CN108601818A - Wnt组合物及其无血清合成方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于在最少血清条件下生成生物活性Wnt多肽的方法和培养系统。本文描述的还包括用于在无血清条件下生成生物活性Wnt多肽的方法和培养系统。

Description

Wnt组合物及其无血清合成方法
交叉引用
本申请案要求保护2016年1月28日提交的美国临时申请第62/288,365号的权益，该申请通过引用并入本文。
发明背景
Wnt蛋白形成了与卷曲低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)编码的细胞表面受体结合的高度保守性分泌型信号传导分子家族。WNT基因家族由编码分泌型信号传导蛋白的结构相关基因组成。这些蛋白质已涉及肿瘤形成和几个发育过程，包括细胞命运调控和胚胎发生过程中的模式化。一旦结合，配体就引发一系列细胞内事件，最终导致通过β-连环蛋白(catenin)和DNA结合蛋白TCF的核活性转录靶基因(Clevers H,2004Wnt signaling:Ig-norrin the dogma.Curr Biol 14:R436-R437；Nelson和Nusse 2004Convergence of Wnt,beta-catenin,and cadherin pathways.Science 303:1483-1487；Gordon和Nusse2006Wnt signaling:Multiple pathways,multiple receptors,and multipletranscription factors.J Biol Chern 281:22429-22433)。
Wnt也涉及与骨生成程序相关的各种细胞决定。例如，Wnt调节sox9的表达水平，其影响间充质祖细胞对骨骼发育命运的保证。Wnt影响细胞分化为成骨细胞或软骨细胞。在成年动物中，有大量证据表明Wnt信号传导调节骨量。例如，人Wnt共受体LRP5中的突变与几种高骨量综合征相关，包括I型骨质疏松和骨内膜骨质增生或常染色体显性骨硬化，以及低骨量疾病、骨质疏松-假神经胶质瘤。Wnt抑制剂Dkk1的产生增加与多发性骨髓瘤相关，多发性骨髓瘤是骨吸收增加作为其区别性特征之一的疾病。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了在最少血清条件(例如，无血清条件)下生成生物活性Wnt多肽的方法和培养系统。在某些实施方案中，本文还公开了包含工程化为向最少血清培养基(例如，无血清培养基)中分泌生物活性Wnt多肽的细胞的组合物。
在某些实施方案中，本文公开了一种在最少血清条件下生成生物活性Wnt多肽的体外方法，其包括在最少血清条件下培养来自于受编码Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，并且在最少血清条件下从所述培养基中收集分泌的Wnt多肽。在一些实施方案中，工程化细胞系为cGMP相容性细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性昆虫细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性昆虫细胞系为Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。在一些实施方案中，细胞作为贴壁或悬浮培养物生长。在一些实施方案中，细胞生长达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，之后从所述培养基中收集分泌的Wnt多肽。在一些实施方案中，表达载体为cGMP相容性载体。在一些实施方案中，表达载体为哺乳动物载体。在一些实施方案中，哺乳动物载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0、UCOE表达载体或GS系统表达载体。在一些实施方案中，表达载体为昆虫细胞表达载体。在一些实施方案中，昆虫细胞表达载体为pIEx或pBiEx载体。在一些实施方案中，Wnt多肽包含异源信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽包含天然信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5B多肽或Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ IDNO:1具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是包含约1至约33个氨基酸截短的多肽。在一些实施方案中，截短为C端截短。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是具有C端截短的SEQ ID NO:1的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:2具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是由SEQ ID NO:2组成的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽以至少约10ng/mL的浓度分泌到培养基中。在一些实施方案中，最少血清条件包括减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。在一些实施方案中，最少血清条件包括无动物组分培养基。在一些实施方案中，最少血清条件包括基本上不含非人血清的培养基。在一些实施方案中，最少血清条件包括基本上不含非人蛋白的培养基。在一些实施方案中，最少血清条件包括具有少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清的培养基。在一些实施方案中，最少血清条件包括具0％血清的培养基。在一些实施方案中，血清为胎牛血清。在一些实施方案中，培养基还包含血清替代品。在一些实施方案中，血清替代品包含CellEss、ITS(例如，ITS3或ITS3+)、Excyte、OneShot或Knockout。在一些实施方案中，培养基基本上不含外源因子。在一些实施方案中，外源因子包含病原体、传染性海绵状脑病(TSE)因子或其组合。在一些实施方案中，方法还包括利用离子交换法、疏水性纯化法或亲和纯化法纯化Wnt多肽。在一些实施方案中，方法还包括用脂质体配制纯化Wnt多肽。在一些实施方案中，方法还包括用药学上可接受的赋形剂配制纯化Wnt多肽。通过以上讨论的体外方法生成生物活性Wnt多肽。
在某些实施方案中，本文公开了一种Wnt培养系统，其包含最少血清培养基，分泌到最少血清培养基中的生物活性Wnt多肽，及来自于受编码生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中细胞在最少血清培养基的存在下生长。在一些实施方案中，工程化细胞系为cGMP相容性细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性昆虫细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性昆虫细胞系为Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。在一些实施方案中，表达载体为cGMP相容性载体。在一些实施方案中，表达载体为哺乳动物载体。在一些实施方案中，哺乳动物载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0、UCOE表达载体或GS系统表达载体。在一些实施方案中，表达载体为昆虫细胞表达载体。在一些实施方案中，昆虫细胞表达载体为pIEx或pBiEx载体。在一些实施方案中，Wnt多肽包含异源信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽包含天然信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5B多肽或Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ IDNO:1具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是包含约1至约33个氨基酸截短的多肽。在一些实施方案中，截短为C端截短。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是具有C端截短的SEQ ID NO:1的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:2具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是由SEQ ID NO:2组成的多肽。在一些实施方案中，在培养基中分泌的生物活性Wnt3A多肽的浓度为至少约10ng/mL。在一些实施方案中，培养基为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15日龄。在一些实施方案中，培养基为减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。在一些实施方案中，培养基为无动物组分培养基。在一些实施方案中，培养基基本上不含非人血清。在一些实施方案中，培养基基本上不含非人蛋白。在一些实施方案中，培养基包含少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清。在一些实施方案中，培养基包含0％血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清。在一些实施方案中，培养基还包含血清替代品。在一些实施方案中，血清替代品包含CellEss、ITS、Excyte、OneShot或Knockout。在一些实施方案中，培养基基本上不含外源因子。在一些实施方案中，外源因子包含病原体、传染性海绵状脑病(TSE)因子或其组合。
在某些实施方案中，本文公开了一种培养基，其包含最少血清培养基，分泌到最少血清培养基中的生物活性Wnt多肽，及来自于受编码生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中细胞在最少血清培养基的存在下生长。在一些实施方案中，工程化细胞系为cGMP相容性细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系为cGMP相容性昆虫细胞系。在一些实施方案中，cGMP相容性昆虫细胞系为Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。在一些实施方案中，表达载体为cGMP相容性载体。在一些实施方案中，表达载体为哺乳动物载体。在一些实施方案中，哺乳动物载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0、UCOE表达载体或GS系统表达载体。在一些实施方案中，表达载体为昆虫细胞表达载体。在一些实施方案中，昆虫细胞表达载体为pIEx或pBiEx载体。在一些实施方案中，Wnt多肽包含异源信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽包含天然信号序列。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5B多肽或Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ IDNO:1具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是包含约1至约33个氨基酸截短的多肽。在一些实施方案中，截短为C端截短。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是具有C端截短的SEQ ID NO:1的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:2具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽是由SEQ ID NO:2组成的多肽。在一些实施方案中，在培养基中分泌的生物活性Wnt3A多肽的浓度为至少约10ng/mL。在一些实施方案中，培养基为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15日龄。在一些实施方案中，培养基为减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。在一些实施方案中，培养基为无动物组分培养基。在一些实施方案中，培养基基本上不含非人血清。在一些实施方案中，培养基基本上不含非人蛋白。在一些实施方案中，培养基包含少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清。在一些实施方案中，培养基包含0％血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清。在一些实施方案中，培养基还包含血清替代品。在一些实施方案中，血清替代品包含CellEss、ITS、Excyte、OneShot或Knockout。在一些实施方案中，培养基基本上不含外源因子。在一些实施方案中，外源因子包含病原体、传染性海绵状脑病(TSE)因子或其组合。
在某些实施方案中，本文公开了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括：(a)将分离的Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以产生Wnt多肽-陪伴分子复合物；(b)将Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离；并且(c)使Wnt多肽-陪伴分子复合物与脂质体水溶液接触以产生脂质体Wnt多肽。在一些实施方案中，多个陪伴分子包含卷曲蛋白-8(Frizzled-8)。在一些实施方案中，来自多个陪伴分子的每个陪伴分子均包含卷曲蛋白-8融合蛋白。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白。在一些实施方案中，截短卷曲蛋白-8蛋白包含卷曲蛋白-8的半胱氨酸富集区(CRD)。在一些实施方案中，截短卷曲蛋白-8蛋白包含跨越SEQ ID NO:4的氨基酸残基25至氨基酸残基172的区域。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白还包含IgG Fc部分。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时或更长时间。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约30℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间，介于约1℃和约8℃之间，或介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间，介于约15℃和约30℃之间，介于约20℃和约30℃之间，介于约23℃和约30℃之间，或介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少1℃、2℃、4℃、8℃、10℃、20℃、23℃、25℃或30℃的温度下温育。在一些实施方案中，多个陪伴分子中的每一个进一步固定在珠粒上。在一些实施方案中，多个陪伴分子中的每一个进一步间接固定在珠粒上，其中每个陪伴分子与识别抗体Fc部分的多肽结合，并且其中多肽固定在珠粒上。在一些实施方案中，多肽为蛋白A。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4或约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些实施方案中，Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:2.5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些实施方案中，步骤b)的分离包括用pH为约3.0的缓冲液洗脱分离的Wnt多肽-陪伴分子复合物。在一些实施方案中，包含脂质体的磷脂具有介于约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长。在一些实施方案中，脂质体在介于约6.5和约8.0，约7.0和约7.8，或约7.2和约7.6之间的pH下具有0净电荷。在一些实施方案中，磷脂为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)。在一些实施方案中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方案中，DMPC和胆固醇的浓度按介于约70:30和约100:0之间的比率来限定。在一些实施方案中，步骤a)的温育还包括从本文描述的Wnt培养系统中收获分离的Wnt多肽。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽是分离的Wnt5B多肽或分离的Wnt10B多肽。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽是分离的Wnt3A多肽。
在某些实施方案中，本文公开了一种纯化Wnt多肽的方法，其包括：(a)将脂质体Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以形成脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物；(b)将脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离；并且(c)从脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱脂质体Wnt多肽以产生纯化脂质体Wnt多肽。在一些实施方案中，多个陪伴分子包含卷曲蛋白-8。在一些实施方案中，来自多个陪伴分子的每个陪伴分子均包含卷曲蛋白-8融合蛋白。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白。在一些实施方案中，截短卷曲蛋白-8蛋白包含卷曲蛋白-8的半胱氨酸富集区(CRD)。在一些实施方案中，截短卷曲蛋白-8蛋白包含跨越SEQ ID NO:4的氨基酸残基25至氨基酸残基172的区域。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白还包含IgG Fc部分。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，多个陪伴分子包含低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Lrp6)。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时或更长时间。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约30℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间，介于约1℃和约8℃之间，或介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间，介于约15℃和约30℃之间，介于约20℃和约30℃之间，介于约23℃和约30℃之间，或介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子在至少1℃、2℃、4℃、8℃、10℃、20℃、23℃、25℃或30℃的温度下温育。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白进一步固定在珠粒上。在一些实施方案中，卷曲蛋白-8融合蛋白进一步间接固定在珠粒上，其中卷曲蛋白-8融合蛋白与识别Fc部分的多肽结合，并且其中多肽固定在珠粒上。在一些实施方案中，多肽为蛋白A。在一些实施方案中，脂质体Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4或约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些实施方案中，步骤b)的分离包括用缓冲液洗脱脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物，其中缓冲液任选地具有约3.0的pH。在一些实施方案中，包含脂质体的磷脂具有介于约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长。在一些实施方案中，脂质体在介于约6.5和约8.0，约7.0和约7.8，或约7.2和约7.6之间的pH下具有0净电荷。在一些实施方案中，磷脂为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)。在一些实施方案中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方案中，DMPC和胆固醇的浓度按介于约70:30和约100:0之间的比率来限定。在一些实施方案中，步骤a)的温育还包括使获自本文描述的Wnt培养系统的分离的Wnt多肽与脂质体水溶液接触以产生脂质体Wnt多肽。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽是分离的Wnt5B多肽或分离的Wnt10B多肽。在一些实施方案中，分离的Wnt多肽是分离的Wnt3A多肽。
另外的方面和实施方案将从本公开其余部分显而易见，并且包括在本发明内。
附图说明
图1说明了在血清替代品Excyte的存在下和降低血清浓度时的Wnt3A活性。Wnt多肽来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体。使用双光报告因子测定法分析来自适应于5％血清+excyte(蓝色虚线柱)、3％血清+excyte(红色虚线柱)和2％血清+excyte(紫色虚线柱)的细胞的条件培养基中的WNT3a活性。将这种活性与来自适应于5％血清(蓝色实线柱)、3％血清(红色实线柱)和2％血清(紫色实线柱)的细胞而未补充excyte的条件培养基的活性进行比较。将来自于在10％血清中(橙色柱)生长的细胞的条件培养基用作阳性对照。与10％FBS相比，来自适应于2％血清和2％血清+excyte的细胞的条件培养基的活性降至6.4％。降低血清浓度导致条件培养基中的Wnt3A活性降低。添加Excyte对条件培养基中的Wnt3A活性并无影响。
图2显示了在血清替代品CellEss的存在下和降低血清浓度时的Wnt3A活性。Wnt3A多肽来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体。使用双光报告因子测定法分析来自适应于补充了Excyte的7.5％和5％血清的细胞的条件培养基中的Wnt3A活性。将这种活性与来自在10％血清中生长的细胞的条件培养基中的Wnt3A活性进行比较。培养基中CellEss的存在不能恢复条件培养基中的Wnt3A活性。
图3显示了来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体的Wnt3A活性。首先使细胞适应于炭处理的单次FBS(OS FBS)。在来自适应于OSFBS的细胞的条件培养基中未测量到可检测活性。适应OSFBS后，为OSFBS补充ITS3或脂质混合物1。使用LSL双光报告因子测定法测试条件培养基中的WNT3A活性。与阳性对照(10％FBS)相比时，来自适应于OSFBS+ITS样品的细胞的条件培养基展示出～10％的活性。与阳性对照(10％FBS)相比时，来自适应于OSFBS+脂质混合物样品的细胞的条件培养基展示出26％的活性。
图4显示了细胞在不同血清条件下的Wnt3A多肽分泌。细胞在含10％、1％和0％血清的条件下生长。诱导细胞并在5天内(第2天、第3天和第5天)收集条件培养基。
图5说明了CHO细胞在无血清条件下分泌的Wnt3A的活性。图5A说明了LSL报告因子测定法。图5B说明了检测Wnt3A的存在的蛋白质印迹(Western blot)分析。
图6说明了来自于在无血清条件下生长的稳定转染CHO-S细胞系的Wnt3A活性。
图7说明了利用本文描述的陪伴分子纯化Wnt多肽的示意图。
图8说明了显示卷曲蛋白-8融合蛋白与蛋白A固定珠粒的预复合的示意图。
图9说明了显示卷曲蛋白-8-Fc与蛋白A以两个不同比率复合的蛋白质印迹。
图10说明了显示使用卷曲蛋白-8融合蛋白-蛋白A策略纯化的Wnt3A的蛋白质印迹。
