnt7a多肽,例如,缺少N端至少220个氨基酸的Wnt7a多肽。所述截短的Wnt7a多肽缺少一个或多个脂化位点,但仍然出人意料地保留了Wnt7a生物活性、受体结合特异性,并相比脂化的Wnt具有改良的溶解度、生产、全身性递送和组织吸收。
尽管PI3K/Akt/mTOR通路对于肌肉细胞肥大的重要性已被描述,在肌肉细胞中特异性刺激该通路的治疗挑战,存在促进损伤的和患病的肌肉组织中的修复和再生的明显障碍。利用有效的PI3-激酶活化剂如IGF-1的早期研究在体外产生了肥大,但可能存在“脱靶”的代谢效应(即,IGF-1和PI3K是看家性代谢、生存和代谢过程的关键调控因子)。因此,PI3K/Akt/mTOR通路的肌肉特异性Wnt7a-Fzd7刺激可能性将代表重要和独特的治疗突破。
如下文所进一步详细描述,本发明部分地包括独创性的Wnt多肽,其提供了针对该技术障碍以及应用Wnt多肽治疗来促进损伤和患病肌肉组织中的修复和再生的其他障碍的出人意料的解决方案。
D.多肽
Wnt信号转导通路是细胞信号转导网络的关键元件。人Wnt基因家族由19个成员组成,其以22个或24个Cys残基以及几个保守的Asn和Ser残基编码进化上保守的糖蛋白。示例性人Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。
所述Wnt为分泌型糖蛋白,其在运输和释放至胞外环境前被大幅修饰。在信号序列切割和转移至内质网(ER)后,Wnt通过内膜系统被运输至细胞表面并接受一些修饰。Wnt接受了连接于N端的糖基化(Burrus andMcMahon1995;Kadowaki et al.,1996;Komekado et al.,2007;Kurayoshi etal.,2007;Mason et al.,1992;Smolich et al.,1993;Tanaka et al.2002)。许多Wnt还在第一保守半胱氨酸处被棕榈酰化,例如,Wnt1的C93、Wnt3a的C77和Wnt5a的C104(Galli et al.,2007;Kadowaki et al.,1996;Komekado et al.,2007;Willert et al.2003)。此外,Wnt3a在保守丝氨酸S209处被棕榈油酸修饰,该保守丝氨酸在Wnt1(S224)Wnt5a中也是保守的(Takada et al.,2006)。而且,这些保守的半胱氨酸和丝氨酸残基存在于许多Wnt的N端,例如,Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt9a、Wnt10a和Wnt11等(Takada et al.,2006)。
Wnt酰化被广泛认为导致了分泌的Wnt众所周知的疏水性(Willert etal.,2003)。此外,哺乳动物Wnt的翻译后脂化被认为对发挥功能非常重要。使Wnt1、Wnt3a或Wnt5a的保守N端半胱氨酸突变阻止了细胞培养中的棕榈酰化。这些突变的Wnt能分泌,但被表明具有极少或没有信号转导活性(Galli et al.,2007;Komekado et al.,2007;Kurayoshi et al.,2007;Willert et al.,2003),而未棕榈酰化的Wnt被认为无法结合Fzd受体(Komekado et al.,2007;Kurayoshi et al.2007)。使Wnt3a中心部位的保守丝氨酸突变阻止了棕榈油酸的添加并阻碍了分泌,并由此阻碍了活性(Takada et al.,2006)。对果蝇Wg的研究证明了酰化的重要性(Franch-Marro et al.,2008a;Nusse2003;van den Heuvel et al.,1993)。
此外,这些数据得到果蝇中豪猪(porc)表型的支持,其显示明显丧失了Wg信号转导(van den Heuvel et al.,1993)。Porc是位于ER的整合膜O-酰基转移酶(Kadowaki et al.,1996),其为Wg棕榈酰化(Zhai et al.,2004)和Wg ER排除(Tanaka et al.,2002)所必需。脊椎动物的Porc也促进了Wnt脂化,且是Wnt信号转导和Wnt生物活性所必需(Galli et al.,2007)。
这些研究建立了这样的模型,其中棕榈油酸修饰是分泌所必需,而棕榈酸酯是Fzd结合所必需。因此,缺少用于这些报道的脂质修饰之一或两者的N端氨基酸序列的Wnt多肽预计会缺少生物活性。
在各种实施方案中,本发明部分地包括Wnt多肽例如,截短的Wnt、Wnt融合多肽,其保留了Wnt生物活性,但其经改造而去除了WntN端的翻译后修饰位点,所述位点对溶解度、生产、全身性递送和组织吸收有不良影响。在具体的实施方案中,本发明的Wnt多肽促进干细胞和祖细胞扩增以及肌肉肥大,并促进细胞和/或组织形成、再生、维持和修复。如本文所用,术语“经典的”是指天然存在多肽中存在的氨基酸或氨基酸基团。在一些情形中,当指天然存在多肽中存在的氨基酸时,“经典的”和“天然的”可互换使用。
在某些实施方案中,Wnt多肽为截短的,例如,缺少天然Wnt多肽的N端和/或C端氨基酸。在一些具体的实施方案中,所述Wnt多肽包含N端和/或C端截短,但保留了或具有增加的经典的和/或非经典的Wnt信号转导活性。
如本文所用,除非另有说明,术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用,并依照常规含义,即作为由肽键或修饰的肽键连接的氨基酸序列。如本文其他地方所述,本发明的多肽包括但不限于,截短的多肽、具有生物活性的多肽片段和融合多肽。多肽并不限于特定的长度,例如,它们可包含全长蛋白多肽或全长蛋白多肽的片段,且可包含多肽的翻译后修饰,例如,糖基化、乙酰化、磷酸化等,以及其他本领域已知的天然存在的和非天然存在的修饰。可使用各种熟知的重组和/或合成技术中的任何一种制备本发明的多肽,其示例性实例进一步讨论如下。在一个实施方案中,所述Wnt多肽为截短的Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11或Wnt16多肽。
在另一个实施方案中,所述Wnt多肽为Fc-融合多肽,其包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11或Wnt16多肽的全部或生物活性片段。
在一个优选的实施方案中,所述Wnt多肽为Wnt7a多肽、截短的Wnt7a多肽或Wnt7a Fc-融合多肽,或它们的组合。
如本文所用,术语“Wnt7a多肽”是指Wnt7a蛋白,其具有对应于野生型Wnt7a序列的多肽序列。在一些实施方案中,术语“Wnt7a多肽”是指Wnt7a多肽、截短的Wnt7a多肽、具有生物活性的Wnt7a多肽片段或Wnt7a融合多肽,其具有与参考Wnt7a序列有至少约65%、66%、67%、68%、69%70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%的同一性的Wnt7a氨基酸序列。可针对至少约10、25、50、75、100、125、150、175、200、300个或更多个连续氨基酸进行同一性评估,或者可针对全长序列进行评估。确定%同一性或%同源性的方法为本领域已知,为此目的可使用任何合适的方法。Wnt7a多肽的示例性实例如SEQ ID NO:2-23所示。
然而,在具体的实施方案中,本发明的Wnt多肽经过改造,以便它们包含N端和/或C端缺失或截短,且在具体的实施方案中,所述Wnt多肽包含N端和/或C端缺失或截短,并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在一些实施方案中,所述Wnt多肽包含N端和/或C端缺失或截短,缺少一个或多个脂化位点,并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在具体的实施方案中,所述Wnt多肽为Wnt7a多肽,其包含N端和/或C端缺失或截短,并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在一些实施方案中,所述Wnt7a多肽包含N端和/或C端缺失或截短,缺少一个或多个脂化位点,并保留了非经典的Wnt信号转导活性。
如本文所用,术语“截短的Wnt多肽”或“包含N端和/或C端截短或缺失的Wnt多肽”可互换使用,并指缺少N端或C端氨基酸残基的Wnt多肽或Wnt多肽的生物活性片段或其变体,或者包含一个或多个氨基酸缺失的其同源物、间接同源物或直接同源物。在本发明的具体实施方案中,截短的Wnt多肽包含一个或多个氨基酸缺失,但产生了保留Wnt生物活性的多肽。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽保留了至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%的天然存在的Wnt多肽活性。
如本文所用,术语“N端缺失”和“N端截短”通常可互换使用,并指从多肽中缺失了N-端氨基酸。例如:包含349个氨基酸且具有220个氨基酸的N-端缺失的多肽所产生的多肽,其包含所述所肽的129个C端氨基酸;包含349个氨基酸且具有234个氨基酸的N端缺失的多肽所产生的多肽,其包含所述所肽的115个C端氨基酸;以及包含349个氨基酸且具有263个氨基酸的N端缺失的多肽所产生的多肽,其包含所述所肽的86个C端氨基酸。在具体的实施方案中,根据本发明的Wnt多肽,例如Wnt7a,包含至少220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283或284个N端氨基酸的N端缺失或截短。在具体的实施方案中,包含N端截短的Wnt多肽还将包含一个或多个C端氨基酸截短或缺失。
在具体的实施方案中,根据本发明的Wnt多肽,包含足以消除一个或多个Wnt脂化位点的N端缺失或截短。在某个实施方案中,Wnt多肽包含至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个N端氨基酸的N端缺失。
如本文所用,术语“C端缺失”和“C端截短”通常可互换使用,且是指从多肽缺失一个或多个C端氨基酸。例如:包含349个氨基酸且具有10个氨基酸的C端缺失的多肽所产生的多肽,其包含所述所肽的339个N端氨基酸;以及包含349个氨基酸且具有20个氨基酸的C端缺失的多肽所产生的多肽,其包含所述所肽的329个N端氨基酸。在具体的实施方案中,根据本发明的Wnt多肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个C端氨基酸的C端缺失或截短。在具体的实施方案中,包含C端截短的Wnt多肽还将包含一个或多个N端氨基酸截短或缺失。
在具体的实施方案中,根据本发明的截短的Wnt多肽包含一个或多个N端氨基酸截短和一个或多个C端氨基酸截短,如本文其他地方所述。在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含约10个至约300个N端氨基酸的N-端缺失或截短和约1个至约50个C端氨基酸的C端缺失或截短。
在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含约220个至约284个N端氨基酸的N端缺失或截短和约1个至约50个C端氨基酸的C端缺失或截短。
在一个实施方案中,本发明包括这样的Wnt多肽,其包含含有一个或多个N端氨基酸截短和一个或多个C端氨基酸截短的Wnt多肽的最小生物活性片段,如本文其他地方所述。如本文所用,术语“最小活性片段”或“最小生物活性片段”是指Wnt多肽片段保留了至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%的天然存在的Wnt多肽活性。在具体的实施方案中,本发明包括最小生物活性Wnt片段,其包含Wnt多肽的60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续氨基酸。
在具体的实施方案中,所述天然存在的Wnt多肽活性或Wnt生物活性是非经典的Wnt信号转导活性。在具体的实施方案中,所述Wnt7a生物活性是非经典的Wnt7a信号转导活性。
在另一个实施方案中,提供了最小生物活性Wnt片段,其包含SEQID NO:3所示氨基酸序列的60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续氨基酸。
在具体的实施方案中,Wnt多肽的生物活性片段可为这样的多肽片段,其为本领域已知的、或本文引用或以其他方式公开的Wnt多肽氨基酸序列的例如,30、35、40、45、50、55、60、0、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个连续或非连续氨基酸,包括其间的所有整数(例如,101、102、103)和范围(例如,50-75,75-100,125-150)。在某些实施方案中,具有生物活性的Wnt多肽片段包含经典的活性相关序列、结构域或天然存在的Wnt多肽的基序。在某些实施方案中,根据本发明的Wnt多肽包含一个或多个N端氨基酸截短和一个或多个C端氨基酸截短,如本文其他地方所述。
在具体的实施方案中,Wnt7a多肽的生物活性片段可为这样的多肽片段,其为本文所述Wnt7a多肽中任一多肽所示氨基酸序列的例如,30、35、40、45、50、55、60、0、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续或非连续氨基酸,包括其间的所有整数(例如,101、102、103)和范围(例如,50-75、75-100、100-129)。在某些实施方案中,具有生物活性的Wnt7a多肽片段包含经典的活性相关序列、结构域或天然存在的Wnt7a多肽的基序。在某些实施方案中,根据本发明的Wnt7a多肽包含一个或多个N端氨基酸截短和一个或多个C端氨基酸截短,如本文其他地方所述。
在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含约220个至约284个N端氨基酸的N端缺失或截短,包括其间的所有整数和范围(例如,221、222、223、224、225),以及约1个至约50个C端氨基酸的C端缺失或截短,包括其间的所有整数和范围(例如,1、2、3、4、5),只要所述截短的Wnt7a多肽保留了天然存在的Wnt7a多肽的活性。通常,所述生物活性片段具有不小于约1%、5%、10%、20%、30、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的其所源自的天然存在Wnt7a多肽的活性,如非经典的Wnt信号转导活性。
在一些实施方案中,截短的Wnt多肽,例如具有生物活性的Wnt多肽片段以至少约1%、5%、10%、20%、30、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的天然存在的Wnt多肽与相同细胞结合伴侣的结合亲和力,结合至一个或多个细胞结合伴侣,例如卷曲受体。在一些实施方案中,截短的Wnt多肽对于选定的细胞结合伴侣(尤其是参与经典活动的结合伴侣)的结合亲和力,可为天然存在的Wnt多肽的相应结合亲和力的至少约1.5x、2x、2.5x、3x、3.5x、4x、4.5x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、200x、300x、400x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x或更多倍强(包括其间的所有整数)。