图11显示Fz8和脂质体竞争结合Wnt3A。图11A显示脂质体和Wnt3A在室温下温育6小时，接着进行超速离心以产生L-Wnt3A。然后，将这种预先形成的L-Wnt3A与Fz8一起在室温下温育6小时，然后超速离心将脂质体缔合蛋白与未缔合蛋白分离。免疫印迹显示几乎所有Fz8(98.6％)均在上清液中，而仅在脂质体团块中检测到Wnt3A。图11B显示Fz8和Wnt3A在4℃下预先温育24小时，然后将这种Fz8—Wnt3A溶液与脂质体一起在室温下温育6小时，接着进行超速离心。在这些条件下，观察到Fz8留在上清液中(99.6％)，但观察到大部分Wnt3A(93.0％)与Fz8共定位于上清液中。图11C显示Wnt3A、Fz8和脂质体一起在室温下温育6小时，接着进行超速离心。观察到Fz8留在上清液中(91.8％)，但Wnt3A分隔开，62.1％进入脂质体团块而37.9％进入上清液。数据是来自至少三个独立重复的平均值±SEM，或者是至少三个独立重复的代表。
图12显示在三种不同条件下温育人Wnt3A、小鼠Fz8和脂质体。图12A显示脂质体和Wnt3A在室温下温育12小时，接着进行超速离心以产生L-Wnt3A。然后，将这种预先形成的L-Wnt3A与Fz8一起在室温下温育6小时，然后超速离心将脂质体缔合蛋白与未缔合蛋白分离。免疫印迹显示约94.5％的Fz8在上清液中，而在脂质体团块中检测到约88.7％的Wnt3A。图12B显示Fz8和Wnt3A在4℃下预先温育24小时，然后将这种Fz8—Wnt3A溶液与脂质体一起在室温下温育12小时，接着进行超速离心。在这些条件下，观察到大部分Fz8留在上清液中(72.8％)，但观察到大部分Wnt3A(65.7％)与Fz8共定位于上清液中。图12C显示Wnt3A、Fz8和脂质体在室温下温育12小时，接着进行超速离心。观察到Fz8留在上清液中(94.0％)，但观察到Wnt3A分隔开，29.9％进入脂质体团块而70.1％进入上清液。数据是来自至少三个独立重复的平均值±SEM，或者是至少三个独立重复的代表。
图13显示了Wnt3A、LRP6和脂质体的结合复合物。图13A显示脂质体和Wnt3A在室温下温育6小时，接着进行超速离心以产生L-Wnt3A。然后，将这种预先形成的L-Wnt3A与LRP6一起在室温下温育6小时，然后超速离心将脂质体缔合蛋白与未缔合蛋白分离。免疫印迹显示LRP6分隔开，61.7％在团块中而38.3％在上清液中，然而在脂质体团块中检测到Wnt3A。图13B显示LRP6和Wnt3A在4℃下预先温育24小时，然后将这种LRP6—Wnt3A溶液与脂质体一起在室温下温育6小时，接着进行超速离心。在这些条件下，观察到几乎所有LRP6(96.2％)留在上清液中，并且观察到Wnt3A分隔开，65.9％进入团块而34.1％进入上清液。图13C显示Wnt3A、LRP6和脂质体在室温下温育6小时，接着进行超速离心。观察到LRP6大部分留在上清液中(88.9％)，并且观察到Wnt3A分隔开，79.7％进入脂质体团块而20.3％进入上清液。数据是来自至少三个独立重复的平均值±SEM，或者是至少三个独立重复的代表。
图14显示在三种不同条件下温育人Wnt3A、小鼠LRP6和脂质体。图14A显示脂质体和Wnt3A在室温下温育6小时，接着进行超速离心以产生L-Wnt3A。然后，将这种预先形成的L-Wnt3A与LRP6一起在室温下温育12小时，然后超速离心将脂质体缔合蛋白与未缔合蛋白分离。免疫印迹显示LRP6分隔开，48.2％在团块中而51.8％在上清液中，然而仅在脂质体团块中检测到Wnt3A。图14B显示LRP6和Wnt3A在4℃下预先温育24小时，然后将这种LRP6—Wnt3A溶液与脂质体一起在室温下温育12小时，接着进行超速离心。在这些条件下，观察到几乎所有LRP6(91.5％)留在上清液中，并且观察到Wnt3A分隔开，61.5％进入团块而38.5％进入上清液。图14C显示Wnt3A、LRP6和脂质体在室温下温育12小时，接着进行超速离心。观察到LRP6大部分留在上清液中(90.8％)，并且观察到Wnt3A分隔开，70.8％进入脂质体团块而29.2％进入上清液。数据是来自至少三个独立重复的平均值±SEM，或者是至少三个独立重复的代表。
发明详述
Wnt多肽构成了协调细胞发育和生物过程的信号传导分子家族。在一些情况下，Wnt多肽调节干细胞自我更新、细胞凋亡和细胞运动。在其它情况下，Wnt多肽有助于发育，例如组织稳态。Wnt多肽是高度疏水性蛋白质，并且在一些情况(例如，某些培养基条件)下生物学功能减少或丧失。在一些情况下，用外源试剂(例如脂质体)配制Wnt多肽允许Wnt多肽维持生物学功能。例如，已经证实将Wnt多肽与脂囊泡(例如脂质体)组合产生的Wnt制剂(Morrell NT、Leucht P、Zhao L、Kim J-B、ten Berge D等(2008)Liposomal PackagingGenerates Wnt Protein with In Vivo Biological Activity.PLoS ONE 3(8):e2930；及Zhao等，Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes,Methods Enzyrnol465:331-47(2009))具有生物学活性(Minear等，Wnt proteins promote boneregeneration.Sci.Transl.Med.2,29ra30(2010)；及Popelut等，The acceleration ofimplant osseointegration by liposomal Wnt3A,Biomaterials 31 9173e9181(2010)；美国专利第7,335,643和7,153,832号)。
在一些情况下，在血清的存在下从培养细胞中分泌出Wnt多肽。血清含有各种脂质组分，其在一些情况下稳定体外的高度疏水性Wnt多肽。疏水性是基于糖基化和棕榈酰化(一些情况下Wnt活性所需的修饰)的存在。然而，出于安全的原因，包括FDA和EMA在内的监管机构通常要求从旨在用于人类的药物中去除所有动物产品。另外，如果没有遵循适当程序来防止病毒和其它病原体的污染，则禁止胎牛血清用于制造FDA监管的医疗产品。
本文公开了在最少血清条件(例如，无血清条件)下生成Wnt多肽的方法和培养系统。在一些实施方案中，本文公开了一种在最少血清条件下生成生物活性Wnt多肽的体外方法，其包括在最少血清条件下培养来自于受编码Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，并且在最少血清条件下从培养基中收集分泌的Wnt多肽。在一些情况下，本文描述的还包括一种培养基，其包含最少血清培养基；分泌到最少血清培养基中的生物活性Wnt多肽；及来自于受编码生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中细胞在最少血清培养基的存在下生长。在另外的情况下，本文描述的包括制备脂质体Wnt多肽的方法及使用外源陪伴分子纯化获自最少血清条件的Wnt多肽的方法。
在一些实施方案中，最少血清条件是无血清条件。在一些情况下，本发明基于分泌生物活性Wnt多肽(例如，人Wnt3A)的无血清法的开发。在一些实施方案中，本文公开了在无血清条件下生成生物活性Wnt多肽的体外方法，其包括在无血清条件下培养来自于受编码Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞；并且在无血清条件条件下从培养基中收集分泌的Wnt多肽。在一些情况下，本文描述的还包括一种培养基，其包含无血清培养基；分泌到无血清培养基中的生物活性Wnt多肽；及来自于受编码生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中细胞在无血清培养基的存在下生长。
在一些实施方案中，在无血清培养基中生成Wnt多肽的能力对临床使用具有显著益处。相应地，提供了方法和组合物用于无血清分泌人WNT3a和从中获得的组合物。
某些术语
在描述本方法之前，应理解本发明不限于描述的特定方法，因此当然可以变化。还应理解本文使用的术语是仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应理解除非上下文另有明确规定，否则到下限单位的十分之一，介于该范围的上限和下限与该规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在本发明所涵盖的较小范围内，受限于规定范围内任何明确排除的限制。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)，为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。
本文提到的所有出版物明确地通过引用并入本文以公开和描述连同所述出版物一起引用的方法和/或材料。
本发明的方法，以及测定其在特定患者或应用中的功效的试验，可以根据本文的教导，使用本领域中标准的程序进行。因此，本发明的实践可以采用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有全面解释，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第2版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Animal CellCulture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编辑，1987)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”(Mullis等编辑，1994)；和“Current Protocols inImmunology”(J.E.Coligan等编辑，1991)；以及前述全部文献的更新或修订版本。
如本文中所用，“市售”化合物可从商业来源获得，包括但不限于Acros Organics(Pittsburgh PA)、Aldrich Chemical(Milwaukee WI,including Sigma Chemical andFluka)、Apin Chemicals Ltd.(Milton Park UK)、Avocado Research(Lancashire U.K.)、BDH Inc.(Toronto,Canada)、Bionet(Cornwall,U.K.)、Chemservice Inc.(West ChesterPA)、Crescent Chemical Co.(Hauppauge NY)、Eastman Organic Chemicals、EastmanKodak Company(Rochester NY)、Fisher Scientific Co.(Pittsburgh PA)、FisonsChemicals(Leicestershire UK)、Frontier Scientific(Logan UT)、ICN Biomedicals,Inc.(Costa Mesa CA)、Key Organics(Cornwall U.K.)、Lancaster Synthesis(WindhamNH)、Maybridge Chemical Co.Ltd.(Cornwall U.K.)、Parish Chemical Co.(Orem UT)、Pfaltz&Bauer,Inc.(Waterbury CN)、Polyorganix(Houston TX)、Pierce Chemical Co.(Rockford IL)、Riedel de Haen AG(Hannover,Germany)、Spectrum Quality Product,Inc.(New Brunswick,NJ)、TCI America(Portland OR)、Trans World Chemicals,Inc.(Rockville MD)、Wako Chemicals USA,Inc.(Richmond VA)、Novabiochem and ArgonautTechnology。
也可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备化合物。如本文中所用，“本领域普通技术人员已知的方法”可以通过各种参考书籍和数据库鉴别。详述用于制备本发明化合物的反应物的合成，或提供对描述所述制备的文章的参考的合适参考书籍和论文包括，例如"Synthetic Organic Chemistry",John Wiley&Sons,Inc.,New York；S.R.Sandler等，"Organic Functional Group Preparations,"第2版，Academic Press,New York,1983；H.O.House,"Modern Synthetic Reactions"，第2版，W.A.Benjamin,Inc.MenloPark,Calif.1972；T.L.Gilchrist,“Heterocyclic Chemistry”，第2版，John Wiley&Sons,New York,1992；J.March,“Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms andStructure”，第4版，Wiley-Interscience,New York,1992。特定和类似反应物也可以通过美国化学协会化学文摘社准备的已知化学品索引鉴别，其在大多数公共和大学图书馆可用，以及通过在线数据库可用(可以联系华盛顿美国化学协会获取更多详细资料)。目录中已知但市场上不可买到的化学品可以通过定制化学品合成机构制备，其中许多标准化学品供应机构(例如，上面列出的那些)提供定制合成服务。
如本文中所用，最少血清条件包括血清存在减少，例如具有约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.25％、0.2％、0.1％、0.05％血清或更少的血清条件。在一些情况下，最少血清条件包含9％至0％、5％至0.05％、5％至0.1％、5％至0.25％、4％至0.05％、4％至0.1％、4％至0.2％、3％至0.05％、3％至0.1％、3％至0.2％、3％至0.25％、2％至0.05％、2％至0.01％、2％至0.25％或2％至0.5％血清。在一些情况下，最少血清条件包含减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。在一些情况下，减血清培养基包含约1％至约5％血清(例如，胎牛血清)。在一些情况下，无蛋白培养基不含动物来源的任何蛋白质或组分，但有时含有从植物水解物获得的肽和/或多肽。在一些情况下，化学成分限定的培养基包含重组蛋白和/或激素(例如重组白蛋白和胰岛素，及化学成分限定的脂质)，不含胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些情况下，化学成分限定的培养基是无蛋白的、化学成分限定的培养基，其包含低分子量组成部分并且有时也含合成肽和/或激素。在一些情况下，化学成分限定的培养基是无肽、无蛋白的化学成分限定的培养基，在一些情况下，无血清培养基(或限定培养基)包含未限定的动物源性产物如血清白蛋白、水解物、生长因子、激素、载体蛋白和附着因子。在一些实施方案中，本文中所用的最少血清条件是指包含少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.25％、0.2％、0.1％或0.05％血清的培养基条件。在一些实施方案中，本文中所用的最少血清条件是指包含9％至0％、5％至0.05％、5％至0.1％、5％至0.25％、4％至0.05％、4％至0.1％、4％至0.2％、3％至0.05％、3％至0.1％、3％至0.2％、3％至0.25％、2％至0.05％、2％至0.01％、2％至0.25％或2％至0.5％血清的培养基条件。在一些实施方案中，本文中所用的最少血清条件是指减血清培养基条件。在一些实施方案中，本文中所用的最少血清条件是指无蛋白培养基条件。在一些实施方案中，本文中所用的最少血清条件是指化学成分限定的培养基条件。在一些实施方案中，如本文中所用的最少血清条件是指无血清培养基条件。
Wnt多肽
Wnt多肽或蛋白质形成了调节胚胎发生期间的细胞与细胞相互作用的高度保守性分泌型信号传导分子家族。在一些实施方案中，Wnt多肽包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10A、Wnt10B(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a和Wnt-16b多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽选自Wnt3A多肽、Wnt5A多肽和Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt5A多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt10B多肽。术语“Wnt”或“Wnt基因产物”或“Wnt多肽”在本文中使用时涵盖天然序列Wnt多肽、Wnt多肽变体、Wnt多肽片段和嵌合Wnt多肽。
“天然序列多肽”是具有与源自自然的Wnt多肽相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可从产生内源Wnt蛋白的细胞分离或者可通过重组或合成手段产生。因此，天然序列多肽可具有例如天然存在的人类多肽、鼠类多肽或来自其它哺乳动物物种或非哺乳动物物种例如果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)等的多肽的氨基酸序列。
术语“天然序列Wnt多肽”包括但不限于Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10A、Wnt10B(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a和Wnt-16b多肽。在一些情况下，术语“天然序列Wnt多肽”包括人Wnt多肽。在一些情况下，人Wnt多肽包括人Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10A、Wnt10B(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a和Wnt-16b多肽。在一些情况下，人Wnt多肽为人Wnt3A多肽。在一些情况下，人Wnt多肽为人Wnt5A。在另外的情况下，人Wnt多肽为人Wnt10B。
在一些情况下，Wnt1通过GenBank参考号NP005421.1和AAH74799.1查阅。Wnt2通过GenBank参考号NP003382.1和AAH78170.1查阅。一般而言，Wnt2在脑部、丘脑、胎儿和成人肺部或在胎盘中表达。Wnt2B具有两个同种型并且其GenBank参考号分别为NP004176.2和NP078613.1。在一些情况下，同种型1在成人心脏、脑部、胎盘、肺部、前列腺、睾丸、卵巢、小肠和/或结肠中表达。在成人脑部中，主要在尾状核、底丘脑核和丘脑中发现。在一些情况下，也在胎儿脑部、肺部和肾脏中检测到。在一些情况下，同种型2在胎儿脑部、胎儿肺部、胎儿肾脏、尾状核、睾丸和/或癌细胞系中表达。
Wnt3和Wnt3A在发育神经管的形态发生期间在细胞-细胞信号传导中起不同作用。Wnt3具有GenBank参考号AB060284.1(还请参见GenBank编号BAB61052.1和AAI03924.1)。Wnt3A具有GenBank登录号BC103922和登录号BC103921。在一些情况下，术语“天然序列Wnt蛋白”或“天然序列Wnt多肽”包括有或无起始N端甲硫氨酸(Met)及有或无天然信号序列的Wnt3A天然多肽(例如，登录号BC103921和BC103922的多肽)。在一些情况下，该术语包括有或无其N端甲硫氨酸(Met)及有或无天然信号序列的SEQ ID NO:2的352个氨基酸的天然人Wnt3A多肽。
在一些实施方案中，Wnt4具有Genbank参考号NP1 10388.2和BAC23080.1。Wnt5A具有Genbank参考号NP003383.1和NP003383.2。Wnt5b具有Genbank参考号BAB62039.1和AAG38659。Wnt6具有Genbank参考号NP006513.1和BAB55603.1。Wnt7a具有Genbank参考号NP004616.2和BAA82509.1。在一些情况下，其在胎盘、肾脏、睾丸、子宫、胎儿肺部、胎儿脑部或成人脑部中表达。Wnt7b具有Genbank参考号NP478679.1和BAB68399.1。在一些情况下，其在胎儿脑部、肺部和/或肾脏中，或在成人脑部、肺部和/或前列腺中表达。Wnt8A具有至少两种替代性转录产物，Genbank参考号NP114139.1和NP490645.1。Wnt8B在前脑中表达。其具有Genbank参考号NP003384.1。Wnt10A具有Genbank参考号AAG45153和NP079492.2。在大多数成人组织中检测到Wnt10B，在心脏和骨骼肌中的水平最高。其具有Genbank参考号NP003385.2。在一些情况下，Wnt11在胎儿肺部、肾脏、成人心脏、肺部、骨骼肌和胰腺中表达。其具有Genbank参考号NP004617.2。Wnt14具有Genbank参考号NP003386.1。Wnt15在胎儿肾脏或成人肾脏中表达，或在脑部中表达。其具有Genbank参考号NP003387.1。Wnt16具有两种通过选择性剪接产生的同种型，Wnt-16a和Wnt-16b。同种型Wnt-16a在胰腺中表达。同种型Wnt-16b在外周淋巴器官如脾脏、阑尾和淋巴结中，或在肾脏中表达，但不在骨髓中表达。Wnt16a和Wnt16b的Genbank参考号分别为NP476509.1和NP057171.2。列出的所有GenBank、SwissProt和其它数据库序列均明确地通过引用并入本文。
“变体”多肽意指下面所定义的与天然序列多肽具有低于100％序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括其中在天然序列的N或C端或在其内部添加了一个或多个氨基酸残基的多肽；约1至40个氨基酸残基缺失并任选地用一个或多个氨基酸残基取代的多肽；及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基已经共价修饰，使得所得产物具有非天然存在的氨基酸。
在一些情况下，生物活性Wnt变体具有与天然序列Wnt多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性Wnt变体具有与天然序列Wnt多肽具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96％、97％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性Wnt变体具有与天然序列Wnt多肽具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性Wnt变体具有与天然序列Wnt多肽具有至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，生物活性Wnt变体为Wnt3A变体。在一些实施方案中，生物活性Wnt变体为人Wnt3A变体。
在一些情况下，生物活性Wnt变体包含在一个或多个氨基酸位置的脂质修饰。在一些情况下，脂质修饰在Wnt变体上的位置等同于SEQ ID NO:1中所列的位置77。在一些情况下，脂质修饰在Wnt变体上的位置等同于SEQ ID NO:1中所列的位置209。在一些情况下，脂质修饰包括等同于SEQ ID NO:1中所列的位置77和209的两个位置。在一些情况下，Wnt变体为Wnt3A、Wnt5A或Wnt 10B。在一些情况下，Wnt变体为Wnt3A。在一些情况下，Wnt3A变体包含在等同于SEQ ID NO:1中所列的残基77的位置处的脂质修饰。在一些情况下，Wnt3A变体包含在等同于SEQ ID NO:1中所列的残基209的位置处的脂质修饰。在一些情况下，Wnt3A变体包含在等同于SEQ ID NO:1中所列的残基77和209的位置处的脂质修饰。在一些情况下，修饰为棕榈酰化。
在一些情况下，生物活性Wnt变体还包含通过糖基化修饰的残基。在一些情况下，修饰出现在等同于SEQ ID NO:1中所列的位置82和/或298的位置。在一些情况下，Wnt变体为Wnt3A。在一些情况下，Wnt3A变体还包含通过糖基化修饰的残基。在一些情况下，Wnt3A变体在等同于SEQ ID NO:1中所列的残基82和/或残基298的一个或多个位置处还包含糖基化残基。
术语“氨基酸”是指含有氨基酸和羧基两者的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸的D-和L-异构体。如本文中所用，术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。
术语“α-氨基酸”是指含有氨基和羧基两者，与指定为α-碳的碳结合的分子。
术语“β-氨基酸”是指含有氨基和羧基两者的呈β构型的分子。
术语“天然存在的氨基酸”是指通常发现于自然界中合成的多肽中并且以一个字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V通称的20种氨基酸中的任一种。
下表显示了天然氨基酸的特性汇总：