本发明还包括Wnt多肽、截短的Wnt多肽、具有生物活性的Wnt多肽片段和Wnt融合多肽,其包含一个或多个氨基酸突变、添加或替换。在具体的实施方案中,本发明的Wnt多肽包含一个或多个氨基酸突变、添加和/或替换,但其保留或具有增加的Wnt生物活性。优选地,Wnt多肽包含一个或多个氨基酸突变、添加和/或替换,且保留至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%的天然存在的Wnt活性。
本发明还包括Wnt7a多肽、截短的Wnt7a多肽、具有生物活性的Wnt7a多肽片段和Wnt7a融合多肽,其包含一个或多个氨基酸突变、添加或替换。在具体的实施方案中,本发明的Wnt7a多肽包含一个或多个氨基酸突变、添加和/或替换,但其保留或具有增加的Wnt7a生物活性。优选地,Wnt7a多肽包含一个或多个氨基酸突变、添加和/或替换,且保留至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%的天然存在的Wnt7a活性。
如本文所用,术语“天然存在的”是指可在自然界中发现的多肽或多核苷酸序列。例如,天然存在的多肽或多核苷酸序列可为这样的多肽或多核苷酸序列,其在生物体中存在并可从生物体分离,且其没有在实验室中被人为特意修饰。术语“野生型”和“天然存在的”通常可互换使用。
如本文所用,Wnt多肽,例如保留了“天然存在的Wnt活性”、“天然存在的Wnt7a活性”、“正常Wnt活性”或“未修饰的Wnt活性”的Wnt7a、其截短物、其生物活性片段以及Wnt融合多肽,是指修饰的Wnt多肽,例如Wnt7a,其产生的生理响应或其具有的物理或药代动力学特性为相应天然存在的Wnt多肽例如Wnt7a的生理响应或物理或药代动力学特性的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%。在一些实施方案中,本发明的Wnt7a多肽保留了非经典的Wnt信号转导活性。
在本发明的上下文中,截短的多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、其间接同源物、或其直接同源物、或融合多肽,当展示约10%、20%、30%、40%或50%的野生型蛋白活性,优选至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的野生型蛋白活性时,其被认为具有与野生型蛋白至少基本上相同的活性。在具体的实施方案中,所述截短的多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、其间接同源物、或其直接同源物、或融合多肽,展示至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或约100%的野生型蛋白活性。在某些实施方案中,可获得大于野生型活性的活性。
截短的Wnt多肽、具有生物活性的Wnt多肽片段或其变体、或其同源物、其间接同源物、或其直接同源物、或Wnt融合多肽的活性,例如可通过测量其模拟野生型Wnt生物活性的能力来确定,例如,通过刺激所述Wnt信号转导通路如通过促进对称的干细胞扩增或细胞生长,并将所述能力与野生型蛋白的活性进行比较。测量和定征干细胞分裂,例如卫星干细胞分裂,以及细胞生长,例如肌肉肥大的方法为本领域已知。
本发明的截短的多肽可包括多肽变体。如本文所用,术语“变体”是指通过修饰、添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而区别于参考多肽的多肽,如本文其他地方所讨论,以及如本领域所理解。在某些实施方案中,多肽变体通过一个或多个氨基酸替换(例如,1、2、3、4、5个或更多个替换)而区别于参考多肽,所述替换可为保守的或非保守的替换。例如,在各种实施方案中,可在发现于天然存在的Wnt多肽中的任何氨基酸残基中进行一个或多个保守或非保守替换。在其他具体实施方案中,Wnt多肽变体包含一个或多个氨基酸添加、缺失或替换,以便增加Wnt通路信号转导活性,和/或相比天然存在的Wnt多肽,增加本发明Wnt多肽的稳定性、溶解度、全身性递送和/或组织吸收。
为产生这类变体,例如根据表1,本领域技术人员,例如可改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
表1-氨基酸密码子
确定哪个氨基酸残基可被替换、插入或缺失而不丧失生物学或免疫学活性的指导,可使用本领域熟知的计算机程序如DNASTARTM软件来找到。如需要,可进行氨基酸替换以从多肽改变和/或去除功能基团。可选择地,本文公开的蛋白变体中的氨基酸改变可为保守氨基酸改变,即带类似电荷或不带电荷的氨基酸的替换。保守氨基酸改变涉及其侧链相关联的氨基酸家族成员之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为4个家族:酸性的(天冬氨酸盐、谷氨酸盐)、碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸),以及不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被一起分类为芳香氨基酸。参见表2。
表2-保守氨基酸替换
初始残基 | 保守替换 |
Ala(A) | Gly;Ser |
Arg(R) | Lys |
初始残基 | 保守替换 |
Asn(N) | Gln;His |
Cys(C) | Ser |
Gln(Q) | Asn |
Glu(E) | Asp |
Gly(G) | Ala;Pro |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;Gln;Glu |
Met(M) | Leu;Tyr;Ile |
Phe(F) | Met;Leu;Tyr |
Ser(S) | Thr |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe |
Val(V) | Ile;Leu |
其他替换也是允许的,且可根据经验或按照其他已知的保守(或非保守)替换来确定。
在作出这类改变时,可考虑到氨基酸的亲水指数。本领域通常了解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle,1982,通过引用并入本文)。本领域已知,某些氨基酸可被其他具有类似亲水指数或分数的氨基酸替换,且仍然产生具有类似生物活性的蛋白,即仍获得生物功能等效的蛋白。在作出这类改变时,优选替换那些亲水指数在±2以内的氨基酸,尤其优选±1以内的那些,甚至更尤其优选±0.5以内的那些。本领域也了解,可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。
本发明的多肽变体包括糖基化形式、与其他分子的集合性缀合物,以及与非相关化学基团(例如,聚乙二醇化的分子)的共价缀合物。如本领域所知,共价变体可通过将官能基(functionalities)与在所述氨基酸链或者N端或C端残基处发现的基团连接来制备。变体还包括等位变体、种变体和突变蛋白。在某些实施方案中,不影响蛋白功能活性的区域的截短或缺失也是变体。
可通过本领域已知的方法来确定本发明的多肽中对于发挥功能很关键的氨基酸,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells,Science244:1081-1085,1989)。对于配体-受体结合至关重要的位点也可通过结构分析来确定,如结晶化、核磁共振或光亲和标记(Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992和de Vos et al.Science255:306-312,1992)。
某些改变不会显著影响蛋白的折叠或活性。本领域技术人员进行氨基酸替换的数目取决于许多因素,包括以上所述的那些。一般来说,对任何给定多肽的替换数目不会超过50、40、30、25、20、15、10、5或3个。
此外,多肽和/或突变蛋白的聚乙二醇化有望提供改良的特性,如增加的半衰期、溶解度和蛋白酶抗性。聚乙二醇化为本领域所熟知。
序列同一性可用于比较两个多核苷酸或多肽序列的一级结构、描述第一序列相对于第二序列的一级结构,和/或描述序列关系如变体和同源物。当比对最大相关性时,序列同一性测量两个序列中相同的残基。比较多肽序列时,当比对最大一致性时,如果两个序列中的氨基酸序列相同,则两个序列被称为“相同的”,如下所述。可使用计算机实现的算法来分析序列关系。两个或更多个多核苷酸或者两个或更多个多肽之间的序列关系可通过计算这些序列的最佳对齐方式并对比对中的匹配和空位打分来确定,其产生百分比序列同一性和百分比序列相似性。多核苷酸关系也可基于其每个编码的多肽的比较来描述。许多用于序列比较和分析的程序和算法是已知的。
通常,通过在比较窗上比较序列来进行两个序列间的比较,以确定和比较局部区域的序列相似性。如本文所用,“比较窗”是指至少约20个连续位置,通常为30至约75个、40至约50个位置的片段,其中两个序列进行最优比对后,可将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。
当使用确定的氨基酸替换矩阵(例如,BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分进行相似性打分比对时,两个序列被“最优比对”,以便达到这对序列可能的最高分数。氨基酸替换矩阵及其在定量两个序列之间的相似性中的应用为本领域熟知且描述于,例如Dayhoff et al.(1978)Amodel of evolutionary change in proteins.”“Atlas of Proein Sequence andStructure,Vol.5,Suppl.3(ed.M.O.Dayhoff),pp.345-352.Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.和Henikoff et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919。BLOSUM62矩阵(图10)在序列比对方案如GappedBLAST2.0中通常被用作默认的打分替换矩阵。空位存在罚分应用于在一个比对的序列中引入单个氨基酸空位,而空位延伸罚分应用于插入至已开放的空位中的每个额外的空氨基酸位置。比对界定为比对开始和结束的每个序列的氨基酸位置,并且任选地通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位,以便达到可能的最高分数。尽管最佳比对和打分可以手动完成,通过使用计算机实现的比对算法可使该过程更为便利,例如Gapped BLAST2.0,其描述于Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402,且在美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)向公众提供。可使用例如PSI-BLAST来进行最佳比对,包括多重比对,其通过www.ncbi.nlm.nih.gov提供,且描述于Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。
此外,比较序列的最佳比对可通过下述方法进行:Smith andWaterman(1981)Add.APL.Math2:482的局部标识算法、Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA85:2444的相似性查找法、这些算法的计算机实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics ComputerGroup(GCG),575Science Dr.,Madison,WI),或通过目测。在一个实施方案中,可使用BLAST比对工具来评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列片段组成,其分别来自每个待比对的序列。Smith-Waterman或Sellers算法的修改可发现所有通过延伸或修剪无法提高分数的片段对,称为高分片段对(HSPs)。BLAST比对的结果包括统计学测量,以显示仅从偶然可预期到BLAST分数的可能性。
原始分数S,计算自与每个比对的序列相关的空位和替换的数目,其中更高的相似性分数表明为更显著的对齐。替换分数可通过查表来给出(参见PAM,BLOSUM)。
空位分数通常计算为空位开放罚分G和空位延伸罚分L的总和。对于长度为n的空位,空位罚分(gap cost)为G+Ln。根据经验选择空位罚分G和L,但通常选择高数值的G(10-15),例如11,以及低数值的L(1-2),例如1。
比特(bit)分数S'源自原始比对分数S,其中考虑了所用打分系统的统计特征。针对打分系统将比特分数标准化,从而,其可用于比较来自不同查找的比对分数。术语“比特分数”和“相似性分数”可互换使用。比特分数显示该比对有多好;分数越高,对齐越好。
E-值或预期值,描述了具有类似分数的序列通过偶然性在数据库中出现的可能性。其为预期通过偶然性在数据库搜索中出现的具有等于或好于S分数的不同比对的数目的预测。E-值越小,该比对越显著。例如,具有e-117的E值的比对意味着具有类似分数的序列仅凭偶然性非常不可能出现。此外,比对随机对的氨基酸的预期分数需要为负值,否则长的比对将倾向于具有高分数,不论比对的片段是否相关。此外,BLAST算法使用合适的替换矩阵、核苷酸或氨基酸,且对于有空位的比对,使用空位生成和延伸罚分。例如,多肽序列的BLAST比对和比较通常使用BLOSUM62矩阵进行,所用的空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在一个实施方案中,从使用BLOSUM62矩阵进行的BLAST分析报告序列相似性分数,所用的空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在一个具体实施方案中,本文提供的序列同一性/相似性分数是指使用GAP第10版(GCG,Accelrys,San Diego,Calif.)采用以下参数获得的值:采用50的空位权重和3的长度权重以及nwsgapdna.cmp打分矩阵的核苷酸序列%同一性和%相似性;采用8的空位权重和2的长度权重以及BLOSUM62打分矩阵的氨基酸序列%同一性和%相似性(Henikoff andHenikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:10915-10919)。GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J Mol Biol48:443-453的算法查找两个完整序列的比对,其使匹配数目最大化,并使空位数目最小化。
在一个具体实施方案中,所述截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3-5中任一序列的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的BLAST比特分数或序列相似性分数为至少170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、256、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274或275,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在一个具体实施方案中,所述截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3-5中任一序列的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的BLASTe-值分数为至少e-52、e-53、e-54、e-55、e-56、e-57、e-58、e-59、e-60、e-61、e-62、e-63、e-64、e-65、e-66、e-67、e-68、e-69、e-70、e-71、e-72、e-73、e-74、e-75、e-76、e-77、e-78、e-79或e-80,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为220-275,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ IDNO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为e-74至2e-78,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:4的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为210-242,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ IDNO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为e-66至e-69,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:5的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为171-184,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ IDNO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为e-52至3e-52,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为至少220,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为至少e-74,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:4的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为至少210,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为至少e-66,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在某些实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:5的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的相似性分数为至少171,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。在具体的实施方案中,截短的Wnt多肽包含可与SEQ ID NO:3的多肽序列进行最优比对的氨基酸序列,所产生的e-值分数为至少e-52,其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵,空位存在罚分为11,而空位延伸罚分为1。
在另一个示例性方法中,“序列同一性百分比”通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最优比对的序列来确定,其中相比用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失),在所述比较窗中的多肽序列部分可包含20%或更少的,通常5%-15%或10%-12%的添加或缺失(即,空位)。通过以下方式计算所述百分比:确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数,用匹配位置数除以参考序列的总位置数(即,窗的大小),并将该结果乘以100得到序列同一性百分比。
E.融合多肽
在各种实施方案中,本发明部分地包括,融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。在一个实施方案中,所述融合多肽包含截短的Wnt多肽、具有生物活性的Wnt多肽片段和/或这样的肽,其还包含一个或多个氨基酸突变、替换和/或添加,如本文其他地方所述。在一个优选的实施方案中,所述Wnt多肽为Wnt7a。在一个具体实施方案中,所述Wnt多肽为Wnt7a融合多肽,其包含N端和/或C端缺失或截短并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在一些实施方案中,所述Wnt7a多肽为Wnt7a融合多肽,其包含N端和/或C端缺失或截短,缺少一个或多个脂化位点并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在优选的实施方案中,所述融合多肽保留了非经典的Wnt信号转导活性。
在具体的实施方案中,本发明的Wnt融合多肽促进干细胞扩增,并促进细胞和/或组织形成、再生、维持和修复。本发明的Wnt融合多肽用于在人的受损和患病的肌肉组织中促进修复和再生的方法中。
融合多肽可包含在所述蛋白N末端的信号肽,其在翻译同时或翻译后指导所述蛋白、截短的Wnt多肽或具有生物活性的Wnt多肽片段的转移。融合多肽还可包含连接子或间隔子、Fc结构域、一个或多个蛋白酶切割位点,或一个或多个表位标签或其他序列,以便于所述多肽的合成、纯化或产生。
融合多肽和融合蛋白是指本发明多肽被直接或通过氨基酸连接子共价连接至一个或多个异源多肽序列(融合伴侣)。形成所述融合蛋白的多肽通常以C端连接至N端,尽管它们也可以C端连接至C端、N端连接至N端,或N端连接至C端。所述融合蛋白的多肽可为任何顺序。
为基本上任何所需目的,可设计和包含所述融合伴侣,只要它们不给所述多肽的所需活性带来不利影响。例如,在一个实施方案中,可选择融合伴侣以便增加所述蛋白的溶解度,从而促进Wnt多肽的生产和/或纯化,和/或促进Wnt的全身性递送和/或组织吸收。融合多肽可通过化学合成方法制备,或通过两个基团之间的化学连接制备,或者通常可采用其他标准技术制备。在一个实施方案中,Wnt例如Wnt7a融合多肽,包含信号肽和截短的Wnt多肽或具有生物活性的Wnt多肽片段。
在一个具体实施方案中,Wnt例如,Wnt7a融合多肽包含信号肽、如本文其他地方所述的截短的Wnt多肽或具有生物活性的Wnt多肽片段、蛋白酶切割位点和表位标签。
如本文所用,术语“信号肽”是指确保进入分泌途径的先导序列。对于工业化生产分泌蛋白,所述待生产的蛋白需要从宿主细胞或宿主生物体中有效地分泌出来。所述信号肽可为例如,所述待生产蛋白的天然信号肽、异源信号肽,或天然和异源信号肽的杂合体。许多信号肽被用于生产分泌蛋白。
用于本发明融合多肽的信号肽的示例性实例,包括但不限于:CD33信号肽;免疫球蛋白信号肽,例如IgGκ信号肽或IgGμ信号肽;生长激素信号肽;红细胞生成素信号肽;白蛋白信号肽;分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒信号肽,例如轮状病毒VP7糖蛋白信号肽。
在具体的实施方案中,本发明的融合多肽包含蛋白酶切割位点和表位标签,以促进截短的Wnt多肽,例如Wnt7a的纯化和生产。蛋白酶切割位点的位置通常位于所述Wnt多肽C端和表位标签之间,以便于在将所述Wnt递送至细胞或组织前去除异源序列。
可用于本发明融合蛋白的异源蛋白酶切割位点的示例性实例,包括但不限于:烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。
可用于本发明融合蛋白的表位标签的示例性实例,包括但不限于:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
融合蛋白通常可采用标准技术制备。例如,编码所需融合物的多肽元件的DNA序列可分别组装,并连接至合适的表达载体中。编码一个多肽元件的DNA序列的3'端通过或不通过肽连接子连接至编码第二多肽元件的DNA序列的5'端,以便所述序列的阅读框同相(in phase)。这允许翻译为保留了两个多肽元件生物活性的单融合蛋白。
如需要,也可使用肽连接子序列以足够距离分隔所述融合多肽元件,以确保每个多肽折叠为其二级和三级结构。通过使用本领域熟知的标准技术,这样的肽连接子序列被整合至所述融合蛋白。可基于以下因素选择某些肽连接子序列:(1)其采用柔性伸展构象的能力;(2)其采用能够与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力;以及(3)缺少可与多肽功能表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽连接子序列含有Gly、Asn和Ser残基。其他接近中性的氨基酸,如Thr和Ala也可用于连接子序列。可有效用作连接子的氨基酸序列包括公开于以下文献中的序列:Maratea et al.,Gene40:3946(1985);Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:82588262(1986);美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号。所述连接子序列通常可为1至约50个氨基酸长度。当所述第一和第二多肽具有可用于分隔所述功能结构域和防止空间位阻的非必需N端氨基酸区域时,不需要连接子序列。这两个编码序列可直接融合,而无需任何连接子或通过使用由五联体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复1-3次组成的柔性多聚连接子。这样的连接子通过插入至VH和VL之间已被用于构建单链抗体(scFv)(Bird et al.,1988,Science242:423-426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5979-5883)。所述连接子被设计为使得形成单链抗体的可变区的两个β-折叠之间能够正确地相互作用。可使用的其他连接子包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudhary etal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Bird et al.,1988,Science242:423-426)。
通常,多肽、融合多肽(及其编码多核苷酸)和细胞是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸为从其原始环境中去除的多肽或多核苷酸。例如,如本文所用,“分离的肽”或“分离的多肽”等是指在体外将肽或多肽分子从细胞环境和从与所述细胞其他组分的结合中分离和/或纯化出来,即其不大量地与体内物质结合。类似地,如本文所用,“分离的多核苷酸”是指已经被纯化而与在天然存在状态下和它侧接的序列分离,例如,从正常情况下与该片段邻接的序列上脱离的DNA片段。如果,例如多核苷酸被克隆至不是其自然环境的部分的载体中,则多核苷酸被认为是分离的。“分离的细胞”是指获自体内组织或器官且基本上无胞外基质的细胞。优选地,如果其至少约60%纯、至少约70%纯、至少约80%纯、至少约90%纯,更优选地至少约95%纯,以及最优选地至少约99%纯,则多肽、多核苷酸或细胞是分离的。
在具体的实施方案中,多肽可在细胞中或合成性表达为融合蛋白,然后纯化。
在其他实施方案中,一个或多个多肽可在它们于细胞中或合成性制备以后进行融合。通常,根据本领域已知的和本文描述的技术,任选地通过多种生物相容的聚合物或不相关的化学基团,可将在制备出融合物中的单个多肽后再融合的多肽共价地连接或缀合。如本领域所知,可通过将官能基(functionalities)与在氨基酸链或N端或C端残基中发现的基团连接来制备共价变体。此外,非肽聚合物(例如,至少2个共价连接的非肽部分)包括,例如,聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、寡糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解聚合物、脂类聚合物、几丁质、透明质酸及它们的组合物,可作为间隔子或连接子来融合两个或更多个多肽序列。合适的非肽聚合物的实例包括但不限于,PEG、N-(2-羟丙基)甲丙烯酰胺(HPMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯亚胺(PEI)。
如本文所用,术语“获自”是指样品例如,多核苷酸或多肽分离自或源自特定来源如重组宿主细胞。在另一个实施方案中,术语“获自”是指细胞分离自或源自诸如体内组织或器官的来源。
在各种实施方案中,提供了包含截短的Wnt蛋白和Fc结构域的融合多肽。所述Fc结构域可融合至另一多肽例如,连接子多肽或Wnt多肽的N端或C端。所述Fc-融合物可作为分子伴侣:提高蛋白稳定性和溶解度。所述Fc-融合物也可对体内药代动力学特性具有主要影响:通过增加分子量、防止通过肾脏过滤排出以及通过存在于身体的许多细胞上的新生Fc受体来循环该蛋白,延长了该蛋白的半衰期。治疗性抗体和治疗性Fc-融合蛋白可通过刺激或抑制免疫反应来起作用:与效应细胞上Fcγ受体相互作用产生免疫功能如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
4种人IgG同型物(1、2、3和4)以不同的亲和力结合活化性Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受体和补体(C1q)的第一元件,产生极不相同的效应功能。例如,IgG1诱导有效的ADCC和CDC反应,而IgG2和IgG4同种型对于正调控性Fcγ受体具有明显降低的亲和力。因此,当需要特定效应功能时,可使用特定IgG同种型的Fc结构域。当一种免疫反应非治疗上所需时,可使用IgG4亚型Fc或经改造而具有降低的效应功能的其他亚型Fc结构域。产生免疫反应的具体CH2和CH3结构域点突变为本领域所知(Chames2009)。