“疏水性氨基酸”包括小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸。“小疏水性氨基酸”为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。“大疏水性氨基酸”为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物。“极性氨基酸”为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物。“带电荷的氨基酸”为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其类似物。
术语“氨基酸类似物”是指结构与氨基酸类似并且可以在拟肽类大环的形成中可以取代氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于β-氨基酸和其中氨基或羧基被类似反应性基团取代(例如，伯胺被仲胺或叔胺取代，或羧基被酯取代)的氨基酸。
术语“非天然氨基酸”是指不是通常发现于自然界中合成的多肽中并且以一个字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V通称的20种氨基酸之一的氨基酸。非天然氨基酸或氨基酸类似物包括但不限于以下氨基酸类似物。
氨基酸类似物包括β-氨基酸类似物。β-氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(R)-β-苯丙氨酸；(R)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(R)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(R)-3-氨基-5-己烯酸；(R)-3-氨基-5-己炔酸；(R)-3-氨基-5-苯基戊酸；(R)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(S)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氟苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(S)-3-氨基-5-己烯酸；(S)-3-氨基-5-己炔酸；(S)-3-氨基-5-苯基戊酸；(S)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-羧酸；1,2,5,6-四氢吡啶-4-羧酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；D-β-苯基丙氨酸；β-亮氨酸；L-β-高丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-苄基酯；L-β-高谷氨酸δ-苄基酯；L-β-高异亮氨酸；L-β-高亮氨酸；L-β-高甲硫氨酸；L-β-高苯丙氨酸；L-β-高脯氨酸；L-β-高色氨酸；L-β-高缬氨酸；L-Nω-苄氧羰基-β-高赖氨酸；Nω-L-β-高精氨酸；O-苄基-L-β-高羟脯氨酸；O-苄基-L-β-高丝氨酸；O-苄基-L-β-高苏氨酸；O-苄基-L-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-L-β-高天冬酰胺；(R)-β-苯基丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；L-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；L-Nω-β-高赖氨酸；Nδ-三苯甲基-L-β-高谷氨酰胺；Nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-L-β-高精氨酸；O-叔丁基-L-β-高羟脯氨酸；O-叔丁基-L-β-高丝氨酸；O-叔丁基-L-β-高苏氨酸；O-叔丁基-L-β-高酪氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。
氨基酸类似物包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和亮氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-L-丙氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-D-丙氨酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-萘基)-D-丙氨酸；β-(2-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-L-丙氨酸；β-氯-L-丙氨酸；β-氰基-L-丙氨酸；β-环己基-D-丙氨酸；β-环己基-L-丙氨酸；β-环戊烯-1-基-丙氨酸；β-环戊基-丙氨酸；β-环丙基-L-Ala-OH.二环己基铵盐；β-叔丁基-D-丙氨酸；β-叔丁基-L-丙氨酸；γ-氨基丁酸；L-α,β-二氨基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氢-D-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4,4,4-三氟-缬氨酸；4,5-脱氢-L-leu-OH.二环己基铵盐；4-氟-D-苯基甘氨酸；4-氟-L-苯基甘氨酸；4-羟基-D-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；环戊基-D-Gly-OH.二环己基铵盐；环戊基-Gly-OH.二环己基铵盐；D-α,β-二氨基丙酸；D-α-氨基丁酸；D-α-叔丁基甘氨酸；D-(2-噻吩基)甘氨酸；D-(3-噻吩基)甘氨酸；D-2-氨基己酸；D-2-茚满基甘氨酸；D-烯丙基甘氨酸-二环己基铵盐；D-环己基甘氨酸；D-正缬氨酸；D-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲基苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；L-α,β-二氨基丙酸；L-α-氨基丁酸；L-α-叔丁基甘氨酸；L-(3-噻吩基)甘氨酸；L-2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；L-2-氨基己酸二环己基-铵盐；L-2-茚满基甘氨酸；L-烯丙基甘氨酸.二环己基铵盐；L-环己基甘氨酸；L-苯基甘氨酸；L-炔丙基甘氨酸；L-正缬氨酸；N-α-氨基甲基-L-丙氨酸；D-α,γ-二氨基丁酸；L-α,γ-二氨基丁酸；β-环丙基-L-丙氨酸；(N-β-(2,4-二硝基苯基))-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)乙基)-D-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)乙基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-4-甲基三苯甲基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-烯丙氧羰基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)乙基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己-1-基)乙基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-烯丙氧羰基)-L-α,γ-二氨基丁酸；D-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脱氢-L-亮氨酸；环戊基-D-Gly-OH；环戊基-Gly-OH；D-烯丙基甘氨酸；D-高环己基丙氨酸；L-1-芘基丙氨酸；L-2-氨基己酸；L-烯丙基甘氨酸；L-高环己基丙氨酸；和N-(2-羟基-4-甲氧基-Bzl)-Gly-OH。
氨基酸类似物包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸；L-2-氨基-3-脲基丙酸；L-瓜氨酸；Lys(Me)2-OH；Lys(N3)—OH；Nδ-苄氧羰基-L-鸟氨酸；Nω-硝基-D-精氨酸；Nω-硝基-L-精氨酸；α-甲基-鸟氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-环亚己-1-基)乙基)-D-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-环亚己-1-基)乙基)-L-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-D-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-L-鸟氨酸；D-鸟氨酸；L-鸟氨酸；Arg(Me)(Pbf)-OH；Arg(Me)2-OH(不对称)；Arg(Me)2-OH(对称)；Lys(ivDde)-OH；Lys(Me)2-OH.HCl；Lys(Me3)-OH氯化物；Nω-硝基-D-精氨酸；和Nω-硝基-L-精氨酸。
氨基酸类似物还包括天冬氨酸或谷氨酸的类似物。天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-D-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-L-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(N-γ-乙基)-L-谷氨酰胺；[N-α-(4-氨基苯甲酰基)]-L-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-α-氨基辛二酸；D-2-氨基己二酸；D-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；L-2-氨基己二酸；苏式-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-D-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-L-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；Glu(OAll)-OH；L-Asu(OtBu)—OH；和焦谷氨酸。
氨基酸类似物还包括半胱氨酸和甲硫氨酸的类似物。半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于Cys(法呢基)-OH、Cys(法呢基)-OMe、α-甲基-甲硫氨酸、Cys(2-羟乙基)-OH、Cys(3-氨丙基)-OH、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜亚胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基氯化锍、硒代甲硫氨酸、半胱氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-DL-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-L-半胱氨酸、4-甲氧基苄基-D-青霉胺、4-甲氧基苄基-L-青霉胺、4-甲基苄基-D-青霉胺、4-甲基苄基-L-青霉胺、苄基-D-半胱氨酸、苄基-L-半胱氨酸、苄基-DL-高半胱氨酸、氨甲酰基-L-半胱氨酸、羧乙基-L-半胱氨酸、羧甲基-L-半胱氨酸、二苯甲基-L-半胱氨酸、乙基-L-半胱氨酸、甲基-L-半胱氨酸、叔丁基-D-半胱氨酸、三苯甲基-L-高半胱氨酸、三苯甲基-D-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、L-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、硒代-L-胱氨酸、胱硫醚、Cys(StBu)—OH和乙酰氨基甲基-D-青霉胺。
氨基酸类似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的类似物。苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸类似物的实例包括β-甲基-苯基丙氨酸、β-羟基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-DL-苯基丙氨酸、α-甲基-D-苯基丙氨酸、α-甲基-L-苯基丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、2,4-二氯-苯基丙氨酸、2-(三氟甲基)-D-苯基丙氨酸、2-(三氟甲基)-L-苯基丙氨酸、2-溴-D-苯基丙氨酸、2-溴-L-苯基丙氨酸、2-氯-D-苯基丙氨酸、2-氯-L-苯基丙氨酸、2-氰基-D-苯基丙氨酸、2-氰基-L-苯基丙氨酸、2-氟-D-苯基丙氨酸、2-氟-L-苯基丙氨酸、2-甲基-D-苯基丙氨酸、2-甲基-L-苯基丙氨酸、2-硝基-D-苯基丙氨酸、2-硝基-L-苯基丙氨酸、2；4；5-三羟基-苯基丙氨酸、3,4,5-三氟-D-苯基丙氨酸、3,4,5-三氟-L-苯基丙氨酸、3,4-二氯-D-苯基丙氨酸、3,4-二氯-L-苯基丙氨酸、3,4-二氟-D-苯基丙氨酸、3,4-二氟-L-苯基丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯基丙氨酸、3,4-二甲氧基-L-苯基丙氨酸、3,5,3′-三碘-L-甲腺原氨酸、3,5-二碘-D-酪氨酸、3,5-二碘-L-酪氨酸、3,5-二碘-L-甲腺原氨酸、3-(三氟甲基)-D-苯基丙氨酸、3-(三氟甲基)-L-苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、3-溴-D-苯基丙氨酸、3-溴-L-苯基丙氨酸、3-氯-D-苯基丙氨酸、3-氯-L-苯基丙氨酸、3-氯-L-酪氨酸、3-氰基-D-苯基丙氨酸、3-氰基-L-苯基丙氨酸、3-氟-D-苯基丙氨酸、3-氟-L-苯基丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-D-苯基丙氨酸、3-碘-L-苯基丙氨酸、3-碘-L-酪氨酸、3-甲氧基-L-酪氨酸、3-甲基-D-苯基丙氨酸、3-甲基-L-苯基丙氨酸、3-硝基-D-苯基丙氨酸、3-硝基-L-苯基丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、4-(三氟甲基)-D-苯基丙氨酸、4-(三氟甲基)-L-苯基丙氨酸、4-氨基-D-苯基丙氨酸、4-氨基-L-苯基丙氨酸、4-苯甲酰基-D-苯基丙氨酸、4-苯甲酰基-L-苯基丙氨酸、4-双(2-氯乙基)氨基-L-苯基丙氨酸、4-溴-D-苯基丙氨酸、4-溴-L-苯基丙氨酸、4-氯-D-苯基丙氨酸、4-氯-L-苯基丙氨酸、4-氰基-D-苯基丙氨酸、4-氰基-L-苯基丙氨酸、4-氟-D-苯基丙氨酸、4-氟-L-苯基丙氨酸、4-碘-D-苯基丙氨酸、4-碘-L-苯基丙氨酸、高苯丙氨酸、甲腺原氨酸、3,3-二苯丙氨酸、甲腺原氨酸、乙基-酪氨酸和甲基-酪氨酸。
氨基酸类似物包括脯氨酸的类似物。脯氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3,4-脱氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺-4-羟基-脯氨酸、噻唑烷-2-羧酸和反-4-氟-脯氨酸。
氨基酸类似物包括丝氨酸和苏氨酸的类似物。丝氨酸和苏氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧基丁酸、2-氨基-3-甲氧基丁酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-乙氧基丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸和α-甲基丝氨酸。
氨基酸类似物包括色氨酸的类似物。色氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-L-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-L-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-D-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；D-1,2,3,4-四氢-咔啉-3-羧酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢咔啉-1-羧酸；7-氮杂色氨酸；L-1,2,3,4-四氢-咔啉-3-羧酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-L-色氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸类似物为外消旋。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的D异构体。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的L异构体。在其它实施方案中，氨基酸类似物包含呈R或S构型的手性中心。在另外其它实施方案中，β-氨基酸类似物的氨基经保护基团，例如叔丁氧羰基(BOC基团)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、甲苯磺酰基等取代。还有其它实施方案中，β-氨基酸类似物的羧酸基团受保护，例如如同其酯类衍生物。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的盐。
“非必需”氨基酸残基是可由多肽的野生型序列改变而来，未消除或基本上改变其必需生物或生物化学活性(例如受体结合或激活)的残基。“必需”氨基酸残基是由多肽的野生型序列改变而来时，导致消除或基本上消除多肽的必需生物或生物化学活性的残基。
“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，K、R、H)、酸性侧链(例如，D、E)、不带电荷的极性侧链(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、非极性侧链(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、β-分支侧链(例如，T、V、I)和芳香族侧链(例如，Y、F、W、H)。因此，多肽中预测的非必需氨基酸残基，例如被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基置换。可接受的取代的其它实例是基于等排考虑(例如，正亮氨酸取代甲硫氨酸)或其它特性(例如2-噻吩基丙氨酸取代苯丙氨酸，或6-Cl-色氨酸取代色氨酸)的取代。
生物活性Wnt多肽
在某些实施方案中，本文公开了用于生成基本上同源的生物活性Wnt组合物的方法，所述组合物纯化自分泌到最少血清条件(例如，无血清培养基)中的原材料。在一些情况下，本文描述的是在最少血清条件下生成生物活性Wnt多肽的体外方法，其包括在最少血清条件下培养来自于受编码Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞；并且在最少血清条件下从培养基中收集分泌的Wnt多肽。在一些情况下，本文描述的还包括一种培养基，其包含最少血清培养基，分泌到最少血清培养基中的生物活性Wnt多肽，及来自于受编码生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中细胞在最少血清培养基的存在下生长。
表达构建体
在一些实施方案中，通过重组方法生成包含一种或多种变体的Wnt多肽。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A、Wnt5A或wnt10b多肽。在一些情况下，包含一种或多种变体的Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些情况下，包含一种或多种变体的Wnt多肽为Wnt5A多肽。在一些情况下，包含一种或多种变体的Wnt多肽为Wnt10B多肽。
通过向Wnt多肽DNA中引入适当的核苷酸变化，制备氨基酸序列变体，包括在C端截短的变体。此类变体表示在天然存在的Wnt多肽的氨基酸序列内部或其一端或两端的插入、取代和/或指定缺失。产生插入、取代和/或指定缺失(例如截短)的任何组合以得到最终构建体，只要最终构建体具有如本文所定义的所需生物学活性。氨基酸变化也可以改变Wnt多肽的翻译后过程，例如通过插入、缺失或以其它方式影响Wnt多肽的前导序列而改变糖基化位点的数量或位置，改变膜锚定特征，和/或改变Wnt多肽的细胞内定位。
在一些实施方案中，Wnt多肽内的一个或多个变体包含取代、插入、缺失或其组合。在一些情况下，Wnt3A多肽包含取代、插入、缺失或其组合。在一些情况下，Wnt5A多肽包含取代、插入、缺失或其组合。在其它情况下，Wnt10B多肽包含取代、插入、缺失或其组合。
在一些情况下，编码Wnt3A多肽的DNA用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示。在一些情况下，例如通过截短SEQ ID NO:1的序列，或通过利用SEQ ID NO:2的序列来制备编码Wnt3A多肽的DNA。在一些情况下，还通过如本领域已知的寡核苷酸合成、扩增等获得编码Wnt多肽的基因。
将编码Wnt多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入可复制载体中进行表达。许多此类载体可用。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。优选地，选择GMP相容性载体，例如市售载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0等。
在一些实施方案中，使用耐受最少血清培养基条件的表达载体。在一些情况下，最少血清培养基条件包括减血清培养基条件、无蛋白培养基条件、化学成分限定的培养基条件或无血清培养基条件。在一些实施方案中，使用耐受减血清培养基条件的表达载体。在一些实施方案中，使用耐受无蛋白培养基条件的表达载体。在一些实施方案中，使用耐受化学成分限定的培养基条件的表达载体。
在一些实施方案中，使用耐受无血清培养基条件的表达载体。在一些情况下，表达载体导致高拷贝数量的所需转录产物和目标蛋白的分泌。在一些情况下，表达载体与cGMP相容性哺乳动物细胞系相容。哺乳动物表达载体的非限制性实例包括pOptivec载体、pTargeTTM载体、BacMam pCMV-Dest载体、Flp-InTM核心系统、载体套组、载体、载体、pCMVTNTTM载体、pcDNA4.0和pcDNATM4/TO载体。在一些实施方案中，表达载体选自pOptivec和pTargeTTM载体。pOptivec载体是允许快速克隆含有哺乳动物分泌信号的基因和CMV启动子下游的目标基因的适合型双顺反子质粒。二氢叶酸还原酶选择标志物允许快速选择。在一些情况下，这种载体用于瞬时转染CHO-S细胞。在一些情况下，pTargeTTM载体用于瞬时转染CHO-S细胞和产生表达Wnt蛋白(例如Wnt3A)的稳定细胞系。
编码序列还将包括允许WNT分泌的信号序列。信号序列可以是载体的组分，或者可以是插入载体中的编码Wnt的DNA的一部分。优选的异源信号序列是宿主细胞所识别和加工(例如，通过信号肽酶裂解)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或其它哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自其它动物Wnt多肽的信号序列，及来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号序列。
表达载体可含选择基因，也称为可选择标志物。该基因编码转化宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白质。未用含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中不会存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷，或(c)供给不可从复合培养基获得的关键营养素。
表达载体将含有宿主生物所识别并且与Wnt编码序列可操作连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')(通常在约100至1000个碱基对之内)，控制与之可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译的非翻译序列。此类启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件中的一些变化，例如营养素的存在或缺乏或温度变化，引发DNA在其控制下的转录水平提高。各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是公知的。天然Wnt多肽启动子序列和许多异源启动子均可用于指导Wnt多肽的表达。然而，优选异源启动子，因其通常容许更多的转录和更高的产率。