在具体的实施方案中,融合多肽包含截短的Wnt多肽和Fc结构域。在某些实施方案中,所述Wnt-Fc结构域融合多肽保留了Wnt生物活性,但并不诱导ADCC和CDC反应。所述Fc结构域可获自免疫球蛋白的任何类别——IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。在一些实施方案中,Fc区为野生型Fc区。在一些实施方案中,Fc区为突变的Fc区。在一些实施方案中,Fc区在N末端截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,在铰链结构域)。
在具体的实施方案中,本发明的Wnt融合多肽包含如本文其他地方所述的N端和/或C端截短的Wnt多肽或具有生物活性的Wnt多肽片段以及Fc结构域。在某些实施方案中,本发明的Wnt融合多肽包含如本文其他地方所述的信号肽、N端和/或C端截短的Wnt多肽或具有生物活性的Wnt多肽片段、蛋白酶和Fc结构域。在一些实施方案中,这些Wnt融合多肽包含N端和/或C端缺失或截短,缺少一个或多个脂化位点,并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在优选的实施方案中,这些Wnt-Fc结构域融合蛋白不具有可检测的ADCC或CDC活性。在各种相关的实施方案中,相比天然的Wnt多肽,这些Wnt-Fc结构域融合蛋白保留了Wnt生物活性,并具有改良的生产、分泌和/或稳定性。
在其他实施方案中,本发明的Wnt7a融合多肽包含如本文其他地方所述的N端和/或C端截短的Wnt7a多肽或具有生物活性的Wnt7a多肽片段和Fc结构域。在某些实施方案中,本发明的Wnt7a融合多肽包含如本文其他地方所述的信号肽、N端和/或C端截短的Wnt7a多肽或具有生物活性的Wnt7a多肽片段、蛋白酶和Fc结构域。在一些实施方案中,这些Wnt7a融合多肽包含N端和/或C端缺失或截短,缺少一个或多个脂化位点并保留了非经典的Wnt信号转导活性。在优选的实施方案中,这些Wnt7a-Fc结构域融合蛋白不具有可检测的ADCC或CDC活性。在各种相关的实施方案中,相比天然的Wnt7a多肽,这些Wnt7a-Fc结构域融合蛋白保留了Wnt生物活性并具有改良的生产、分泌和/或稳定性。
F.多核苷酸
本发明还提供了编码本发明Wnt多肽的分离的多核苷酸。在各种实施方案中,本发明部分地包括,编码保留了Wnt生物活性的多肽截断物或具有生物活性的片段或Wnt融合多肽的Wnt多核苷酸,并且在一些实施方案中,其具有增加的Wnt信号转导活性。在具体的实施方案中,本发明的Wnt多核苷酸编码Wnt多肽,其促进干细胞扩增且促进细胞和/或组织形成、再生、维持和修复。
本发明的Wnt多核苷酸适于临床规模上生产Wnt多肽并用于在人的受损和患病肌肉组织中促进修复和再生的方法。在某些实施方案中,Wnt多核苷酸编码Wnt多肽,其缺少一个或多个用于所述Wnt多肽脂化的天然氨基酸。在某些具体的实施方案中,Wnt多核苷酸编码截短的Wnt多肽,其包含一个或多个氨基酸缺失或Wnt多肽或Wnt融合多肽的N端和/或C端截短。在优选的实施方案中,所述Wnt多核苷酸编码Wnt融合多肽或Wnt7a多肽,其包含一个或多个氨基酸缺失或N端和/或C端截短,但保留了或具有增加的Wnt生物活性,如经典的和非经典的Wnt信号转导活性。
可使用本领域已知的方案合成核酸,其描述于Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology211,3-19;Thompson et al.,PCT国际公开第WO99/54459号;Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684;Wincottet al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59-68;Brennan et al.,1998,BiotechnolBioeng.,61,33-45;和Brennan,美国专利第6,001,311号。
通过“核苷酸”是指以N-糖苷键与磷酸化糖连接的杂环含氮碱基。本领域认为核苷酸包括天然(标准的)碱基和本领域熟知的修饰的碱基。这类碱基通常位于核苷酸糖基部分的1’位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸基。核苷酸可在糖、磷酸和/或碱基部分处未经修饰或经修饰,也可互换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等(参见例如,Usman and McSwiggen,同上;Eckstein et al.,PCT国际公开第WO92/07065号;Usman et al.,PCT国际公开第WO93/15187号;Uhlman&Peyman,同上)。有几个本领域已知的修饰的核酸碱基实例,其概述于Limbach et al.,(1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196)。
如本文所用,术语“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指已从特定物种的总基因组DNA分离的DNA分子。因此,编码多肽的DNA片段是指,DNA片段包含一个或多个编码序列,但其已基本上从获得该DNA片段的物种的总基因组DNA分离或纯化出来。术语“DNA片段”和“多核苷酸”包括DNA片段和此类片段的更小的片段以及重组载体,包括例如,质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
本领域技术人员应理解,本发明的多核苷酸序列可包括基因组序列、基因组外的和质粒编码的序列以及更小的改造的基因片段,其表达或可适用于表达蛋白、多肽、肽等。这类片段可为天然分离的、重组的或经人工合成改造的。
本领域技术人员应理解,多核苷酸可为单链的(编码链或反义链)或双链的,且可为DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。其他编码性或非编码性序列可以但不必须存在于本发明的多核苷酸中,且多核苷酸可以但不必须连接至其他分子和/或支持材料。
多核苷酸可包括天然序列(即,编码本发明的多肽或其部分的内源序列),或者可包括该序列的变体或生物学功能等同物。多核苷酸变体可包含一个或多个如本文其他地方所述的替换、添加、缺失和/或插入,优选地,以便变体编码缺少经典的脂化位点,但保留了,且在一些实施方案中具有增加的生物活性如通路信号转导活性的多肽。
还包括与编码本发明多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。在“严格条件下”杂交描述了这样的杂交方案,其中彼此至少具有60%同一性的核苷酸序列保持杂交状态。高度严格的杂交条件是使得探针、引物或寡核苷酸仅能与其靶序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的且各不相同。适度严格条件是这样的条件,其使用比高度严格条件具有较少严格性的洗涤液和杂交条件(Sambrook,1989),以便多核苷酸将与本发明核酸的整体、片段、衍生物或类似物杂交。适度严格条件描述于(Ausubel et al.,1987;Kriegler,1990)。低度严格条件是这样的条件,其使用比适度严格条件具有较少严格性的洗涤液和杂交条件(Sambrook,1989),以便多核苷酸与本发明核酸的整体、片段、衍生物或类似物杂交。低度严格条件,如种间杂交的条件,描述于(Ausubel et al.,1987;Kriegler,1990;Shilo andWeinberg,1981)。
在其他实施方案中,本发明提供分离的多核苷酸,其包含序列的各种长度的连续延伸,所述序列与编码本文所述多肽或融合多肽的多核苷酸相同或互补。例如,本发明提供的多核苷酸编码本发明多肽的至少约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续氨基酸残基。本领域技术人员应理解,由于遗传密码的简并性,有许多核苷酸序列编码如本文所述的多肽,包括经最优化用于人和/或灵长类密码子选择的多核苷酸。此外,也可使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。
可使用多种成熟的已有技术中的任何一种鉴定、制备和/或操作本发明的多核苷酸组合物(通常参见,Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,1989,以及其他类似文献)。
多种表达载体/宿主系统是已知的,并可用于容纳和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于,微生物如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌;用酵母表达载体转化的酵母;用病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒CaMV;烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如,Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统;或哺乳动物细胞系统。
存在于表达载体的“控制元件”或“调控序列”是该载体的非翻译区的那些—增强子、启动子、5'和3'非翻译区—其与宿主细胞蛋白相互作用而进行转录和翻译。所述载体元件通常包括但不限于,下述中的一个或多个:信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、由宿主生物体识别的启动子和转录终止序列。也可使用特定启动信号来实现编码目标多肽的序列的更有效翻译。
可针对其以期望的方式调控插入序列的表达或加工表达的蛋白的能力来挑选宿主细胞株。这类多肽修饰包括但不限于,乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。也可使用切割“前原(prepro)”形式的蛋白的翻译后加工,从而促进正确的插入、折叠和/或功能。示例性哺乳动物宿主细胞如CHO细胞、COS细胞、CV1细胞、小鼠L细胞、小鼠LSL细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、HT1080细胞、BHK-21细胞、HEK293细胞、NIH-3T3细胞、LM细胞、YI细胞、NSO和SP2/0小鼠杂交瘤细胞等、Namalwa细胞、RPMI-8226细胞、Vero细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞或其他永生化和/或转化细胞,其具有针对这类翻译后活性的特定细胞结构和特征机制,可被挑选以确保外来蛋白的高表达以及正确修饰和加工。
采用对产物有特异性的多克隆或单克隆抗体,检测和测量多核苷酸编码产物的表达的多种方案为本领域所知。实例包括酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射免疫检测(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。这些和其他检测法还描述于Hampton et al.,Serological Methods,a LaboratoryManual(1990),以及Maddox et al.,J.Exp.Med.158:1211-1216(1983)等。
用目标多核苷酸序列转化的宿主细胞,可在适于表达和从细胞培养物回收所述蛋白的条件下培养。根据所用的序列和/或载体,由重组细胞产生的蛋白可被分泌或容纳于细胞内。
除了重组生产方法,本发明的多肽及其片段可通过使用固相技术直接进行肽合成来制备(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可使用人工技术或通过自动化来进行蛋白的合成。例如,可使用AppliedBiosystems431A肽合成器(Perkin Elmer)来实现自动化合成。可选择地,可分别化学合成各种片段并用化学方法组合,从而生产全长分子。
G.组合物
在各种实施方案中,本发明部分地包括,Wnt多肽和编码其的多核苷酸的新组合物。如本文其他地方所述,Wnt治疗应用的主要限制或障碍之一是其低溶解度,这使得其无法在临床规模上生产。本发明发明人设计了新的Wnt多肽,相比天然存在的Wnt,其具有增加的溶解度、稳定性、生产、全身性递送和组织吸收,并保留了或具有增加的Wnt生物活性。在具体的实施方案中,本发明提供了可溶性Wnt多肽的水性制剂,以促进干细胞扩增和肌肉肥大,并促进细胞和/或组织形成、再生、维持和修复。
本发明的组合物可包含一种或多种如本文所述的多肽、多核苷酸、包含其的载体等,以及一种或多种药学上可接受的盐、载体、稀释剂、赋形剂和/或生理上可接受的溶液,以用于单独地或与一种或多种其他治疗形式组合给予至细胞或动物。还应理解,如需要,本发明的组合物还可与其他试剂例如,其他蛋白、多肽、分子或各种药物活性剂组合给药。对于也可包含在所述组合物中的其他组分几乎没有限制,条件是其他药剂不会负面地影响所述Wnt组合物的治疗潜力,如所述组合物促进肌肉肥大以及促进组织形成、再生、维持和修复的能力。
“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂,其被美国食品和药物管理局批准为用于人或家养动物为可接受的。
可用作药学上可接受载体的材料的其他示例性实例包括:(1)糖,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石;(8)赋形剂,如可可油和栓剂蜡;(9)油类,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二醇类,如丙二醇;(11)多元醇,如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯类,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)藻酸;(16)无热源水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)pH缓冲液;(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐类;(22)药学上可接受的细胞培养基;以及(23)用于药物制剂中的其他无毒相容物质。
就此而言,在本发明中可使用赋形剂,用于多种目的,如调节制剂的物理、化学或生物学特性,如调节粘度和/或本发明的工艺过程以提高效力和/或使该制剂稳定,以及针对防止由于例如制造、运输、储藏、使用前准备、给药期间及此后产生的压力所造成的降解和损坏的工艺过程。
可获得关于就此有用的蛋白稳定和制剂材料和方法的众多阐述,如Arakawa et al.,“Solvent interactions in pharmaceutical formulations,”PharmRes.8(3):285-91(1991);Kendrick et al.,“Physical stabilization of Proteinsin aqueous solution,”RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEINFORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE,Carpenter and Manning,eds.Pharmaceutical Biotechnology.13:61-84(2002),以及Randolph et al.,“Surfactant-protein interactions,”Pharm Biotechnol.13:159-75(2002),其各自通过其引用全部并入本文,尤其是与赋形剂和加工其以用于本发明的制剂相关的部分,尤其是对于蛋白药物产品和加工用于兽医和/或人医疗应用。