从哺乳动物宿主细胞内的载体的转录可以例如通过从以下来源获得的启动子来控制：来自病毒基因组，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选地猿猴病毒40(SV40)；来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子；来自热休克启动子，只要此类启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子便于作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子便于作为HindIII E限制片段获得。
可通过向载体内插入增强子序列而增加转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300个碱基对，其作用于启动子以增加其转录。增强子相对方向和位置独立，已经发现于转录单元的5'和3'，内含子内以及编码序列本身内。现在已知许多增强子序列来自于哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点晚期的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可剪接到表达载体内编码序列的5'或3'位置，但优选位于启动子的5'位点。
用于哺乳动物宿主细胞内的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码Wnt多肽的mRNA的非翻译区内转录为多聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
构建含有以上所列一种或多种组分的合适载体采用标准技术。分离的质粒或DNA片段以产生需要载体所需的形式裂解、定制和重新连接。
在本发明的实践中特别有用的是在哺乳动物细胞中提供瞬时表达的表达载体。一般而言，表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，使得宿主细胞积聚表达载体的许多拷贝，并且转而合成高水平的由表达载体编码的所需多肽。包含合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统允许对克隆DNA所编码的多肽进行方便的阳性鉴定以及快速筛选此类多肽的所需生物或生理特性。
在一些情况下，使用无血清培养基。无血清培养基的非限制性实例CD CHO培养基、CD CHO AGTTM培养基、CD OptiCHOTM培养基、CHO-S-SFM II(任选包括次黄嘌呤和胸腺嘧啶)、CD 293AGTTM培养基、腺病毒表达培养基(AEM)、FreeStyleTM 293表达培养基、FreeStyleTM CHO表达培养基、CD FortiCHOTM培养基、302无血清培养基、325PF CHO无血清培养基、CD CHO-2无动物组分的培养基、CD CHO-3培养基和CDHO DHFR-无动物组分的培养基。
可进行本发明的方法以遵守FDA或WHO对GMP生产的指导方针。对于此的指导方针可从有关监管机构获得。参见例如，“WHO good manufacturing practices:mainprinciples for pharmaceutical products.Annex 3in:WHO Expert Committee onSpecifications for Pharmaceutical Preparations.Forty-fifth report.Geneva,World Health Organization,2011(WHO Technical Report Series,No.961)”；“ICH Q5Bguideline.Analysis of the expression construct in cells used for productionof r-DNA derived protein products.Geneva,International Conference onHarmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticalsfor Human Use,1995”；“Handbook:good laboratory practice(GLP):quality practicesfor regulated non-clinical research and development,第2版Geneva,UNDP/WorldBank/WHO,Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases,2009”；各自通过引用明确并入本文。
通常，使用细胞库系统生产重组DNA源生物治疗剂，所述细胞库系统涉及源自主细胞库的工作细胞库(WCB)。本发明包括用用于分泌WNT3A蛋白的载体转染的CHO-S细胞的冷冻等分试样，所述细胞可用作主细胞库或工作细胞库。
方法
本文公开的包括用于分泌生物活性Wnt多肽的无血清方法的开发。在一些情况下，生物活性Wnt多肽为人生物活性Wnt多肽。在一些情况下，生物活性Wnt多肽为Wnt3A、Wnt5A或Wnt10B多肽。在一些情况下，生物活性Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些情况下，生物活性Wnt多肽为人Wnt3A多肽。
在一些实施方案中，cGMP相容性细胞系经编码Wnt多肽的表达载体转染。示例性cGMP相容性细胞系包括哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系；或昆虫细胞系例如Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。
在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在选自以下的cGMP相容性细胞系中转染：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在CHO细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在BHK细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在HEK细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在Sf9细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在Sf21细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在Tn-368细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在High Five细胞系中转染。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt 5a多肽或Wnt 10b多肽。
在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在选自以下的cGMP相容性细胞系中转染：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在CHO细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在BHK细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在HEK细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在Sf9细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在Sf21细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在Tn-368细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在HighFive细胞系中转染。
在一些情况下，CHO细胞系为CHO-S细胞系。在一些情况下，编码Wnt多肽的表达载体在CHO-S细胞系中转染。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt 5a多肽或Wnt 10b多肽。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的表达载体在CHO-S细胞系中转染。在一些情况下，编码Wnt3A多肽的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的表达载体在CHO-S细胞系中转染。在另外的情况下，编码包含变体(例如，缺失或截短)的Wnt3A多肽的表达载体在CHO-S细胞系中转染。
在一些情况下，经编码包含缺失或截短的Wnt3A多肽的表达载体转染的CHO-S细胞的组合允许蛋白质有效分泌到最少血清培养基(例如，无血清培养基)中。在一些情况下，缺失或截短为C端缺失或截短。在一些情况下，Wnt3A多肽如SEQ ID NO:1所示。在一些情况下，经编码其中相对于SEQ ID NO:1(BC103921)，C端被截短的Wnt3A多肽的表达载体转染的CHO-S细胞的组合允许蛋白质有效分泌到不存在血清或其它动物产品的培养基中。
如本文别处所述，最少血清培养基有时包含少于9％血清。在一些情况下，血清为FBS。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS至多为约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或更少。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS至少为约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或更多。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约0.05％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约0.1％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约0.5％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约1％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约2％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约3％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约4％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约5％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约6％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约7％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约8％。在一些情况下，最少血清培养基中存在的FBS为约9％。在其它情况下，最少血清培养基为无血清培养基。
有时，最少血清培养基包含由植物水解物但非动物来源的蛋白质或组分获得的组分如肽和/或多肽。在其它情况下，最少血清培养基包含重组蛋白和/或激素并且不含FBS、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在另外的情况下，最少血清培养基包含低分子量组成部分和任选地合成肽和/或激素。
在一些实施方案中，最少血清培养基含一种或多种附加补充物。在一些实施方案中，附加补充物为脂质补充物。脂质补充物的非限制性实例包括脂质混合物1(Sigma-Aldrich)、脂质混合物2(Sigma-Aldrich)、(Rocky Mountain Biologicals)和化学成分限定的脂质浓缩物(Life Technologies)。在一些实施方案中，无血清培养基含脂质补充物。
在一些实施方案中，本发明的方法包括在Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)表达和分泌的条件下，在无血清培养基中培养经包含C端截短Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)的表达载体转染的CHO细胞(例如，CHO-S细胞)，Wnt多肽包含与启动子可操作连接的分泌信号序列，其可为天然Wnt(例如，Wnt3A)信号序列或异源信号序列。在一些实施方案中，方法还包括用表达载体转染细胞的初始步骤。在一些实施方案中，方法包括从培养基中纯化这样生成的多肽。在一些实施方案中，将Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)纯化到适于GMP临床使用的程度。在一些实施方案中，将这样纯化的Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)包装成单位剂量制剂。
在一些实施方案中，CHO细胞悬浮生长。在一些实施方案中，CHO细胞贴壁。在一些实施方案中，培养基包含血清替代品。在一些实施方案中，血清替代品不含动物产品。在一些实施方案中，血清替代品包含纯化蛋白，例如胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白等中的一种或多种，但缺乏例如生长因子、类固醇激素、糖皮质激素、细胞粘附分子、可检测Ig、有丝分裂原等。血清替代品可在培养基中以至多约0.1％、至多约0.25％、至多约0.5％、至多约0.75％、至多约1％、至多约2.5％、至多约5％、至多约7.5％或至多约10％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约0.1％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约0.25％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约0.5％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约0.75％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约1％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约2.5％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约5％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约7.5％的浓度存在。血清替代品可在培养基中以至多约10％的浓度存在。
合适的培养基可选自本领域已知的那些，包括但不限于DMEM、RPMI-1640、MEM、Iscove’s、CHO细胞培养基等。合适的血清替代品包括未用动物产品生产的那些，或仅具有纯化的动物蛋白组分的那些。市售适于这个目的的补充物包括但不限于如本领域已知的CellEss、ITS(例如，ITS3或ITS3+)、Excyte、OneShot、Knockout等。在一些情况下，ITS补充物是包含胰岛素、转铁蛋白和硒的混合物的补充物。培养基还可包含但不限于诸如GlutaMaxTM(基于谷氨酰胺的二肽)、抗生素(例如，多西环素)、G418、非必需氨基酸、杀稻瘟菌素(blasticidine)等组分。
Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约250ng/ml、至少约500ng/ml、至少约750ng/ml、至少约1μg/ml、至少约1.1μg/ml、至少约1.25μg/ml、至少约1.5μg/ml、至少约1.75μg/ml、至少约2.5μg/ml、至少约5μg/ml、至少约7.5μg/ml、至少约10μg/ml或更高。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约10ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约25ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约50ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约75ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约100ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约250ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约500ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约750ng/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.1μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.25μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.5μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.75μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约2.5μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约5μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约7.5μg/ml。Wnt多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约10μg/ml。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt5A多肽。在一些情况下，Wnt多肽为Wnt 10B多肽。
在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些情况下，Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平为至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约250ng/ml、至少约500ng/ml、至少约750ng/ml、至少约1μg/ml、至少约1.1μg/ml、至少约1.25μg/ml、至少约1.5μg/ml、至少约1.75μg/ml、至少约2.5μg/ml、至少约5μg/ml、至少约7.5μg/ml、至少约10μg/ml或更高。
Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约10ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约25ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约50ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约75ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约100ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约250ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约500ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约750ng/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.1μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.25μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.5μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约1.75μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约2.5μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约5μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约7.5μg/ml。Wnt3A多肽向无血清培养基的分泌水平可为至少约10μg/ml。
在一些实施方案中，表达和分泌的Wnt多肽的C端截短5至40个氨基酸。在一些情况下，表达和分泌的Wnt多肽的C端截短5至35个氨基酸，10至35个氨基酸，10至33个氨基酸，10至30个氨基酸，15至33个氨基酸，15至30个氨基酸，20至35个氨基酸，20至33个氨基酸，20至30个氨基酸，25至33个氨基酸或25至30个氨基酸。
在一些实施方案中，表达和分泌的Wnt多肽的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33个或更多个氨基酸，并且可在N或C端另外截短，只要蛋白质保持生物活性。在一些实施方案中，Wnt多肽截短5个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短10个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短15个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短20个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短25个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短30个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽截短33个氨基酸。
在一些情况下，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，表达和分泌的Wnt3A多肽的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33个或更多个氨基酸，并且可在N或C端另外截短，只要蛋白质保持生物活性。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短5个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短10个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短15个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短20个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短25个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短30个氨基酸。在一些实施方案中，Wnt3A多肽截短33个氨基酸。
在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQID NO:1具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ IDNO:1具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQID NO:2具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ IDNO:2具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，Wnt3A多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，将Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)纯化到至少约5μg/ml的初始浓度；通常为至少约10μg/ml，更通常为至少约50μg/ml，并且可以高于约100μg/ml存在。将Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)配制于脂质体中。可用去垢剂将Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)稳定于制剂中。可用脂质将Wnt多肽(例如，Wnt3A多肽)稳定于制剂中。