在某些实施方案中,本发明组合物包含选自以下的赋形剂:环糊精及衍生物、纤维素、脂质体、胶束形成剂例如,胆酸,以及聚合物载体例如,聚酯和聚酐。
在具体的实施方案中,组合物尤其是药物蛋白组合物,包含蛋白和溶剂,且进一步包含一种或多种药学上可接受的表面活性剂,优选以下一种或多种:聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨聚糖的其他脂肪酸酯、聚乙氧烯化物和泊洛沙姆188,尤其优选聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80,优选约0.001%-0.1%聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80,非常优选约0.002%-0.02%聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80,尤其是0.002%-0.02%聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。许多其他这类表面活性剂可用于本发明的实施方案中。除此以外还包括以下物质:吐温20,包括但不限于约0.0005%至约0.01%吐温20;胆酸钠,包括但不限于约0.001%至约0.01%胆酸钠;甘胆酸钠(sodium glycholate),包括但不限于约0.001%至约0.01%甘胆酸钠;脱氧胆酸钠,包括但不限于约0.001%至0.01%脱氧胆酸钠;甘氨脱氧胆酸钠,包括但不限于约0.001%至约0.01%甘氨脱氧胆酸钠;CHAPS,包括但不限于约0.001%至约0.01%CHAPS;CHAPSO,包括但不限于约0.001%至约0.01%CHAPSO;Emphigen BB,包括但不限于约0.001%至约0.01%Emphigen BB;SDS,包括但不限于约0.001%至约0.01%SDS;Mega-8,包括但不限于约0.001%至约0.01%Mega-8;Genepol C-100,包括但不限于约0.001%至约0.01%Genepol C-100;Brij35,包括但不限于约0.001%至约0.01%Brij35;Pluronic F-68,包括但不限于约0.001%至约0.01%Pluronic F-68;Pluronic F-127,包括但不限于约0.001%至约0.01%Pluronic F-127;Zwittergent3-12,包括但不限于约0.001%至约0.01%Zwittergent3-12;PEG-8000,包括但不限于约0.001%至约0.01%PEG-8000;PEG-4000,包括但不限于约0.001%至约0.01%PEG-4000;HPCD,包括但不限于约0.001%至约0.1%HPCD;以及Triton X-100,包括但不限于约0.001%至约0.01%Triton X-100。
“药学上可接受的盐”包括酸和碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指保留了游离碱的生物学效力和特性的那些盐,其在生物学上或其他方面并非不利的,且其以无机酸和有机酸形成,所述无机酸诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等,所述有机酸诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、羊蜡酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸(gfiitaricacid)、2-氧-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”是指保留了游离酸的生物学效力和特性的那些盐,其在生物学上或其他方面并非不利的。这些盐是把无机碱或有机碱加入至游离酸酯而制备。衍生自无机碱的盐,包括但不限于,钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐,包括但不限于,伯胺、仲胺和叔胺的盐、取代的胺,包括天然存在的取代的胺、环胺,以及碱性离子交换树脂,如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。尤其优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
“药物组合物”是指本发明的化合物和本领域通常接受的用于将具有生物活性的化合物递送至哺乳动物例如人的媒介。这样的媒介包括用于其的所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
配制组合物的其他方法为本领域技术人员所知,例如,描述于Physicians Desk Reference,第62版,Oradell,NJ:Medical Economics Co.,2008;Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGraw-Hill,2005;Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版,Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000;and The Merck Index,第14版,Whitehouse Station,NJ:Merck ResearchLaboratories,2006;其各自的相关部分以引用的方式并入本文。
在某些情况下,可取的是通过肠胃外给药来递送本文公开的组合物。如本文所用,词语“肠胃外给药”和“肠胃外给予”是指除肠内给药和局部给药以外的给药模式,通常通过注射给药,且包括但不限于,静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮肤内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。参见,例如,美国专利第5,543,158号;美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号(其各自明确地通过引用以其整体并入本文)。
在某些实施方案中,所述组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气雾剂递送载体来递送。通过鼻气溶胶喷剂将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺的方法描述于,例如,美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(其各自明确地通过引用以其整体并入本文)。同样,使用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利第5,725,871号,其明确地通过引用以其整体并入本文)递送药物也为药学领域所熟知。同样,以聚四氟乙烯载体基质形式经粘膜递送药物描述于美国专利第5,780,045号(其明确地通过引用以其整体并入本文)。
H.给药方法
在一个实施方案中,使细胞例如,干细胞如卫星干细胞与包含一种或多种本发明的Wnt多肽和/或多核苷酸的组合物接触。还考虑了本发明的细胞可在体外、离体(ex vivo)或体内进行接触。在其他实施方案中,本发明的Wnt组合物被给予至对象。
本发明的所述组合物可直接给予(作为蛋白/多肽,或对于基因治疗在表达载体的情形下)至对象,或离体递送至源自所述对象的细胞(例如,在离体基因治疗中)。直接体内递送所述组合物通常通过肠胃外注射来实现,例如,皮下、腹膜内、经静脉内心肌、瘤内、瘤周,或注射至组织的间隙空间。其他给药模式包括经口和肺部给药、栓剂和经皮施用、经针和基因枪或无针注射器给药。
本发明的组合物也可通过直接注射给予至组织如肌肉。在本发明的一些实施方案中,本发明的组合物通过将所述组合物直接注射至肌肉组织来给予,从而在注射的肌肉中预防肌肉减少,或促进注射的肌肉再生或修复,例如通过促进注射的肌肉的肌肉细胞扩增或肥大。
通常,递送核酸用于离体和体外应用可通过如下来实现,例如,葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封于脂质体中、将DNA直接显微注射入细胞核,以及病毒如腺病毒(与腺相关病毒)或甲病毒介导,所有这些均为本领域所熟知。
在某些实施方案中,优选的是使用病毒载体或其他体内多核苷酸递送技术来递送一种或多种修饰的Wnt。在一个优选的实施方案中,所述病毒载体为非整合性载体或基于转位子载体。这可使用多种熟知方法中的任何一种来实现,如载体,包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒载体(AAV),或使用其他病毒载体作为表达构建物(包括但不限于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒)。
也可使用非病毒方法来给予本发明的多核苷酸。在一个实施方案中,多核苷酸可通过微注射直接给予至细胞,或通过注射给予至组织,如通过描述于Dubensky et al.,(1984)或Benvenisty&Reshef(1986)的技术。可以设想编码目标基因的DNA也可以类似的方式在体内转移并表达基因产物。
本发明用于将裸DNA表达构建体转移至细胞的另一实施方案可涉及粒子轰击。该方法取决于将包覆有DNA的微弹加速至高速的能力,从而允许它们穿透细胞膜并进入细胞而不杀死细胞(Klein et al.,1987)。在另一个实施方案中,通过电穿孔将多核苷酸给予至细胞。
I.治疗方法
本发明的包括但不限于截短的Wnt7a多肽、具有生物活性的Wnt7a多肽、Wnt7a融合多肽的Wnt多肽和组合物可用于各种治疗应用。例如,本文所描述的组合物和方法可用于促进有需要的对象中的组织形成、再生、修复或维持。
本发明的Wnt组合物的一些相关治疗应用包括需要通过增加肌肉大小、体积或强度来预防肌肉减少或再生减少的或损伤的肌肉组织的情况。这类情况可包括,例如,化疗或放射治疗后、肌肉损伤后,或在治疗或管理影响肌肉的疾病和病症中。在某些实施方案中,所述影响肌肉的疾病或病症可包括尿失禁、消耗性疾病(例如恶病质,其可能与诸如癌症或AIDS的疾病有关)、肌肉衰减或萎缩,或肌肉退行性疾病。肌肉衰减和萎缩可能与例如,肌肉减少症(包括年龄相关的肌肉减少症)、ICU引起的虚弱、肌肉废用(例如由于昏迷无力、受伤或固定不动引起的肌肉费用)、手术引起的虚弱(例如,臀部或膝关节置换手术后)、肌肉退行性疾病(例如,肌肉萎缩)有关。这是不完全的列举。
在某些实施方案中,本发明的多肽和组合物可用于刺激肌肉卫星细胞的对称性扩增,从而增加肌肉组织中固有卫星细胞或定向的前体细胞的比例。所述多肽和组合物也可用于促进肌肉肥大,如通过增加单根肌肉纤维的大小。因此,本发明的多肽和组合物可增加肌肉细胞的数目和肌肉细胞的大小,从而可用于例如,替换损伤的或有缺陷的组织,或预防肌肉萎缩或肌肉质量的减少,尤其是,涉及影响肌肉的疾病和病症的那些,如肌肉萎缩症、神经肌肉性和神经性退行性疾病、肌肉消耗性疾病和病症、萎缩症、心血管疾病、中风、心力衰竭、心肌梗塞、癌症、HIV感染、AIDS等。
在其他实施方案中,所述组合物和方法可用于修复或再生功能失调的骨骼肌,例如,在患有肌肉退行性疾病的对象中。所述对象可能怀疑患有或处于患骨骼肌损伤、退化或萎缩的风险中。所述骨骼肌损伤可为疾病相关的或非疾病相关的。所述人对象可能患有或处于患肌肉退化或肌肉萎缩的风险中。所述肌肉退化或肌肉萎缩可全部或部分由疾病,例如AIDS、癌症、肌肉退行性疾病,或它们的组合引起。
肌肉萎缩的示例性实例,包括但不限于:杜氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克氏肌肉萎缩症(BMD)、强直性肌肉萎缩症(也称斯坦纳特病)、肢-带型肌肉萎缩症、面肩胛臂肌肉萎缩症(FSH)、先天性肌肉萎缩症、眼咽型肌肉萎缩症(OPMD)、远端型肌肉萎缩症和埃-德二氏肌肉萎缩症。参见,例如,Hoffman et al.,N.Engl.J.Med.,318.1363-1368(1988);Bonnemann,C.G.et al.,Curr.Opin.Ped.,8:569-582(1996);Worton,R.,Science,270:755-756(1995);Funakoshi,M.et al.,Neuromuscul.Discord.,9(2):108-114(1999);Lim,L.E.and Campbell,K.P.,Cure.Opin.Neurol.,11(5):443-452(1998);Voit,T.,Brain Dev.,20(2):65-74(1998);Brown,R.H.,Annu.Rev.Med.,48:457-466(1997);Fisher,J.and Upadhyaya,M.,Neuromuscul.Disord.,7(1):55-62(1997)。
在某些实施方案中,提供了如本文所述的组合物在制备用于促进有需要的对象的肌肉形成、维持、修复或肌肉再生的药物的应用。在具体的实施方案中,提供了如本文所述的组合物,以用于制备用于促进有需要的对象的肌肉形成、维持、修复或肌肉再生的药物。所述Wnt多肽可用于预防或治疗肌肉萎缩,如通过增加肌纤维的大小或数目。
所述组合物可按有效量如治疗有效量给予。对于体内治疗人和非人对象,通常将包含有效量的一种或多种修饰的本发明Wnt多肽的组合物给予至所述对象。“有效量”是指能够以需要的剂量和时间段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
本发明Wnt多肽或包含其的组合物的“治疗有效量”可根据以下因素变化,如个体的疾病状态、年龄、性别和体重,以及Wnt多肽在个体中引起所需响应的能力。治疗有效量也是指在其中Wnt多肽的任何毒性或有害效果均被治疗上的有益效果超过的量。术语“治疗有效量”是指Wnt多肽或包含其的组合物有效“治疗”哺乳动物(例如,患者)的疾病或病症的量。
“预防有效量”是指能够以需要的剂量和时间段有效获得所需的预防结果的量。由于预防剂量是在疾病前或疾病早期阶段用于对象,通常但非必须地,所述预防有效量小于所述治疗有效量。
在各种实施方案中,相比未处理的干细胞群体,本发明提供了增加成体干细胞如卫星干细胞的分裂对称性的方法。本文公开的方法还能促进对称的干细胞分裂而不改变干细胞分裂速率,并能促进干细胞群体的生存。所述方法可在体外、离体或体内进行。
在具体的实施方案中,将包含一种或多种修饰的Wnt多肽和/或多核苷酸的组合物在体内给予至有需要的对象。如本文所用,术语“对象”包括当不限于哺乳动物,包括例如,人、非人灵长类(例如,狒狒、猩猩、猴)、小鼠、猪、牛、山羊、狗、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴子、绵羊或其他非人哺乳动物;非哺乳动物,包括例如,非哺乳动物的脊椎动物,如鸟类(例如,鸡或鸭)或鱼,以及非哺乳动物的无脊椎动物。在优选的实施方案中,所述对象为人。需要治疗疾病或病症的对象包括,表现出这类疾病或病症症状的对象,如患有疾病或病症的那些对象以及处在患疾病或病症风险中的那些对象。