在一些实施方案中，使用本领域熟知的方法制造脂质体。脂质体是由层状相脂质双分子层和含水核组成的人工制备的球形囊泡。有几种类型的脂质体，如多层囊泡(MLV)、小的单层脂质体囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)和螺旋形囊泡。在一些情况下，脂质体由磷脂形成。在一些实施方案中，磷脂分为具有二酰甘油结构的那些或源自鞘磷脂的那些。在一些实施方案中，二酰甘油结构包括磷脂酸(磷脂酸盐)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷酸肌醇如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇双磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。在一些实施方案中，鞘磷脂包括神经酰胺磷酰胆碱、神经酰胺磷酸乙醇胺和神经酰胺磷酰基脂质。在一些实施方案中，脂质体由磷脂酰胆碱形成。
在一些实施方案中，脂质也基于其相变温度(Tm)或液晶相与凝胶相之间的温度界面进行选择。在一些实施方案中，Tm受头基种类、烃长度、不饱和性和电荷控制。例如，短的脂质(含8、10或12个尾碳链长度的脂质)在低于4℃的温度下具有液晶相。然而，由这些短链碳脂质制成的脂质体因其溶解细胞膜而对细胞有毒。由较长碳链脂质制成的脂质体对细胞无毒，但其转变温度较高。例如，具有16个尾部碳长的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)的Tm为约41℃。在一些实施方案中，本文所用脂质的Tm介于约10℃和约37℃、15℃和约30℃、18℃和约27℃或21℃和约25℃之间。在一些实施方案中，本文所用脂质的Tm为至少22℃、23℃、24℃或更高。在一些实施方案中，本文所用脂质的Tm为至多22℃、23℃、24℃或更低。在一些实施方案中，本文所用脂质具有至少约12、13、14个或更多的尾部碳长。在一些实施方案中，本文所用脂质具有至多约12、13、14个或更少的尾部碳长。
在一些实施方案中，脂质进一步基于脂质体的净电荷进行选择。在一些实施方案中，脂质体在介于约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8或约7.2和约7.6之间的pH下的净电荷为0。在一些实施方案中，脂质体在约7.3、约7.4或约7.5的pH下的净电荷为0。在一些实施方案中，脂质体在介于约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8或约7.2和约7.6之间的pH下具有净正电荷。在一些实施方案中，脂质体在约7.3、约7.4或约7.5的pH下具有净正电荷。在一些实施方案中，脂质体在介于约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8或约7.2和约7.6之间的pH下具有净负电荷。在一些实施方案中，脂质体在约7.3、约7.4或约7.5的pH下具有净负电荷。
在一些实施方案中，脂质选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、1-十四烷酰-2-十六酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(MPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS)和1,2-二己酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPG)。在一些实施方案中，脂质为DMPC。
在一些实施方案中，另外的脂质制成脂质体。在一些实施方案中，另外的脂质为胆固醇。在一些情况下，磷脂酰胆碱例如DMPC和胆固醇的浓度由诸如比率等值定义。在一些实施方案中，磷脂酰胆碱例如DMPC和胆固醇的浓度比介于约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0。在一些实施方案中，磷脂酰胆碱例如DMPC和胆固醇的浓度比为约90:10。在一些实施方案中，浓度单位为摩尔。在一些实施方案中，比率为摩尔:摩尔。
在一些实施方案中，以至少约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ng/μL或更高的浓度用脂质体重构Wnt多肽。在一些实施方案中，以至多约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ng/μL或更低的浓度用脂质体重构Wnt多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5A多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。
在一些实施方案中，按至少约0.1:50、0.5:30、1:20或1:14或更高的Wnt多肽与脂质体比率用脂质体重构Wnt多肽。在一些实施方案中，按至多约0.1:50、0.5:30、1:20或1:14或更低的Wnt多肽与脂质体比率用脂质体重构Wnt多肽。在一些情况下，比率为重量:重量比。在一些情况下，Wnt多肽的单位为纳克单位。
在一些实施方案中，用脂质体重构Wnt多肽的温度至少介于约15℃和约37℃、约18℃和约33℃或约20℃和约28℃之间。在一些实施方案中，温度为至少约21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或更高。在一些实施方案中，温度为至多约21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或更低。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5A多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。
在一些实施方案中，Wnt多肽整合到脂质体膜中。在一些情况下，Wnt多肽从脂质体膜伸出到脂膜表面上。在一些情况下，Wnt多肽未并入到脂质体的含水核内。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5A多肽或Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，Wnt3A多肽整合到脂质体膜中。在一些情况下，Wnt3A多肽从脂质体膜伸出到脂膜表面上。在一些情况下，Wnt3A多肽未并入到脂质体的含水核内。
在一些实施方案中，用脂质体重构的Wnt多肽称为脂质体Wnt多肽或L-Wnt。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5A多肽或Wnt10B多肽。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt3A多肽。在一些实施方案中，用脂质体重构的Wnt3A多肽称为脂质体Wnt3A多肽或L-Wnt3A。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt5A多肽。在一些实施方案中，用脂质体重构的Wnt5A多肽称为脂质体Wnt5A多肽或L-Wnt5A。在一些实施方案中，Wnt多肽为Wnt10B多肽。在一些实施方案中，用脂质体重构的Wnt10B多肽称为脂质体Wnt10B多肽或L-Wnt10B。
在一些实施方案中，L-Wnt经历离心步骤，然后悬浮在缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在一些情况下，L-Wnt储存在氮气下。在一些情况下，L-Wnt在氮气下稳定，无重大活性损失。在一些情况下，L-Wnt储存在介于约1℃和约8℃之间的温度下。在一些情况下，L-Wnt在至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更高的温度下稳定，无重大活性损失。在一些情况下，L-Wnt在至多约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更低的温度下稳定，无重大活性损失。在一些实施方案中，L-Wnt稳定至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更长时间，无重大活性损失。在一些实施方案中，L-Wnt稳定至多约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更短时间，无重大活性损失。
在一些实施方案中，L-Wnt3A经历离心步骤，然后悬浮在缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在一些情况下，L-Wnt3A储存在氮气下。在一些情况下，L-Wnt3A在氮气下稳定，无重大活性损失。在一些情况下，L-Wnt3A储存在介于约1℃和约8℃之间的温度下。在一些情况下，L-Wnt3A在至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更高的温度下稳定，无重大活性损失。在一些情况下，L-Wnt3A在至多约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更低的温度下稳定，无重大活性损失。在一些实施方案中，L-Wnt3A稳定至少约10、20、30、40、50、60、70、80 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更长时间，无重大活性损失。在一些实施方案中，L-Wnt3A稳定至多约10、20、30、40、50、60、70、80 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更短时间，无重大活性损失。
在一些情况下，术语“无重大活性损”是指脂质体Wnt多肽的功能活性接近于不存在脂质体时相应天然Wnt多肽的功能活性。在一些情况下，脂质体Wnt多肽的功能活性与天然Wnt多肽的功能活性相比，为至少约100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％或更高。在一些情况下，脂质体Wnt多肽的功能活性与天然Wnt多肽的功能活性相比，为至多约100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％或更低。在一些情况下，使用例如质谱法等测定法，与本文别处描述的生物标志物分析相关的测定法，移植手术例如肾包膜下移植手术、脊柱融合手术、ALP、TRAP和TUNEL染色，免疫组织化学法及显微CT分析和移植物生长量化来检测Wnt多肽的功能活性。
在一些情况下，术语“稳定”是指Wnt多肽呈折叠状态并且不会展开或降解。在一些情况下，术语“稳定”还指Wnt多肽保持功能活性，无重大活性损失。在一些情况下，用于测定稳定性的测定法，确定Wnt多肽的活性的测定法，如同以上描述的那些，并且包括例如基于LSL细胞的测定法例如基于小鼠LSL细胞的测定法。
在一些实施方案中，本文公开了一种使用陪伴分子制备脂质体Wnt多肽的方法。在一些情况下，所述方法包括(a)将分离的Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以产生Wnt多肽-陪伴分子复合物；(b)将Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离；并且(c)使Wnt多肽-陪伴分子复合物与脂质体水溶液接触以产生脂质体Wnt多肽。
在一些情况下，本文还公开了一种使用陪伴分子纯化Wnt多肽的方法。在一些情况下，所述方法包括：(a)将脂质体Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以形成脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物；(b)将脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离以产生纯化脂质体Wnt多肽；并且(c)从脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱脂质体Wnt多肽以产生纯化脂质体Wnt多肽。
在一些情况下，本文描述的陪伴分子包含利于大分子结构组装或拆卸的蛋白质或其片段。在一些情况下，陪伴分子包含利于纯化方法的蛋白质或其片段。如本文在Wnt多肽的上下文中所用，陪伴分子包含利于纯化分离的Wnt多肽和/或制备脂质体Wnt多肽的蛋白质或其片段。此外，如本文在Wnt多肽的上下文中所用，陪伴分子是体外添加到包含分离的Wnt多肽的溶液中的分离或外源蛋白质或其片段。在一些情况下，分离的Wnt多肽是已经从细胞溶液中收获并纯化的Wnt多肽。
在一些实施方案中，陪伴分子包含卷曲蛋白-8。FZD8基因编码的卷曲蛋白-8是七次跨膜结构域蛋白和Wnt多肽的受体。
在一些情况下，人卷曲蛋白-8(NCBI参考序列：NP_114072.1；SEQ ID NO:4)长度为694个氨基酸。在一些情况下，卷曲蛋白-8包含27个氨基酸的信号序列、248个氨基酸的细胞外N端和89个氨基酸的C端。在一些情况下，N端还包含两个假定N连接糖基化位点、聚脯氨酸区段和聚甘氨酸区段。另外，N端包含半胱氨酸富集结构域(CRD)，其长度为约120个氨基酸。卷曲蛋白-8的C端包含Thr-x-Val三肽、Lys-Thr-x-x-x-Trp基序和长度为25个氨基酸的聚甘氨酸重复序列。
在一些情况下，本文描述的卷曲蛋白-8多肽与人卷曲蛋白-8具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些情况下，本文描述的卷曲蛋白-8多肽与SEQ ID NO:4具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，本文描述的陪伴分子包含卷曲蛋白-8融合蛋白。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白。在一些情况下，截短卷曲蛋白-8蛋白包含卷曲蛋白-8的半胱氨酸富集区(CRD)。在一些情况下，截短卷曲蛋白-8蛋白包含跨越SEQID NO:4的氨基酸残基25至氨基酸残基172的区域。
在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白还包含抗体的Fc部分。在一些情况下，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些情况下，抗体为IgG。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白(例如，卷曲蛋白-8的CRD部分)和IgG Fc部分。
在一些情况下，截短卷曲蛋白-8蛋白直接与Fc部分共价连接。在其它情况下，截短卷曲蛋白-8蛋白通过接头间接与Fc部分共价连接。在一些情况下，接头包含一系列甘氨酸、丙氨酸或其组合。在一些情况下，接头包含氨基酸序列IEGRMD(SEQ ID NO:6)。
在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ IDNO:5具有至少80％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少96％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少97％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少98％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少99％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ IDNO:5具有至少100％序列同一性。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白由SEQ ID NO:5中所列的序列组成。
在一些实施方案中，本文描述的陪伴分子包含低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)或低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)。LRP5和LRP6为I型、单次跨膜糖蛋白，其充当Wnt蛋白家族的共受体。在一些情况下，LRP5包含一个24个氨基酸的信号序列、一个1361个氨基酸的胞外区、一个23个氨基酸的TM结构域和一个207个氨基酸的细胞质尾。在一些情况下，LRP6包含一个19个氨基酸的信号序列、一个1353个氨基酸的胞外区、一个23个氨基酸的TM区段和一个218个氨基酸的细胞质尾。在一些实施方案中，本文描述的陪伴分子为LRP6。
在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少10分钟或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少30分钟或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少1小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少2小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少3小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少4小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少5小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少6小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少10小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少12小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少18小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子温育至少24小时或更长时间。在一些情况下，分离的Wnt多肽从最少血清条件获得并且不存在脂质体。在其它情况下，在与陪伴分子一起温育以进一步纯化之前将分离的Wnt多肽配制成脂质体Wnt多肽。
在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间，介于约1℃和约8℃之间，或介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间，介于约15℃和约30℃之间，介于约20℃和约30℃之间，介于约23℃和约30℃之间，或介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约8℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约15℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约20℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约23℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽从最少血清条件获得并且不存在脂质体。在其它情况下，将分离的Wnt多肽配制成脂质体Wnt多肽。
在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少1℃、2℃、4℃、8℃、10℃、20℃、23℃、25℃或30℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少1℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少2℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少4℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少8℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少10℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少20℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少23℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少25℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子在至少30℃的温度下温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽从最少血清条件获得并且不存在脂质体。在其它情况下，在与陪伴分子一起温育以进一步纯化之前将分离的Wnt多肽配制成脂质体Wnt多肽。
在一些实施方案中，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4或约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:0.5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:1的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:1.5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:2的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:2.5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:3的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:4的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽和多个陪伴分子以约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。在一些情况下，分离的Wnt多肽从最少血清条件获得并且不存在脂质体。在其它情况下，在与陪伴分子一起温育以进一步纯化之前将分离的Wnt多肽配制成脂质体Wnt多肽。
在一些实施方案中，多个陪伴分子中的每一个进一步固定在珠粒上。在一些情况下，每个陪伴分子直接固定在珠粒上。在其它情况下，每个陪伴分子间接固定在珠粒上。
在一些实施方案中，多个陪伴分子中的每一个均包含卷曲蛋白-8融合蛋白。在一些情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白直接固定在珠粒上。在其它情况下，卷曲蛋白-8融合蛋白间接固定在珠粒上，其中卷曲蛋白-8融合蛋白与识别抗体Fc部分的多肽结合，并且其中多肽固定在珠粒上。在一些情况下，多肽为蛋白A。
在一些情况下，进行分离步骤以从多个珠粒上洗脱Wnt多肽-陪伴分子复合物和/或分离的Wnt多肽。在一些情况下，分离步骤以分批模式进行。在其它情况下，使用固定有陪伴分子/或与识别抗体Fc部分的多肽(例如，蛋白A)进一步结合的陪伴分子的柱进行分离步骤。在一些情况下，具有酸性pH的缓冲液用于分离步骤(或洗脱步骤)。在一些情况下，缓冲液的pH为约2、2.5、3、3.5、4、5或约6。在一些情况下，缓冲液的pH为约3。
在一些情况下，使用台阶梯度(step gradient)从多个珠粒上洗脱Wnt多肽-陪伴分子复合物和/或分离的Wnt多肽。在一些情况下，台阶梯度包含第一梯度和第二梯度。在一些情况下，第一梯度包含盐浓度至多为0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更低的第一缓冲液。在一些情况下，第一梯度包含盐浓度至少为0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更高的第一缓冲液。在一些情况下，构成第一梯度的第一缓冲液用作洗涤步骤以去除未结合的杂质(例如，未复合Wnt多肽和/或陪伴分子)。在一些实施方案中，至多使用1、2、3、4、5个或更多个洗涤步骤。在一些实施方案中，至少使用1、2、3、4、5个或更多个洗涤步骤。在一些实施方案中，第二梯度包含盐浓度至少为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更高的第二缓冲液。在一些实施方案中，第二梯度包含盐浓度至多为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更低的第二缓冲液。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钙、磷酸钾、磷酸镁、磷酸钠、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等。
在一些实施方案中，还将去垢剂配制到第一和/或第二缓冲液中。在一些实施方案中，去垢剂为CHAPS或Triton X-100。在一些实施方案中，CHAPS或Triton X-100的百分比为至少0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更高。在一些实施方案中，CHAPS或Triton X-100的百分比为至多0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更低。在一些情况下，使用缓冲液组分例如三(羟甲基)甲胺HCl(Tris-HCl)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO),4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES),3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-二(2-乙磺酸)(PIPES),2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)等。
在一些情况下，第一和/或第二缓冲液的pH为至少4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更高。在一些情况下，第一和/或第二缓冲液的pH为至多4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更低。
在一些情况下，使用附加洗脱步骤以从Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱分离的Wnt多肽。在一些情况下，洗脱缓冲液，例如包含如上所述的第一梯度和第二梯度和/或包含去垢剂，用于从Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱分离的Wnt多肽。
在一些情况下，使用脂质体水溶液从Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱分离的Wnt多肽以生成脂质体Wnt多肽。在一些情况下，陪伴分子为卷曲蛋白-8融合蛋白。在一些情况下，使用脂质体水溶液从Wnt多肽-卷曲蛋白-8复合物洗脱分离的Wnt多肽。
Wnt多肽组合物
提供了组合物，其中在无血清培养基或药学上可接受的赋形剂中提供分泌到无血清培养基中的生物活性Wnt多肽，浓度为至少约0.1μg/ml；至少约0.25μg/ml；至少约0.5μg/ml；至少约0.75μg/ml；至少约1μg/ml；至少约2.5μg/ml；至少约5μg/ml；至少约7.5μg/ml；至少约10μg/ml；至少约25μg/ml；至少约50μg/ml；至少约75μg/ml；至少约100μg/ml；至少约250μg/ml；至少约500μg/ml；至少约750μg/ml；至少约1mg/ml；至少约2.5mg/ml；至少约5mg/ml；至少约7.5mg/ml；至少约10mg/ml；至少约25mg/ml；至少约50mg/ml；至少约75mg/ml；至少约100mg/ml；或更高。
在一些实施方案中，在没有凝胶过滤纯化步骤的情况下通过使培养基在蓝色琼脂糖凝胶离子交换柱(Blue Sepharose ion-exchange column)上进行纯化来纯化通过本发明的方法和培养系统生成的Wnt多肽。在一个实施方案中，也在没有硫酸肝素柱的纯化步骤的情况下进行纯化。在另一个实施方案中，在蓝色琼脂糖凝胶离子交换柱上的纯化使用150mM至1.0M的盐梯度进行，其中所述盐可以是例如氯化钠或氯化钾。在其它实施方案中，通过使分离的Wnt多肽与陪伴分子复合，并从Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱分离的Wnt多肽来纯化Wnt多肽。纯化方案之后可以是配制到脂质体中。对于不同目的，例如稳定储存，可以冻干蛋白质。冻干优选对例如至少约1mg/ml的初始纯化制剂进行。可添加组分以提高蛋白质稳定性，例如脂质、去垢剂等。
通过本发明的方法和培养系统生成的蛋白质可以并入到各种用于治疗性施用的制剂中。一方面，通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂将试剂配制成药物组合物，并且配制成呈固体、半固体或液体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉剂、粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球等。因而，蛋白质和/或其它化合物的施用可以各种方式实现。蛋白质和/或其它化合物在施用或可以是系统性的或者可以依靠制剂，或通过使用作用以将活性剂量保持在植入部位的植入物而定位。
在药物剂型中，蛋白质和/或其它化合物可以呈其药学上可接受的盐的形式施用，或其也可单独使用或与其它药物活性化合物呈适当缔合以及呈组合使用。所述试剂可以组合以提供混合活性。以下方法和赋形剂是示例性的并且不得解释为限制本发明。
药物制剂呈单位剂型提供，其中术语“单位剂型”是指适合作为用于人类受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含预定量的蛋白质，计算的量足以联合药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物产生所需效果。本发明单位剂型的规格取决于采用的特定组合物和要达到的效果，及与宿主中的组合物相关的药效学。
药学上可接受的赋形剂，例如媒介物、佐剂、载体或稀释剂是市售。而且，药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、润湿剂等，是市售。用于本发明的方法和组合物中的任何化合物均可作为药学上可接受的碱加成盐提供。“药学上可接受的碱加成盐”是指保持游离酸的生物有效性和特性的那些盐，其并非是生物学或其它方面不良的。这些盐由无机碱或有机碱向游离酸的加成而制备。源自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙和镁盐。源自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等的盐。特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
根据正在治疗的患者和病状以及施用途径，对于普通人按0.001mg至500mg/kg体重/天，例如约0.1-100mg/kg体重/天，例如20mg/kg体重/天的剂量施用蛋白质。
技术人员将易于认识到剂量水平可随特定的酶、症状严重程度和受试者对副作用的易感性而变化。一些蛋白质比其它的更有效。指定酶的优选剂量可由本领域的技术人员通过各种手段容易地测定。优选的手段是测量指定化合物的生理效力。
本发明的组合物可用于预防以及治疗目的。如本文中所用，术语“治疗”是指预防疾病和治疗疾病或已有病状并且更通常地是指增强预期组织、部位、时间等的Wnt3A活性。本发明在持续疾病的治疗上提供了显著进展并且有助于稳定和/或改善患者的临床症状。理想地在受影响组织中的功能丧失之前进行此类治疗，但是也有助于恢复丧失的功能或预防功能进一步丧失。治疗效果的证据可以是疾病严重程度的任何降低或病状的改善，例如骨愈合增强等。可以根据临床结果来测量治疗效果或者可通过生物化学试验来测定。可选地，可以检查疾病症状的减轻。
在本发明的其它实施方案中，提供了细胞组合物，其中所述细胞包含含C端截短Wnt3A蛋白的表达载体，C端截短Wnt3A蛋白包含与启动子可操作连接，用于分泌的信号序列，其可为天然Wnt3A信号序列或异源信号序列。在一些实施方案中，细胞为CHO-S。在一些实施方案中，细胞作为包含无血清培养基的组合物提供。在其它实施方案中，细胞是冷冻且有活力的并且任选地在适于接种培养的等分试验中提供。
在容器，例如等分试样中提供细胞，浓度为约103个细胞/ml、104个细胞/ml、105个细胞/ml、106个细胞/ml、107个细胞/ml，至多约108个细胞/ml或更高。细胞可以在任何合适的培养基中冷冻以维持细胞活力，并且可包括DMSO。细胞组合物可以呈GMP形式提供，例如用于主细胞库或工作细胞库中的组合物，其源自限定条件和克隆史下的单一宿主细胞，然后分配到多个容器中。
在一些实施方案中，通过在功能测定法中例如β-连环蛋白(β-catenin)的稳定化，促进肝细胞的生长等，测定活性水平，在非功能测定法中例如免疫染色、ELISA、考马斯(coomasie)或银染色凝胶上的量化等，量化存在的Wnt蛋白的量并且测定生物活性Wnt与总Wnt的比率来测量组合物中Wnt蛋白的比活性。通常，如此定义的基本上均匀的组合物中的比活性将为原材料比活性的至少约5％，通常为原材料比活性的至少约10％，并且可为约25％、约50％、约90％或更高。
Wnt生物活性的测定法包括β-连环蛋白的稳定化，这可以通过例如连续稀释Wnt组合物来进行测量。Wnt生物活性的示例性测定法使Wnt组合物与细胞例如小鼠L细胞接触。培养细胞足以稳定β-连环蛋白的一段时间，通常为至少约1小时，并裂解。细胞裂解产物通过SDS PAGE分解，然后转移到硝酸纤维素中并用对β-连环蛋白有特异性的抗体探测。其它测定法包括在非洲蟾蜍属动物帽化测定中进行靶基因的C57MG转化和诱导。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了用于和本文描述的一种或多种方法、工艺和组合物一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或分区以容纳一个或多个容器例如小瓶、管等的容器，每个容器包含要用于本文描述的方法中的单独要素之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一些实施方案中，容器由各种材料例如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含包装材料。包装材料的实例包括但不限于瓶、管、包、容器、瓶和适合所选制剂及预期施用和治疗模式的任何包装材料。
例如，容器包括Wnt蛋白。此类试剂盒任选地包括关于其在本文描述的方法中的用途的标识性描述或标签或说明。
试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明，及带有使用说明的包装插页。通常还会包括一组说明。
在一个实施方案中，标签是在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，将形成标签的文字、数字或其它字符附着、模制或蚀刻到容器本身上时，标签是在容器上；当标签存在于也容纳容器的贮器或载体内时，标签与容器相关联，例如作为包装插页。在一个实施方案中，标签用于表明内容物将用于特定的治疗应用。标签还指示内容物的使用方向，例如用于本文描述的方法中。
以下非限制性实施例中提供了本发明的更多详情。
实施例1
人Wnt3A多肽的生成和向无血清培养基中的分泌
WNT3A是有效激活成人干细胞并刺激其自我更新和存活的脂质改性人干细胞生长因子。所述蛋白质通过糖基化和棕榈酰化经翻译后修饰。
同时采用两种通用方法来开发无血清方法；第一，尝试使血清表达细胞系逐渐适应无血清条件。第二，开发新的细胞系。对于第一种方法，试验至少5种单独的血清替代品以试图取代血清在WNT蛋白分泌中的作用。这些替代品包括市售Excite、Cell-Ess、脂质混合补充物和ITS补充物。对于第二种方法，严格评价了以下所有组合：1.鉴定用于生成WNT3A的GMP相容性细胞系，其包括CHO-K、CHO-S、DG44和TReX。2.检测两种编码WNT3A的cDNA克隆物(例如，BC103922和BC103921)。鉴定用于克隆的GMP相容性载体，其包括OpticVec、pTarget和pcDNA4TO。4.使用两种方法用于转染(稳定和瞬时)。5.检测两种方法进行诱导(多西环素和四环素)。所有这些方法均引起WNT3A从CHO细胞系强表达，但不分泌。在一些情况下，在条件培养基中发现极少量的WNT3A，但在任何情况下，这种蛋白质都未展现出功能。
图1-3进一步说明了第一种方法。图1说明了在血清替代品Excyte的存在下和降低血清浓度时的Wnt3A活性。Wnt多肽来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体。使用双光报告因子测定法分析来自适应于5％血清+excyte(蓝色虚线柱)、3％血清+excyte(红色虚线柱)和2％血清+excyte(紫色虚线柱)的细胞的条件培养基中的Wnt3A活性。将这种活性与来自适应于5％血清(蓝色实线柱)、3％血清(红色实线柱)和2％血清(紫色实线柱)的细胞而未补充excyte的条件培养基的活性进行比较。将来自于在10％血清中(橙色柱)生长的细胞的条件培养基用作阳性对照。与10％FBS相比，来自适应于2％血清和2％血清+excyte的细胞的条件培养基的活性降至6.4％。降低血清浓度导致条件培养基中的Wnt3A活性降低。添加Excyte对条件培养基中的Wnt3A活性并无影响。
图2显示了在血清替代品CellEss的存在下和降低血清浓度时的Wnt3A活性。Wnt3A多肽来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体。使用双光报告因子测定法分析来自适应于补充了Excyte的7.5％和5％血清的细胞的条件培养基中的Wnt3A活性。将这种活性与来自在10％血清中生长的细胞的条件培养基中的Wnt3A活性进行比较。培养基中CellEss的存在不能恢复条件培养基中的Wnt3A活性。
图3显示了来自于编码SEQ ID NO:1中所列蛋白质序列的表达载体的Wnt3A活性。首先使细胞适应于炭处理的单次FBS(OS FBS)。在来自适应于OSFBS的细胞的条件培养基中未测量到可检测活性。适应OSFBS后，为OSFBS补充ITS3或脂质混合物1。使用LSL双光报告因子测定法测试条件培养基中的WNT3A活性。与阳性对照(10％FBS)相比时，来自适应于OSFBS+ITS样品的细胞的条件培养基展示出～10％的活性。与阳性对照(10％FBS)相比时，来自适应于OSFBS+脂质混合物样品的细胞的条件培养基展示出26％的活性。
在第二种方法中，开发了允许在不存在血清的情况下Wnt3A有效分泌的培养条件。鉴定CHO-K1衍生细胞系(例如，CHO-S)，其在无血清条件下有效分泌Wnt3A。用含有WNT3AcDNA(编码智人无翼型MMTV整合位点家族成员3A的BC103922，mRNA完整编码序列)的pcDNA4.0载体瞬时转染CHO-S细胞。从细胞收获的条件培养基(CM)适用于WNT报告(LSL)细胞；经GFP表达质粒转染的CHO-S细胞用作对照。这种活性测定法连同对CM的蛋白质印迹分析一起证明在不存在血清或任何其它动物组分的情况下Wnt3A分泌。
在诱导后的第3天至第13天之间收集来自CHO细胞培养物的条件培养基(CM)并汇合。基于每天对CM中蛋白质产量的分析，确定这个天数范围在本实施例中所用的培养条件下是最佳的。在这些条件下，在第3-13天之间出现最高蛋白质产量，而在第13天后细胞开始死亡。
实施例2
基于小鼠LSL细胞的测定法
用Wnt反应性荧光素酶报告质粒pSuperTOPFlash(Addgene)和组成型LacZ表达构建体pEF/Myc/His/LacZ(Invitrogen)稳定转染小鼠LSL细胞以将将β-半乳糖苷酶活性标准化为细胞数。用以上两种质粒稳定转染人胚肾上皮(HEK293T)细胞。除非另有说明，否则以150uL总体积中有10uL的浓度，在补充了10％FBS(Gibco)和1％P/S(Cellgro)的DMEM中用L-WNT3A处理细胞(50000个细胞/孔，96孔板)。还包括纯化WNT3A蛋白的连续稀释。
细胞在37℃、5％CO2下温育过夜，然后洗涤，用裂解缓冲液(Applied Biosystems)裂解，并且使用双光联合报告基因测定系统(Applied Biosysytems)量化荧光素酶和β-半乳糖苷酶表达水平。在双光即用型发光计(Berthold)上以一式三份的读数量化生物发光。由通过WNT3A蛋白质的连续稀释生成的标准曲线定义WNT3A(ng/uL)和L-WNT3A的活性。在涉及时程的实验中，将WNT3A活性表示为百分比活性。百分比活性计算如下：
L-WNT3A剂量反应曲线使用原代MEF。LSL和HEK293T细胞经工程化为对Wnt和Wnt激动剂最大限度地敏感并且因此可能未提供关于剂量、药物作用和临床反应之间的关系的有意义的数据。为了更严密地模拟对Wnt刺激的体内细胞反应，使用Wnt靶基因Axin2的表达作为途径活性的量度来测定小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
实施例3
WNT3A的脂质重构
许多蛋白质在高温下变性，并且在体温下避免此类变性是延长蛋白质治疗剂持续时间的关键。脂质体包装保留了Wnt3A的生物活性，并且这种制剂在多种骨损伤应用中具有功效。纯化后，重组Wnt3A重构成由DMPC和胆固醇组成的脂质囊泡。
在一些方面中，L-WNT3A制剂将用于研究性新药(IND)I期研究中以治疗骨延迟愈合的高风险患者的骨缺损。在一些情况下，收获自体骨移植物材料(BGM)，离体用L-WNT3A处理，然后洗涤并团块化。在一些情况下，所得材料，即活化BGM(例如，BGMACT)被视为药物产品并且可立即使用。在一些情况下，L-WNT3A不会直接施用给患者，而仅用于离体激活自体细胞。在一些情况下，对于所述程序的初始阶段，预期所述制剂将满足全身施用型脂质体蛋白制剂的可接受标准(纯度、稳定性等)。
实施例4
扩大实验
将来自冰箱原液的细胞接种到15cm组织培养板上。在37℃、5％CO2下温育3-4天后，将细胞1:5展开到2x15cm平板中4天。将这些细胞进一步1:5扩增到20x15cm平板中。温育24小时后，用多西环素诱导细胞。每24小时收集一次CM并在4℃下储存。测量CM的活性以确认WNT3A分泌。将1％TritonX添加到1L CM中并通过0.22μm过滤器过滤。然后将CM装载到150ml蓝色琼脂糖凝胶柱上。从该试验中，将80μg的WNT3A洗脱在一定梯度的KCl中。
实施例5
CHO细胞系中Wnt3A多肽的生成和分泌
开发了CHO-K1衍生(例如，CHO-S)细胞系，其在无血清条件下分泌Wnt3A。用含有WNT3A cDNA BC103922的pcDNA4.0载体瞬时转染CHO-S细胞。2天后收获条件培养基(CM)。为了检测WNT3A活性，用CM处理WNT报告细胞(LSL)；用GFP表达质粒转染的CHO-S细胞作为对照。
图5中所示的活性测定法显示来自用GFP质粒对照转染的CHO细胞的CM在LSL报告因子测定法中表现出基线活性(图5A，泳道2和图5B，泳道2)。来自用BC103922cDNA转染的CHO细胞的CM在LSL测定法中表现出升高的活性，并且W蛋白质印迹分析证实存在在与WNT3A相同的分子量下运行的条带(图5B，泳道1和泳道3)。已经进行了另外的表征。用0.8mg/mL或1.0mg/mL博来霉素(zeocin)选择细胞。所得细胞在无血清条件下生长。收集并浓缩CM。使用LSL测定法测量活性，并与纯化WNT3A的活性进行比较(图6，浅蓝色柱)。在0.8mg/mL博来霉素选择下，即使CM浓缩，在克隆物中也未检测到活性(图6，中蓝色柱)。在使用1.0mg/ml博来霉素选择分离的克隆物中检测到活性(图6，深蓝色柱)。
实施例6
用卷曲蛋白-8融合蛋白纯化Wnt3A多肽
利用卷曲蛋白-8融合蛋白-蛋白A纯化方案纯化Wnt3A(图7)。首先，将包含蛋白A固定珠粒的树脂按50μL和25μL体积等分到两支Eppendorf管中。每支管中的树脂进一步用20个柱体积的PBS洗涤。向每支管中添加约10μL的卷曲蛋白-8融合蛋白，最终浓度分别为约50μg卷曲蛋白-8/1mL蛋白A或100μg卷曲蛋白-8/1mL蛋白A。将卷曲蛋白-8融合蛋白在4℃下温育约1.5至2小时。温育后，用PBS去除未结合的卷曲蛋白-8融合蛋白。
接下来，在4℃下在含卷曲蛋白-8融合蛋白-蛋白A树脂的两支管中的一支中温育约100ng于具有1％CHAPS的PBS中的Wnt3A约1.5至2小时。温育后，用包含1％CHAPS的PBS缓冲液去除未结合的Wnt3A。第二支管用作对照。
图8说明了显示卷曲蛋白-8融合蛋白与蛋白A固定珠粒的预复合的示意图。
图9说明了显示卷曲蛋白-8-Fc与蛋白A以两个不同比率复合的蛋白质印迹。
图10说明了显示使用卷曲蛋白-8融合蛋白-蛋白A策略纯化的Wnt3A的蛋白质印迹。
实施例7
卷曲蛋白8和脂质体共享Wnt3A上的相同结合位点
与小鼠卷曲蛋白8半胱氨酸富集结构域(Fz8-CRD)复合的非洲爪蟾Wnt8(XWnt8)的晶体结构证明Wnt8脂质修饰与Fz8-CRD上的沟接合，接触9个Fz8残基并穿过Fz8-CRD上的裂缝(PMID：22653731)。基于非洲爪蟾Wnt8的晶体结构，假设脂质体通过与Wnt脂质修饰直接相互作用而维持Wnt3A呈活性构象，并且脂质体双层在空间上保护脂质修饰免受亲水环境影响。为了测试该假设，首先将Wnt3A重构到脂质体内(L-Wnt3A)，然后将Fz8添加到L-Wnt3A溶液中。将样品超速离心以分离脂质体缔合蛋白和未结合的蛋白质。使用Fz8和Wnt3A抗体的蛋白质印迹分析证明，～98％的Fz8存在于上清液中，未与脂质体团块缔合(浅灰色柱，图11A)，并且100％的Wnt3A与脂质体团块缔合(深灰色柱，图11A)。为了测试这些相互作用动力学是否随时间而变化，将L-Wnt3A与Fz8在室温(RT)下温育12小时。在这些条件下，94.5％的Fz8存在于上清液中(浅灰色Fz8柱，图12A)，并且11％的Wnt3A存在于富含Fz8的上清液(浅灰色Wnt3A柱，图12A)中，而在脂质体团块中观察到～89％Wnt3A(深灰色Wnt3A柱，图12A)。这些结果显示Fz8和脂质体之间竞争结合Wnt3A，表明Wnt3A上的Fz8结合结构域被脂质体阻塞，并且Wnt3A基于其亲和力分离。
为了进一步测试该假设，首先将Fz8与Wnt3A一起温育以促进Fz8-Wnt3A相互作用。在4℃下温育12小时后，添加脂质体，并将样品在23℃下进一步温育6小时。将这些样品超速离心以将脂质体缔合蛋白与未缔合蛋白分离。如图11A中所观察到的，蛋白质印迹分析显示>99％的Fz8蛋白存在于上清液中(浅灰色柱，图11B)。然而，在这些温育条件下，Wnt3A的分布发生变化：93％的Wnt3A的存在于上清液中，而只有7％的Wnt3A与脂质体团块缔合。这些结果显示Fz8和脂质体竞争结合Wnt3A上的相同结构域。
接下来，将Wnt3A、脂质体和Fz8在室温下温育6小时。在室温下温育Wnt3A和脂质体6小时后，～90％的Wnt活性和Wnt蛋白与脂质体团块(PMID:24400074)缔合。在这些温育条件下，约92％的Fz8存在于上清液中(图11C，浅灰色柱)，并且8％的Fz8存在于颗粒中(图11C，深灰色柱)。约62％的Wnt3A存在于团块中(图11C，深灰色柱)，而不是仅Wnt3A和脂质体一起温育时(PMID：24400074)时的约90％。约38％的Wnt3A存在于具有Fz8的上清液成分中，但是如果温育12小时，则在上清液中观察到70％的Wnt3A(浅灰色Wnt3A柱，图12C)。将Wnt3A分级分离到脂质体中或与Fz8一起存在于上清液中。
实施例8
Wnt3A上的Lrp6结合位点未被脂质体阻塞
将L-Wnt3A与Lrp6在室温下温育6小时。将样品超速离心以从团块中的脂质体缔合成分中去除上清液中的脂质体未缔合蛋白。观察到约62％的Lrp6与团块中的脂质体缔合(图13A)。在上清液中观察到约38％(图13A)。在团块中观察到约100％的L-Wnt3A(图13A)。大部分Lrp6连同Wnt3A和脂质体一起发现于团块中，表明Lrp6与未被脂质体阻塞的位点结合。接下来，将Wnt3A与Lrp6在4℃预温育12小时以促进Lrp6-Wnt3A相互作用。将这种蛋白质复合物在室温下与脂质体一起温育6小时，然后超速离心以将脂质体缔合成分与未缔合成分分离。>96％的Lrp6存在于上清液中(图13B)，而仅约3.8％的Lrp6与脂质体团块缔合存在(图13B)。在这些温育条件下，约34％的Wnt3A存在于富含Lrp6的上清液成分中(图13B)。约66％的Wnt3A存在于脂质体团块中(图13B)，而不是如图13A中观察到的100％。
假设Wnt3A基于其对脂质体和Lrp6的亲和力而分离。为了测试这种Wnt3A，将Lrp6和脂质体在23℃下一起温育6小时。上清液和团块的蛋白质印迹分析显示，约90％的Lrp6存在于上清液中(图13C)，并且约11％存在于脂质体团块中(图13C)。约20％的Wnt3A存在于上清液中(图13C)。在这些条件下，当与图13B中的条件相比时，更多的Wnt3A(70.8％对比61.5％)与脂质体团块缔合(图13C)，表明Wnt3A对LRP6的结合亲和力比对脂质体的低。与涉及Fz8温育的实验结果相反(图11C、图12C)，温育更长时间(12小时)并不影响Lrp6和Wnt3A分布(图14C)。这些实验证明Lrp6结合Wnt3A上位于暴露于溶剂的区域中的位点，并且Wnt3A对LRP6的结合亲和力比对脂质体的低。