在具体的实施方案中,在体内、离体或体外扩增卫星干细胞群体的方法包括,将所述干细胞与有效量的组合物接触,所述组合物包含截短的Wnt7a多肽、具有生物活性的Wnt7a多肽、Wnt7a融合多肽,或者能结合至并激活Fzd7或编码此类Wnt7a多肽的多核苷酸的其直接同源物、其间接同源物或其同系物。
撇开任何具体理论的束缚,据信增加组织中卫星细胞的数目提供了增强的组织再生潜力。
在具体的实施方案中,干细胞在离体或体外被分离或维持并扩增,然后给予至有需要的对象。例如,可在离体或体外培养和扩增干细胞,并与有效量的本发明Wnt组合物接触,然后根据本领域技术人员已知的方法将其作为治疗性干细胞组合物给予至患者。在某些实施方案中,扩增的干细胞群体与治疗性Wnt组合物组合在一起给予至患者。
所述促进干细胞扩增的方法可用于刺激干细胞的离体或体外扩增,从而提供适于移植或给予至有需要的对象的细胞群体。
在一些形式的排尿节制中,可使用本发明的组合物或方法治疗肌肉功能失调,例如,通过直接将蛋白注射至肌肉。因此,在一个实施方案中,所述方法可用于治疗尿失禁。
在进一步的实施方案中,受损或功能失调的肌肉组织可为心肌。例如,所述受损肌肉组织可为由心血管事件如心肌梗塞或心力衰竭引起的心肌受损,其中所述靶干细胞可为心脏干细胞。根据本发明的另一个方面,提供了促进哺乳动物的心脏干细胞扩增或心脏肌肉肥大的方法,包括将有效量的如本文所述的组合物给予至所述哺乳动物。
此外,除了将所述干细胞用于移植,干细胞或包含干细胞的组合物可用作研究工具和/或作为诊断分析或试剂盒的部分。不希望为限制性的,试剂盒可包含肌肉干细胞、一种或多种修饰的Wnt多肽、细胞培养物或生长培养基、细胞低温保藏培养基、一种或多种药学上可接受的递送介质、一种或多种修饰的Wnt多核苷酸序列或遗传构建物、用于将细胞移植或递送至有需要的对象的一种或多种装置、对使用、递送、移植、培养、低温保藏如本文所述细胞或其任何组合的指导。
细胞扩增和/或肌肉肥大的指示物可被可定性或定量地监测,且包括,例如,总形态、总细胞数、组织学、组织化学或免疫组织化学的变化,或者特定细胞标记的存在、不存在或相对水平。细胞标记的存在、不存在或相对水平可通过以下技术来分析,例如,组织化学技术、免疫学技术、电泳、蛋白质印迹分析、FACS分析、流式细胞术等。可选择地,可检测编码所述细胞标记蛋白的基因所表达的mRNA的存在,例如,采用PCR技术、Northern印迹分析、使用合适的寡核苷酸探针等。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和发布的专利均通过引用并入本文,如同每个单个出版物、专利申请或发布的专利均被明确地和单独地说明其通过引用并入本文。
尽管为了清楚理解的目的,上述发明已经以说明和实例的方式相当详细地得以描述,对于本领域技术人员来说容易显而易见的是,基于本发明的教导,在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下,可对其作出一些改变和修改。仅以说明而非限制的方式提供以下实施例。本领域技术人员可容易地理解,各种非关键性参数可被改变或修改而产生基本上相似的结果。
实施例
实施例1
截短的Wnt蛋白的设计
Wnt家族蛋白的长度为300-400个氨基酸,并含有几个包括糖基化和脂化的翻译后修饰。Wnt蛋白的脂化给大规模重组生产、制剂(formulation)和可能的治疗应用带来了挑战。通常公认的是,Wnt的脂化对于其信号转导活性是必需的,尽管该领域大多数研究的完成仅使用了一种同种型(Wnt3a)并仅通过使用一个Wnt信号转导通路(β-连环蛋白依赖性转录激活的经典激活)(Willert et al2003)(Takada2006)。图1显示,半胱氨酸(Wnt7a的Cys73)和丝氨酸(Wnt7a的Ser206)的潜在脂化位点在Wnt家族成员之间是保守的。Wnt7a的信号转导活性,尤其是其非经典的信号转导,甚至当推荐的脂化位点通过诱变为丙氨酸残基而被去除时,仍可维持。在C73A和/或S206A位点构建单个或两个丙氨酸替换,产生了具有适度改良的生产(当在哺乳动物细胞组织培养中表达时)和制剂特征的蛋白,同时其保留了体外和体内活性)。Wnt蛋白被截短为保留活性的活性结构域。所述截短的Wnt允许较高水平的生产且为去脂化的—有助于水溶液中的制剂和稳定性。
使用ProteinPredict软件程序分析了所述Wnt7a氨基酸序列以建立结构基序的预测模型,该软件程序能评估二级结构预测和可能的溶剂可接触性。图2A所示为针对人Wnt7a序列的预测,并突出显示了两个结构域:包含大多数α-螺旋二级结构的N端结构域,以及包含大多数蛋白折叠二级结构的C端结构域。从N端结构域至C端结构域的过渡发生在约残基235至残基265之间。
ProteinPredict二级结构预测程序还用于定征经典的人Wnt3a蛋白。图2B所示为Wnt3a可能的结构域结构,其类似于Wnt7a的结构,具有N端α-螺旋结构和C端蛋白折叠结构。在人Wnt3a中,这两个结构域之间的过渡发生于约残基237-270。预测的C端结构域不含潜在的脂化位点,如之前所绘制。构建了这些结构域的表达盒以评估是否Wnt信号转导活性能保留在所述Wnt蛋白的单个区域内,并同时使对脂质翻译后修饰的需要最小化。该蛋白可有益于蛋白生产、制剂,以及最终的治疗应用和工业应用。
设计了一些表达构建物用于评估构建活性Wnt信号转导分子并同时将氨基酸序列截短为不连续的未脂化结构域的可能性。图3所示为突出显示各种Wnt7a蛋白形式的示意图。图示了潜在脂化位点的丙氨酸替换(Wnt7a C73A和/或S206A)。如以下所述,将几个截短的Wnt构建物置于细菌表达盒中。构建了用于在哺乳动物表达系统中生产的大多数蛋白形式。对于这些形式,内源Wnt7a分泌信号肽被外源信号肽如IgG-κ、CD33或IL2信号肽替换。信号肽可潜在地改善来自哺乳动物表达系统的重组蛋白的分泌效率。
产生以下两种不同C端结构域Wnt的截短物表达于哺乳动物组织培养物中并被检测到:Wnt7a aa235-349和Wnt7a aa264-349。如通过预测所评估,Wnt7a aa264-349包含更明确的结构域,并同时保持有偶数个半胱氨酸残基(12)。Wnt7aaa264-349蛋白表达为融合至人IgG1Fc结构域的蛋白,所述Wnt片段和所述Fc结构域之间的连接子区域中包含或不包含烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别位点。该系统允许所述融合蛋白的有效表达和分泌,以及随后的在特异性TEV识别位点将Wnt7a aa264-349蛋白水解切割。使用亲和层析法清除所得的消化蛋白的Fc结构域、蛋白酶,以及任何残基、未消化的融合蛋白—产生小分子量Wnt264-349氨基酸蛋白片段的纯化的制剂。Wnt7a aa264-349具有11kDa的计算分子量和约17kDa的观察分子量,该差异最可能缘于翻译后的糖基化。
在本实施例中,所述Wnt-Fc融合蛋白包含对所述Fc区具有特异性的以下点突变:E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S。根据所述构建物,这些突变对应于Wnt融合蛋白中的各个位置。此外,这些突变降低了IgG1Fc结构域对于Fcγ受体的亲和力,因此,限制了所述融合蛋白的任何不良免疫激活的可能性。所有实例的序列描述和对应的序列识别如图3和所附的序列表文件所示。
实施例2
截短的Wnt的构建
根据以下方法构建截短的Wnt多肽和包含其的载体。
Wnt的用于细菌表达的载体构建
使用野生型人Wnt7a作为模板进行PCR,构建了包含Wnt7a C端结构域的pET29a(+)表达载体。使用正向引物5’-GCATCATATGGCCGTTCACGTGGAGCCTG-3’(SEQ ID NO:24)和反向引物5’-GCATGCGGCCGCTCACTTGCACGTGTACATCTCC-3’(SEQ IDNO:25)扩增编码Wnt7a的氨基酸235-349的多核苷酸序列。PCR产物经NdeI和Not1限制酶消化并在NdeI和Not1位点之间连接至pET29a(+)载体。使用聚合酶制备所述截短的Wnt7a构建物。
使用野生型人Wnt7a作为模板进行PCR,构建了包含Wnt7a C端结构域的pET28a(+)表达载体。使用正向引物5’-GCATCCATGGCCGTTCACGTGGAGCCTG-3’(SEQ ID NO:26)和反向引物5’-GCATGCGGCCGCTCACTTGCACGTGTACATCTCC-3’(SEQ IDNO:25)扩增编码Wnt7a的氨基酸235-349的多核苷酸序列。PCR产物经NcoI和Not1限制酶消化并在NcoI和Not1位点之间连接至pET28a(+)载体。使用聚合酶制备所述截短的Wnt7a构建物。
实施例3
Wnt融合多肽的构建
根据以下方法构建Wnt融合多肽和包含其的载体。
Wnt的用于哺乳动物表达的载体构建
构建了包含融合至人Wnt7a C端结构域的CD33信号肽的、融合有TEV蛋白酶位点和6HIS标签的pcDNA3.1(+)表达载体。CD33的多核苷酸序列(5’-ATGCCCCTGCTGCTGCTCCTCCCTCTGCTGTGGGCTGGCGCTCTGGCCATGGAT-3’(SEQ ID NO:27))编码氨基酸序列MPLLLLLPLLWAGALAMD(SEQ ID NO:28)),并融合至编码人Wnt7a的氨基酸235-349的多核苷酸序列。将所得构建物克隆至包含TEV蛋白酶位点和6HIS表位序列的pcDNA3.1(+)表达载体。所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
构建了包含融合至Wnt7a C端结构域的IgGκ信号肽的、融合有TEV蛋白酶位点和FLAG标签的pcDNA3.1(+)表达载体。IgGκ的多核苷酸序列(5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3’(SEQ ID NO:29))编码氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO:30)),并融合至编码人Wnt7a的氨基酸235-349的多核苷酸序列。将所得构建物克隆至包含TEV蛋白酶位点和FLAG表位序列的pcDNA3.1(+)表达载体。所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
还制备了下列Wnt7a构建物并将其克隆至哺乳动物细胞表达载体如pcDNA3.1(+):人Wnt7a的Wnt7a aa31-349、Wnt7a aa235-349和/或Wnt7aaa264-349,其组合有编码氨基酸序列MPLLLLLPLLWAGALAMD(SEQID NO:28)的CD33分泌信号肽(5’ATGCCCCTGCTGCTGCTCCTCCCTCTGCTGTGGGCTGGCGCTCTGGCCATGGAT-3’(SEQ ID NO:27)),或编码氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO:30))的IgGκ链分泌型信号肽(5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3’(SEQ ID NO:29))。在没有任何其他标签或融合物的情况下构建这些融合蛋白,以制备SEQ ID NO:33、34、35和36所示的多肽序列。而且,通过添加C端IgG-Fc结构域,构建了同样的截短的Wnt/信号肽融合物。此处所用的特定FC-融合结构域为人IgG1,其具有以下突变以降低效应细胞功能:E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S。这些构建物的截短的Wnt7a-Fc-融合多肽序列如SEQ ID NO:37、38、39和40所示。
使用CD33和IgGκ链外源分泌信号肽并结合Fc-融合物构建了其他截短形式的Wnt7a,但在所述Wnt和所述Fc结构域之间包含有蛋白酶识别位点。这些构建物利用Fc-融合蛋白的改良的表达和纯化,并最终从所述Wnt多肽移除Fc结构域。这些构建物的截短的Wnt7a-Fc融合多肽序列如SEQ ID NO:41、42、43和44所示。
实施例4
Wnt蛋白表达和纯化
活性Wnt蛋白的有效、规模化生产受制于重组系统中相对低的Wnt蛋白表达和分泌加上这些脂化蛋白制剂的挑战的组合。已经在哺乳动物系统中小规模地有效制备活性Wnt,并在有效地将脂化Wnt保持在活性构象的清洁剂和脂质体的存在下进行有效纯化(Willert2008)(Morrel2008)。对于经典的Wnt蛋白的这些研究已完成,而对于非经典的Wnt蛋白的研究则还未完成。然而,脂质体制剂的应用对于治疗生产是个挑战,且使用清洁剂如3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)不一定适于治疗给药。制备了包含外源信号肽的全长Wnt蛋白,希望所述外源信号肽将改善分泌效率。此外,表达了具有外源信号肽和Fc结构域融合物的分泌型和纯化的全长Wnt。还制备了如实施例1-3所述的表达和纯化的Wnt截短物,再次比较了外源信号肽和Fc-融合蛋白的应用。
对于哺乳动物细胞生产,以106个活细胞/ml的细胞密度在293Freestyle无血清培养基中制备了293F悬浮培养物。在具有1μl MirusTransIT Pro试剂/μg载体DNA的Opti-MEM I培养基中,通过1μg Wnt表达载体/ml培养物的脂质体转染对细胞进行瞬时转染。允许形成DNA:脂质体复合体达25分钟,然后加入至293F悬浮培养物中。将转染的细胞于37℃、8%CO2下在定轨振荡器上以130rpm孵育72小时。通过两轮离心收获所述条件培养基,其中一轮以300x g,而另一轮以3000x g离心,然后进行无菌过滤。使用针对WNT或人IgG的Fc结构域的特异性抗体,通过蛋白质印迹法定量条件培养基中的Wnt蛋白。根据被转染的构建物,条件培养基中正常的WNT产率范围为0.9-10μg/mL。采用并行的Sartorius Vivaflow200装置在2.5bar的恒定压力下运行,通过切向流过滤将收获的培养基浓缩5倍。最终的培养基通过0.2μm MilliporeOpticap XL150囊式过滤器进行无菌过滤,并继续进行蛋白纯化步骤。
使用载入至HiTrap Blue HP柱(5mL)的澄清条件培养基纯化无Fc-融合物的野生型Wnt7a和去脂化Wnt蛋白。用25mL的20mM Tris-HCl pH7.5、1%(w/v)CHAPS洗柱,然后用25mL的20mM Tris-HCl pH7.5、1%(w/v)CHAPS、1.5M KCl洗脱。将用抗Wnt7a蛋白质印迹法检测的洗脱级分中的Wnt7a合并,并在2mL结合有抗Wnt7a抗体的Sepharose4FastFlow上进一步纯化。以0.2mL/min速率进行加样,然后用20mL PBS、1%CHAPS洗涤。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.5、150mM NaCl、1%CHAPS洗脱结合的Wnt7a。以预填充有50μL1M Tris-HCl pH9.0的1-mL级分收集洗脱液。用SDS-PAGE分析洗脱级分中的Wnt7a的纯度,并用银染色检测。