实施例9
下表说明了本申请中公开的卷曲蛋白-8和卷曲蛋白-8融合蛋白序列。
尽管在前面的描述中参考某些实施方案说明了本发明，但是本发明不限于此。实际上，除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且属于所附权利要求的范围内。
序列表
<110> The Board of Trustees-Leland Stanford Junior University
Helms, Jill
Dhamdhere, Girija
Liu, Bo
Smith, Andrew
Gomez, Alan
<120> Wnt组合物及无血清合成方法
<130> STAN-1218WO
<150> US 62/288,365
<151> 2016-01-28
<160> 6
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 385
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Pro Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
35 40 45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
50 55 60
Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
100 105 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
115 120 125
Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu
145 150 155 160
Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
165 170 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
180 185 190
Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
195 200 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
210 215 220
Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225 230 235 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
245 250 255
Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val
260 265 270
Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
275 280 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile
290 295 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala
305 310 315 320
Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr
325 330 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
340 345 350
Asn Pro Gly Ser Arg Ala Gly Asn Ser Ala His Gln Pro Pro His Pro
355 360 365
Gln Pro Pro Val Arg Phe His Pro Pro Leu Arg Arg Ala Gly Lys Val
370 375 380
Pro
385
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Pro Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
35 40 45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
50 55 60
Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
100 105 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
115 120 125
Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu
145 150 155 160
Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
165 170 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
180 185 190
Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
195 200 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
210 215 220
Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225 230 235 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
245 250 255
Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val
260 265 270
Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
275 280 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile
290 295 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala
305 310 315 320
Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr
325 330 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
340 345 350
<210> 3
<211> 2826
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
atggccccac tcggatactt cttactcctc tgcagcctga agcaggctct gggcagctac 60
ccgatctggt ggtcgctggc tgttgggcca cagtattcct ccctgggctc gcagcccatc 120
ctgtgtgcca gcatcccggg cctggtcccc aagcagctcc gcttctgcag gaactacgtg 180
gagatcatgc ccagcgtggc cgagggcatc aagattggca tccaggagtg ccagcaccag 240
ttccgcggcc gccggtggaa ctgcaccacc gtccacgaca gcctggccat cttcgggccc 300
gtgctggaca aagctaccag ggagtcggcc tttgtccacg ccattgcctc agccggtgtg 360
gcctttgcag tgacacgctc atgtgcagaa ggcacggccg ccatctgtgg ctgcagcagc 420
cgccaccagg gctcaccagg caagggctgg aagtggggtg gctgtagcga ggacatcgag 480
tttggtggga tggtgtctcg ggagttcgcc gacgcccggg agaaccggcc agatgcccgc 540
tcagccatga accgccacaa caacgaggct gggcgccagg ccatcgccag ccacatgcac 600
ctcaagtgca agtgccacgg gctgtcgggc agctgcgagg tgaagacatg ctggtggtcg 660
caacccgact tccgcgccat cggtgacttc ctcaaggaca agtacgacag cgcctcggag 720
atggtggtgg agaagcaccg ggagtcccgc ggctgggtgg agaccctgcg gccgcgctac 780
acctacttca aggtgcccac ggagcgcgac ctggtctact acgaggcctc gcccaacttc 840
tgcgagccca accctgagac gggctccttc ggcacgcgcg accgcacctg caacgtcagc 900
tcgcacggca tcgacggctg cgacctgctg tgctgcggcc gcggccacaa cgcgcgagcg 960
gagcggcgcc gggagaagtg ccgctgcgtg ttccactggt gctgctacgt cagctgccag 1020
gagtgcacgc gcgtctacga cgtgcacacc tgcaagtagg caccggccgc ggctccccct 1080
ggacggggcg ggccctgcct gagggtgggc ttttccctgg gtggagcagg actcccacct 1140
aaacggggca gtactcctcc ctgggggcgg gactcctccc tgggggtggg gctcctacct 1200
gggggcagaa ctcctacctg aaggcagggc tcctccctgg agctagtgtc tcctctctgg 1260
tggctgggct gctcctgaat gaggcggagc tccaggatgg ggaggggctc tgcgttggct 1320
tctccctggg gacggggctc ccctggacag aggcggggct acagattggg cggggcttct 1380
cttgggtggg acagggcttc tcctgcgggg gcgaggcccc tcccagtaag ggcgtggctc 1440
tgggtgggcg gggcactagg taggcttcta cctgcaggcg gggctcctcc tgaaggaggc 1500
ggggctctag gatggggcac ggctctgggg taggctgctc cctgagggcg gagcgcctcc 1560
ttaggagtgg ggttttatgg tggatgaggc ttcttcctgg atggggcaga gcttctcctg 1620
accagggcaa ggccccttcc acgggggctg tggctctggg tgggcgtggc ctgcataggc 1680
tccttcctgt gggtggggct tctctgggac caggctccaa tggggcgggg cttctctccg 1740
cgggtgggac tcttccctgg gaaccgccct cctgattaag gcgtggcttc tgcaggaatc 1800
ccggctccag agcaggaaat tcagcccacc agccacctca tccccaaccc cctgtaaggt 1860
tccatccacc cctgcgtcga gctgggaagg ttccatgaag cgagtcgggt ccccaacccg 1920
tgcccctggg atccgagggc ccctctccaa gcgcctggct ttggaatgct ccaggcgcgc 1980
cgacgcctgt gccacccctt cctcagcctg gggtttgacc acccacctga ccaggggccc 2040
tacctgggga aagcctgaag ggcctcccag cccccaaccc caagaccaag cttagtcctg 2100
ggagaggaca gggacttcgc agaggcaagc gaccgaggcc ctcccaaaga ggcccgccct 2160
gcccgggctc ccacaccgtc aggtactcct gccagggaac tggcctgctg cgccccaggc 2220
cccgcccgtc tctgctctgc tcagctgcgc ccccttcttt gcagctgccc agcccctcct 2280
ccctgccctc gggtctcccc acctgcactc catccagcta caggagagat agaagcctct 2340
cgtcccgtcc ctccctttcc tccgcctgtc cacagcccct taagggaaag gtaggaagag 2400
aggtccagcc ccccaggctg cccagagctg ctggtctcat ttgggggcgt tcgggaggtt 2460
tggggggcat caaccccccg actgtgctgc tcgcgaaggt cccacagccc tgagatgggc 2520
cggccccctt cctggcccct catggcggga ctggagaaat ggtccgcttt cctggagcca 2580
atggcccggc ccctcctgac tcatccgcct ggcccgggaa tgaatgggga ggccgctgaa 2640
cccacccggc ccatatccct ggttgcctca tggccagcgc ccctcagcct ctgccactgt 2700
gaaccggctc ccaccctcaa ggtgcgggga gaagaagcgg ccaggcgggg cgccccaaga 2760
gcccaaaaga gggcacaccg ccatcctctg cctcaaattc tgcgtttttg gttttaatgt 2820
tatatc 2826
<210> 4
<211> 694
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gln Arg Ser Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ala Lys Glu
20 25 30
Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile Gly Tyr
35 40 45
Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu
50 55 60
Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys
65 70 75 80
Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys
85 90 95
Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu
100 105 110
Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala
115 120 125
Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly Asn Pro
130 135 140
Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Thr Thr Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ser Pro Pro Arg Arg Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gly Glu Gln Pro
165 170 175
Pro Ser Gly Ser Gly His Gly Arg Pro Pro Gly Ala Arg Pro Pro His
180 185 190
Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ala Ala Ala Pro Pro
195 200 205
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Ala Arg Pro Pro Gly Gly Gly
210 215 220
Ala Ala Pro Cys Glu Pro Gly Cys Gln Cys Arg Ala Pro Met Val Ser
225 230 235 240
Val Ser Ser Glu Arg His Pro Leu Tyr Asn Arg Val Lys Thr Gly Gln
245 250 255
Ile Ala Asn Cys Ala Leu Pro Cys His Asn Pro Phe Phe Ser Gln Asp
260 265 270
Glu Arg Ala Phe Thr Val Phe Trp Ile Gly Leu Trp Ser Val Leu Cys
275 280 285
Phe Val Ser Thr Phe Ala Thr Val Ser Thr Phe Leu Ile Asp Met Glu
290 295 300
Arg Phe Lys Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Ala Cys Tyr
305 310 315 320
Leu Phe Val Ser Val Gly Tyr Leu Val Arg Leu Val Ala Gly His Glu
325 330 335
Lys Val Ala Cys Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly
340 345 350
Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly
355 360 365
Gly Pro Gly Gly Arg Gly Glu Tyr Glu Glu Leu Gly Ala Val Glu Gln
370 375 380
His Val Arg Tyr Glu Thr Thr Gly Pro Ala Leu Cys Thr Val Val Phe
385 390 395 400
Leu Leu Val Tyr Phe Phe Gly Met Ala Ser Ser Ile Trp Trp Val Ile
405 410 415
Leu Ser Leu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Gly Met Lys Trp Gly Asn Glu
420 425 430
Ala Ile Ala Gly Tyr Ser Gln Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Leu Val
435 440 445
Pro Ser Val Lys Ser Ile Ala Val Leu Ala Leu Ser Ser Val Asp Gly
450 455 460
Asp Pro Val Ala Gly Ile Cys Tyr Val Gly Asn Gln Ser Leu Asp Asn
465 470 475 480
Leu Arg Gly Phe Val Leu Ala Pro Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ile Gly
485 490 495
Thr Met Phe Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg Ile Arg Ser
500 505 510
Val Ile Lys Gln Gln Asp Gly Pro Thr Lys Thr His Lys Leu Glu Lys
515 520 525
Leu Met Ile Arg Leu Gly Leu Phe Thr Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala
530 535 540
Ala Val Val Val Ala Cys Leu Phe Tyr Glu Gln His Asn Arg Pro Arg
545 550 555 560
Trp Glu Ala Thr His Asn Cys Pro Cys Leu Arg Asp Leu Gln Pro Asp
565 570 575
Gln Ala Arg Arg Pro Asp Tyr Ala Val Phe Met Leu Lys Tyr Phe Met
580 585 590
Cys Leu Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Val Trp Val Trp Ser Gly Lys
595 600 605
Thr Leu Glu Ser Trp Arg Ser Leu Cys Thr Arg Cys Cys Trp Ala Ser
610 615 620
Lys Gly Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ala Gly Gly
625 630 635 640
Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly
645 650 655
Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Tyr Ser Asp Val Ser Thr Gly
660 665 670
Leu Thr Trp Arg Ser Gly Thr Ala Ser Ser Val Ser Tyr Pro Lys Gln
675 680 685
Met Pro Leu Ser Gln Val
690
<210> 5
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gln Arg Ser Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ala Lys Glu
20 25 30
Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile Gly Tyr
35 40 45
Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu
50 55 60
Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys
65 70 75 80
Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys
85 90 95
Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu
100 105 110
Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala
115 120 125
Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly Asn Pro
130 135 140
Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
145 150 155 160
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
165 170 175
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
180 185 190
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
195 200 205
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
210 215 220
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
225 230 235 240
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
245 250 255
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
260 265 270
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
275 280 285
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
290 295 300
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
305 310 315 320
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
325 330 335
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
340 345 350
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
355 360 365
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370 375 380
Lys
385
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Ile Glu Gly Arg Met Asp
1 5

Claims (129)

1.一种Wnt培养系统，其包含：
最少血清培养基；
分泌到所述最少血清培养基中的生物活性Wnt多肽；及
来自于受编码所述生物活性Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞，其中所述细胞在所述最少血清培养基的存在下生长。
2.根据权利要求1所述的培养系统，其中所述工程化细胞系为cGMP相容性细胞系。
3.根据权利要求1或2所述的培养系统，其中所述cGMP相容性细胞系为cGMP相容性哺乳动物细胞系。
4.根据权利要求3所述的培养系统，其中所述cGMP相容性哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。
5.根据权利要求3或4所述的培养系统，其中所述cGMP相容性哺乳动物细胞系为CHO-K1衍生细胞系。
6.根据权利要求1或2所述的培养系统，其中所述cGMP相容性细胞系为cGMP相容性昆虫细胞系。
7.根据权利要求6所述的培养系统，其中所述cGMP相容性昆虫细胞系为Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的培养系统，其中所述表达载体为cGMP相容性载体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的培养系统，其中所述表达载体为哺乳动物载体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的培养系统，其中所述哺乳动物载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0、UCOE表达载体或GS系统表达载体。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的培养系统，其中所述表达载体为昆虫细胞表达载体。
12.根据权利要求1-8或11中任一项所述的培养系统，其中所述昆虫细胞表达载体为pIEx或pBiEx载体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的培养系统，其中所述Wnt多肽包含异源信号序列。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的培养系统，其中所述Wnt多肽包含天然信号序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的培养系统，其中所述Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5B多肽或Wnt10B多肽。
16.根据权利要求15所述的培养系统，其中所述Wnt多肽为Wnt3A多肽。
17.根据权利要求15或16所述的培养系统，其中所述Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:1具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的培养系统，其中所述Wnt3A多肽是包含约1至约33个氨基酸截短的多肽。
19.根据权利要求18所述的培养系统，其中所述截短为C端截短。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的培养系统，其中所述Wnt3A多肽是具有C端截短的SEQ ID NO:1的多肽。
21.根据权利要求15或16所述的培养系统，其中所述Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:2具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。
22.根据权利要求15或16所述的培养系统，其中所述Wnt3A多肽是由SEQ ID NO:2组成的多肽。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的培养系统，其中在所述培养基中所述分泌的生物活性Wnt3A多肽的浓度为至少约10ng/mL。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的培养系统，其中所述培养基为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15日龄。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基为减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。
26.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基为无动物组分培养基。
27.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基基本上不含非人血清。
28.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基基本上不含非人蛋白。
29.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基包含少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清。
30.根据权利要求1-24中任一项所述的培养系统，其中所述培养基包含0％血清。
31.根据权利要求29或30所述的培养系统，其中所述血清为胎牛血清。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的培养系统，其中所述培养基还包含血清替代品。
33.根据权利要求32所述的培养系统，其中所述血清替代品包含CellEss、ITS、Excyte、OneShot或Knockout。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的培养系统，其中所述培养基基本上不含外源因子。
35.根据权利要求34所述的培养系统，其中所述外源因子包含病原体、传染性海绵状脑病(TSE)因子或其组合。
36.一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括：
a)将分离的Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以产生Wnt多肽-陪伴分子复合物；
b)将所述Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离；并且
c)使所述Wnt多肽-陪伴分子复合物与脂质体水溶液接触以产生所述脂质体Wnt多肽。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述多个陪伴分子包含卷曲蛋白-8。
38.根据权利要求36所述的方法，其中来自所述多个陪伴分子的每个陪伴分子均包含卷曲蛋白-8融合蛋白。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述截短卷曲蛋白-8蛋白包含卷曲蛋白-8的半胱氨酸富集区(CRD)。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述截短卷曲蛋白-8蛋白包含跨越SEQ ID NO:4的氨基酸残基25至氨基酸残基172的区域。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白还包含IgG Fc部分。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子温育至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时或更长时间。
45.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约1℃和约30℃之间的温度下温育。
46.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间，介于约1℃和约8℃之间，或介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间，介于约15℃和约30℃之间，介于约20℃和约30℃之间，介于约23℃和约30℃之间，或介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。
48.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子在至少1℃、2℃、4℃、8℃、10℃、20℃、23℃、25℃或30℃的温度下温育。
49.根据权利要求36所述的方法，其中所述多个陪伴分子中的每一个进一步固定在珠粒上。
50.根据权利要求36所述的方法，其中所述多个陪伴分子中的每一个进一步间接固定在珠粒上，其中每个陪伴分子与识别抗体Fc部分的多肽结合，并且其中所述多肽固定在所述珠粒上。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多肽为蛋白A。
52.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽和所述多个陪伴分子以约1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4或约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。
53.根据权利要求36所述的方法，其中所述Wnt多肽和所述多个陪伴分子以约1:2.5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。
54.根据权利要求36所述的方法，其中所述步骤b)的分离包括用pH为约3.0的缓冲液洗脱所述分离的Wnt多肽-陪伴分子复合物。
55.根据权利要求36所述的方法，其中包含所述脂质体的磷脂具有介于约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长。
56.根据权利要求36所述的方法，其中所述脂质体在介于约6.5和约8.0，约7.0和约7.8，或约7.2和约7.6之间的pH下具有0净电荷。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述磷脂为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)。
58.根据权利要求36所述的方法，其中所述脂质体还包含胆固醇。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中DMPC和胆固醇的浓度按介于约70:30和约100:0之间的比率来限定。
60.根据权利要求36所述的方法，其中所述步骤a)的温育还包括从根据权利要求1-35所述的Wnt培养系统中收获所述分离的Wnt多肽。
61.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽是分离的Wnt5B多肽或分离的Wnt10B多肽。
62.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽是分离的Wnt3A多肽。
63.一种纯化Wnt多肽的方法，其包括：
a)将脂质体Wnt多肽与多个陪伴分子一起温育以形成脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物；
b)将所述脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物与未复合陪伴分子分离；并且
c)从所述脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物洗脱所述脂质体Wnt多肽以产生纯化脂质体Wnt多肽。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述多个陪伴分子包含卷曲蛋白-8。
65.根据权利要求63所述的方法，其中来自所述多个陪伴分子的每个陪伴分子均包含卷曲蛋白-8融合蛋白。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白包含截短卷曲蛋白-8蛋白。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述截短卷曲蛋白-8蛋白包含卷曲蛋白-8的半胱氨酸富集区(CRD)。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述截短卷曲蛋白-8蛋白包含跨越SEQ ID NO:4的氨基酸残基25至氨基酸残基172的区域。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白还包含IgG Fc部分。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
71.根据权利要求63所述的方法，其中所述多个陪伴分子包含低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Lrp6)。
72.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子温育至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时或更长时间。
73.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约1℃和约30℃之间的温度下温育。
74.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约1℃和约10℃之间，介于约1℃和约8℃之间，或介于约1℃和约4℃之间的温度下温育。
75.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子在介于约10℃和约30℃之间，介于约15℃和约30℃之间，介于约20℃和约30℃之间，介于约23℃和约30℃之间，或介于约25℃和约30℃之间的温度下温育。
76.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子在至少1℃、2℃、4℃、8℃、10℃、20℃、23℃、25℃或30℃的温度下温育。
77.根据权利要求65所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白进一步固定在珠粒上。
78.根据权利要求65所述的方法，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白进一步间接固定在珠粒上，其中所述卷曲蛋白-8融合蛋白与识别所述Fc部分的多肽结合，并且其中所述多肽固定在所述珠粒上。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述多肽为蛋白A。
80.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽和所述多个陪伴分子以约1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4或约1:5的Wnt多肽:陪伴分子比率温育。
81.根据权利要求63所述的方法，其中所述步骤b)的分离包括用缓冲液洗脱所述脂质体Wnt多肽-陪伴分子复合物，其中所述缓冲液任选地具有约3.0的pH。
82.根据权利要求63所述的方法，其中包含所述脂质体的磷脂具有介于约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长。
83.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体在介于约6.5和约8.0，约7.0和约7.8，或约7.2和约7.6之间的pH下具有0净电荷。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述磷脂为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)。
85.根据权利要求63所述的方法，其中所述脂质体还包含胆固醇。
86.根据权利要求84或85所述的方法，其中DMPC和胆固醇的浓度按介于约70:30和约100:0之间的比率来限定。
87.根据权利要求63所述的方法，其中所述步骤a)中的温育还包括使获自根据权利要求1-35所述的Wnt培养系统的分离的Wnt多肽与脂质体水溶液接触以产生所述脂质体Wnt多肽。
88.根据权利要求63所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽是分离的Wnt5B多肽或分离的Wnt10B多肽。
89.根据权利要求63所述的方法，其中所述分离的Wnt多肽是分离的Wnt3A多肽。
90.一种在最少血清条件下生成生物活性Wnt多肽的体外方法，其包括：
a)在所述最少血清条件下培养来自于受编码Wnt多肽的表达载体转染的工程化细胞系的细胞；并且
b)在所述最少血清条件下从所述培养基中收集分泌的Wnt多肽。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述工程化细胞系为cGMP相容性细胞系。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述cGMP相容性细胞系为cGMP相容性哺乳动物细胞系。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述cGMP相容性哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述cGMP相容性哺乳动物细胞系为CHO-K1衍生细胞系。
95.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述cGMP相容性细胞系为cGMP相容性昆虫细胞系。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述cGMP相容性昆虫细胞系为Sf9细胞系、Sf21细胞系、Tn-368细胞系或High Five(BTI-TN-5B1-4)细胞系。
97.根据权利要求90-96中任一项所述的方法，其中所述细胞作为贴壁或悬浮培养物生长。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述细胞生长达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，之后从所述培养基中收集所述分泌的Wnt多肽。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的方法，其中所述表达载体为cGMP相容性载体。
100.根据权利要求90-99中任一项所述的方法，其中所述表达载体为哺乳动物载体。
101.根据权利要求90-100中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物载体OpticVec、pTarget、pcDNA4TO4、pcDNA4.0、UCOE表达载体或GS系统表达载体。
102.根据权利要求90-99中任一项所述的方法，其中所述表达载体为昆虫细胞表达载体。
103.根据权利要求90-99或102中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞表达载体为pIEx或pBiEx载体。
104.根据权利要求90-103中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽包含异源信号序列。
105.根据权利要求90-103中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽包含天然信号序列。
106.根据权利要求90-105中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽为Wnt3A多肽、Wnt5B多肽或Wnt10B多肽。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述Wnt多肽为Wnt3A多肽。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:1具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。
109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述Wnt3A多肽是包含约1至约33个氨基酸截短的多肽。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述截短为C端截短。
111.根据权利要求106-110中任一项所述的方法，其中所述Wnt3A多肽是具有C端截短的SEQ ID NO:1的多肽。
112.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述Wnt3A多肽是与SEQ ID NO:2具有约90％、95％、99％或更高序列同一性的多肽。
113.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述Wnt3A多肽是由SEQ ID NO:2组成的多肽。
114.根据权利要求106-113中任一项所述的方法，其中所述Wnt3A多肽以至少约10ng/mL的浓度分泌到所述培养基中。
115.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括减血清培养基、无蛋白培养基、化学成分限定的培养基或无血清培养基。
116.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括无动物组分培养基。
117.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括基本上不含非人血清的培养基。
118.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括基本上不含非人蛋白的培养基。
119.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括具有少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％血清的培养基。
120.根据权利要求90-114中任一项所述的方法，其中所述最少血清条件包括具0％血清的培养基。
121.根据权利要求119或120所述的方法，其中所述血清为胎牛血清。
122.根据权利要求90-121中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含血清替代品。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述血清替代品包含CellEss、ITS、Excyte、OneShot或Knockout。
124.根据权利要求90-123中任一项所述的方法，其中所述培养基基本上不含外源因子。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述外源因子包含病原体、传染性海绵状脑病(TSE)因子或其组合。
126.根据权利要求90-125中任一项所述的方法，其还包括利用离子交换法、疏水性纯化法或亲和纯化法纯化所述Wnt多肽。
127.根据权利要求90-126中任一项所述的方法，其还包括用脂质体配制所述纯化Wnt多肽。
128.根据权利要求90-127中任一项所述的方法，其还包括用药学上可接受的赋形剂配制所述纯化Wnt多肽。
129.一种通过权利要求1-35所述的Wnt培养系统或权利要求90-128所述的体外方法生成的生物活性Wnt多肽。
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