使用载入至HiTrap rProtein A FF柱(5mL)的澄清条件培养基纯化融合至人Fc的Wnt7a变体。用40mL PBS、1%CHAPS洗柱。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.5、150mM NaCl、1%CHAPS洗脱结合的融合蛋白。以预填充有0.25mL1M Tris-HCl pH9.0的5-mL级分收集洗脱液。用SDS-PAGE分析洗脱级分中的Wnt7a的纯度,并用考马斯染色检测。
将含有Wnt7a的级分合并,并用Amicon Ultra-15浓缩器浓缩至2mL。最后使用以PBS、1%CHAPS平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare LifeSciences)将浓缩的Wnt7a进行缓冲液交换。以BSA为标准,用Bradford检测测定蛋白浓度。
以这种方式制备的Wnt FC融合蛋白,在表达培养基中和作为纯化后产物均清楚地显示了显著改良的收率(图4)。此外,最小Wnt片段–Wnt7a氨基酸264-349的生产是可行的,且作为FC-融合蛋白产生了高收率。如通过考马斯SDS-PAGE所显示(图5),这些Wnt蛋白还展现出高的纯度水平。
实施例5
Wnt截短物保留了体外生物活性
此前已经表明Wnt7a通过非经典途径(即不通过β-连环蛋白信号转导),最可能通过受体卷曲蛋白7诱导肌肉肥大和干细胞扩增(Le Grand2009)(Von Maltzahn2012)。在培养物中野生型Wnt7a诱导了肌纤维肥大(图6A)。对Wnt7a诱导的肌纤维肥大定量,并以图形展示于图7。
按如下进行体外肥大实验:将所有细胞于37℃、在具有5%CO2的潮湿空气中培养。C2C12细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCCCRL-1772),并维持于涂覆有明胶的组织培养平板上的、添加有20%胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。对于体外肥大检测,将C2C12细胞以2,000细胞/孔接种于涂覆有明胶的96孔平板上。人骨骼肌成肌细胞(HSMM)获自Lonza公司,并维持于涂覆有明胶的组织培养平板上的F10、15%FBS、0.5%鸡胚提取物、0.4μg/ml地塞米松和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子中。对于体外肥大检测,将HSMM以12,000细胞/孔接种于涂覆有明胶的96孔平板上。对于体外肥大检测中的C2C12细胞和HSMM,24小时后将培养基换成添加有2%马血清的DMEM。3天后加入Wnt蛋白,并使其与所述细胞一起再孵育2天。将细胞固定(4%多聚甲醛PBS,10分钟),用0.1%Triton X-100/PBS进行透化,用溶于PBS的10%山羊血清和0.1%Triton X-100封闭,并用小鼠抗slow MyHC和小鼠抗fast MyHC染色。用PBS洗涤细胞,然后用山羊抗小鼠Alexa488染色。用DAPI染色细胞核。使用Axiovision软件进行图像采集和纤维直径测量。使用每孔最少100个直径计数和每个处理2孔的条件来评估不同Wnt蛋白的体外活性。
野生型Wnt7a(wtWnt7a)和Fc融合物(wtWnt7a-FC)均诱导了肥大(图7)。出人意料的是,当作为Fc-融合蛋白(图7)或在从Fc结构域蛋白水解切割后(图8C)使用时,Wnt7a aa264-349也诱导了明显的肥大。较长的C端Wnt7a片段-Wnt7a aa235-349也在小鼠和人成肌细胞包括人原代抗肌萎缩病成肌细胞中诱导了明显的肥大(图8A和8B)。这些结果清楚地表明,甚至在所述蛋白被明显截短而产生出无预测的脂化位点的片段后,仍然保留了Wnt活性。此外,虽然在清洁剂CHAPS中配制时,所有检测的Wnt形式均有活性,但当在无CHAPS的磷酸盐缓冲盐水中配制时,wtWnt7a失去了其大多数的生物活性。当CHAPS被移除后,wtWnt7a-Fc和Wnt7a截短物均保留有活性(图7)。该结果显示了,缺少脂质部分的截短物的对Fc-融合物部分的伴侣活性和增加的水稳定性。
实施例6
截短的Wnt蛋白和Wnt Fc融合蛋白具有改良的稳定性,并能够配制于治疗相关赋形剂中
所有实施例1-4中设计、表达和纯化的Wnt蛋白在-20℃储存和几轮冻融循环后均在肌肉肥大检测中展示了活性。当在清洁剂CHAPS中纯化和配制时,修饰的Wnt蛋白也具有活性。然而,CHAPS并非当前普遍用于治疗性赋形剂的制剂组分。为了评估长期稳定性和在与治疗应用更相关的赋形剂中重新配制所述Wnt蛋白的可能性,进行了加速稳定性研究以及肌纤维肥大活性评估。
于4℃或37℃,通过孵育相同的蛋白浓度0、1、4或7天,评估了各种Wnt7a蛋白形式的蛋白稳定性。评估了3种不同的赋形剂制剂:0.2%CHAPS/PBS、0.05%聚山梨醇酯80(PS80)/PBS或仅PBS。剩余的蛋白使用蛋白质印迹分析进行评估。用像素密度测定法将蛋白质印迹信号转换为表示剩余蛋白级分相比起始蛋白量(时间为0)的值。当于4℃在CHAPS或聚山梨醇酯制剂中孵育时,所有蛋白形式均为稳定的(图9)。然而,当不使用清洁剂于4℃在PBS中延长孵育时,大量的蛋白丢失。此外,在PBS中,仅Wnt7a aa264-349或作为Fc-融合物均比全长Wnt7a-Fc融合物明显更加稳定。该结果表明,Wnt截短物在这些条件下是有利的。
37℃时,在PBS中配制的所有3种蛋白制剂均丢失了蛋白。然而,截短形式的Wnt7a具有比全长蛋白Fc-融合物更高的稳定性。37℃时,在清洁剂存在下,在所有Wnt7a蛋白形式中均随时间发生了蛋白降解,但比仅PBS制剂的降解速度更慢。这些数据清楚地表明,Wnt7a蛋白包括其截短物和融合物,可配制于治疗相关赋形剂如聚山梨醇酯80中,并保留大量的蛋白稳定性。
在加速稳定性测试后,评估了剩余的Wnt7a蛋白活性。于4℃或37℃以相同的蛋白浓度孵育各种形式的Wnt7a蛋白0、1、4或7天。评估了赋形剂制剂0.2%CHAPS/PBS和0.05%聚山梨醇酯80。如实施例5和6中所述,评估了剩余蛋白在体外肌纤维肥大检测中的活性。使用了阴性的制剂对照和阳性的、可市购的Wnt7a蛋白对照。对Wnt7a、Wnt7a-Fc-融合蛋白、截短的Wnt7a aa264-349和截短的Wnt7a aa264-349-Fc-融合蛋白均进行了比较。
当于4℃在任一赋形剂中孵育达7天时,所有检测的蛋白形式均保留了大多数其原始的蛋白活性(图10和11)。然而,当孵育温度为37℃时,全长Wnt7a随时间进程而失去了其大多数活性。此外,当作为Fc-融合蛋白检测时,全长Wnt7a随时间而保留了更多活性,表明Fc结构域稳定了蛋白结构以及因此的活性,证实了图7和实施例5中所显示的结果。截短的Wnt7a片段、Wnt7a aa264-349在两种赋形剂中均随时间进程而保留了肌肉肥大活性,并确证了截短的、非脂化Wnt7a蛋白形式的活性及其用于治疗性开发的改良的特性。因此,治疗相关赋形剂如聚山梨醇酯80可用于配制Wnt蛋白,包括截短的Wnt蛋白。
实施例7
Wnt7a蛋白截短物和融合物蛋白保留了信号转导特异性
有19个人Wnt蛋白和10个卷曲受体和各种共受体,如LRP、ROR、RYK等。已证明Wnt7a通过卷曲蛋白7受体发送信号,驱动非经典的平面细胞极性通路,并通过G-蛋白激活事件来激活PI3-激酶通路(VonMaltzahn2012)。最充分定征的Wnt信号转导通路是经典的Wnt信号转导通路,其中Wnt与卷曲受体和共受体相互作用,引起β-连环蛋白依赖性转录激活,驱动细胞的存活、增殖以及某些情况下的分化。经改造用于治疗性开发和递送的Wnt蛋白应该被设计为保留了其受体和信号转导通路特异性。前述实施例中公开的经改造的截短的、非脂化Wnt蛋白保留了所需的肌肉肥大活性。使用相同的Wnt7a蛋白形式进行了进一步的试验,以排除“脱靶”效果,如激活所述经典通路的。
为了评估这一点,我们使用了非常灵敏的报告子系统——Wnt pBAR报告子。该报告子由连接至驱动萤火虫荧光素酶表达的最小启动子元件的TCF增强子元件的串联体重复组成(Biechele2008)。当转染至哺乳动物细胞系时,该报告子可用于测量对于细胞治疗的经典Wnt活性。使用包含pBAR报告子的一组具有组织特异性的、已有的稳定细胞系,我们检测了用重组Wnt3a阳性对照或Wnt7a变体滴定处理所述细胞时的经典的Wnt信号转导。由图12可知,含有pBAR报告子的4个细胞系被用于检测重组Wnt3a、全长Wnt7a和截短的Wnt7a aa264-349-FC融合物的经典Wnt信号转导活性。尽管Wnt3a在所有检测的细胞系中均诱导了强烈的荧光素酶报告子响应,Wnt7a蛋白处理均没有引起经典的活性。因此,很显然,产生在肌肉肥大、非经典通路中保留有活性的片段的Wnt7a的截短没有获得经典的信号转导活性。
实施例8
Wnt7a截短和融合蛋白保留了体内治疗活性
已表明当通过注射用于体内表达的Wnt表达载体或纯化的蛋白制剂来直接引入至肌肉时,Wnt7a能在啮齿类系统中诱导明显的骨骼肌肥大。体内给予Wnt用于人要求能够在相关的赋形剂中并以高浓度配制所述Wnt–以使注射量最小化。将获得了高蛋白生产水平并具有较高稳定性的Wnt7a Fc-融合物和Wnt截短物配制于治疗相关赋形剂中,并维持了体外活性。所配制的Wnt组合物还保留了体内活性。
在异氟烷的麻醉下,将Wnt7a蛋白注射至暴露的C57Bl6小鼠左后肢胫骨前(TA)肌,所述小鼠具有正常肌肉功能,且抗肌萎缩病的遗传模型C57B/scsn-DmdMdx/J小鼠系同样如此。切口位点用外科粘合剂封闭,然后将动物保养3周。3周结束后处死动物,并将TA肌切除、称重,并通过包埋于最适切割温度(OCT)包埋剂中为组织学评估做准备。将冷冻的TA肌以14μm切片,并在纯乙醇中固定5分钟。在0.1%Triton-X100/PBS中将切片透化20分钟。用50:50MOM封闭剂和10%山羊血清/PBS封闭切片,然后用抗Pax7抗体和/或抗层粘连蛋白抗体进行免疫染色。用PBS洗涤后,用山羊抗小鼠Alexa555抗体和山羊抗兔Alexa488抗体孵育切片。最后,用DAPI孵育切片,用PBS洗涤,并用Fluoromount-G封片。使用Axiovision软件进行图像采集,并用Image J软件完成用于最小菲雷特直径测量(最小纤维直径测量)的图像分析。对于每只动物,产生最少1000根纤维的菲雷特值,并计算中值。表示了每个处理组的中值的动物间均值,以及每个处理组的累加纤维群变化(fiber population shift)。
相比制剂对照注射和来自相同动物的未处理对侧肌肉,单独注射2.5μg Wnt7a蛋白在C57Bl6小鼠TA肌中诱导了明显的肌肉肥大(图13)。所述肥大效果相当于等量的已知的肥大因子IGF-L。通过分析来自每个处理组的所测肌纤维整体,很明显该效果是由于纤维直径中值的增加,即大多数肌肉受到影响。
还在体内肌肉肥大检测中测定了截短的Wnt7a aa264-349。将2.5μgWnt7a Fc-融合蛋白注射至抗肌萎缩病MDX小鼠模型的TA肌。3周后,相比Fc-融合物对照蛋白,观察到明显的肥大(图14)。甚至当在碱性磷酸盐缓冲盐水制剂中给予所述Wnt片段时,其仍诱导了肥大。因此,很明显Wnt7a成功地被片段化和/或融合至Fc结构域,从而提高了生产、制剂和给药参数,且仍然保留了体外和体内活性。
实施例9
Wnt截短物和Fc-融合蛋白的改良的药代动力学特性
Wnt是通过局部、旁分泌或梯度信号转导电位来驱动细胞过程以及组织发育和重塑的分泌蛋白。为了充分利用Wnt蛋白的治疗潜力,不管是作为细胞和组织再生过程的激动剂,或者是作为异常的营养性和肿瘤形成性生长的抑制剂,都需要相比对应的天然、未修饰的Wnt蛋白具有增强的全身递送潜力的蛋白形式。
进行了药代动力学分析,以评估本发明的截短的Wnt7a和Wnt7a Fc-融合蛋白的全身递送潜力。进行了药代动力学分析,以评估所述截短的Wnt7a和Wnt7a Fc-融合蛋白的全身递送潜力。在C57Bl6小鼠中进行各种Wnt蛋白的快速灌注静脉注射。在48小时的多个时间点进行系列血液抽取。将血液采集于EDTA中并处理为血浆。使用夹心ELISA检测评估血浆样品的Wnt7a蛋白。针对来自所述蛋白C端区的肽,产生了用于检测Wnt7a的抗体,并预先优化以用于检测所有经改造的和截短形式的Wnt7a蛋白。将未修饰的多克隆抗体用作涂覆(coating)抗体,并将识别Wnt7a蛋白不同区的生物素化多克隆抗体用于检测。用未修饰的Wnt7a抗体涂覆平板过夜,然后用脱脂奶粉封闭。在与测试样品相同的媒介中稀释纯化的Wnt7a蛋白变体,并加入(spike)阴性对照小鼠血浆以建立标准浓度曲线。将标准物和测试样品加入至平板并孵育1小时。每个步骤之间都进行洗涤,将生物素化Wnt7a抗体加入至所述平板,然后加入缀合有中性亲和素(neutravidin)的辣根过氧化物酶。通过加入TMB试剂将ELISA继续10分钟,然后加入硫酸。在分光光度计上读取450nm处的吸光度,并用Softmax软件分析数据。进行了全身半衰期的比较评估。
给予50μg全长Wnt7a(约2mg/kg),并给予等摩尔量的其他Wnt变体。如所预期的,全长Wnt7a蛋白(FTV500)仅在第一时间点(给予后30分钟)被全身性检测到,此后则未检出(图15)。当作为Fc-融合蛋白(FTV512)给予时,Wnt7a的半衰期明显提高。分子量显著增加和Fc-结构域通过新生Fc受体促进保留和循环的可能性,是有助于增加半衰期的可能因素。然而,Wnt7a-Fc融合物的半衰期仍然相对较短。
出人意料的是,相比全长Fc融合蛋白,包含氨基酸264-349(FTV529)的非常低分子量(计算值11KDa)的Wnt7a截短物表现得同样好,其在2小时的时间点时可清楚检测到,表明这种蛋白形式更易于全身递送。相比全长Wnt7a,表达为Fc-融合蛋白的Wnt7a aa264-349截短物显示了最显著的全身性半衰期延长,其在30分钟的时间点具有6倍大的检测,且在8小时的时间点时相对于背景具有清晰的检测。
因此,本分析清楚地表明,经改造的Wnt蛋白具有改良的全身半衰期,且具有活性的C端片段(氨基酸264-349)Fc-融合蛋白的性能优于其他蛋白的性能。
一般来说,在所附权利要求中,所用术语不应解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中公开的具体实施方案,而应解释为包括连同这些权利要求所赋予的等效物的完整范围的所有可能的实施方案。因此,权利要求并不限于本公开。
Claims (95)
1.包含N端缺失的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失去除了一个或多个脂化位点。
2.根据权利要求1所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失包含300个N端氨基酸的缺失。
3.根据权利要求1所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失包含250个N端氨基酸的缺失。
4.根据权利要求1所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失包含200个N端氨基酸的缺失。
5.根据权利要求1所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失包含150个N端氨基酸的缺失。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失去除了一个脂化位点。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失去除了至少两个脂化位点。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述N端缺失去除了所有脂化位点。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述分离的Wnt多肽还包含一个或多个C端氨基酸的C端缺失。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述分离的Wnt多肽还包含至少10个C端氨基酸的C端缺失。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述分离的Wnt多肽还包含至少20个C端氨基酸的C端缺失。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述分离的Wnt多肽还包含至少50个C端氨基酸的C端缺失。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述多肽包含具有生物活性的Wnt多肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述多肽保留了非经典的Wnt信号转导活性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的产品收率。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的分泌特性。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的Wnt多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的稳定性或半衰期。
18.Wnt融合多肽,其包含权利要求1-17中任一项所述分离的Wnt多肽。
19.根据权利要求18所述的Wnt融合多肽,其包含Fc结构域。
20.根据权利要求19所述的Wnt融合多肽,其中所述多肽不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
21.根据权利要求19所述的Wnt融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的产品收率。
22.根据权利要求19所述的Wnt融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的分泌特性。
23.根据权利要求19所述的Wnt融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt多肽具有改良的稳定性或半衰期。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的Wnt融合多肽,其包含天然信号肽、异源信号肽,或天然和异源信号肽的杂合体。
25.根据权利要求24所述的Wnt融合多肽,其中所述异源信号肽选自:CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒信号肽。
26.根据权利要求25所述的Wnt融合多肽,其中所述异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽或IgGμ信号肽。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的Wnt融合多肽,其包含异源蛋白酶切割位点。
28.根据权利要求27所述的Wnt融合多肽,其中所述异源蛋白酶切割位点选自:烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。
29.根据权利要求18-28中任一项所述的Wnt融合多肽,其包含选自以下的表位标签:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
30.组合物,其包含权利要求1-17中任一项所述的Wnt多肽或权利要求18-29中任一项所述的Wnt融合多肽。
31.根据权利要求30所述的组合物,其包含药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
32.根据权利要求31所述的组合物,其中赋形剂增加了所述组合物的Wnt多肽或Wnt融合多肽的半衰期。
33.根据权利要求31所述的组合物,其中赋形剂增加了所述组合物的Wnt多肽或Wnt融合多肽的稳定性。
34.分离的Wnt7a多肽,其包含:
(a)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且还包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的至少220个氨基酸的N端缺失;
(b)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列;
(c)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列;
(d)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列;或
(e)包含与SEQ ID NO:3-5中任一序列所示氨基酸序列相同的至少70个连续氨基酸的氨基酸序列。
35.根据权利要求34所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述分离的Wnt7a多肽还包含一个或多个C端氨基酸的C端缺失。
36.根据权利要求34所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述分离的Wnt7a多肽还包含至少10个C端氨基酸的C端缺失。
37.根据权利要求34所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述分离的Wnt7a多肽还包含至少20个C端氨基酸的C端缺失。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽包含具有生物活性的Wnt7a多肽。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽保留了非经典的Wnt7a信号转导活性。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的产品收率。
41.根据权利要求34-39中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的分泌特性。
42.根据权利要求34-39中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的稳定性或半衰期。
43.根据权利要求34所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽包含SEQ ID NO:3-5中任一序列所示的氨基酸序列。
44.根据权利要求34所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128或129个连续氨基酸。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述分离的Wnt7a多肽相比具有SEQ ID NO:2和18-23中任一序列所示氨基酸序列的Wnt多肽,具有增加的水溶液溶解度。
46.根据权利要求34-45中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述分离的Wnt7a多肽结合细胞表面上的卷曲受体。
47.根据权利要求34-46中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽保留了非经典的Wnt信号转导活性。
48.根据权利要求34-47中任一项所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述多肽未被脂化并且保留了非经典的Wnt信号转导活性。
49.根据权利要求46所述的分离的Wnt7a多肽,其中所述细胞为骨骼肌卫星干细胞。
50.根据权利要求46所述的分离的Wnt7a多肽,其中相比缺少所述分离的Wnt7a多肽下的卫星干细胞扩增,所述分离的Wnt7a多肽与卷曲受体的结合增加了卫星干细胞扩增。
51.Wnt7a融合多肽,其包含权利要求34-50中任一项所述的分离的Wnt7a多肽。
52.根据权利要求51所述的Wnt7a融合多肽,其包含Fc结构域。
53.根据权利要求52所述的Wnt7a融合多肽,其中所述肽不具有ADCC或CDC活性。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的产品收率。
55.根据权利要求51-53中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的分泌特性。
56.根据权利要求51-53中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其中所述多肽相比天然存在的Wnt7a多肽具有改良的稳定性或半衰期。
57.根据权利要求51-56中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其包含天然信号肽、异源信号肽,或天然和异源信号肽的杂合体。
58.根据权利要求57所述的Wnt7a融合多肽,其中所述异源信号肽选自:CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒信号肽。
59.根据权利要求57所述的Wnt7a融合多肽,其中所述异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽或IgGμ信号肽。
60.根据权利要求51-59中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其包含异源蛋白酶切割位点。
61.根据权利要求60所述的Wnt7a融合多肽,其中所述异源蛋白酶切割位点选自:烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。
62.根据权利要求51-61中任一项所述的Wnt7a融合多肽,其包含选自以下的表位标签:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
63.多核苷酸,其编码权利要求34-50中任一项所述的Wnt7a多肽或权利要求51-62中任一项所述的Wnt7a融合多肽。
64.载体,其包含权利要求63所述的多核苷酸。
65.宿主细胞,其包含权利要求64所述的载体。
66.根据权利要65所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞或细菌细胞。
67.由权利要66所述的宿主细胞产生的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽。
68.组合物,其包含:权利要求34-50中任一项所述的Wnt7a多肽或权利要求51-62中任一项所述的Wnt7a融合多肽;编码权利要求34-50中任一项所述的Wnt7a多肽或权利要求51-62中任一项所述的Wnt7a融合多肽的多核苷酸;或者含有编码权利要求34-50中任一项所述的Wnt7a多肽或权利要求51-62中任一项所述的Wnt7a融合多肽的多核苷酸的载体。
69.根据权利要求68所述的组合物,其包含药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
70.根据权利要求68所述的组合物,其中赋形剂增加了所述组合物的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的半衰期。
71.根据权利要求68所述的组合物,其中赋形剂增加了所述组合物的Wnt7a多肽或Wnt7a融合多肽的稳定性。
72.根据权利要求68所述的组合物,其中所述组合物可溶于水溶液。
73.根据权利要求68所述的组合物,其中所述组合物经配制用于注射。
74.根据权利要求68所述的组合物,其中所述组合物经配制用于以下的一种或多种:静脉内注射、心脏内注射、皮下注射、腹腔内注射或直接注射至肌肉。
75.根据权利要求68所述的组合物,其中所述组合物促进组织形成、再生、维持或修复。
76.根据权利要求75所述的组合物,其中所述组织为肌肉。
77.根据权利要求76所述的组合物,其中所述肌肉为骨骼肌、心肌或平滑肌。
78.根据权利要求68所述的组合物,其中所述组合物促进干细胞扩增。
79.根据权利要求78所述的组合物,其中所述干细胞为成体干细胞。
80.根据权利要求79所述的组合物,其中所述成体干细胞为卫星干细胞。
81.根据权利要求76所述的组合物,其中所述组合物促进肌肉肥大或预防萎缩。
82.治疗或预防肌肉减少的方法,其包括将权利要求68所述的组合物给予至对象。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述组合物可溶于水溶液。
84.根据权利要求82所述的方法,其中所述组合物经配制用于注射。
85.根据权利要求82所述的方法,其中所述组合物经配制用于以下的一种或多种:静脉内注射、心脏内注射、皮下注射、腹腔内注射或直接注射至肌肉。
86.根据权利要求82所述的方法,其中所述对象患有影响肌肉的疾病或病症,或者有患影响肌肉的疾病或病症的风险。
87.根据权利要求86所述的方法,其中所述疾病为退行性疾病。
88.根据权利要求87所述的方法,其中所述退行性疾病为肌肉萎缩症。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述肌肉萎缩症选自:杜氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克氏肌肉萎缩症(BMD)、埃-德二氏肌肉萎缩症、兰-迪二氏肌肉萎缩症、面肩胛臂肌肉萎缩症(FSH)、肢-带型肌肉萎缩症、冯·格雷非-福克斯肌肉萎缩症、眼咽型肌肉萎缩症(OPMD)、强直性肌肉萎缩症(斯坦纳特病)和先天性肌肉萎缩症。
90.根据权利要求86所述的方法,其中所述影响肌肉的疾病或病症为消耗性疾病、肌肉衰减、肌肉萎缩、ICU引起的虚弱、长期废用性肌萎缩、手术引起的虚弱或肌肉退行性疾病。
91.根据权利要求86所述的方法,其中所述病症是与肌肉废用、长期固定不动、手术引起的虚弱或损伤有关的肌肉萎缩症。
92.根据权利要求82所述的方法,其中给予所述组合物预防肌肉萎缩。
93.根据权利要求82所述的方法,其中给予所述组合物促进肌肉肥大。
94.根据权利要求92或93所述的方法,其中所述肌肉为骨骼肌或心肌。
95.根据权利要求92或93所述的方法,其中给予所述组合物促进卫星干细胞扩增。
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